Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64617

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI), The Hong Kong Polytechnic University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Streszczenie

Płyn łzowy jest jednym z łatwo dostępnych płynów biologicznych, które można zbierać bezinwazyjnie. Proteomika łez ma potencjał do odkrycia biomarkerów dla wielu chorób i schorzeń oczu. Stwierdzono, że kolumna wychwytująca zawiesinę jest wydajnym i przyjaznym dla użytkownika procesem przygotowywania próbek do szerokiego zastosowania dalszej analizy proteomicznej. Jednak strategia ta nie została dobrze zbadana w analizie ludzkiego proteomu łez. Niniejszy protokół opisuje zintegrowany przepływ pracy od klinicznych próbek ludzkich łez do oczyszczonych peptydów do nieinwazyjnych badań biomarkerów białka łzy przy użyciu spektrometrii mas, która zapewnia wgląd w biomarkery choroby i monitorowanie w połączeniu z analizą bioinformatyczną. Zastosowano preparat próbki wychwytującej zawiesinę białkową, co zademonstrowało odkrycie proteomu łez za pomocą szybkich, powtarzalnych i przyjaznych dla użytkownika procedur, jako uniwersalnego, zoptymalizowanego preparatu próbki do analizy ludzkiego płynu łzowego. W szczególności procedura wychwytywania zawiesiny przewyższyła przygotowanie próbki w roztworze pod względem odzysku peptydów, identyfikacji białek i krótszego czasu przygotowania próbki.

Wprowadzenie

Proteomika łez została potraktowana jako przedmiot do zbadania potencjalnych biomarkerów chorób i schorzeń oczu1,2,3,4,5,6, aby uzyskać dostęp do patogenezy stanu okulistycznego i ogólnoustrojowego, a także wykorzystać zalety nieinwazyjnego pobierania próbek łez za pomocą Paski Schirmera. Postęp technologiczny spektrometrii mas nowej generacji umożliwił kwantyfikację białek w mikrolitrowych łzach z dokładnością i precyzją, które nie były możliwe w przeszłości. Metody przygotowania próbek nie są jeszcze znormalizowane. Solidny i ustandaryzowany proces przygotowania próbek ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia zastosowania klinicznego w badaniach nad biomarkerami białka łzowego. Proces przygotowania próbek do wychwytywania zawiesiny (S-Trap) został niedawno opisany jako skuteczna i czuła metoda przygotowania próbki do szerokiej analizy proteomicznej7,8. Jednak strategia ta nie została dobrze opisana w analizie ludzkiego proteomu łez, przewyższała przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) i trawienie w roztworze pod względem wydajności trawienia enzymatycznego i większej liczby identyfikacji białek za pomocą analizy spektrometrii mas9. Podejście oparte na S-Trap zostało zademonstrowane w przygotowaniu tkanki siatkówki 10, tkanki utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE)11, cells12, microorganism13, oraz biopsji płynnej14,15.

Ten protokół opisuje zintegrowany ilościowy przepływ pracy od próbek klinicznych do enzymatycznie trawionego białka w celu odkrycia nieinwazyjnego panelu biomarkerów białka łez z szybką, powtarzalną i solidną strategią techniczną. Krótko mówiąc, płyn łzowy pobrano za pomocą standardowego paska Schirmera i natychmiast wysuszono za pomocą oftalmicznej grzałki ramowej, aby zapobiec autolizie białek w temperaturze pokojowej. Osadzone białka całkowite wyekstrahowano przy użyciu 5% buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu (SDS) zgodnie z sugestią producenta, a następnie dokonano pomiaru białka. Wyekstrahowany lizat poddano następnie standardowej redukcji za pomocą ditiotreitolu (DTT) i alkilacji jodoacetamidem (IAA).

Po zakwaszeniu kwasem fosforowym, do białek zbiorczych dodano bufor wytrącający białko z kolumny zatrzymującej zawiesinę, zawierający 90% metanolu i 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB). Próbka została następnie przeniesiona do nowej mikrokolumny zatrzymującej zawiesinę. Trawienie enzymatyczne z trypsyną do sekwencjonowania w proporcji 1:25 (w/w, trypsyna: białko) w temperaturze 47 °C przez 1 godzinę. Powstałe peptydy zostały następnie eluowane przez wirowanie, sekwencyjnie z 50 mM TEAB, 0,2% wodnym kwasem mrówkowym (FA) i 50% acetonitrylem (ACN) zawierającym 0,2% FA. Wymyte peptydy suszono próżniowo i rozpuszczono w 0,1% FA. Stężenie peptydu zmierzono i dostosowano do 0,5 μg/μl do analizy spektrometrii mas.

Protokół

Badani wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem w badaniu. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Człowieka Politechniki w Hongkongu i było zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

1. Zbieranie ludzkiego płynu łzowego za pomocą paska Schirmera

  1. Załóż rękawice i zdezynfekuj, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
  2. Sprawdź, czy opakowanie wewnętrzne jest nienaruszone, sterylne i nie przeterminowane.
  3. Zegnij górną część paska Schirmera lekko do wewnątrz przy znaku 0 mm, jak wskazano w pobliżu półkola końcówki paska (Rysunek 1).
  4. Wyjmij pasek z opakowania wewnętrznego, przytrzymując koniec paska i unikaj bezpośredniego kontaktu z obszarem pobierania próbki w odległości od 0 do 25 mm.
  5. Poproś osobę, aby odwróciła wzrok od miejsca, w którym znajduje się pasek, który ma zostać umieszczony.
  6. Delikatnie pociągnij dolną powiekę w dół i zaczep koniec paska w dolnej części kości w pobliżu bocznego obszaru kantu (Rysunek 2). Powtórz tę samą procedurę na drugim oku.
  7. Poproś osobę badaną, aby delikatnie zamknęła powieki, aby zminimalizować podrażnienie.
  8. Zbieraj płyn łzowy przez około 5 minut lub najlepiej pobrano próbkę łzy o średnicy 15-20 mm.
  9. Poproś osobę, aby otworzyła obie oczy, delikatnie pociągnęła dolną powiekę w dół i usunęła paski z obiektu.
  10. Sprawdź uwodnioną długość na pasku Schirmera i zapisz zebraną ilość w mm.
  11. Osusz pasek za pomocą standardowego, czystego grzejnika ramowego, aż płyn całkowicie wyschnie.
    UWAGA: Należy unikać nadmiernego nagrzewania, które mogłoby potencjalnie zwęglić bibułę filtracyjną.
  12. Włóż każdy wysuszony pasek Schirmera do oznakowanej krioprobówki i przechowuj go najlepiej w chłodnym, suchym miejscu w ciemności do czasu dalszej obróbki.

2. Przygotowanie chemikaliów i odczynników

  1. Bufor do lizy (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 ml
    1. Odpipetować 1 ml 1 M TEAB i 80 μL 12% kwasu fosforowego. Wirować i krótko sonikować, aby usunąć pęcherzyki. Uzupełnij do 20 ml wodą dejonizowaną.
    2. Odważyć 1 g SDS i dodawać do roztworu oscylując, aż do rozpuszczenia.
  2. Bufor do wytrącania białek (90% metanolu, 100 mM TEAB, pH 7,1), 10 ml
    1. Dodać 893 μl 1 M TEAB i 92 μl wody dejonizowanej.
    2. Dodać 15 μl 85% wag. kwasu fosforowego i 9 ml metanolu do roztworu i krótko przemieszać.
  3. Bufor wytrawiający (50 mM TEAB), 1 ml
    1. Dodać 50 μl 1 M TEAB i uzupełnić do 1 ml wodą dejonizowaną.
  4. 200 mM roztwór ditiotreitolu (DTT), 500 μL
    1. Odważyć 15 mg naziemnej telewizji cyfrowej i rozpuścić w 500 μl wody dejonizowanej; krótko przetrząsnąć.
      UWAGA: Przygotuj przed użyciem.
  5. 400 mM roztwór jodoacetamidu (IAA), 200 μL
    1. Odważyć 15 mg IAA i rozpuścić w 200 μl wody dejonizowanej. UWAGA: Przygotuj się przed użyciem i unikaj światła.
  6. 0,2% kwas mrówkowy, 50% acetonitryl, 10 ml
    1. Przygotuj 10 ml 50% acetonitrylu w wodzie dejonizowanej.
    2. Dodać 20 μl kwasu mrówkowego i krótko wirować.
  7. 0,2% roztwór kwasu mrówkowego, 10 ml
    1. Dodaj 20 μl kwasu mrówkowego do 10 ml wody dejonizowanej i krótko wiruj.
  8. 0,1% roztwór kwasu mrówkowego, 10 ml
    1. Dodać 10 μl kwasu mrówkowego do 10 ml wody dejonizowanej; krótko odwirować.

3. Ekstrakcja białka w pasie Schirmera

  1. Wytnij i wyrzuć przedni koniec poza oznaczenie 0 mm paska, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenie spowodowane kontaktem tkanek spojówek z czystymi nożyczkami ze stali nierdzewnej.
  2. Pokrój pasek w odstępach co 1 mm do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (Rysunek 3).
  3. Dodać 100 μl buforu do lizy do probówki mikrowirówki i wirować z prędkością 1 000 obr./min, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w termomikserze.
  4. Krótko odwirować i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Przenieś paski do końcówek do pipet o pojemności 200 μl za pomocą czystych kleszczyków. Umieścić końcówki w tej samej probówce z kroku 3.4 z uchwytem i odwirować w temperaturze pokojowej 4 000 × g przez 1 minutę dalej, aby uzyskać maksymalny odzysk pozostałej próbki na pasku.
  6. Zmierz stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub kompatybilnego testu białkowego.

4. Przygotowanie próbki do wychwytywania zawiesiny

  1. Normalizować próbki do 50 μg białka na podstawie wyniku testu białka.
  2. Dodać 200 mM DTT w stosunku 1:10 (v/v, DTT: próbka) do końcowego stężenia 20 mM DTT i inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  3. Schłodzić roztwór białka do temperatury pokojowej.
  4. Dodać 400 mM IAA w stosunku 1:10 (v/v, IAA: próbka) do końcowego stężenia 40 mM IAA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Dodać 12% wodnego roztworu kwasu fosforowego w stosunku 1:10 (v/v, kwas: próbka) do końcowego stężenia 1,2% kwasu fosforowego i krótko przetrząsnąć.
  6. Dodać bufor wiążący białko w stosunku 1:6 (v/v, próbka: bufor) i krótko wirować.
    UWAGA: Na tym etapie powinny powstać cząstki białka koloidalnego, a roztwór będzie wyglądał na półprzezroczysty, jeśli ilość białka jest wystarczająca.
  7. Odkręć mikrokolumnę wirującą zatrzymującą zawieszenie i zmontuj kolumnę wirującą na probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml, aby zebrać przepływ.
  8. Dodać do kolumny do 200 μl zakwaszonej mieszaniny lizatu białkowego.
  9. Odwirować kolumnę pod ciśnieniem 4 000 × g przez 20 s. Cząstki białka zostały uwięzione; powtarzać, aż próbki zostaną załadowane do kolumny.
  10. Dodać 150 μl buforu wiążącego białka i odwirować w ilości 4 000 × g przez 20 s, aby przepłukać zawieszone białko. Powtórz 3 razy.
  11. Zamontuj mikrokolumnę zatrzymującą zawiesinę na nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1.5 ml.
  12. Dodać 20 μl 50 mM buforu wytrawiającego TEAB zawierającego proteazę w stosunku 1:25 (w/w, trypsyna: białko) do filtra wewnątrz kolumny wirowej, unikając pęcherzyków i szczeliny powietrznej między filtrem a roztworem wytrawiającym.
  13. Zakryj mikrokolumnę wirującą zatrzymującą zawieszenie, aby zapobiec parowaniu. Inkubować w temperaturze 47 °C przez 1 godzinę w termomikserze; Nie potrząsać ani nie wirować podczas trawienia.
  14. Elute peptydy za pomocą 40 μl 50 mM TEAB za pomocą siły odśrodkowej przy 4 000 × g przez 20 s.
  15. Dodać 40 μl 0,2% FA i odwirować w temperaturze 4 000 × g przez 20 s.
  16. Dodaj 35 μl 0,2% FA, 50% acetonitrylu i odwiruj w 4,000 × g przez 20 s.
  17. Zebrać trzy eluaty i wysuszyć za pomocą wirówki próżniowej.
  18. Przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. Odtworzenie peptydów do analizy spektrometrii mas

  1. Rozpuść próbkę w 12 μl 0,1% FA, odwiruj i krótko odwiruj.
  2. Zmierz stężenie peptydów za pomocą zestawu do oznaczania peptydów.
  3. Normalizuj stężenie peptydów do 0,5 μg/μL w 0,1% FA.
  4. Przenieść mieszaninę peptydów do fiolki z automatycznym samplerem i przygotować do analizy metodą spektrometrii mas.

6. Pobieranie próbek metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas

  1. Załadować 3 μg peptydu izokratycznym buforem ładującym (0,1% FA, 5% ACN) do kolumny-pułapki (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) przy natężeniu przepływu 2 μL/min przez 15 min.
  2. Frakcjonować peptydy za pomocą nanokolumny analitycznej z odwróconymi fazami (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) przy natężeniu przepływu 350 nL/min w 155-minutowym gradiencie separacji. Stosować ruchomą fazę A składającą się z mieszaniny 0,1% kwasu mrówkowego (v/v), 5% ACN (v/v) w wodzie i ruchomej fazy B zawierającej 0,1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) w wodzie. Użyj następującego gradientu: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.
  3. Wykonaj akwizycję zależną od danych (DDA) z zakresem skanowania TOF-MS od 350 do 1800 m/z czasem akumulacji 250 ms i dynamicznym czasem wykluczenia celu wynoszącym 18 s. Następnie należy przeprowadzić skanowanie MS/MS przy prędkości od 100 do 1 800 m/z w trybie wysokiej czułości z czasem akumulacji 50 ms dla 50 najlepszych prekursorów na cykl z progiem 125 cps dla sygnału MS/MS o stanie naładowania od +2 do +4.
  4. Analizuj surowe dane za pomocą przywołanego oprogramowania lub innych kompatybilnych silników z referencyjną bazą danych w FASTA z publicznie dostępnej bazy danych UniProt database.

Wyniki

Ten protokół umożliwia pobieranie próbek łez za pomocą pasków Schirmera, które są przechowywane w suchym miejscu w temperaturze pokojowej przed późniejszym przygotowaniem próbki do analizy spektrometrii mas. Przebieg pracy wspomaganego filtrem przygotowania próbki (FASP) z mikrokolumną zatrzymującą zawiesinę umożliwił szybkie przygotowanie próbki w ciągu kilku godzin, w porównaniu z powszechnie stosowanymi procedurami trawienia w roztworze w ciągu kilku dni, które wymagają inkubacji przez noc. Wydajność odzysku peptydów była znacznie wyższa (p < 0,001) niż standardowy protokół trawienia w roztworze i z dobrą odtwarzalnością przy współczynniku zmienności (%CV) < 7%. Pulę próbek łez powtórzono w sześciu powtórzeniach technicznych z 74,2 ± 5,0% odzyskiem peptydów i 52,8 ± 1,6% odzyskiem peptydu w próbkach przygotowanych za pomocą procedur w roztworze. Zbiorczą próbkę łez z ilością białka 36,3 μg naniesiono na pasek Schirmera i wyekstrahowano zgodnie z wcześniejszym opisem, skuteczność ekstrakcji białka wyniosła 81% (29,5 ± 6,8 μg, średnia ± SD).

Oba przepływy pracy załadowały 3 μg peptydów na MS, a wyszukiwanie DDA dało w sumie 1 183 ± 118 białek (5 757 ± 537 różnych peptydów) i 874 ± 70 białek (4 400 ± 328 peptydów) przy 1% FDR odpowiednio w grupie pułapkowania zawiesiny i w roztworze. Analiza ontologii genów (GO) przy użyciu systemu klasyfikacji PANTHER ujawniła bardzo podobne proteomy dla obu podejść, przy czym wiązanie, aktywność katalityczna i regulacja funkcji molekularnych są ich głównymi funkcjami molekularnymi (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Zegnij górną część paska Schirmera na znaku 0 mm przed aplikacją. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Pozycja paska Schirmera podczas zbierania łez. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ilustracja obsługi pasków Schirmera przed ekstrakcją białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wykres kołowy ilustrujący analizę ontologii genów dla proteomów zidentyfikowanych za pomocą przepływu pracy w roztworze i procesu pułapkowania zawiesiny, przy użyciu systemu klasyfikacji PANTHER. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Aby uzyskać dokładne wyniki przy użyciu tej metody, we wszystkich procedurach od pobrania próbki łez należy nosić jednorazowe rękawiczki niewymagające zasilania, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki. Ważne jest, aby na każdym etapie unikać pęcherzyków i szczelin powietrznych między filtrem a roztworem próbki, wykorzystując kolumny mikroprzędzące. Jeżeli objętość próbki jest większa niż pojemność kolumn, zaleca się powtórzenie procesu. Protokół ten okazał się bardziej wydajny niż tradycyjny protokół w roztworze pod względem czasu przygotowania, odzysku białka i całkowitej identyfikacji białka. Dzieje się tak głównie dlatego, że próbki poddawane są większości wymaganych procedur na tej samej kolumnie, w przeciwieństwie do metody w roztworze, która obejmuje wiele etapów przenoszenia, takich jak wytrącanie acetonu, trawienie i oczyszczanie (odsalanie), co zwiększa prawdopodobieństwo zmian w uzyskanych danych.

Oprócz próbek łez pobranych metodą mikrokapilarną16,17, ten przepływ pracy FASP z mikrokolumną zatrzymującą zawiesinę zapewnia alternatywną metodę przygotowania próbki, która umożliwia szybkie i solidne przygotowanie próbki łez pobranej za pomocą pasków Schirmera, przy minimalnym przygotowaniu materiału i przyjaznych dla użytkownika krokach do wykonania. Pozwala to na powtarzalne przygotowanie próbki łez do dużych badań kohortowych dotyczących wielu chorób lub schorzeń oczu z lepszym odzyskiwaniem peptydów i identyfikacją białek przez stwardnienie rozsiane w porównaniu z procedurami w roztworze. Ten niezawodny proces może być regularnie wykorzystywany do przygotowywania próbek biomarkerów łez do badań i innych celów klinicznych. Co najważniejsze, wymaga minimalnego przeszkolenia personelu w zakresie pobierania próbek na miejscu i eliminuje potrzebę przechowywania próbek w zamrażarce. Próbki są suszone na miejscu, aby zminimalizować autolizę i degradację białek. W związku z tym umożliwia to wygodną wysyłkę pocztą, co ułatwia dalszą analizę, w przeciwieństwie do stosowania rurek mikrokapilarnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez inicjatywę InnoHK i Rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu; Centrum Badawcze SHARP Vision; oraz Centrum Badawcze Innowacji Medycyny Chińskiej (RCMI) na Politechnice w Hongkongu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki z plastikowym gwintem 9 mmThermo ScientificC4000-11
Acetonitryl, LCMS GradeAnaquaAC-1026
Wirówka MiniSpin plusEppendorf5453000097
DL-ditiotreitol (DTT), BioUltraSigma-Aldrich43815
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mlEppendorf30120086
Kwas mrówkowy, odczynnik ACS, ≥ 96%Sigma-Aldrich695076
Grzejnik ramowy OPTIMONSUN ElectronicBreitfeld & Schliekert GmbH1203166
Jodoacetamid (IAA), BioUltraSigma-AldrichI1149
Metanol, HPLC GradeAnaquaMA-1292
Nunc Biobankowanie i probówki kriogeniczne do hodowli komórkowych, 2 mlThermo Fisher Scientific368632
Kwas fosforowy, 85% wag. w H2OSigma-Aldrich345245
Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy PierceThermo Fisher Scientific23275
Zestaw do oznaczania białek BCA Pierce Rapid GoldThermo Fisher ScientificA53225
Kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotuSciexTripleTOF 6600
Paski okulistyczne SchirmerEntod Research Cell UK LtdDEW Tearstrips
S-Trap Micro KolumnaProtifiC02-micro-80
SureSTART 9 mm ZakrętkiThermo ScientificCHSC9-40
Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 1 MSigma-Aldrich18597
Ultra-sprawna chromatografia cieczowaEksigentNanoLC 400 
Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)Thermo Fisher Scientific15525017

Bibliografia

  1. Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83(2021).
  2. Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18(2021).
  3. Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120(2021).
  4. Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186(2020).
  5. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
  6. Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
  7. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  8. Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  9. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  10. Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27(2021).
  11. Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
  12. Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
  13. Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985(2019).
  14. Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290(2023).
  15. Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53(2022).
  16. Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16(2020).
  17. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p yn zowyprzygotowanie pr bek bia ekpasek Schirmeraodzyskiwanie peptyd widentyfikacja bia ekodkrywanie biomarker w

Powiązane artykuły