Artykuł metodologiczny

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) występuje tylko u ssaków i pełni funkcję termogeniczną. Brązowe adipocyty charakteryzują się wielomiejscową cytoplazmą z wieloma kropelkami lipidów, centralnym jądrem, wysoką zawartością mitochondriów i ekspresją białka rozprzęgającego 1 (UCP1). BAT zaproponowano jako potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu otyłości i związanych z nią zaburzeń metabolicznych ze względu na ich zdolność do rozpraszania energii metabolicznej w postaci ciepła. Aby zbadać funkcję i regulację BAT, niezbędna jest hodowla brązowych adipocytów. Obecny protokół optymalizuje przetwarzanie tkanek i różnicowanie komórek w celu hodowli brązowych adipocytów od nowonarodzonych myszy. Dodatkowo przedstawiono procedury obrazowania zróżnicowanych adipocytów zarówno za pomocą immunofluorescencji konfokalnej, jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W brązowych adipocytach zróżnicowanych za pomocą technik opisanych w niniejszym dokumencie zachowane są główne cechy definiujące klasyczne BAT, w tym wysokie poziomy UCP1, zwiększona masa mitochondrialna i bardzo bliski kontakt fizyczny między kropelkami lipidów a mitochondriami, co czyni tę metodę cennym narzędziem do badań BAT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biała i brązowa tkanka tłuszczowa różnią się swoim położeniem anatomicznym, pochodzeniem komórkowym, funkcją, morfologią i całkowitą masą. Biała tkanka tłuszczowa (WAT) jest głównym rezerwuarem energii fizjologicznej organizmu i przechowuje duże ilości triacyloglicerolu (TAG) w wysoce wyspecjalizowanych komórkach, które mają pojedynczą gigantyczną kroplę lipidu zajmującą większość ich objętości komórkowej1. Lipoliza TAG uwalnia wolne kwasy tłuszczowe, które dostają się do krążenia ogólnoustrojowego, aby zaspokoić zapotrzebowanie energetyczne podczas postu lub innych stanów ujemnego bilansu energetycznego. Dodatkowo, WAT wydziela produkty białkowe i lipidowe, zwane odpowiednio adipokinami i lipokinami, które pełnią funkcje metaboliczne, immunologiczne i regulacyjne rozrodcze, co czyni WAT największą tkanką endokrynną w organizmie2.

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) to znacznie mniejszy narząd, którego główną funkcją fizjologiczną jest termogeneza bez drżenia, aby zapobiec hipotermii. U myszy i nowonarodzonych ludzi BAT jest dobrze zdefiniowanym narządem znajdującym się w przestrzeni międzyłopatkowej. Dorośli ludzie nie mają BAT międzyłopatkowego (iBAT); niemniej jednak rozwijają klastry brązowych komórek podobnych do adipocytów zintegrowanych w magazynach, które w przeciwnym razie w większości zawierają WAT. Te adipocyty "brązowo-białe" (brite) mają wspólne cechy morfologiczne i molekularne z klasycznymi adipocytami iBAT, ale mają inne pochodzenie komórkowe3,4.

W przeciwieństwie do białych adipocytów, brązowe adipocyty mają wiele małych kropelek lipidów i obfite mitochondria5. Białko rozprzęgające 1 (UCP1, znane również jako termogenina) ulega unikalnej ekspresji przez adipocyty brunatne i brite i pośredniczy w wycieku protonów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM), odłączając w ten sposób transport elektronów od syntezy ATP i wytwarzając ciepło. Termogeneza bez dreszczy w BAT jest aktywowana przez noradrenalinę (NE), która jest uwalniana z końcówek współczulnych w BAT w odpowiedzi na stymulację zimnem6. NE wiąże się z receptorami beta-adrenergicznymi (głównie beta 3) na powierzchni brązowych adipocytów i wyzwala wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną za pośrednictwem cAMP. Powoduje to lipolizę TAG, beta-oksydację mitochondrialnych kwasów tłuszczowych i wytwarzanie ciepła po aktywacji UCP13. Ścisły związek funkcjonalny między kropelkami lipidów a mitochondriami w brązowych adipocytach ma strukturalne odpowiedniki, takie jak interakcja między tymi organellami w obszarach, które są duże i mają bardzo ścisły kontakt fizyczny7,8.

iBAT ma obfite naczynia krwionośne i końcówki współczulne9. Struktury te, wraz z preadipocytami, komórkami odpornościowymi, fibroblastami i cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej, tworzą frakcję naczyniową zrębu tłuszczowego (SVF)10. Doniesiono, że wiele protokołów generuje dojrzałe adipocyty z preadipocytów11,12,13,14,15 (Tabela uzupełniająca 1); Niemniej jednak wykazują one ekstremalne różnice w przetwarzaniu tkanek i składzie pożywek do hodowli różnicujących. Opisany w niniejszym dokumencie protokół pozwala na efektywne i powtarzalne różnicowanie brązowych adipocytów, które (1) wyrażają kluczowe adipogenne czynniki transkrypcyjne receptor gamma aktywowany proliferatorem peroksysomów (PPARγ) i białko wiążące CCAAT/enhancer alfa (C/EBPα), (2) wyrażają dojrzałe markery adipocytów perylipinę1 (PLIN1) i determinant klastrowy 36 (CD36), (3) gromadzą obfite kropelki lipidów, (4) mają wysoką masę mitochondrialną i dużą obfitość kompleksów OXPHOS, (5) mają potencjał termogeniczny, określany przez wysoki poziom UCP1, oraz (6) mają mitochondrialne zmiany morfologiczne związane z fenotypem dojrzałych brązowych adipocytów. Metodologia ta jest wykorzystywana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uogólnionej lipodystrofii15,16,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Pontificia Universidad Católica de Chile. Do tego badania wykorzystano nowonarodzone myszy P0,5 obu płci, pochodzące z mieszanego tła szczepów C57BL / 6J i 129J.

1. Ekstrakcja tkanek

  1. Wyczyść i zdezynfekuj stół warsztatowy 70% roztworem etanolu i użyj sterylnego materiału chirurgicznego.
  2. Eutanazja nowonarodzonych szczeniąt P0,5 przez ścięcie nożyczkami chirurgicznymi zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej (skierowaną w dół) i wykonaj nacięcie skóry o długości 1 cm na środku grzbietu zwierzęcia za pomocą ostrych nożyczek. Ostrożnie usuń skórę.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli skóra nie zostanie dobrze usunięta, może rozerwać i uszkodzić iBAT oraz uniemożliwić optymalne przygotowanie SVF.
  4. Chirurgicznie odłączyć iBAT od tuszy za pomocą małych nożyczek.
    UWAGA: iBAT jest wizualizowany jako dwa zraziki tłuszczowe, które można usunąć niezależnie.
  5. Zbierz oba płaty iBAT za pomocą szczypiec z zakrzywionymi końcówkami, aby usunąć je niezależnie.
  6. Umieść dwa płatki w plastikowej probówce z 1,5 ml sterylnego PBS w temperaturze pokojowej. Utrzymuj tkanki w ich indywidualnych probówkach, aż ekstrakcja tkanek zostanie zakończona dla wszystkich wymaganych młodych.

2. Trawienie tkankowe

  1. Podwielokrotność 300 μl buforu do wytrawiania kolagenazy typu II (0,2% kolagenazy typu II w buforze [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM glukozy, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA i 1% penicyliny/streptomycyny, przy pH 7,4]) (Tabela 1) w probówkach 1,5 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość probówek do liczby pojedynczych tkanek do ekstrakcji. W niniejszym badaniu użyto siedmiu probówek, co odpowiada miotowi siedmiu młodych.
  2. Przenieś się na ławkę i umieść płaty iBAT w buforze do wytrawiania kolagenazy typu II w celu degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej.
  3. Inkubować tkanki iBAT przez 45 minut w temperaturze 37 °C, ciągłe, delikatne wstrząsanie przy prędkości 800 obr./min (Rysunek 1).

3. Przetwarzanie tkanek

UWAGA: Po trawieniu wykonaj wszystkie poniższe kroki w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym klasy II.

  1. Przygotuj i oznacz dwa zestawy plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml dla każdej pojedynczej próbki.
  2. Mechanicznie rozbić zawiesinę tkankową w buforze do trawienia kolagenazy typu II poprzez pipetowanie w górę iw dół za pomocą mikropipety P1,000 i przefiltrowanych końcówek. Użyj nowej końcówki dla każdej próbki.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok. Upewnij się, że tkanka została mechanicznie zdezagregowana za pomocą końcówki i pipety w górę iw dół, aż do zakończenia makroskopowej homogenizacji.
  3. Przepuścić zdezagregowane tkanki przez indywidualne sitka do komórek 100 μm (patrz tabela materiałów) do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 500 μl buforu ACK (patrz tabela materiałów) do przefiltrowanych próbek tkanek, odwrócić probówki 4-5 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 min.
    UWAGA: Nie należy przekraczać czasu inkubacji, ponieważ może to spowodować uszkodzenie interesujących komórek.
  5. Odwirować próbki tkanek o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej (DMEM-F12 z 10% FBS, 1% antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym, pH 7,2) (patrz Tabela materiałów).
  7. Przepuść zawiesiny przez sitko o pojemności 40 μm do nowych probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety P1 000 i przefiltrowanych końcówek.
  8. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Osad odpowiada SVF zawierającemu preadipocyty.
  9. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki przez pipetowanie.
  10. Przygotować jedną probówkę o pojemności 15 ml dla każdej próbki, dodając 5 ml pożywki hodowlanej.
  11. Dodać każdy zawieszony osad do odpowiadającej mu 15 ml probówki zawierającej 5 ml pożywki hodowlanej. Odwróć probówkę 4-5 razy, aby wymieszać zawartość komórek.
  12. Zasiaj każdą próbkę do sześciu dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej, dodając 1 ml zawiesiny do każdej studzienki (Rysunek 1).

4. Posiew frakcji naczyniowej zrębu (SVF)

  1. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień, aż komórki osiągną 100% zbieżności.
    UWAGA: W tym okresie usuwane są nieplastyczne przylegające komórki, w wyniku czego powstaje pierwotna hodowla wzbogacona o SVF zawierający preadipocyty.
  2. Gdy komórki staną się w 100% zlewne, usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki 800 μl sterylnego PBS.
  3. Dodaj 150 μl 0,25% trypsyny-EDTA (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki i umieść płytkę hodowlaną na 3 minuty w inkubatorze w celu odłączenia komórek.
    UWAGA: Sprawdź, czy komórki są odłączone za pomocą mikroskopu światła z kontrastem fazowym.
  4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 850 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka.
  5. Zebrać komórki z sześciu studzienek wysianych w kroku 3.12 i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Uzupełnić całkowitą objętość do 12 ml, dodając 6 ml pożywki hodowlanej. Odwróć probówkę 4-5 razy, aby wymieszać zawartość.
  7. Pobrać 1 ml próbki do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień, aż komórki osiągną zbieg.
  8. Gdy komórki staną się w 100% zlewne, odłącz je za pomocą 150 μl 0,25% trypsyny-EDTA zgodnie z tymi samymi warunkami inkubacji, co w kroku 4.3, i wysiewaj je zgodnie z powierzchnią studzienki wymaganą do eksperymentu.
  9. Wykonaj obrazowanie w wysokiej rozdzielczości po zamocowaniu komórek w kroku 8.
    UWAGA: Gęstość 35 000 komórek/cm² jest zalecana do dalszych eksperymentów (ekstrakcja białka i całkowitego RNA, 330 000 komórek [jeden dołek na płytce 6-dołkowej]; immunofluorescencja [IF], 10 500 komórek [jeden dołek płytki 96-dołkowej]).

5. Różnicowanie adipogenne

  1. Inkubować komórki z pożywką indukcyjną (DMEM-F12 z 10% FBS, 1% antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym, pH 7,2, uzupełnionym 500 nM deksametazonem, 125 nM indometacyną, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyną [IBMX], 5 μM rozyglitazonem, 1 nM T3 i 20 nM insuliny) (Tabela 1) przez 72 godziny (dzień 0 do dnia 2) (Rysunek 2).
    UWAGA: Pożywkę hodowlaną należy wymieniać co drugi dzień; Tak więc pierwsza zmiana pożywki musi nastąpić w 2 dniu po początkowej indukcji.
  2. Zmień na pożywkę podtrzymującą (DMEM-F12 z 10% FBS, 1% antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym, pH 7,2, uzupełnionym 5 μM rozyglitazonem, 1 nM T3 i 20 nM insuliną) (Tabela 1) w 3 dniu i utrzymuj tę pożywkę podtrzymującą do 7 dnia (Rysunek 2).
    UWAGA: Pożywkę podtrzymującą należy wymienić w 5 i 7 dniu. Małe kropelki lipidów można uwidocznić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym od 3 dnia różnicowania. Duże kropelki lipidów są widoczne w 7 dniu różnicowania. Procedury różnicowania trwające dłużej niż 7 dni powodują utratę komórek przez oderwanie, prawdopodobnie z powodu dużej wyporności komórek obciążonych lipidami.

6. Przygotowanie homogenatu komórkowego

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną w dniu 0 i 7 różnicowania i przemyć komórki 3 razy sterylnym PBS.
  2. Po ostatnim oczyszczeniu dodaj 1,3 ml sterylnego PBS do każdej studzienki.
    UWAGA: Utrzymuj komórki w lodzie do czasu wyczyszczenia ostatniej płytki.
  3. Zbierz komórki mechanicznie z jednego dołka 6-dołkowej płytki (~ 330 000 komórek) za pomocą skrobaka do komórek i umieść zawiesinę komórkową w probówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować próbki o masie 2 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Wyjmij PBS za pomocą mikropipety i utrzymuj probówki na lodzie.
  6. Zawiesić osad komórkowy w buforze RIPA z inhibitorami proteazy i fosfatazy (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Do lizy osadu komórkowego wystarczy 70-80 μL.
  7. Odwirować próbki o masie 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i wyrzucić granulki.
    UWAGA: Supernatant reprezentuje homogenat komórkowy.
  9. Określ stężenie białka w homogenacie komórkowym za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) do kolorymetrycznego wykrywania i ilościowego oznaczania całkowitego białka18,19.

7. Western blotting

  1. Przygotować 30 μg homogenatu komórkowego (od kroku 6.8) i dodać dostępny w handlu bufor do ładowania próbki SDS-PAGE (patrz Tabela materiałów).
  2. Rozpuść w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym-SDS20 (PAGE-SDS) zgodnie z masą cząsteczkową każdego białka.
    UWAGA: Użyj 10% PAGE-SDS dla PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 i UCP1, 12% PAGE-SDS dla OXPHOS i 15% PAGE-SDS dla TOM20 (patrz Tabela materiałów).
  3. Elektrotransferować białka na membranę PVDF (patrz Tabela materiałów) pod ciśnieniem 350 mA przez 2 godziny
    UWAGA: Pojemnik na lód należy wymienić po 1 godzinie. Podczas całego procesu utrzymuj komorę na lodzie.
  4. Zablokuj błony 5% BSA lub mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) przez 2 godziny, postępując zgodnie z zaleceniami zawartymi w kartach katalogowych przeciwciał.
  5. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami (przeciwciała użyte w tym badaniu są szczegółowo opisane w tabeli materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wszystkie przeciwciała użyte w tym badaniu rozcieńczono w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym.
  6. Przemyć membrany 3 razy 0,1% TBS-T i inkubować je z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (patrz tabela materiałów) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj membrany 3 razy 0,1%. TBS-T. Wykonaj ostatnie pranie za pomocą 1x TBS. Przechowuj membrany w 1x TBS do czasu wizualizacji. Zaleca się przechowywanie maksymalnie 1 godzinę.
  8. Wizualizacja membran za pomocą chemiluminescencji20 lub dowolnej innej preferowanej metody.

8. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości

  1. Wykonaj test immunofluorescencyjny, wykonując poniższe czynności.
    1. Wysiewaj i różnicuj pierwotne kultury brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy P0,5 (zgodnie z krokiem 4.8) na 96-dołkowych płytkach z dnem optycznym (patrz tabela materiałów).
    2. Utrwalić komórki w dniu 0 i 7 różnicowania za pomocą 4% PFA przez 20 minut i przemyć 3 razy sterylnym PBS.
    3. Przepuszczaj komórki 0,1% Triton X-100 przez 15 minut i blokuj je 3% żelatyną rybną (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Przemyć 3 razy sterylnym PBS i inkubować z przeciwciałem PLIN1 (1:400, patrz Tabela Materiałów) w 1% BSA/PBS przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    5. Przemyć 3 razy sterylnym PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w stosunku 1:1 000 (1% BSA/PBS) (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Wybarwić jądra 1 μg/ml Hoechst 33342, a kropelki lipidów 1 μg/ml BODIPY przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Obrazy fluorescencyjne zostały uzyskane przy użyciu systemu obrazowania komórek (patrz tabela materiałów). Ogólnie rzecz biorąc, 9 lub 16 zdjęć na studnię zostało uzyskanych za pomocą dwóch do trzech kanałów z powiększeniem 20x.
  2. Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową, wykonując poniższe czynności.
    1. Hoduj i różnicuj brązowe preadipocyty w szalkach do hodowli komórkowych o wymiarach 35 mm x 10 mm.
    2. W dniu 0 i 7 różnicowania usunąć pożywkę i utrwalić komórki na 1 godzinę za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu, pH 7,0 (patrz tabela materiałów).
    3. Przemyć komórki 3 razy 0,05 M buforem kakodylanu sodu przez 10 minut i potraktować je 1% wodnym tetratlenkiem osmu (patrz tabela materiałów) przez 15 minut.
    4. Przemyj komórki 3 razy wodą dwudestylowaną przez 5 minut i potraktuj je 1% wodnym octanem uranylu (patrz Tabela Materiałów) przez 15 minut.
    5. Odwadniaj komórki za pomocą gradientu etanolu 30%, 50%, 70%, 95% i 100% przez 5 minut za każdym razem.
    6. Wstępnie zanurz ogniwa w eponie/etanolu w proporcji 1:1 na 30 minut, a następnie w epon na 1 godzinę (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Włączenie komórek odbywa się bezpośrednio w naczyniu poprzez dodanie świeżego eponu w celu pokrycia całej monowarstwy kultury komórkowej. Pozostawić epon do polimeryzacji w piecu w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.
    7. Zanurz naczynie do hodowli komórkowych w ciekłym azocie na 2 minuty, a następnie rozbij je za pomocą szczypiec, aby poluzować plastikowy wtrącenie.
    8. Przykleić segmenty inkluzji z komórkami do bloku żywicy, aby uzyskać drobne nacięcia (80 nm) równolegle do powierzchni w ultramikrotomie (patrz tabela materiałów).
    9. Barwieć kawałki 1% wodnym octanem uranylu przez 4 minuty i cytrynianem ołowiu przez 5 minut, zgodnie z Reynolds et al.21.
    10. Wizualizuj siatki w mikroskopie elektronowym (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipogeneza jest regulowana przez sieć czynników transkrypcyjnych, które są odpowiedzialne zarówno za ekspresję kluczowych białek indukujących powstawanie brązowych adipocytów, jak i ich funkcjonowanie22, w tym klasyczne regulatory adipogenne, takie jak PPARγ i C/EBPα23,24,25, jak również markery dojrzałych adipocytów26,27. Poprzez testowanie różn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół jest prostą i powtarzalną dwufazową procedurą różnicowania (ryc. 2) do generowania komórek o cechach molekularnych i morfologicznych dojrzałych brązowych adipocytów. Chirurgiczne pobranie iBAT jest pierwszym krytycznym krokiem, ponieważ rozerwanie tkanki poważnie ogranicza żywotność materiału wyjściowego. Przetwarzanie tkanek jest również kluczowe, ponieważ jednorodna zawiesina komórek, która jest wolna od zanieczyszczeń, znacznie zwiększa ilość SVF, którą można hodować. W ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez FONDECYT (1181214 i 1221146) oraz Anillos (ACT210039) na stypendia VC i doktoranckie ANID 21171743 dla AMF i ANID 21150665 dla FS. Dziękujemy Alejandro Munizaga za pomoc w przetwarzaniu próbek i doradztwo techniczne dotyczące transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ilustracje zostały wykonane przy użyciu oprogramowania BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Bufor Tris/GlicynaBioRad1610734
16% wodny roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa Sciences15710
35 mm Naczynie do hodowli komórkowych w stylu TC Falcon353001
3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)Calbiochem410957
40% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1BioRad1610148
płytka 6-dołkowa SPL Nauki przyrodnicze -
96-dołkowa optyczna z pokrywką sterylna hodowla komórkowaThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Wstępnie wybarwiona drabinka białkowa Maestrogen02102-250
ACK bufor lizujący GibcoA10492-01
Nadsiarczan amonu BioRad1610700
Antybiotyk-antybiotykGibco 
Przeciwciało przeciw myszym IgG, Sygnalizacja komórkowa przeciwciała sprzężonego z HRP7076
Przeciwciało anty-królicze IgG, Przeciwciało sprzężone z HRP   Sygnalizacja komórkowa7074
Bloker klasy blotting BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα Sygnalizacjakomórkowa2295
CaCl2Calbiochem 
Przeciwciało CD36InvitrogenPA1-16813
Sitko do komórek 100 & mikro; m, nylonowyfiltr352360
40 µ m, nylonFalcon352340
Kolagenaza typu IIGibco17101-015
Cytacja 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBiotek
Deksametazon SigmaD4902
DMEM/F-12, proszekGibco12500062
EMBed-812 EMBed-812 EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Mikroskopia elektronowa Sciences14120
Absolutny etanolMerck 100983 
Surowica bydlęca płodu Gibco16000-044
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnychSigmaG7041
GlukozaGibco 15023-021
Aldehyd glutarowy 25% roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Sciences16210
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Koktajl inhibitorów fosfatazy halt 100X Thermo Scientific78427
Koktajl inhibitorów proteazy Halt 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulina SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Bufor próbki redukujący znacznik pasa ruchu Termo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ sterylna woda --
Mitoprofile Total OXPHOS Gryzoń WB przeciwciało KoktajlAbcam MS604
NaClfirmy Merck 
OmniPur  10x PBS Płynny KoncentratCalbiochem6505-OP
Tetratlenek osmu Nauki o mikroskopii elektronowej19100
Przeciwciało Perilipina 1Sygnalizacja komórkowa9349
PPARγ (81B8) przeciwciałoSygnalizacja komórkowa2443
Liza bufora RIPA Thermo Scientific89901
RozyglitazonMerck557366
Wodorowęglan sodu SigmaS5761
Kakdylan SoduMikroskopia Elektronowa Sciences12300
Dodecylosiarczan sodu BioRad1610301
T3 SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific TEMED
 BioRad1610800
Przeciwciało TOM20Sygnalizacja komórkowa42406
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS-10X)Sygnalizacja komórkowa12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, klasa biologii molekularnejPromega H5152
UCP1Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała 14670
Ultracut RLeica 
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Nauki22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyjanagXLS3
15240062 przeciwciała 208291 siatkowy Falcon Membrana PVDF 5295521064041000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341(2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Brunatna tkanka t uszczowar nicowanie adipocyt wkonfokalna immunofluorescencjatransmisyjna mikroskopia elektronowafunkcja mitochondri wekspresja UCP1krople lipidowe

Powiązane artykuły