Artykuł metodologiczny

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64606

⸱

16 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Streszczenie

Odwrócenie immunosupresyjnego charakteru mikrośrodowiska guza jest kluczowe dla skutecznego leczenia nowotworów za pomocą leków immunoterapeutycznych. Mysie modele raka są bardzo ograniczone pod względem różnorodności i cierpią z powodu słabego przełożenia na praktykę kliniczną. Aby służyć jako bardziej fizjologiczny model przedkliniczny dla badań nad immunoterapią, protokół ten został opracowany w celu oceny leczenia ludzkich nowotworów u myszy odtworzonej z ludzkim układem odpornościowym. Ten unikalny protokół demonstruje rozwój ludzkiego układu odpornościowego (HIS, "humanizowany") myszy, po którym następuje implantacja ludzkiego guza, ksenoprzeszczepu pochodzącego z linii komórkowej (CDX) lub ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX). Myszy HIS są generowane przez wstrzyknięcie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + wyizolowanych z krwi pępowinowej noworodkom BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) o wysokim niedoborze odporności, które są również zdolne do zaakceptowania guza ksenogenicznego. Podkreślono znaczenie kinetyki i charakterystyki rozwoju ludzkiego układu odpornościowego i implantacji nowotworu. Na koniec opisano dogłębną ocenę mikrośrodowiska guza za pomocą cytometrii przepływowej. W licznych badaniach z wykorzystaniem tego protokołu stwierdzono, że mikrośrodowisko guza poszczególnych guzów jest rekapitulowane u myszy HIS-PDX; "Gorące" guzy wykazują dużą infiltrację immunologiczną, podczas gdy "zimne" guzy nie. Model ten służy jako poligon doświadczalny dla immunoterapii skojarzonych dla szerokiego zakresu nowotworów u ludzi i stanowi ważne narzędzie w dążeniu do medycyny spersonalizowanej.

Wprowadzenie

Modele raka myszy są ważne dla ustalenia podstawowych mechanizmów wzrostu guza i ucieczki immunologicznej. Jednak badania nad leczeniem raka na modelach mysich przyniosły skończoną translację do kliniki ze względu na ograniczone modele syngeniczne i różnice specyficzne dla gatunku1,2. Pojawienie się terapii immunologicznych jako dominującego podejścia do kontroli nowotworów ponownie podkreśliło potrzebę stworzenia modelu in vivo z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym. Postępy u myszy z ludzkim układem odpornościowym (myszy HIS) w ciągu ostatniej dekady umożliwiły badanie immunoonkologii in vivo w wielu różnych typach nowotworów i środkach immunoterapeutycznych3,4,5,6. Ludzkie modele nowotworów, w tym ksenoprzeszczepy pochodzące od linii komórkowych i pacjentów (odpowiednio CDX i PDX), rosną dobrze u myszy HIS i w większości przypadków są prawie identyczne z ich wzrostem u gospodarza z niedoborem odporności, który nie ma ludzkiego wszczepienia krwiotwórczego7,8. Opierając się na tym kluczowym odkryciu, naukowcy wykorzystali mysi model HIS do badania immunoterapii u ludzi, w tym terapii skojarzonych mających na celu zmianę mikrośrodowiska guza (TME) w celu zmniejszenia immunosupresji, a tym samym zwiększenia ukierunkowanego immunologicznie zabijania guza. Te modele przedkliniczne pomagają rozwiązać problemy związane z heterogenicznością nowotworów u ludzi, a także mogą przewidywać powodzenie leczenia, a także monitorować toksyczność leków związanych z odpornością9,10.

Produkcja modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym poprzez wprowadzenie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych wymaga mysz z niedoborem odporności, która nie odrzuci ksenoprzeszczepu. Obecne mysie modele HIS pochodzą ze szczepów myszy z niedoborem odporności, które zostały zgłoszone ponad 30 lat temu. Pierwszym opisanym szczepem myszy z niedoborem odporności były myszy SCID, które nie miały limfocytów T i B11, a następnie hybrydowy NOD-SCID z polimorfizmem SIRPα odpowiedzialnym za tolerancję makrofagów myszy na komórki ludzkie, ze względu na zwiększone wiązanie allelu NOD SIRPα z ludzką cząsteczką CD4712,13. Na początku 2000 roku delecja wspólnego łańcucha gamma receptora IL-2 (IL-2Rγc) zarówno w szczepach BALB/c, jak i NOD z niedoborem odporności była przełomem dla ulepszonego wszczepienia człowieka, ze względu na delecje genetyczne uniemożliwiające rozwój komórek NK gospodarza14,15,16,17. Alternatywne modele, takie jak myszy BRG i NRG, osiągają niedobór limfocytów T i B poprzez delecję genu Rag1 lub Rag2, wymaganego do rearanżacji genów receptora komórek T i B, a tym samym dojrzewania i przeżycia limfocytów18,19. Użyta w tym artykule mysz BRGS (BALB/c -Rag2nullIl2RγCnullSirpαNOD) łączy niedobór łańcucha IL-2Rγ i allel NOD SIRPα na tle Rag2-/-, w wyniku czego mysz z wysokim niedoborem odporności bez komórek T, B lub NK, ale z wystarczającą energią i zdrowiem, aby umożliwić długotrwałe wszczepienie trwające ponad 30 tygodni13.

myszy HIS mogą być generowane na wiele sposobów, przy czym wstrzyknięcie PBMC przez człowieka jest najbardziej bezpośrednią metodą15,18,20. Jednak myszy te mają wyraźną ekspansję aktywowanych ludzkich limfocytów T, co powoduje chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) w wieku 12 tygodni, co uniemożliwia długotrwałe badania. Alternatywnie, ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste z krwi pępowinowej (CB), szpiku kostnego i wątroby płodu mogą być również wykorzystywane do wszczepienia i produkcji ludzkiego układu odpornościowego de novo. W tym systemie hematopoetyczne komórki macierzyste wytwarzają wieloliniowy ludzki układ odpornościowy z generacją T, B i wrodzonych komórek odpornościowych, które są co ważniejsze tolerancyjne wobec mysiego gospodarza, w porównaniu z myszami PBMC, które rozwijają głównie limfocyty T. W związku z tym GVHD jest nieobecny lub znacznie opóźniony, a badania można rozszerzyć na myszy w wieku do 10 miesięcy. CB zapewnia łatwe, dostępne i nieinwazyjne źródło ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+, które ułatwia wszczepienie wielu myszy HIS z genetycznie identycznym układem odpornościowym17,18,20,21. W ciągu ostatnich kilku lat mysie modele HIS były szeroko wykorzystywane do badania immunoterapii i TME3,4,5,6. Pomimo rozwoju układu odpornościowego pochodzenia ludzkiego u tych myszy, ludzkie guzy ksenoprzeszczepu rosną w podobnym tempie w porównaniu z myszami kontrolnymi z niedoborem odporności i pozwalają na złożoną interakcję między komórkami rakowymi a komórkami odpornościowymi, co jest ważne dla utrzymania mikrośrodowiska wszczepionego PDX3,7,8. Protokół ten został wykorzystany do przeprowadzenia ponad 50 badań testujących leczenie myszy HIS-BRGS z PDX i CDX. Ważnym wnioskiem jest to, że ludzkie nowotwory u myszy HIS zachowują swoje unikalne TME, zgodnie z definicją molekularną oceny guza w stosunku do początkowej próbki pacjenta i charakterystyki nacieku immunologicznego3,22,23. Nasza grupa koncentruje się na dogłębnej ocenie HIS zarówno w narządach odpornościowych, jak i w guzie za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. W niniejszym artykule opisujemy protokół humanizacji myszy BRGS, oceny chimeryzmu, implantacji ludzkich guzów, pomiarów wzrostu guza, podawania leczenia raka oraz analizy komórek HIS za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoły IACUC #00593 i #00021). Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z Biurem Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych (OLAR), akredytowaną placówką Amerykańskiego Stowarzyszenia Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, na kampusie medycznym University of Colorado Denver Anschutz. Wszystkie próbki ludzkiej krwi pępowinowej zostały pobrane jako darowizny od dawców pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację, a zatem nie podlegają zatwierdzeniu przez komisję etyczną ds. badań klinicznych na ludziach.

UWAGA: Kompozycje wszystkich mediów i roztworów wymienionych w protokole są zawarte w Pliku Uzupełniającym 1. Rysunek 1 ilustruje ogólny protokół generowania i analizy odpowiedzi immunologicznej na nowotwory u myszy HIS-BRGS.

1. Generacja myszy HIS

  1. Hodowla myszy BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) myszy
    UWAGA: Ten szczep jest skrajnie ubogi w odporność, bez komórek T, B lub NK. Dlatego należy stosować rygorystyczne środki, aby zapobiec infekcjom oportunistycznym. Utrzymuj kolonię na diecie zawierającej trimetoprim i sulfadiazynę na przemian 2 tygodnie z normalną dietą. Utrzymuj najwyższy możliwy poziom ostrożności w pomieszczeniu mieszkalnym (np. prysznic z barierką dla osób niepełnosprawnych z ograniczonym dostępem).
    1. Utrzymuj kolonie myszy homozygotycznych BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) i BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) jako rozrodcze.
    2. Hodowla BRGSN/N×BRGB/Bw celu uzyskania szczeniąt BRGSB/N, które mają być wykorzystane jako biorcy ludzkich komórek macierzystych. W tej kolonii BRGSB/N są zdrowsze niż BRGSN/N i wszczepiają się na równoważnym poziomie (więcej niż BRG).
  2. Izolacja ludzkich komórek macierzystych CD34+ z pępowiny CB
    UWAGA: Do tej procedury nie stosuje się antybiotyków. Dlatego niezbędna jest dobra sterylna technika.
    1. Umieść stożkowy stojak na probówki o pojemności 50 ml, a także 3 stożkowe probówki o pojemności 15 ml i ~10 x 50 ml w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Spryskaj worek do pobierania krwi 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia w BSC.
    2. Obliczyć liczbę stożkowych probówek o pojemności 50 ml wymaganych do izolacji gradientu gęstości CB = objętość CB/15, zaokrąglonych w górę i do parzystej liczby probówek. Obliczyć objętość krwi na probówkę = objętość CB/liczba probówek. Ostrożnie wlej krew z worka CB do każdej stożkowej probówki; jest to maksymalnie 15 ml na probówkę. Za pomocą pipety automatycznej i pipety serologicznej o pojemności 25 ml wymieszać krew w stosunku 1:1 ze sterylnym PBS, pipetując w górę i w dół.
    3. Użyć pipetora automatycznego o niskiej prędkości i pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby powoli podsycić krew roztworem gradientu gęstości o temperaturze pokojowej (RT) 1,077 g/ml (patrz tabela materiałów) bez naruszania interfejsu. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała dna probówki. Powtórz dla wszystkich probówek. Następnie wirować przez 30 minut przy 850 x g, bez hamowania, w temperaturze pokojowej, aby zapewnić utrzymanie gradientu gęstości.
    4. Wizualizuj komórkową sierść kożuchową na gradiencie gęstości 1,077 g / ml jako mętną białą warstwę. Usunąć i wyrzucić warstwę osocza do około 10 ml powyżej kożucha za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i pipetora automatycznego.
    5. Zebrać kożuszek za pomocą sterylnego transferu lub pipety serologicznej. Użyj pipety jak szpatułki, aby zeskrobać komórki z boku stożkowej rurki, jednocześnie zwalniając bańkę (lub powoli pipetując), aby wyciągnąć komórki do góry. Połącz kożuchy z dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml w jedną nową stożkową rurkę o pojemności 50 ml.
    6. Umyj komórki, wlewając 45 ml sterylnego HBSS zawierającego 2% FBS do każdej stożkowej probówki. Wirować przez 11 minut przy 360 x g przy wilgotności względnej.
    7. Zassać media płuczące do granulatu we wszystkich probówkach. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pipety automatycznej ponownie zawiesić pierwsze osadki w 10 ml HBSS zawierającej 2% FBS. Ponownie zawiesić każdą osadkę w tych samych 10 ml HBSS i przepłukać każdą probówkę dodatkowymi 10 ml HBSS, aby zebrać wszystkie komórki do jednej probówki.
    8. Wlać 45 ml sterylnego HBSS zawierającego 2% FBS do stożkowej probówki. Wirować przez 10 minut przy 360 x g, w temperaturze 4 °C.
    9. Zassać bufor płuczący do osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad w 20 ml bufora magnetycznego separatora komórek (patrz Tabela materiałów). Usunąć małą porcję, aby policzyć komórki za pomocą hemacytometru w rozcieńczeniu 1:20 w błękitu metylenowego. Dodaj liczbę niebieskich i białych komórek. Wirować przy 360 x g, przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje technologię kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów). Protokół może być modyfikowany do użytku z dowolną technologią separacji komórek, przy wystarczającej czystości i wydajności komórek macierzystych CD34+.
    10. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek CD34+ wyizolowany z krwi pępowinowej w 300 μl buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek. Najpierw dodaj 100 μl odczynnika blokującego FcR, a następnie 100 μl kulek magnetycznych CD34+ na 1 x10 8 komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut (bez lodu).
    11. Dodać 5 ml buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek i wirować w temperaturze 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu magnetycznego separatora komórek na 1 x 108 komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej jako "niefrakcjonowana".
    12. Oznacz jeszcze dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml "CD34-" i "CD34+". Umieść trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml (niefrakcjonowane, CD34- i CD34+) w szczelinach A1, B1 i C1 odpowiednio na stojaku chłodzącym (patrz tabela materiałów). Rozdzielić ogniwa za pomocą dwukolumnowego programu selekcji pozytywnej na automatycznym magnetycznym separatorze ogniw (patrz Tabela materiałów) w BSC, zgodnie z instrukcjami producenta przyrządu.
  3. Namnażanie i zamrażanie ludzkich komórek macierzystych CD34+
    1. Podniec 10 μl odzyskanej zawiesiny komórek CD34+ (2 ml) na szkiełku hemocytometrycznym i policzyć komórki pod 10-krotnym powiększeniem. Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34+, mnożąc liczbę komórek przez 2 x 104. Podziel całkowitą liczbę komórek CD34+ przez 250 000, aby obliczyć liczbę fiolek do zamrożenia (50 000 komórek na młode myszy przed ekspansją in vitro).
    2. Przygotować pożywkę CB Iscove's 10% FCS (plus 1 ml ekstra do utraty filtracji), uzupełnioną czynnikiem komórek macierzystych 40 ng/mL, 20 ng/ml Flt3L i 10 ng/ml IL-6 i przepuścić przez filtr 0,22 μm. Ponownie zawiesić komórki CD34+ w stężeniu 100 000 na ml pożywki CB i inkubować w temperaturze 37 °C. W dniu 3 dodać równoważną objętość pożywki CB bez cytokin do kolby zawierającej komórki i pożywki CB z cytokinami.
      UWAGA: Dodanie tych cytokin do pożywki CB sprzyja przetrwaniu i ekspansji komórek CD34 +, jednocześnie zapobiegając różnicowaniu.
    3. Zbierz rozszerzone komórki CD34+ w 5 dniu. Odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dodać tyle podłoża CB, aby pokryć dno kolby. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać całe dno kolby. Zebrać wszystkie podłoża do tej samej probówki o pojemności 50 ml i wirować przy 360 x g przez 11 minut.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki CB. Ostatnią kroplę z pipety należy zapisać na 96-dołkowej płytce w celu zliczenia. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:1 w błękitu trypanowym i dodać 10 μl do hemacytometru, a następnie policzyć i uśrednić komórki z czterech ćwiartek. Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34 +, mnożąc liczbę komórek przez 4 x 104 i zapisz żywotność.
    5. Przygotować n+1 ml pożywki do zamrażania, gdzie n jest liczbą fiolek do zamrażania obliczoną w kroku 1.3.1. Przygotuj pożywkę do zamrażania, dodając 10% (v/v) DMSO do FBS i trzymaj na lodzie. Oznacz kriowiale CB#, CD34+ d5 i datą.
    6. Odwiruj komórki CD34+ w temperaturze 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zassać pożywkę do osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu zamrażającym. Podać podaniec 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej fiolki i równomiernie podzielić pozostałą ilość między fiolki. Dodać fiolki do zamrażarki izopropanolowej schłodzonej do temperatury 4 °C, umieścić w temperaturze -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w celu przechowywania przez >90 dni.
  4. Napromienianie szczeniąt myszy
    1. Zbierz młode BRGSB/N 1-3 dni po urodzeniu do autoklawowanego plastikowego pudełka z wyściółką. Dodaj niewielką ilość ściółki ze szczeniętami. Oznacz pudełko numerem klatki i liczbą szczeniąt.
    2. Ustaw naświetlacz (patrz Tabela materiałów) na dawkę 300 rad. Umieść pudełko szczeniąt w naświetlaczu i wystaw je na działanie 300 rad. Zabierz szczenięta z powrotem do klatki, umieść je w stosie i przykryj ściółką.
  5. Iniekcje dla szczeniąt i preparatyka komórek CD34+
    1. Przygotowanie komórek CD34+ rozpocząć ~3 godziny po napromieniowaniu. Podgrzej 10 ml pożywki CB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym BSC.
    2. Pobrać jedną fiolkę z rozszerzonymi i zamrożonymi komórkami CD34 + in vitro na każde cztery do sześciu szczeniąt do wstrzyknięcia. Szybko rozmrozić w temperaturze 55 °C, aż będzie widoczna niewielka ilość lodu, a następnie dodać komórki do podgrzanej pożywki CB (fiolka powinna być nadal chłodna w dotyku). Użyć 1 ml pożywki do przepłukania każdej fiolki i wirowania komórek w temperaturze 360 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Stwierdzono, że szybkie rozmrażanie w temperaturze 55 °C zapewnia lepszą żywotność komórek (90%-95%) niż rozmrażanie w temperaturze 37 °C.
    3. Ostrożnie zassać pożywkę. Zawiesić (mały) osad w 2 ml pożywki CB, delikatnie wymieszać i dodać ~30 μl zawiesiny komórek do jednego dołka na płytce liczącej. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 w błękitu trypanowym, następnie dodać 10 μl do hemocytometru i policzyć i uśrednić komórki z czterech ćwiartek.
    4. Oblicz całkowitą liczbę komórek CD34+, mnożąc liczbę komórek przez 4 x 104, a następnie zapisz żywotność. Wirować w temperaturze 360 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl sterylnego PBS na n + 1 młode do wstrzyknięcia, co daje 250 000-450 000 komórek CD34 + na mysz. Umieść stożkową rurkę na lodzie w pojemniku transportowym i udaj się do wiwarium w celu wstrzyknięcia szczeniąt.
    6. Do wiwarium BSC należy przynieść lampę grzewczą, pieluchy, strzykawkę 1 ml, igłę 18 g, igłę 30 g oraz preparat komórkowy CD34+ w sterylnych pojemnikach. Umieść sterylną pieluchę ~ 2 stopy pod lampą grzewczą. Wyjmij klatkę ze ściółką, która ma zostać wstrzyknięta i umieść ją w BSC.
    7. Złożyć strzykawkę z igłą ze skosem 18 G. Dopasowując kąt rurki stożkowej do skosu igły, delikatnie wymieszaj i wciągnij zawiesinę komórkową. Umieść szczenięta na pieluszce, aby się rozgrzały (uważaj, czy się nie przegrzeje). Usunąć powietrze ze strzykawki i zastąpić igłę 18 G igłą 30 G, a następnie ostrożnie wcisnąć strzykawkę, aż zawiesina komórek znajdzie się tuż przy końcówce igły.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć strzykawki insulinowej.
    8. Zabieraj jednego szczeniaka na raz na krawędź pieluszki z dala od lampy grzewczej. Unieruchamiaj szczeniaka na boku pod kciukiem i palcem wskazującym, aby uzyskać wyraźny widok twarzy. Zwróć uwagę na żyłę w poprzek policzka pod miejscem, w którym będzie ucho. Wbić igłę płytko do żyły (IV) znajdującej się najbliżej oka i powoli wstrzyknąć 50 μl komórek.
    9. Sprawdź, czy po wstrzyknięciu podskórnym nie tworzy się pęcherzyk. Jeśli tak, wbij igłę głębiej i przystąp do wstrzykiwania komórek. Po pomyślnym zakończeniu będzie widoczna niewielka kropla krwi/krwiak.
      UWAGA: Zapoznaj się z procedurą Gombash Lampe et al.24 dotyczącą wstrzykiwania pup.
    10. Gdy szczenię jest nadal unieruchomione, wykonaj wstrzyknięcie dowątrobowe (IH) z kolejnymi 50 μl komórek (łącznie 100 μl na młode IV+IH). Wątrobę można uwidocznić jako ciemną plamę między białym pasmem mleka a klatką piersiową. Umieść szczenię, któremu wstrzyknięto zastrzyk, na pieluszce z dala od szczeniąt, którym nie wstrzyknięto iniekcji i podgrzej.
      UWAGA: Wstrzyknięcie dożylne powoduje lepszy długoterminowy chimeryzm niż samo wstrzyknięcie IH25, ale wstrzyknięcia dożylne nie zawsze są skuteczne. Dlatego podzielenie wstrzyknięcia między IV i IH zapewnia wszczepienie do większego odsetka myszy.
    11. Powtórz zarówno wstrzyknięcia do żyły twarzowej, jak i IH dla wszystkich szczeniąt. Oczyść krew, przywróć młode do gniazda w klatce i przykryj ściółką.

2. Testowanie ludzkiego chimeryzmu we krwi

  1. Przetestuj chimeryzm we krwi myszy HIS zarówno w wieku 10, jak i 14 tygodni. Pobrać 50 μl krwi przez żyłę zaoczodołową lub przy użyciu alternatywnej metody zatwierdzonej przez IACUC.
    1. W przypadku krwawień zaoczodołowych znieczulenie myszy za pomocą parownika izofluranowego ustawionego na 5 przez 1-2 minuty, a następnie zmniejsz ustawienie parownika na 4. W razie potrzeby zmniejsz działanie waporyzatora, aby myszy pozostały wystarczająco dotlenione pod narkozą. Nie należy trzymać myszy pod izofluranem dłużej niż 5 minut.
    2. Umieść nos znieczulonej myszy w stożku nosowym waporyzatora izofluranu i umieść kroplę środka przeciwbólowego (0,5% proparakainy HCl roztwór okulistyczny USP) na oko.
    3. Po 1 minucie usuń proparakainę za pomocą sterylnej gazy, przeszukaj oko i włóż 75 mm heparynizowaną rurkę hematokrytu za orbitą, aby pobrać 50 μl krwi. Wyrzuć krew do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl heparyny i delikatnie wymieszaj.
    4. Ściśnij oko sterylną gazą, aby zatrzymać krwawienie i nałóż kroplę proparakainy. Usuń mysz z izofluranu i odzyskaj ją w czystej klatce.
  2. Izolacja PBMC z krwi myszy
    1. Wymieszaj krew/heparynę, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie powoli nałóż na 500 μl gradientu gęstości 1,077 g/ml, uważając, aby nie zakłócić interfejsu. Odwirować probówki o stężeniu 1 220 x g przez 20 minut przy suchej temperaturze bez hamulców.
    2. Wyobraź sobie komórkową powłokę kożuchową jako mętną warstwę na szczycie gradientu gęstości 1,077 g / ml, poniżej osocza. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl należy usunąć jak najwięcej komórek z kożuchowca i dodać do nowych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 750 μl pożywki do pożywki. Wirować przy 360 x g przez 11 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zassać pożywkę do 50 μl i ponownie zawiesić granulat w 750 μl pożywki do zbioru. Wirować przy 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zassać do 50 μl. Komórki są gotowe do ponownego zawieszenia w barwieniu powierzchniowym.
  3. Barwienie powierzchni i analiza cytometrii przepływowej
    1. Wypełnij arkusz panelu barwienia (Tabela 1; arkusz roboczy "panel upustu przepływu spektralnego") liczbami myszy i przygotuj koktajl barwienia przeciwciał, dodając wszystkie przeciwciała fluorescencyjne do buforu barwiącego (plik uzupełniający 1). Wykonaj układ płytek, aby dodać próbki do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Zaznacz dna studni za pomocą markera permanentnego. Przed barwieniem miareczkować przeciwciała przy użyciu standardowej procedury, aby określić odpowiednie stężenie26.
    2. Dodać 62 μl koktajlu barwienia powierzchniowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U. Zawiesić ponownie komórki w 50 μl pozostałych w probówce i dodać każdą próbkę do odpowiedniego dołka. Dołączyć studzienkę do pozytywnej kontroli barwienia (ludzkie PBMC + mysie splenocyty, 1 x 106 komórek każdy) do barwienia wraz z próbkami. Wymieszać pipetując i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Wirować przy 680 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Wyjąć płytkę do zlewu, aby usunąć supernatant i umyć komórki, ponownie zawieszając w 150 μl buforu barwiącego, delikatnie pipetując ~10x. Odwirować i ponownie zawiesić każdą studzienkę w 150 μl buforu barwiącego.
    4. Pobrać dane dla 100 μl każdej próbki na cytometrze przepływowym (patrz tabela materiałów) i wyeksportować pliki .fcs. Zaimportuj pliki .fcs do oprogramowania do edycji danych przepływu (patrz Spis materiałów). Zastosuj bramkę wielokątną do wykresu FSC-A x SSC-A otaczającego komórki, z wyłączeniem wszelkich zanieczyszczeń. Zaznacz komórki w bramce (patrz Tabela 1; arkusz "bramkowanie upustu przepływu spektralnego").
    5. Zmień osie na (FSC-A x FSC-H) i bramkują komórki zawarte na przekątnej liniowej, z wyłączeniem dubletów wystających z linii. Zaznacz te komórki i zmień osie na (hCD45 x mCD45).
    6. Zastosuj bramkę wielokątną do populacji hCD45+ i zastosuj nazwę "człowiek". Zastosuj bramkę wielokątną do populacji mCD45+ i zastosuj nazwę "mysz". Utwórz statystykę liczebności zarówno dla populacji ludzi, jak i myszy.
    7. Wybierz populację ludzką i zmień osie na (CD19 x CD3). Zastosuj bramkę wielokątną do komórek CD19+ i nazwij ją "komórkami B". Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD3+ i nazwij ją "limfocyty T". Zastosuj bramkę wielokątną do populacji podwójnie ujemnej i nadaj jej nazwę "NonTB".
    8. Wybierz populację limfocytów T i zmień osie na (CD8 x CD4). Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD4 i CD8 dodatnich i nazwij je odpowiednio "CD4+" i "CD8+".
    9. Wybierz populację bez gruźlicy i zmień osie na (CD56 x szpik). Zastosuj bramkę wielokątną do całkowitej populacji CD56 dodatniej, w tym zdarzeń podwójnie dodatnich, i nazwij ją "komórkami NK". Zastosuj bramkę wielokątną do populacji CD56 ujemnej i mieloidalnej dodatniej i nazwij ją "szpikulową".
    10. Utwórz tabelę dla statystyk procentowych i liczbowych wszystkich populacji i wyeksportuj ją do arkusza kalkulacyjnego (patrz Spis materiałów). Oblicz chimeryzm %hCD45 = %hCD45/(%hCD45 + mCD45).
    11. Wyklucz myszy HIS, które mają <20% hCD45+ (z mCD45 + hCD45) do dalszych eksperymentów.
      UWAGA: W tym badaniu PBMC przygotowano przy użyciu separacji gradientu gęstości 1,077 g / ml w celu czystszego zubożenia RBC. Procedura ta wykluczyła granulocyty ludzkie i mysie z warstwy PBMC. Alternatywnie można zastosować lizę RBC.

3. Wstrzykiwanie guzów myszom

  1. Przed wstrzyknięciem guza potwierdź liczbę limfocytów T z danych dotyczących krwawienia z 14 tygodnia. Guzy są wstrzykiwane, aby były gotowe do zbioru między 20-26 tygodniem, jeśli limfocyty T stanowią >20%, i między 24-28 tygodniem, jeśli limfocyty T stanowią <20% całkowitej populacji komórek odpornościowych. Ten czas wstrzyknięcia zapewnia, że myszy są w wieku 20-28 tygodni i mają wystarczającą liczbę limfocytów T pod koniec badania.
  2. Iniekcja ksenoprzeszczepów pochodzących z linii komórkowych (CDX)
    UWAGA: Procedura jest opisana na przykładzie komórek gruczolakoraka piersi MDA-MB-231 (patrz tabela materiałów).
    1. Rozmrozić porcję zamrożonych komórek, przemyć 1x przez ponowne zawieszenie w 10 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% PenStrep i 1% aminokwasów endogennych i odwirować przy 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić w 10 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% PenStrep i 1% aminokwasów endogennych w kolbie T25 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Linie komórkowe są uwierzytelniane metodą PCR, aby zapewnić prawidłowy typ komórki. Supernatanty komórkowe są testowane na obecność mykoplazmy za pomocą testu biochemicznego przed wstrzyknięciem.
    2. Pasaż i rozszerzanie komórek podczas fazy wzrostu wykładniczego przy około 80% konfluencji.
      1. Odessać pożywkę, przepłukać komórki 5-10 ml sterylnego PBS (pH 7,2) i inkubować z 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 1-5 minut, aż komórki oderwą się od kolby.
      2. Dodaj 5 ml tego samego DMEM i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieść całe 6 ml zawiesiny komórkowej do nowej kolby T75 poddanej działaniu kultury tkankowej (rozcieńczenie 1:3) i dodać dodatkowe 10 ml DMEM.
      3. Pasaż komórek co 2-3 dni przy 80% zbiegu przy rozcieńczaniu 1:3 w DMEM, aby rozszerzyć komórki.
    3. Zbierz komórki z 0,25% trypsyną-EDTA w fazie wzrostu wykładniczego w ciągu sześciu pasaży i przemyj PBS. Wymieszać PBS i ekstrakt z błony podstawnej (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1 i dodać do komórek w końcowym stężeniu 5 x 107 komórek/ml.
    4. Znieczulić myszy izofluranem zgodnie z opisem w kroku 2.1.1. Podskórnie wstrzyknąć 100 μl (5 x 106 komórek) zawiesiny komórek nowotworowych do każdego boku za pomocą igły 23 G.
  3. Wykonać iniekcję ksenoprzeszczepów pobranych od pacjenta (PDX) za pomocą trokarów. Procedura wstrzykiwania oraz inne instrukcje dotyczące rozwoju i konserwacji modelu PDX są dostępne w literaturze27.

4. Pomiar wzrostu guza

  1. Sprawdzaj postęp guza raz w tygodniu po implantacji, wyczuwając wzdłuż boku wzrost guza. Gdy guzy są wyczuwalne, znieczulij myszy izofluranem (jak opisano w kroku 2.1.1) i ogol każdy bok za pomocą elektrycznego trymera, uważając, aby zapobiec owrzodzeniom w miarę wzrostu guza.
    UWAGA: Myszy można golić przed wstrzyknięciem guza, aby zapobiec urazom skóry wokół guzów; Jednak tempo odrastania włosów może utrudniać pomiary guza.
  2. Mierz długość i szerokość guzów dwa razy w tygodniu za pomocą suwmiarki i zapisuj pomiary w mm. Zgłaszaj pomiary guza jako objętość guza (mm3) za pomocą wzoru figure-protocol-1. Należy uważać, aby obciążenie guza nie przekroczyło 2 000 mm3 na pojedynczy guz lub łączną objętość 3 000 mm3,
    UWAGA: Wytyczne dotyczące wykorzystania myszy w badaniach nad rakiem różnią się w zależności od lokalizacji. Proszę zapoznać się z zasadami opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w instytucji badacza.

5. Leczenie farmakologiczne

  1. Przydziel myszy HIS do równoważnych grup leczenia w oparciu o chimeryzm hCD45, chimeryzm hCD3 i chimeryzm hCD8. Gdy guzy osiągną średnio 100 mm3 należy rozpocząć leczenie farmakologiczne.
    UWAGA: Liczba myszy w grupie jest oparta na liczbie myszy HIS wygenerowanych z CB. Zalecane są co najmniej cztery myszy na grupę. Niedwudzielne dopasowywanie wielogrupowe (np. w oprogramowaniu R-vivo Manila) jest przydatne dla tego grupowania28.
  2. Droga i częstotliwość zażywania narkotyków
    1. Inhibitory anty-PD-1 (niwolumab, pembrolizumab) należy wstrzykiwać dootrzewnowo (i.p.) w dawce 30 mg/kg mc. 1 x w tygodniu lub 20 mg/kg 2 razy w tygodniu w przypadku pojedynczych zabiegów lub 10-15 mg/kg 2 razy w tygodniu w przypadku leczenia skojarzonego.
    2. Dawkować terapie skojarzone, takie jak terapie celowane, chemioterapia i napromienianie, zgodnie z projektem eksperymentalnym. Terapie celowane i chemioterapia mogą być podawane przez zgłębnik doustny, i.p. iniekcję lub żywność.
      UWAGA: Dawki mogą być zmieniane i optymalizowane zgodnie z opublikowanymi danymi i modelem guza. Badania dawek są często testowane na biorcach z niedoborem odporności przed badaniami HIS na myszach.
  3. Monitoruj myszy co najmniej 3 razy w tygodniu pod kątem zmian zdrowotnych, takich jak utrata wagi, luźny kał, zgarbiona postawa, zmniejszona mobilność i utrata sierści. Niektóre objawy mogą być oznakami zatrucia lekami lub GVHD, a dawkowanie leku może wymagać zmniejszenia lub zaprzestania. Uśpij myszy w razie potrzeby zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami i ich użytkowania.

6. Pobieranie tkanek i guzów myszy na koniec badania

  1. Eutanazja myszy pojedynczo zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i weterynaryjnymi przy użyciu sprężonego gazu CO2 o natężeniu przepływu 2,75 l / min. Monitoruj myszy trzymane w CO2 przez 1 minutę po śmierci, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną formę eutanazji.
  2. Pobieranie krwi
    1. Pobrać krew przez nakłucie dosercowe. Trzymaj mysz w pozycji pionowej i włóż strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 25 G bezpośrednio do serca z linii tuż po lewej stronie linii środkowej i poniżej żeber. Zebrać krew do strzykawki, najlepiej przez jeden długi pobór i przenieść do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Można wykonać dodatkowe wkłucia igły, aby ostrożnie pobrać dodatkową krew z kącików jamy płuc
      2. .
    2. Pozostawić krew w temperaturze 4 °C na 1 godzinę, a następnie odwirować krew w mikrowirówce przez 6 minut przy 7 800 x g. Zebrać klarowny płyn (surowice) powyżej granicy faz krwi do drugiej czystej i oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać surowicę w temperaturze -20 °C do dalszej analizy, takiej jak miana cytokin zapalnych lub immunoglobulin u ludzi i myszy.
  3. Sekcja tkanek
    1. Po wstrzyknięciu i wzroście komórek nowotworowych u myszy oraz podaniu leczenia farmakologicznego, należy pobrać tkanki. Umieść myszy na piankowej desce do preparacji, z kołkami do przytrzymywania ich na miejscu, a ręce i nogi wyprostuj pod kątem 45°. Wykonaj nacięcie na środku tułowia, zaczynając w pobliżu miednicy i rozciągając się do podbródka, starając się uniknąć przecięcia otrzewnej (chociaż nie jest to konieczne). Pociągnij skórę do krawędzi i przytrzymaj na miejscu za pomocą szpilek.
    2. Usuń węzły chłonne (LN) za pomocą cienkich kleszczy w następującej kolejności: pachwinowa, pachowa, szyjna, krezkowa, rozworowa przełykowa.
      UWAGA: U myszy HIS LN są często bardzo małe, przypominające anlage lub "w stanie zapalnym" z wyraźnym wyglądem niepodobnym do myszy typu dzikiego. Dlatego z każdego miejsca pobiera się tkankę przypominającą LN. Obwodowe LN często pojawiają się jako wypełnione płynem "kulki", podczas gdy LN krezkowe są bardziej gęste. LN krezkowe są najbardziej oczywiste i spójne i są obserwowane jako jeden lub dwa odrębne gęstsze węzły, w przeciwieństwie do ciągu.
    3. Umieścić LN po jednej stronie szkiełek z matowego szkła w 8 ml pożywki do zbioru na szalce Petriego. Trzymając szkiełka pod prostopadłymi kątami z matowymi krawędziami do wewnątrz, delikatnie dociśnij tkanki, aż zawartość komórkowa zostanie uwolniona.
    4. Przepłucz szkiełka kilka razy, rozsuwając je i łącząc ze sobą, aby uwolnić maksymalną ilość komórek. Zbierz komórki za pomocą szklanej pipety o średnicy 5 cali i przefiltruj je przez 9-calową pipetę z bawełnianą zatyczką do oznaczonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Usuń śledzionę z lewej górnej części brzucha za pomocą dwóch par kleszczy lub kleszczy i nożyczek. Zwróć uwagę na wielkość śledziony jako oszacowanie objętości pożywki do refuzji. Zebrać i przefiltrować śledzionę przez trawienie mechaniczne za pomocą szkiełek z matowego szkła, tak jak w przypadku LNs.
      UWAGA: Można zastosować dowolną technikę przygotowania tkanek do zawiesin pojedynczych komórek.
    6. Przeprowadzić liczenie i ponowne zawieszenie komórek z próbek tkanek w sposób opisany poniżej.
      1. Odwirować komórki limfatyczne przy 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać ciecz i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z DNazą.
      2. Usunąć erytrocyty z komórek śledziony przez inkubację z 3 ml buforu do lizy ACK w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie dodanie 10 ml pożywki do pożywki/DNazy. Ponownie odwirować komórki śledziony, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-10 ml pożywki do pobierania/DNazy, w zależności od wielkości śledziony (np. 1 ml dla bardzo małych śledzion i do 10 ml dla największych śledzion).
      3. Dodać 10 μl podwielokrotności zawiesiny komórek do 90 μl pożywki i policzyć za pomocą hemocytometru. Odwirować LN i komórki śledziony, odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w pożywce do pobierania w stężeniu 1 x 108 komórek/ml lub minimum 80 μl.
    7. Wyodrębnij guzy.
      1. Usuń guz z otwartego boku, przytrzymując guz kleszczami, jednocześnie powoli tnąc brzegi guza nożyczkami do preparacji.
      2. Po usunięciu guza zważ go i usuń 1/4 w celu przetworzenia RNA i immunohistochemii (IHC). Podziel 1/4 guza na pół; umieścić jedną połowę (1/8 całego guza) w kriowiale, błyskawicznie zamrozić w płynie N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych badań genomicznych.
      3. Umieść drugą 1/8 guza w oznakowanej probówce zawierającej 10% formaliny. Następnego dnia spłucz i ponownie wymieszaj tkankę w 70% etanolu do przyszłego użycia. Pozostałe 3/4 guza umieścić w naczyniu o średnicy 6 cm i zmielić na kawałki o średnicy ~1 mm za pomocą ostrza skalpela.
      4. Przetransportować kawałki guza do probówki dysocjacyjnej (patrz Tabela materiałów), przepłukać naczynie 5 ml niekompletnego podłoża leukocytów naciekających guz (TIL) i dodać do probówki dysocjacyjnej.
        UWAGA: W przypadku guzów o masie >0,4 g należy przepłukać naczynie 10 ml niekompletnego podłoża TIL i dodać do probówki dysocjującej.
      5. Dodać preparat kolagenazy (patrz tabela materiałów) w końcowym stężeniu 50 mg/ml do tkanki w probówce dysocjacyjnej. Dysocjację tkanki należy przeprowadzić za pomocą dysocjacji mechanicznej w temperaturze 37 °C przez 30 minut do 1 godziny, w zależności od twardości guza.
      6. Po dysocjacji przepuścić zawiesinę przez filtr 100 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i przepłukać filtr 10 ml kompletnej pożywki TIL. Surowica zawarta w tym pożywce zatrzyma reakcję kolagenazy i ochroni komórki przed dalszą degradacją.
      7. Zawiesinę jednokomórkową należy odwirować przy ciśnieniu 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w wystarczającej ilości podłoża do zbioru z DNazą, tak aby zawiesina komórek mogła łatwo przejść przez końcówkę pipety P1000 i zarejestrować objętość do dalszej analizy.
        UWAGA: Mniejsza objętość zwiększa gromadzenie się komórek odpornościowych guza, ale jest bardziej podatna na zatkanie cytometru przepływowego.

7. Barwienie komórek i analizy cytometryczne przepływowe

  1. Przygotowanie bejc i powlekanie komórek
    1. Przygotuj koktajle barwiące: W dniu zbiorów dodaj liczbę próbek do arkusza barwienia (Tabela 2; arkusze "Panel Konwencjonalny przepływ A", "Panel Spectral Flow B" i "Panel Konwencjonalny przepływ C") dla wszystkich plam i wydruku. Przygotuj koktajle barwienia powierzchniowego dla plam A i B w buforze barwiącym (SB), dodając każde przeciwciało indywidualnie z nową końcówką, zaznaczając każdy odczynnik w drodze i przechowując w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie potrzebny. Przygotować odpowiednie barwniki żywotności w PBS bez azydków i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich użycia (przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej). Przygotuj koktajl barwienia powierzchniowego C w dniu 2 w SB wraz z wewnątrzkomórkowymi plamami B i C w odpowiednich przepuszczalnych.
    2. Utwórz układ płytek dla wszystkich próbek w arkuszu barwienia i przekaż 100 μl PBS bez azydku do studzienek. Dołącz niebarwione kontrole dla każdej tkanki i barwienia (dla cytometrii spektralnej).
    3. Dodać komórki do 96-dołkowych płytek zawierających 50 μl PBS. W przypadku barwienia A zawiesić ponownie każdą grupę tkanek w odpowiedniej objętości, zgodnie z zapisem w karcie barwienia, i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu pobrania na cytometrze przepływowym tego samego dnia. W przypadku barwień B i C dodać 25 μl limfy i 60 μl zawiesin komórek tkanki nielimfatycznej do studzienek z PBS.
    4. Przeprowadzić stymulację in vitro cytokin w celu wykrycia przez barwienie wewnątrzkomórkowe za pomocą barwnika C.
      1. Odwirować 96-dołkową płytkę barwiającą C z kroku 7.1.3 przy 680 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Dodać 200 μl kompletnej pożywki TIL (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10% FBS) do każdej studzienki. Przechowywać płytkę z zawiesiną komórek w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. Wczesnym rankiem następnego dnia rozcieńczyć koktajl stymulacji komórek (patrz Tabela Materiałów) w stosunku 1:500 w kompletnych pożywkach TIL. Odwirować płytkę zawierającą zawiesinę komórek o stężeniu 680 x g, aby osadzać komórki i strzepnąć w celu usunięcia pożywki. Zawiesić komórki w 200 μl przygotowanego koktajlu stymulującego komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      3. Dodać 25 μl roztworu inhibitora transportu białek zawierającego monenzynę w rozcieńczeniu 1:1 000 w kompletnych pożywkach TIL, wymieszać komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 4 godziny, aby umożliwić wewnątrzkomórkową akumulację cytokin.
    5. Wykonaj barwienie komórek.
      1. W przypadku barwienia A i B (dzień 1) oraz barwienia C (dzień 2) odwirować przy 680 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przesunąć płytki i dodać do studzienek odpowiednie barwniki żywotności. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Odwirować płytki (jak w kroku 7.1.5.1), następnie dodać odpowiednie plamy powierzchniowe do płytek i delikatnie wymieszać, pipetując pipetą wielokanałową. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ponownie odwirować. Trzepotać płytki, umyć komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą 150 μl SB i odwirować.
      3. Przetrzeć płytki, powtórzyć mycie, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą 150 μl SB i odwirować przy 680 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. W przypadku barwienia A zawiesić ponownie każdą grupę tkanek w odpowiedniej objętości, zgodnie z zapisem w karcie barwienia, i przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku barwienia B utrwalić za pomocą utrwalacza czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (patrz tabela materiałów) przez 30 minut w RT. W przypadku barwienia C utrwalić 1% (v/v) paraformaldehydu w SB przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Odwirować zamocowane na stałe płytki o sile 480 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przemyć 1x w SB. W przypadku plamy B komórki można pozostawić na noc.
      5. Przepuszczalność komórek: ponownie zawiesić studzienki w 150 μl zestawu czynników transkrypcyjnych FoxP3 buforu permeabilizacyjnego dla barwienia B i 0,5% (w/v) saponiny w SB dla barwienia C. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować utrwalone płytki przy 480 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Przesuń płytki i dodaj odpowiednie wewnątrzkomórkowe koktajle barwiące dla barwienia B i barwienia C. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Odwirować zamocowane na stałe płytki o masie 480 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i przetrzeć płytki. Przemyć komórki 150 μl odpowiednich permeabilizacji (barwnik B, zestaw czynników transkrypcyjnych FoxP3, bufor permeabilizacyjny; barwnik C, saponina).
      8. Trzepocz płytki i umyj je pipetując w górę i w dół w 150 μl SB. Wirować przy 480 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przesunąć płytki i ponownie zawiesić komórki w SB według grup tkanek w odpowiednich objętościach podanych w arkuszu barwienia.
        UWAGA: Próbki są teraz gotowe do pobrania za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej.
      9. Ustawić cytometr przepływowy (patrz tabela materiałów) z odpowiednimi pojedynczymi barwionymi próbkami kontrolnymi dla każdej barwie i niebarwionymi próbkami dla każdej grupy tkanek, aby uwzględnić różnice w autofluorescencji podczas odmieszania. Uzyskaj odpowiednie objętości dla każdej grupy tkanek, jak zdefiniowano w arkuszu barwienia (Tabela 2) i wyeksportuj pliki .fcs.
  2. Analiza danych cytometrii przepływowej
    1. Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów), utwórz nową przestrzeń roboczą. Utwórz nowe grupy dla każdego narządu (LN, śledziony i TIL). Zaimportuj pliki .fcs dla każdego narządu do grupy.
    2. Utwórz dwuwymiarowy wykres punktowy, ustaw osie na (FSC-A x SSC-A) i zastosuj bramkę wielokątną do zdarzeń komórkowych, unikając zdarzeń na krawędziach (bramka wszystkich komórek). Wybierz zdarzenia komórkowe, zmień osie na (FSC-A x FSC-H) i zastosuj bramkę wielokątną do zdarzeń na przekątnej liniowej, wykluczając zdarzenia, które odbiegają od przekątnej, aby wygenerować bramkę "singletową". Wybierz bramkę "singlets" i zmień osie na (hCD45 x mCD45). Zastosuj bramki wielokątne do pozytywnych zdarzeń hCD45 i mCD45 i nazwij je odpowiednio "człowiek" i "mysz".
    3. Wybierz populację ludzką i zmień oś Y na Żywą/Martwą Wodę. Zastosuj bramkę wielokątną do żywej/martwej populacji ujemnej, hCD45 dodatniej i nazwij ją "żywy człowiek". Wybierz populację myszy i zmień oś X na Żywa/Martwa Woda. Zastosuj bramkę wielokątną do populacji Live/Dead ujemnej, mCD45 dodatniej i nazwij ją "żywa mysz".
    4. W podobny sposób wybierz bramkę nadrzędną oraz osie X i Y, jak opisano w arkuszach "Bramkowanie konwencjonalnym przepływem A", "Bramkowanie przepływem widmowym B" i "Bramkowanie konwencjonalnym przepływem C" (Tabela 2), aby wyizolować wskazane populacje (np. ludzkie limfocyty B, aktywowane limfocyty T).
      UWAGA: Reprezentatywne bramkowanie dla każdej plamy (, A, B, C) znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
    5. Twórz tabele zliczania i eksportu częstotliwości w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej dla wszystkich populacji i eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego. Populację rodzicielską dla częstości występowania przedstawiono w Tabeli 2.
    6. Wykorzystaj te dane do wygenerowania wykresów na podstawie eksperymentalnych grup leczenia.
      UWAGA: Dane można również analizować za pomocą pakietów R w oprogramowaniu analitycznym. Pojedynczy plik .fcs ze wszystkich próbek, które mają być analizowane, można utworzyć za pomocą funkcji łączenia. Dane te można zmniejszyć wymiarowo za pomocą algorytmu T-SNE, dodając parametry słów kluczowych dla typu tkanki i grupy leczonej. Algorytm FlowSOM może być następnie używany do grupowania populacji, a narzędzie ClusterExplorer może być używane do identyfikowania populacji. W ten sposób można zidentyfikować nowe populacje komórek, porównać je wizualnie i określić ilościowo między grupami poddanymi działaniu substancji lub w różnych tkankach.
    7. Skoreluj parametry immunologiczne dla nowotworów w tej samej grupie leczonej ze wzrostem tego guza w celu zdefiniowania immunotypów, które korelują z zahamowaniem wzrostu guza. Określ ilościowo wzrost guza za pomocą specyficznej szybkości wzrostu (SGR) dla tego guza, pomiaru, który uwzględnia różnicę w objętości guza w określonym czasie. Pomiar ten normalizuje guzy pobrane w różnych dniach ze względu na stan zdrowia myszy i daty rozpoczęcia leczenia.
      figure-protocol-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem guza bocznego i eksperymentalnym harmonogramem (Rysunek 1), wzrost guza i odpowiedź immunologiczna na terapię inhibitorem kinazy tyrozynowej (TKI) i leczenie skojarzone niwolumabem były badane w dwóch różnych PDX ludzkiego raka jelita grubego (CRC). Leki TKI badano na gospodarzach z niedoborem odporności w celu oceny wzrostu guza29. Model ten umożliwił zbadanie zmian w odpowiedzi immunologicznej samego TTKI, a co ważniejsze, w połączeniu z anty-PD-1. Badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich 6 lat, wykorzystując naszą wiedzę zarówno w dziedzinie immunologii, jak i humanizacji myszy, nasz zespół badawczy opracował bardzo potrzebny model przedkliniczny do testowania immunoterapii na różnych nowotworach ludzkich 3,7,30,31. Protokół ten kładzie nacisk na uwzględnienie zmienności modelu, ze szczególnym uwzględnieniem populacji ludzkich limfocytów T skoncentrowanych na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować zarówno Animal Research Facility (OLAR) za opiekę nad naszymi myszami, jak i Flow Cytometry Shared Resource wspieranemu przez Cancer Center Support Grant (P30CA046934) w naszym instytucie za ich ogromną pomoc we wszystkich naszych pracach. Wyrażamy również uznanie zarówno dla Gail Eckhardt, jak i Anny Capasso za naszą inauguracyjną współpracę w zakresie badań nad immunoterapiami ludzkimi PDX w naszym modelu HIS-BRGS. Badanie to było częściowo wspierane przez National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant z wykorzystaniem PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 i Wspólny zasób cytometrii przepływowej, RRID: SCR_022035. Badania te były częściowo wspierane przez NIAID Narodowych Instytutów Zdrowia na podstawie umowy o numerze 75N93020C00058.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml z igłamiMcKesson1031815
probówka 15 mlGrenier Bio-One188271
2-merkaptoetanolSigmaM6250
50 mlprobówki Grenier Bio-One227261
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi130-092-545
BD Golgi Stop Inhibitor transportu białek z monenzynaBD BioscienceBDB563792
BSAFisher ScientificBP1600100
Cell StimCocktail Life Technologies509305
Chill 15 RackMiltenyi130-092-952
Pipety szklane z bawełnianą zatyczkąFisher Scientific13-678-8B
Cultrex Ekstrakt z membrany podstawnejR&;D Systemy363200502
Cytek AuroraCytek
DNaseSigma9003-98-9
eBioscience FoxP3/Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoInvitrogen00-5523-00
Embrionalne komórki macierzyste FCSGibco10439001
probówki Eppendorf; objętość 1,5 mlGrenier Bio-One616201
ExcelMicrosoft
FBSBenchmark100-106 500mL
Ficoll HypaqueGE Healthcare45001752
FlowJo SoftwareBD Biosciences
Kleszcze - drobneRoboz Surgical RS5045
Kleszcze normalneDumontRS4919
FormaldehydFisherF75P1GAL
Szkiełka z matowego szkłaCorning1255310
Gentlemacs C-TubesMiltenyi     130-096-334
Dysocjator GentleMACSMiltenyi130-093-235
pipety szklaneDWK Nauki Przyrodnicze63A53
GlutamaxGibco11140050
HBSS z Ca i MgSigma55037C
HEPESCorningMT25060CI
IgG standardSigmaI2511
IgM standardSigma401108
IMDMGibco12440053
Liberase DLRoche5466202001
LIVE/DEAD Fixable BlueThermoL23105
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MEMGibco1140050
mysz anty-ludzka IgG-APSouthern BiotechJDC-10
mysz anty-ludzka IgG-nienabeledSouthern BiotechH2
mysz anty-ludzka IgM-APSouthern BiotechUHB
mysz anty-ludzka IgM-nieoznakowanaSouthern BiotechSA-DA4
MultiRad 350Precision X-Ray
PBSCorning45000-446
Pen StrepGibco15140122
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875713A
Podłoże p-nitrofenyloweThermo34045
PRISMGraphpad
Rec Hu FLT3LR& Systemy D308-FK-005/CF
Rec Hu IL6R& Systemy D206-IL-010/CF
Rec Hu SCFR& Systemy D255SC010
RPMI 1640Corning45000-39
SaponinSigma8047-15-2
NożyczkiMcKesson862945
Pipety serologiczne 25 mlFisher Scientific1367811
Sterylny filtrNalgene567-0020
Sterylna wodamolekularnaSigma7732-18-5
Analizator komórek YetiBio-Rad12004279
Zombie Greenbiolegend423112

Bibliografia

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118(2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282(2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947(2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37(2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362(2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416(2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037(2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393(2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723(2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063(2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034(2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53(2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 5/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Tagi

Immunoterapia nowotwor wmikro rodowisko guzaludzki uk ad odporno ciowyksenoprzeszczep pochodz cy od pacjentacytometria przep ywowakom rki macierzyste CD34aktywacja limfocyt w Tlimfocyty naciekaj ce guzmyszy z niedoborem odporno ci

Powiązane artykuły