Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Streszczenie

Mnóstwo chorobotwórczych mikroorganizmów nieustannie atakuje rośliny. Kompleks gatunkowy Pseudomonas syringae obejmuje Gram-ujemne bakterie chorobotwórcze roślin o szczególnym znaczeniu dla wielu żywicieli. P. syringae dostaje się do rośliny z powierzchni liścia i szybko namnaża się w apoplastach, tworząc mikrokolonie zajmujące przestrzeń międzykomórkową. Konstytutywna ekspresja białek fluorescencyjnych przez bakterie pozwala na wizualizację mikrokolonii i monitorowanie rozwoju infekcji na poziomie mikroskopowym. Ostatnie postępy w analizie pojedynczych komórek ujawniły dużą złożoność, jaką osiągają klonalne populacje bakterii izogenicznych. Ta złożoność, określana jako heterogeniczność fenotypowa, jest konsekwencją różnic między komórkami w ekspresji genów (niezwiązanych z różnicami genetycznymi) w społeczności bakteryjnej. Aby przeanalizować ekspresję poszczególnych loci na poziomie pojedynczej komórki, szeroko stosuje się fuzje transkrypcyjne z białkami fluorescencyjnymi. W warunkach stresowych, takich jak te występujące podczas kolonizacji apoplastu roślinnego, P. syringae różnicuje się w odrębne subpopulacje w oparciu o niejednorodną ekspresję kluczowych genów wirulencji (tj. systemu wydzielania Hrp typu III). Jednak analiza pojedynczych komórek dowolnej populacji P. syringae odzyskanej z tkanki roślinnej jest trudna ze względu na szczątki komórkowe uwalniane podczas mechanicznego zakłócenia nieodłącznie związanego z procesami inokulacji i ekstrakcji bakteryjnej. Niniejszy raport szczegółowo opisuje metodę opracowaną w celu monitorowania ekspresji genów P. syringae na poziomie pojedynczej komórki podczas kolonizacji rzodkiewnika i roślin fasoli. Opisano przygotowanie roślin i zawiesin bakteryjnych stosowanych do inokulacji przy użyciu komory próżniowej. Odzyskiwanie bakterii endofitycznych z zakażonych liści przez ekstrakcję płynu apoplastycznego jest również wyjaśnione tutaj. Zarówno metody inokulacji bakteryjnej, jak i ekstrakcji bakteryjnej są empirycznie zoptymalizowane w celu zminimalizowania uszkodzeń komórek roślinnych i bakteryjnych, w wyniku czego powstają preparaty bakteryjne optymalne do analizy mikroskopowej i cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Bakterie chorobotwórcze wykazują różnice w różnych fenotypach, co prowadzi do powstawania subpopulacji w obrębie genetycznie identycznych populacji. Zjawisko to znane jest jako heterogeniczność fenotypowa i zostało zaproponowane jako strategia adaptacyjna podczas interakcji bakteria-gospodarz¹. Ostatnie postępy w rozdzielczości optycznej mikroskopów konfokalnych, cytometrii przepływowej i mikrofluidyki, w połączeniu z białkami fluorescencyjnymi, sprzyjały analizom pojedynczych komórek populacji bakterii².

Gram-ujemny Pseudomonas syringae jest archetypem bakterii chorobotwórczej dla roślin, zarówno ze względu na jego znaczenie akademickie, jak i ekonomiczne³. Cykl życiowy P. syringae jest związany z obiegiem wody⁴. P. syringae dostaje się do przestrzeni międzykomórkowych między komórkami mezofilu, apoplastem liści roślin, przez naturalne otwory, takie jak aparaty szparkowe lub rany⁵. Po dostaniu się do apoplastu P. syringae opiera się na systemie wydzielania typu III (T3SS) i efektorach translokowanych typu III (T3E) w celu tłumienia odporności roślin i manipulowania funkcjami komórkowymi roślin z korzyścią dla patogenu⁶. Ekspresja T3SS i T3E zależy od głównego regulatora HrpL, alternatywnego czynnika sigma, który wiąże się z motywami hrp-box w regionie promotorowym docelowych genów⁷.

Poprzez generowanie zlokalizowanych chromosomów fuzji transkrypcyjnych z fluorescencyjnymi genami białkowymi poniżej interesującego genu, można monitorować ekspresję genów na podstawie poziomów fluorescencji emitowanych na poziomie pojedynczej komórki⁸. Za pomocą tej metody ustalono, że ekspresja hrpL jest niejednorodna zarówno w kulturach bakteryjnych wyhodowanych w laboratorium, jak i w populacjach bakterii odzyskanych z roślinnego apoplast^8,9. Chociaż analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki jest zwykle wykonywana w kulturach bakteryjnych hodowanych w pożywkach laboratoryjnych, takie analizy można również przeprowadzić na populacjach bakterii rosnących w roślinie, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat tworzenia subpopulacji w kontekście naturalnym. Potencjalnym ograniczeniem dla analizy populacji bakterii wyekstrahowanych z rośliny jest to, że klasyczne metody inokulacji polegające na infiltracji strzykawki do apoplastu, a następnie ekstrakcji bakteryjnej przez macerację tkanki liścia, zazwyczaj generują dużą ilość resztek komórkowych roślin, które zakłócają dalszą analizę¹⁰. Większość szczątków komórkowych składa się z autofluorescencyjnych fragmentów chloroplastów, które nakładają się na fluorescencję GFP, co skutkuje mylącymi wynikami.

Obecny protokół opisuje proces analizy niejednorodności ekspresji genów pojedynczej komórki w dwóch patosystemach modelowych: jednym utworzonym przez szczep pomidora P. syringae pv. DC3000 i Arabidopsis thaliana (Col-0), a drugim przez P. syringae pv. phaseolicola szczep 1448A i rośliny fasoli (Phaseolus vulgaris odmiana Canadian Wonder). Zaproponowano metodę inokulacji opartą na infiltracji próżniowej za pomocą komory próżniowej i pompy, co daje szybką i wolną od uszkodzeń metodę infiltracji całych liści. Ponadto, jako ulepszenie konwencjonalnych protokołów, stosuje się łagodniejszą metodę ekstrakcji populacji bakterii z apoplastu, która znacznie zmniejsza rozerwanie tkanek, opartą na ekstrakcji płynu apoplastycznego poprzez zastosowanie cykli dodatniego i ujemnego ciśnienia przy użyciu niewielkiej objętości w strzykawce.

Protokół

1. Przygotowanie roślin

1. Przygotuj rośliny Arabidopsis Col-0, wykonując poniższe czynności.
   1. Napełnij doniczkę o średnicy 10 cm mieszanką substratów wermikulitowo-roślinnych w proporcji 1:3 (patrz Tabela materiałów), uprzednio podlaną i przykryj doniczkę metalową siatką o wymiarach 15 cm x 15 cm z otworami 1,6 mm x 1,6 mm. Dopasuj metalową siatkę do mokrej gleby za pomocą gumki recepturki (Rysunek 1A).
   2. Za pomocą mokrej wykałaczki zasiej nasiona Arabidopsis w otworach metalowej siatki. Umieść trzy do czterech nasion w odległych miejscach w doniczce (Rysunek 1B, C).
   3. Przykryj doniczki plastikową kopułą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną i inkubuj je przez 72 godziny w temperaturze 4 °C w celu rozwarstwienia.
      UWAGA: Stratyfikacja (inkubacja przy wysokiej wilgotności i niskiej temperaturze, zgodnie z opisem) poprawia szybkość kiełkowania i synchronizację nasion.
   4. Przenieść doniczki do komory wzrostu roślin w warunkach dnia krótkiego (8 h światła/16 h ciemności w temperaturze 21 °C, natężenie światła: 100 μmol·m⁻²·s⁻¹, wilgotność względna: 70%).
   5. Po wykiełkowaniu nasion (8-10 dni) użyj pęsety, aby usunąć większość sadzonek, trzymając po jednej sadzonce w każdej z pozycji doniczki (sześć sadzonek/doniczkę) (Rysunek 1D). Zdejmij plastikową kopułę, aby odsłonić garnki.
      UWAGA: Rośliny będą gotowe do użycia 4-5 tygodni po wykiełkowaniu.
2. Przygotuj rośliny fasoli Phaseolus vulgaris (odmiana Canadian Wonder).
   1. Przykryj spód szalki Petriego mokrym kawałkiem ręcznika i umieść na nim nasiona fasoli. Uszczelnij szalkę Petriego taśmą chirurgiczną i inkubuj w temperaturze 28 °C przez 3-4 dni (Rysunek 2A).
   2. Przenieś kiełkujące nasiona do doniczki o średnicy 10 cm wypełnionej mokrą mieszanką substratu wermikulitowego i roślinnego w stosunku 1:3.
   3. Inkubować w komorze wzrostu roślin w warunkach długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności w temperaturze 23 °C, natężenie światła: 100 μmol·m⁻²·s⁻¹, wilgotność względna: 70%).
      UWAGA: Rośliny będą gotowe do użycia 10 dni po wykiełkowaniu (Rysunek 2B).

2. Inokulacja rzodkiewnika i roślin fasoli

UWAGA: W tym badaniu użyto szczepów P. syringae pv. tomato DC3000 i P. syringae pv. phaseolicola 1448A.

1. Przygotować inokulum P. syringae.
   1. Szczep P. syringae będący przedmiotem zainteresowania należy rozsiać po wywarze glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l NaCl, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 16 g/l agaru bakteriologicznego, patrz tabela materiałów) uzupełniony odpowiednimi antybiotykami. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 40-48 h.
      UWAGA: Stosowanie antybiotyków jest zalecane, jeśli badany szczep jest nosicielem plazmidu lub genu oporności genomowej. Zalecane stężenia antybiotyków dla P. syringae są następujące: kanamycyna (15 μg/ml), gentamycyna (10 μg/ml), ampicylina (300 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
   2. Zeskrobać biomasę bakteryjną i ponownie zawiesić w 5 ml 10 mM MgCl₂. Zmierz OD₆₀₀ i dostosuj do 0,1, dodając 10 mM MgCl₂,
      UWAGA: OD₆₀₀ 0,1 kultury P. syringae odpowiada 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Wykonać seryjne rozcieńczenia do 10 mM MgCl₂, aby osiągnąć końcowe stężenie inokulum 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Przygotuj 200 ml inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 ml dla roślin fasoli.
   4. Tuż przed inokulacją dodać środek powierzchniowo czynny Silwett L-77 (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 0,02% dla inokulacji fasoli i 0,01% dla Arabidopsis. Należy zauważyć, że Silwett jest nieco szkodliwy dla tkanki Arabidopsis.
2. Wykonaj infiltrację próżniową.
   1. W celu infiltracji rzodkiewnika umieść dwa drewniane patyczki tworzące X nad doniczką (Ryc. 1E) i umieść doniczkę skierowaną w dół na szalce Petriego o średnicy 14 cm zawierającej 200 ml inokulum (Ryc. 1F).
   2. W przypadku inokulacji liści fasoli, wprowadź liść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej inokulum (Rysunek 2C).
   3. Włóż rośliny zanurzone w roztworze inokulum do komory próżniowej (Rysunek 1G i Rysunek 2D) i daj impuls 500 mbar przez 30 s, aby naciekać liście. Powtórz impuls podciśnienia 2-3 razy, aż liść zostanie całkowicie zinfiltrowany (Rysunek 1H i Rysunek 2E).
   4. Odcedź nadmiar roztworu inokulum za pomocą kawałka papieru i włóż rośliny z powrotem do odpowiedniej komory wzrostu.

3. Ekstrakcja bakterii z apoplastu

1. Cztery dni po zaszczepieniu odetnij nadziemną część rośliny Arabidopsis lub zaszczepiony liść z rośliny fasoli i umieść go w strzykawce o pojemności 20 ml bez igły (Ryc. 2G). W przypadku liści fasoli zwiń liść na siebie, pozostawiając aosijalną powierzchnię na zewnątrz, jak pokazano w Rysunek 2F.
2. Dodaj wystarczającą ilość wody destylowanej, aby przykryć tkankę (zwykle 10-15 ml).
3. Włożyć tłok i trzymając strzykawkę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną do góry, usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza wewnątrz strzykawki, delikatnie stukając w cylinder, aż całe powietrze znajdzie się w pobliżu końcówki. Następnie przesuń tłok, aby usunąć powietrze. Gdy wewnątrz strzykawki będzie jak najmniej powietrza, przykryj końcówkę cylindra strzykawki folią parafinową.
4. Ostrożnie naciśnij tłok, aby wytworzyć nadciśnienie, aż tkanka stanie się ciemniejsza (Rysunek 1I i Rysunek 2H). Następnie pociągnij za tłok, aby wytworzyć podciśnienie (Rysunek 1J i Rysunek 2I). Powtórz ten krok 3-5 razy.
5. Usuń folię parafinową i tłok i zbierz płyn zawierający bakterie wyekstrahowane przez apoplast, jak w Rysunek 2J.

4. Analiza jednokomórkowa bakterii wyekstrahowanych przez apoplasty

1. Wizualizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykonując poniższe czynności.
   1. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj wystarczającą objętość, aby wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i umieść na nim kolejny szkiełko (Rysunek 3). Pozostaw je do wyschnięcia na 15 minut i ostrożnie zdejmij szkiełko umieszczone na górze. Za pomocą ostrza pokrój wabikę agarozową na kawałki o wymiarach 5 mm x 5 mm tuż przed użyciem.
   2. Równolegle odwirować 1 ml bakterii wyekstrahowanych apoplastami w stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 20 μl wody w celu zagęszczenia komórek. Umieścić kroplę 2 μl skoncentrowanych komórek na szkiełku nakrywkowym o średnicy 0,17 mm i przykryć kroplę kawałkiem wacika agarozowego o wymiarach 5 mm x 5 mm, uzyskanym wcześniej w kroku 1, jak pokazano w Rysunek 3.
   3. Zobrazuj preparat bakteryjny pod mikroskopem konfokalnym (patrz Tabela materiałów). Do identyfikacji bakterii zielonofluorescencyjnych należy użyć lasera wzbudzającego o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego o długości fali od 500 nm do 550 nm. Aby zidentyfikować wszystkie bakterie, użyj jasnego pola i połącz oba pola.
   4. Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą Fidżi (patrz tabela materiałów). Aby to zrobić, użyj wtyczki MicrobeJ, aby zidentyfikować kontur komórki bakteryjnej i zmierzyć intensywność fluorescencji w obrębie.
      UWAGA: Do tej analizy zaleca się pozyskiwanie obrazu z izolowanych bakterii (nie zgrupowanych).
2. Wykonaj analizę za pomocą cytometrii przepływowej.
   1. Pobrać podwielokrotność zawiesin bakterii ekstrahowanych apoplastami do analizy za pomocą cytometru przepływowego. Zdobądź 100 000 wydarzeń.
   2. Aby odróżnić bakterie od szczątków roślinnych, przeanalizuj apoplast wyekstrahowany z niezaszczepionej rośliny i porównaj wykres punktowy pokazujący rozmiar komórki rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z wielkością komórki rozproszenia bocznego (SSC) z zawiesiną bakteryjną ekstrahowaną apoplastem. Aby zidentyfikować bakterie niefluorescencyjne, należy użyć apoplastów wyekstrahowanych z roślin zaszczepionych niefluorescencyjnymi bakteriami izogenicznymi i porównać ich emisje fluorescencyjne.

Wyniki

Ekspresja systemu wydzielania typu III jest niezbędna do wzrostu bakterii w roślinie. Terminowa ekspresja genów T3SS osiąga się poprzez skomplikowaną regulację, w centrum której znajduje się czynnik sigma funkcji pozacytoplazmatycznej (ECF) HrpL, kluczowy aktywator ekspresji genów związanych z T3SS¹¹. Analizę ekspresji hrpL przeprowadzono wcześniej przy użyciu fuzji transkrypcyjnej zlokalizowanej w chromosomie z dalszym genem gfp bez promotora oraz śledząc wzorce ekspresji za pom...

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda opisuje nieinwazyjną procedurę, która umożliwia infiltrację bakterii do tkanki liściowej rośliny, umożliwiając szybkie zaszczepienie dużych objętości przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozerwania tkanek. Jedną z cech kompleksu gatunkowego P. syringae jest zdolność do przetrwania i namnażania się wewnątrz rośliny apoplastowej i na powierzchni rośliny jako epifit¹⁴. W związku z tym nie można wykluczyć możliwości, że bakterie wyekstrahowane przy użyciu niniejszego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		nakrywkowe 0,17 mm	Brak specjalnych wymagań
Siatka metalowa 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Siatka z włókna szklanego
Doniczki			Brak specjalnych wymagań
Szalki			Brak specjalnych wymagań
Strzykawka			Brak specjalnych wymagań
Probówki stożkowe 50 ml	Sarstedt
Agaroza	Merk
Ampicylina sodowa	GoldBio
Agar bakteriologiczny	Roko
Mikroskop konfokalny Stellaris	Leica Microsystems
FACSPrzedstaw analizator komórek	BD Biosciences
Fidżi
Siarczan gentamycyny	Duchefa	G-0124
Monosiarczan kanamycyny	Fitotechnologia	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Opakowania
sztucznego Podłoże			Brak specjalnych wymagań
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Wykałaczki			Brak specjalnych wymagań
Pęseta
Tryptone	Merk
Komora próżniowa o średnicy 25 cm	Kartell	554
Pompa próżniowa	GAST	DOA-P504-BN
Wermikulit			Brak specjalnych wymagań
Ekstrakt drożdżowy	Merk