Method Article

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skład mikrobiomu jelitowego może mieć ogromny wpływ na fizjologię gospodarza przez cały okres rozwoju i życia zwierzęcia. Pomiar zmian składu mikrobiomu ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji funkcjonalnych relacji między tymi zmianami fizjologicznymi. Caenorhabditis elegans stał się potężnym systemem gospodarza do badania molekularnych czynników wpływających na interakcje gospodarz-mikrobiom. Dzięki przezroczystemu planowi ciała i znakowanym fluorescencyjnie naturalnym mikroorganizmom, względne poziomy drobnoustrojów w mikrobiomie jelitowym pojedynczego zwierzęcia C. elegans można łatwo określić ilościowo za pomocą sortera dużych cząstek. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalnej konfiguracji mikrobiomu, zbierania i analizy populacji C. elegans na pożądanym etapie życia, obsługi i konserwacji sortera oraz analizy statystyczne uzyskanych zestawów danych. Omówiono również kwestie związane z optymalizacją ustawień sortownika w oparciu o interesujące mikroorganizmy, opracowanie skutecznych strategii bramkowania dla etapów życia C. elegans oraz sposoby wykorzystania możliwości sortera do wzbogacenia populacji zwierząt w oparciu o skład mikrobiomu jelitowego. W ramach protokołu zostaną przedstawione przykłady potencjalnych zastosowań, w tym potencjał skalowalności do aplikacji o wysokiej przepustowości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ewolucja zwierząt jest pod ciągłym wpływem mikroorganizmów1. Z różnych mikroorganizmów żyjących w środowisku, żywiciele zwierząt pozyskują określonych partnerów2, którzy rozszerzają możliwości gospodarza i wpływają na jego fizjologię i podatność na choroby3. Na przykład analizy metagenomiczne mikrobiomu jelitowego ujawniły wzbogacone klasy metaboliczne genów drobnoustrojów, które mogą zapewniać większe pozyskiwanie i magazynowanie energii u otyłych myszy4, z których wiele znajduje się również w ludzkim mikrobiomie jelitowym5. Nadal istnieje ogromna potrzeba ustalenia związków przyczynowo-skutkowych i wskazania molekularnych determinantów wpływu mikrobiomu, chociaż postęp jest utrudniony ze względu na złożoność mikrobiomu i podatność systemów gospodarza na badania przesiewowe na dużą skalę.

Modelowy organizm C. elegans stanowi platformę do pogłębienia molekularnego zrozumienia powiązań między mikrobiomem a fizjologią gospodarza. C. elegans posiada 20 komórek jelitowych z warstwą błony śluzowej i strukturami kosmków. Komórki te są wyposażone w liczne geny chemoreceptorów, które wykrywają produkty drobnoustrojów i wytwarzają cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe, które potencjalnie regulują ich kolonizatory jelitowe6,7. Ta zachowana biologia C. elegans doprowadziła do ogromnej liczby odkryć w sygnalizacji gospodarza, która reguluje drobnoustroje jelitowe, w tym sygnalizację insuliny, TGF-beta i kinazę MAP8,9,10.

C. elegans wykorzystują mikroby zarówno jako dietę do wzrostu podczas rozwoju, jak i mikrobiom jako dorośli. Z wiekiem niektóre drobnoustroje mogą nadmiernie gromadzić się w świetle jelita, a relacja gospodarz-mikroorganizm zmienia się z symbiozy na patogenezę11. W swoim naturalnym środowisku C. elegans napotyka szeroki wachlarz gatunków bakterii12,13. Sekwencjonowanie 16S rDNA z reprezentatywnych próbek zebranych w naturalnych siedliskach (zgniłe owoce, łodygi roślin i wektory zwierzęce) ujawniło, że naturalny mikrobiom C. elegans jest zdominowany przez cztery typy bakterii: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes i Actinobacteria. W obrębie tych podziałów znajduje się duże zróżnicowanie w różnorodności i bogactwie bakterii w zależności od siedliska12,13,14,15. Ustanowiono kilka zdefiniowanych społeczności, w tym 63-osobowe (BIGbiome)16 i 12-osobowe (CeMbio) kolekcje reprezentujące najważniejsze rodzaje mikrobiomu stworzone dla społeczności badawczej C. elegans17. Zarówno mikrobiomy, jak i szczepy składowe mogą mieć różnorodny wpływ na fizjologię C. elegans, taki jak wielkość ciała, tempo wzrostu i reakcje na stres9,16,17. Badania te dostarczają zasobów i przykładów do ustalenia C. elegans jako modelu do badań nad mikrobiomem.

Tutaj prezentowany jest przepływ pracy oparty na sorterze dużych cząstek (LPS) (Rysunek 1), który wykorzystuje system C. elegans do jednoczesnego pomiaru składu mikrobiomu i podstawowych pomiarów fizjologii gospodarza w skali populacji. Od strony mikrobiologicznej przepływ pracy można dostosować do tworzenia zdefiniowanego mikrobiomu lub pojedynczych drobnoustrojów w celu przetestowania wytrzymałości i plastyczności społeczności przy rosnących interakcjach mikrobiologicznych. Po stronie gospodarza przepływ pracy umożliwia testy o wysokiej przepustowości w celu pomiaru poziomu kolonizacji drobnoustrojów fluorescencyjnych w mikrobiomie oraz odczytu fizjologicznego gospodarza pod względem rozwoju, wielkości ciała i reprodukcji. Reasumując, model mikrobiomu C. elegans umożliwia przeprowadzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu określenia metabolicznych i genetycznych uwarunkowań modulujących fizjologię gospodarza.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mieszanki mikrobiomu

  1. Wystempluj lub usuń bakterie z wywaru do zamrażania glicerolu na płytkę bulionu lizogennego (LB) lub odpowiednią pożywkę wzrostową i hoduj przez noc w optymalnej temperaturze w oparciu o interesujące szczepy bakterii (zwykle 25 °C dla naturalnych drobnoustrojów C. elegans).
  2. Z płytki LB użyć pojedynczej kolonii z każdego izolatu bakteryjnego (np. 12 bakterii z kolekcji CeMbio) do zaszczepienia 800 μl pożywki LB w oddzielnych dołkach płytki głębinowej o pojemności 1 ml. Inkubować przez noc w optymalnej temperaturze z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    UWAGA: Protokół ten jest zoptymalizowany do użytku ze zdefiniowanymi naturalnymi mikrobiomami (np. CeMbio), ale można go łatwo dostosować do poszczególnych drobnoustrojów poprzez wzrost w odpowiednich warunkach lub innych naczyń hodowlanych (probówek).
  3. Oceń wzrost każdego drobnoustroju za pomocą spektrofotometrii. Przenieść podwielokrotność 20 μl do 80 μl LB i dodać roztwór do przezroczystej płaskiej płytki 96-dołkowej. Zmierz średnicę zewnętrzną600 na czytniku płytek.
  4. Po całonocnym wzroście odwirować płytkę do hodowli głębokiej o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut w celu osadzenia bakterii i usunięcia supernatantu przez aspirację za pomocą 96-dołkowego kolektora aspiracyjnego lub pipety wielokanałowej.
  5. Używając wartości OD600, znormalizuj stężenie każdego drobnoustroju do końcowego OD600 wynoszącego 1,0 przy użyciu sterylnego podłoża M9.
  6. W przypadku łączenia drobnoustrojów należy określić ilość kultury bakteryjnej potrzebnej do eksperymentu i utworzyć główną mieszankę mikrobiomu, łącząc równe objętości każdego szczepu bakteryjnego w probówce o odpowiedniej wielkości (np. probówkach o pojemności 5 ml lub 15 ml).
  7. Umieść 30-50 μl drobnoustrojów z końcowym OD600 wynoszącym 1,0 na środku każdej płytki zawierającej agar z podłożem wzrostu nicieni (NGM) lub well18. Pozwól wysianemu mikrobiomowi rosnąć przez noc w optymalnej temperaturze (tutaj 25 °C).
    UWAGA: Przygotuj wcześniej płytki agarowe NGM zgodnie z instrukcjami w Wormbooku lub używając wstępnie zmieszanego proszku NGM 18. Na przykład do płytek 12-dołkowych dodaje się 3 ml NGM, a do płytek 24-dołkowych dodaje się 1,5 ml.

2. Przygotowanie zsynchronizowanych C. elegans do wzrostu na mikrobiomie

  1. Wyhoduj około 100 robaków na płytkach NGM (6 cm średnicy) obsianych Escherichia coli OP50, aż robaki osiągną ciężką dorosłość. Do celów tego protokołu wykorzystano szczep C. elegans N2, chociaż protokół można łatwo dostosować do innych szczepów nicieni.
  2. Dodać 6 ml buforu M9 (plus 0,01% trytona X-100; M9-TX) do płytki, pipetując w górę i w dół, aby zmyć około 100 grawitacyjnych dorosłych robaków do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Przygotować świeżo przygotowany roztwór wybielacza, mieszając dwie części wybielacza z jedną częścią 5 M NaOH.
  4. Odwiruj robaki przy 3,000 x g przez 30 sekund, aby otulić robaki. Zassać, aby zmniejszyć objętość do 4 ml, a następnie dodać 2 ml roztworu wybielacza.
  5. Zamknij szczelnie pokrywkę i potrząśnij tubką. Monitoruj dorosłe robaki w roztworze pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu. Kiedy dorosłe ciała zaczną się rozpadać, zwykle po 3,5 minuty, przestań się trząść i odwiruj przy 3,000 x g przez 30 s.
  6. Odessać do minimalnej objętości za pomocą pipety. Ponownie zawiesić, odwirować i zassać cztery razy w M9-TX, aby wypłukać wybielacz.
  7. Ponownie zawiesić w 4-6 ml M9-TX i umieścić probówkę na rotatorze na noc, umożliwiając wyklucie się jaj i synchronizację na etapie L1.
  8. Następnego dnia weź 10 μl robaków L1 w M9-TX z probówki i upuść je na czystą szalkę Petriego. Policz liczbę żywych robaków L1 pod mikroskopem stereoskopowym przy 20-krotnym powiększeniu całkowitym.
  9. W oparciu o gęstość L1, odpipetuj odpowiednią objętość, aby upuścić ~50 zsynchronizowanych larw L1 na krawędź płytek NGM wysianych mikrobiomem i inkubować w temperaturze 20 °C. Pozwól robakom rosnąć do pożądanego wieku (dzień 2 lub dzień 3 dorosłości).

3. Zbieranie populacji robaków do analiz mikrobiomu jelitowego

  1. Zmyj robaki z trawnika bakteryjnego za pomocą 1-2 ml M9-TX na wysterylizowaną płytkę o głębokości 2 ml 96 dołków.
    UWAGA: W przypadku szczepów drobnoustrojów, które tworzą znaczne biofilmy, potrząsaj płytką z płynem przez 5 minut, aby rozbić resztki drobnoustrojów.
  2. Odwirować płytkę z głęboką studnią o masie 300 x g przez 1 minutę, aby osadzać robaki, a następnie usunąć płyn za pomocą kolektora zasysającego.
    UWAGA: Użytkownicy mogą użyć pipety wielokanałowej do ręcznego usunięcia cieczy, jeśli kolektor zasysający nie jest dostępny. Upewnij się, że końcówki pipet nie dotykają dna studzienek, aby uniknąć utraty próbek robaków.
  3. Dodaj 1,8 ml M9-TX do każdego dołka płytki głębokiej za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 1,2 ml. Wymieszać kilka razy pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować przy 300 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok cztery razy, aby usunąć bakterie z płynu.
  4. Po ostatnim płukaniu doprowadzić objętość w każdym studzience do 100 μl za pomocą kolektora zasysającego.
    UWAGA: Aby oddzielić dorosłe osobniki od larw za pomocą grawitacji, pozostaw płytkę na ławce na 30-60 s, pozwalając dorosłym robakom opaść na dno studni. Następnie należy odessać płytkę, aby usunąć larwy z zawiesiny.
  5. Dodaj 100 μl 10 mM lewamizolu w M9-TX do każdej studzienki i pozwól robakom sparaliżować się przez 5 minut. Po zabiegu lewamizolem dodaj 4% roztworu wybielacza opisanego w kroku 2.3 do każdego dołka przez 2 minuty, aby w razie potrzeby zmniejszyć grudki bakteryjne. Umyć M9-TX dwukrotnie po zabiegu wybielania i odessać do końcowej objętości 100 μl po drugim praniu.
  6. Przenieś robaki na płaską denną 96-dołkową płytkę zawierającą 150 μl 10 mM lewamizolu w M9-TX. Utrzymuj gęstość robaków na poziomie 50-100 na studnię i podziel robaki na wiele dołków, jeśli populacja jest zbyt zatłoczona.

4. Konfiguracja sortera dużych cząstek i automatycznego podajnika

próbek
  1. Włącz sprężarkę powietrza, komputer i przyrząd LPS. Sprawdź i opróżnij zbiornik na odpady. Następnie dodaj 500 ml wybielacza do pustego zbiornika na odpady. Sprawdź i napełnij osłonę i zbiorniki na wodę, jeśli objętość jest niska. Upewnij się, że zespół rdzenia fluidycznego i optycznego (FOCA) 250 μm jest na swoim miejscu.
  2. Uruchom cząstki kontrolne w celu kontroli jakości. Otwórz oprogramowanie instrumentu LPS. W oknie oprogramowania zaznacz opcję Włącz lasery, aby włączyć lasery 488 nm i 561 nm.
    UWAGA: Możliwe jest pominięcie kroków 4.2-4.5, jeśli cząstki kontrolne zostały przeprowadzone w ciągu ostatnich 2 tygodni i FOCA nie została w tym czasie zmieniona.
  3. Wybierz opcję Skonfiguruj > kontroluj cząsteczki. Wybierz opcję Nie w wierszu polecenia, aby przejść do ustawień domyślnych. Przed każdym użyciem należy zmieszać cząstki kontrolne (10 mldH2O i 10 ml cząstek kontrolnych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml) i załadować je do portu próbki.
  4. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij Pobierz, aby zarejestrować 500 zdarzeń. Upewnij się, że częstotliwość zdarzeń wynosi od 15 do 30 zdarzeń/s.
    UWAGA: Jeśli częstotliwość zdarzeń nie wynosi 15–30 zdarzeń/s, należy skontaktować się z inżynierem w celu dostosowania ustawień maszyny.
  5. Zbadaj współczynnik zmienności (CV) dla wszystkich parametrów. Jeśli CV < 15%, kontrola jakości jest pozytywna i oprogramowanie LPS można zamknąć. Jeśli CV > 15%, uruchom ponownie i wyreguluj mikrometry ze świeżo przygotowanymi cząstkami kontrolnymi, aby wyrównać laser z komórką przepływową.
  6. Podłącz i włącz automatyczny podajnik próbek. Otwórz oprogramowanie automatycznego podajnika próbek. Spowoduje to otwarcie automatycznego podajnika próbek i oprogramowania LPS. W oknie oprogramowania LPS przejdź do pozycji File > New Experiment (Plik) New Experiment (Plik) New Experiment (Plik > nową próbkę). Zaznacz opcję Włącz lasery, aby włączyć lasery 488 nm i 561 nm, jeśli nie zostało to jeszcze zrobione.
  7. Twórz szablony dla wykresów punktowych akwizycji przy użyciu kanałów czasu przelotu (TOF), ekstynkcji (EXT) i fluorescencji w oknie oprogramowania LPS. Dobrą początkową maksymalną liczbą do schwytania wszystkich robaków jest 8 000 dla TOF i EXT. Skale fluorescencji będą się różnić w zależności od każdego drobnoustroju. Uwzględnij próbki robaków kontrolnych wyhodowane na drobnoustrojach niefluorescencyjnych (np. OP50) i każdy mikroorganizm fluorescencyjny osobno (w przypadku mieszania drobnoustrojów) jako kontrolę w każdym doświadczeniu.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy w treści wykresu, aby zmodyfikować skalowanie. Użyj zwierząt kontrolnych, takich jak dorosłe osobniki dnia 1 lub zsynchronizowane L1 (lub populacja będąca przedmiotem zainteresowania), aby pomóc w selekcji bramkowania TOF i EXT.
  8. W oknie automatycznego podajnika próbek wybierz opcję Prime. Przejdź do Plik > Otwórz skrypt, aby wybrać odpowiedni wbudowany skrypt, a następnie kliknij OK.
    1. Tylko w przypadku analizy wybierz skrypt za pomocą opcji Pobierz. Aby posortować, wybierz skrypt za pomocą opcji Dozowanie. W przypadku akwizycji z płytek 96-dołkowych wybierz skrypt z 96 dołkami; Aby uzyskać dostęp z płytek 384-dołkowych, wybierz skrypt z dołkiem 384. Dla objętości próbki (40 lub 100 μl) wybierz skrypt z odpowiednią objętością.
  9. Przejdź do opcji Plate Template (Szablon płyty) w menu oprogramowania automatycznego podajnika próbek i wybierz żądane dołki do analizy. Załadować próbki kontrolne. Po załadowaniu płytki na stolik automatycznego podajnika próbek i zabezpieczeniu naciśnij przycisk Uruchom płytkę w oknie automatycznego podajnika próbników. Zapisz plik, gdy zostaniesz o to poproszony.
    UWAGA: Próbki kontrolne i ustawienia można wykonać za pomocą stożkowej rurki o pojemności 50 ml na porcie próbki LPS przed podłączeniem próbnika LP.
  10. Po zakończeniu akwizycji kliknij przycisk Przechowuj dane na górnej wstążce w oknie oprogramowania LPS i ponownie zapisz dane.

5. Analiza cech C. elegans i poziomu mikrobiomu jelitowego u każdego zwierzęcia

  1. Surowe dane są przechowywane w trzech typach plików: .lmd, .bxr3 .txt. Załaduj plik tekstowy oznaczony etykietą .txt plik do programu R w celu analizy. Wykonaj poniższe czynności w R19.
  2. Użyj pakietu tidyverse20 jako ramy do analizy.
  3. Korzystając z funkcji ggplot (zawartej w tidyverse), wykreśl dane LPS, używając wartości TOF jako osi x i wartości EXT jako osi y. Normalny wykres pokaże dwie chmury kropek. Upewnij się, że jeden z nich znajduje się blisko początku i osi x, wskazując mniejsze cząstki, takie jak larwy i małe szczątki, a druga grupa cząstek znajduje się w prawym górnym rogu wykresu i reprezentuje dorosłe nicienie.
  4. Korzystając z tego grupowania jako wskazówki, wybierz odpowiednie wartości odcięcia TOF i EXT. Bramkowanie może się różnić w zależności od szczepów C. elegans na różnych drobnoustrojach w zależności od zmian w fizjologii (np. zwierzęta ciemne i przezroczyste lub zmiany w przenoszeniu jaj mogą zmieniać współczynniki EXT).
  5. Użyj podzbioru funkcji, aby oddzielić dorosłe osobniki i larwy za pomocą bramkowania TOF i EXT. W poniższym przykładzie użyj ustawień TOF > 1,200 i EXT > 1,000, aby przejść przez bramkę dla dorosłych zwierząt.
  6. Przeanalizuj wynikowe zestawy danych pod kątem różnic statystycznych; w tym eksperymencie użyj funkcji testu t w języku R.
    1. Aby określić wpływ mikrobiomu na wielkość i gęstość optyczną C. elegans, porównaj odpowiednio wartości TOF i EXT między warunkami. TOF jest wskaźnikiem wielkości robaka i może wskazywać na zmiany w tempie wzrostu zwierząt w określonych momentach. Zmiany EXT są największe między końcem rozwoju a dorosłością ze względu na światło rozproszone przez jaja i mogą być wykorzystane do oceny zmian w czasie tego przejścia i płodności. Ocenić proporcje i rozmieszczenie potomstwa, jeżeli zostało ono zachowane podczas analiz.
    2. Aby określić zmiany w poziomach kolonizacji mikrobiomu jelitowego, najpierw znormalizuj wartości fluorescencji (np. czerwone lub zielone kolumny), dzieląc je przez indywidualne wartości TOF dla każdego zwierzęcia. Gdy robaki rosną i stają się dorosłe, objętość ich jelit również się powiększa. Normalizacja pomaga zredukować artefakty wynikające z różnic w rozkładach wielkości próbek zwierząt. Użyj znormalizowanych zwierząt, aby ocenić zmiany w kolonizacji mikrobiomu jelitowego w różnych warunkach.
      UWAGA: Przykład danych pierwotnych i odpowiadające im skrypty języka R można znaleźć w pliku uzupełniającym 1 JOVE_worm_microbiome.txt i pliku uzupełniającym 2 JOVE_worm_microbiome.r. Zobacz Rysunek 2 i Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny przykład tych analiz gospodarza i mikrobiomu przy użyciu dwóch bakterii fluorescencyjnych.

6. Sortowanie zwierząt C. elegans według cech mikrobiomu jelitowego

  1. Zbierz populację C. elegans wyhodowaną na drobnoustrojach znakowanych fluorescencyjnie (np. RFP), jak opisano w kroku 3. Robaki należy umieścić w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml z co najmniej 5 ml próbki. Celuj w około 2,000 robaków/ml, w tym wszystkie dorosłe i potomstwo.
    UWAGA: Można to również zrobić na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem za pomocą samplera LP. Utrzymuj gęstość robaków na poziomie 50–100 na studzienkę.
    1. Jeśli użyto samplera LP, wyłącz i odłącz sampler LP. Przed sortowaniem ponownie podłącz przewody do pobierania próbek i przedmuchiwania do LPS.
  2. Otwórz oprogramowanie LPS, przejdź do File > New Experiment (Plik) New Experiment (Plik) New Experiment (Plik) > New Sample (Plik nową próbkę). Utwórz wykres punktowy z TOF na osi x i Extinction na osi y. Utwórz kolejny wykres punktowy z TOF na osi x i kolorem czerwonym na osi y. Użyj tej samej skali osi i ustawień lasera, które były używane wcześniej. Zaznacz opcję Włącz lasery, aby włączyć lasery 488 nm i 561 nm
    UWAGA: Jeśli te wykresy zostały utworzone wcześniej, przejdź do pozycji Plik > Otwórz eksperyment i Plik > Otwórz próbkę, aby załadować wykresy.
    1. Umieścić probówkę z próbką kontrolną w porcie próbki. W oknie dialogowym Pozyskiwanie/dozowanie kliknij przycisk Pobierz. Zapisz plik, gdy pojawi się monit. Po zmierzeniu wystarczającej liczby robaków do rozróżnienia populacji kliknij przycisk Abort.
      UWAGA: Natężenie przepływu powinno wynosić około 15–30 zdarzeń/s. Jeśli nie, dostosuj stężenia robaków, aby upewnić się, że poszczególne zwierzęta są analizowane lub sortowane według kropli. W LPS robaki przechodzą przez ścieżkę lasera w różnych pozycjach (proste, zwinięte lub wygięte). Mogą potrzebować różnej ilości czasu, aby przejść przez laser i detektor, w zależności od ich pozycji.
    2. Na wykresie kropkowym TOF vs Extinction narysuj bramę wokół dorosłej populacji. Na wykresie TOF vs Red Dot narysuj bramki wokół obszarów o wysokich i niskich wartościach koloru czerwonego jako obszarów zainteresowania dla dorosłych robaków o różnych poziomach kolonizacji mikrobiomu. Przejdź do pozycji Wyświetl hierarchię bramkowania > i upewnij się, że bramki fluorescencyjne są wymienione w bramie populacji dorosłych. Po zoptymalizowaniu ustawień przejdź do pozycji File > Save Experiment i File > Save Sample.
      UWAGA: W poniższym przykładzie wybierz zwierzęta na podstawie bramek TOF/EXT dla dorosłych i podziel je na pule, które wykazują wysoką lub niską kolonizację bakteriami wykazującymi ekspresję białka czerwonej fluorescencji. Jednak dowolna kombinacja parametrów mierzonych przez LPS może być wykorzystana do identyfikacji populacji będącej przedmiotem zainteresowania.
  3. Przed sortowaniem upewnij się, że załadowano odpowiednie urządzenie do zbierania. Aby załadować płytkę 96-dołkową do aparatu do pobierania, wybierz opcję Załaduj płytkę A > Przesuń w sekcji Etap ruchu w oknie dialogowym Nabywanie/dozowanie, aby umożliwić przejście etapu pobierania do pozycji przygotowanej do załadowania płytki 96-dołkowej.
  4. W przypadku sortowania zbiorczego wybierz odpowiedni rozmiar probówki i kliknij przycisk Przesuń, aby załadować probówkę stożkową o pojemności 15 ml lub 50 ml. W sekcji Sortowanie w oknie dialogowym Nabywanie/dozowanie wybierz bramkę sortowania z listy rozwijanej utworzonych regionów. Wprowadź liczbę obiektów ze zdefiniowanego regionu, które mają być dozowane do rurki zbiorczej bezpośrednio pod dyszą komory przepływowej. Kliknij przycisk Sortowanie zbiorcze w oknie dialogowym Nabywanie/dozowanie.
  5. Aby uzyskać informacje na temat dozowania do płytki 96-dołkowej, przejdź do części Konfiguracja > Płytki > Płytki skalibrowane > Płytka 96-dołkowa. Następnie przejdź do Wyświetl szablon płyty >, wybierz studnie, do których zostaną posortowane robaki, wprowadź liczbę obiektów do posortowania do każdej studni i wybierz bramkowane obszary zainteresowania. Jeśli więcej niż jeden region bramkowany zostanie posortowany na tej samej płycie, zaznacz pole Bramka do każdej studni. Kliknij przycisk OK, aby zapisać zmiany.
  6. Po przypisaniu numerów i lokalizacji sortowania kliknij przyciski Napełnij płytkę w oknie dialogowym Nabierz/Dozuj, aby rozpocząć dozowanie na płytkę 96-dołkową.
    1. Przed napełnieniem całej płytki 96-dołkowej należy przeprowadzić próbne sortowanie podzbioru zwierząt lub osób kontrolnych na płytkę 96-dołkową i przeanalizować za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że posortowano odpowiednią liczbę i pożądane populacje zwierząt. Po potwierdzeniu dokładnego sortowania należy powtórzyć kroki 6.3-6.6 dla próbek doświadczalnych. Kliknij przycisk Zapisz dane na górnej wstążce w oknie oprogramowania LPS, aby ponownie zapisać dane.
      UWAGA: Wszystkie pomiary (EXT, TOF, RFP, GFP itp.) można również pobrać dla posortowanych zwierząt i porównać z tymi, które nie były sortowane. Może to pozwolić na jednoczesne uruchamianie trybów analizy i sortowania, jeśli jest to pożądane.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Definiowanie bram populacji dorosłych i larw
W tym przypadku zsynchronizowane C. elegans L1 były hodowane na płytce NGM obsianej E. coli OP50 (Eco), standardową dietą laboratoryjną. Populacje C. elegans zebrano do analizy LPS po 96 godzinach lub 120 godzinach wzrostu w temperaturze 20 °C (Rysunek 2A). Wykres punktowy wyginięcia (EXT, wskaźnik gęstości ciała) w funkcji czasu przelotu (TOF, wskaźnik długości ciała) tworzy dwie wizualnie oddzielone chmury z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wermimetria przepływowa została wykorzystana do scharakteryzowania genów i szlaków C. elegans przeciwko kolonizacji patogenów i toksyczności w kilku badaniach21,22. W tym miejscu przedstawiono podejście o wysokiej przepustowości, które wykorzystuje C. elegans do zbadania, w jaki sposób mikrobiomy jelitowe modulują fizjologię gospodarza. W porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi jednostki tworzące kolonie (CFU) lub sekwencjonowanie am...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH DP2DK116645 (dla B.S.S.), nagrodę dla pilota Fundacji Dunna oraz grant NASA 80NSSC22K0250 (dla B.S.S.). Projekt ten był również wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine z finansowaniem z CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 i RR024574) oraz pomocy Joela M. Sederstroma, a także dotacji na oprzyrządowanie dla grantu LPS NIH (S10 OD025251). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stożkowe dolne probówki wirówkowe 15 mlVWR10026-076
96 płytek głębinowych (1 ml)AxygenP-DW-11-C
96 płytek głębinowych (2 ml)AxygenP-DW-20-C
96-dołkowa płytka CostarCorning3694
AgarMillipore SigmaStandard agar bakteriologiczny jest również wystarczający
Kolektor zasysającyV& P naukoweVP1171A
WybielaczClorox
Roztwór wybielacza Wymieszaj wybielacz z 5M Podchloryn sodu 2:1 (v/v)
Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBiotekCytacja 5Bakteryjny pomiar OD
WirówkaThermo naukowy Sorvall Legend XTRDo 96-dołkowej płytki i stożkowych probówek
Mikroskop fluorescencyjnyNikonTiE
ggplot: Różne narzędzia do programowania R do wykreślania danych.Pakiet RWersja 3.3.2
Autosampler dużych cząstekPróbnik Union BiometricaLP Sortownik
dużych cząstekUnion BiometricaCOPAS Biosorter
LewamizolFisherAC187870100
Bulion lizogeniczny (LB)RPIL24066Standardowe domowe przepisy LB wykorzystujące bakto-trypton, ekstrakt drożdżowy i NaCl są również dostateczny.
Rozwiązanie M9 22 mM KH2PO4 monobasic, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Pożywka wzrostowa nicieniRPIN81800-1000.01 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 dodane po autoklawowaniu.
RStudioGNUWersja 1.3.1093
Podchloryn soduSigma-Aldrich5M
NaOH Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ745
Sterylne szalki Petriego o średnicy 10 cmCorning351029
Sterylne płytki 12-dołkoweVWR10062-894
Sterylne płytki 24-dołkoweVWR10062-896
Sterylne szalki Petriego o średnicy 6 cmCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles