Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Abstract

Skład mikrobiomu jelitowego może mieć ogromny wpływ na fizjologię gospodarza przez cały okres rozwoju i życia zwierzęcia. Pomiar zmian składu mikrobiomu ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji funkcjonalnych relacji między tymi zmianami fizjologicznymi. Caenorhabditis elegans stał się potężnym systemem gospodarza do badania molekularnych czynników wpływających na interakcje gospodarz-mikrobiom. Dzięki przezroczystemu planowi ciała i znakowanym fluorescencyjnie naturalnym mikroorganizmom, względne poziomy drobnoustrojów w mikrobiomie jelitowym pojedynczego zwierzęcia C. elegans można łatwo określić ilościowo za pomocą sortera dużych cząstek. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalnej konfiguracji mikrobiomu, zbierania i analizy populacji C. elegans na pożądanym etapie życia, obsługi i konserwacji sortera oraz analizy statystyczne uzyskanych zestawów danych. Omówiono również kwestie związane z optymalizacją ustawień sortownika w oparciu o interesujące mikroorganizmy, opracowanie skutecznych strategii bramkowania dla etapów życia C. elegans oraz sposoby wykorzystania możliwości sortera do wzbogacenia populacji zwierząt w oparciu o skład mikrobiomu jelitowego. W ramach protokołu zostaną przedstawione przykłady potencjalnych zastosowań, w tym potencjał skalowalności do aplikacji o wysokiej przepustowości.

Introduction

Ewolucja zwierząt jest pod ciągłym wpływem mikroorganizmów¹. Z różnych mikroorganizmów żyjących w środowisku, żywiciele zwierząt pozyskują określonych partnerów², którzy rozszerzają możliwości gospodarza i wpływają na jego fizjologię i podatność na choroby³. Na przykład analizy metagenomiczne mikrobiomu jelitowego ujawniły wzbogacone klasy metaboliczne genów drobnoustrojów, które mogą zapewniać większe pozyskiwanie i magazynowanie energii u otyłych myszy⁴, z których wiele znajduje się również w ludzkim mikrobiomie jelitowym⁵. Na....

Protocol

1. Przygotowanie mieszanki mikrobiomu

1. Wystempluj lub usuń bakterie z wywaru do zamrażania glicerolu na płytkę bulionu lizogennego (LB) lub odpowiednią pożywkę wzrostową i hoduj przez noc w optymalnej temperaturze w oparciu o interesujące szczepy bakterii (zwykle 25 °C dla naturalnych drobnoustrojów C. elegans).
2. Z płytki LB użyć pojedynczej kolonii z każdego izolatu bakteryjnego (np. 12 bakterii z kolekcji CeMbio) do zaszczepienia 800 μl pożywki LB w oddzielnych dołkach płytki głębinowej o pojemności 1 ml. Inkubować przez noc w optymalnej temperaturze z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
   UWAGA: Protokół ten jest zopty....

Results

Definiowanie bram populacji dorosłych i larw
W tym przypadku zsynchronizowane C. elegans L1 były hodowane na płytce NGM obsianej E. coli OP50 (Eco), standardową dietą laboratoryjną. Populacje C. elegans zebrano do analizy LPS po 96 godzinach lub 120 godzinach wzrostu w temperaturze 20 °C (Rysunek 2A). Wykres punktowy wyginięcia (EXT, wskaźnik gęstości ciała) w funkcji czasu przelotu (TOF, wskaźnik długości ciała) tworzy dwie wizualnie oddzielone chmury z.......

Discussion

Wermimetria przepływowa została wykorzystana do scharakteryzowania genów i szlaków C. elegans przeciwko kolonizacji patogenów i toksyczności w kilku badaniach^21,22. W tym miejscu przedstawiono podejście o wysokiej przepustowości, które wykorzystuje C. elegans do zbadania, w jaki sposób mikrobiomy jelitowe modulują fizjologię gospodarza. W porównaniu z istniejącymi metodami wykorzystującymi jednostki tworzące kolonie (CFU) lub sekwencjonowanie am.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stożkowe dolne probówki wirówkowe 15 ml	VWR	10026-076
96 płytek głębinowych (1 ml)	Axygen	P-DW-11-C
96 płytek głębinowych (2 ml)	Axygen	P-DW-20-C
96-dołkowa płytka Costar	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard agar bakteriologiczny jest również wystarczający
Kolektor zasysający	V& P naukowe	VP1171A
Wybielacz	Clorox
Roztwór wybielacza			Wymieszaj wybielacz z 5M Podchloryn sodu 2:1 (v/v)
Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy	Biotek	Cytacja 5	Bakteryjny pomiar OD
Wirówka	Thermo naukowy	Sorvall Legend XTR	Do 96-dołkowej płytki i stożkowych probówek
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon	TiE
ggplot: Różne narzędzia do programowania R do wykreślania danych.	Pakiet R	Wersja 3.3.2
Autosampler dużych cząstek	Próbnik Union Biometrica	LP Sortownik
dużych cząstek	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Lewamizol	Fisher	AC187870100
Bulion lizogeniczny (LB)	RPI	L24066	Standardowe domowe przepisy LB wykorzystujące bakto-trypton, ekstrakt drożdżowy i NaCl są również dostateczny.
Rozwiązanie M9			22 mM KH2PO4 monobasic, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Pożywka wzrostowa nicieni	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 dodane po autoklawowaniu.
RStudio	GNU	Wersja 1.3.1093
Podchloryn sodu	Sigma-Aldrich		5M
NaOH Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ745
Sterylne szalki Petriego o średnicy 10 cm	Corning	351029
Sterylne płytki 12-dołkowe	VWR	10062-894
Sterylne płytki 24-dołkowe	VWR	10062-896
Sterylne szalki Petriego o średnicy 6 cm	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787