Artykuł metodologiczny

Manipulacja rytmicznym przyjmowaniem pokarmu u myszy za pomocą niestandardowego systemu żywienia

DOI:

10.3791/64624

⸱

16 grudnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Texas A&M University, 2Center for Biological Clocks Research, Texas A&M University, 3Interdisciplinary Program of Genetics, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ograniczenie czasu przyjmowania pokarmu okazało się obiecującą interwencją mającą na celu złagodzenie chorób metabolicznych wywołanych przez dietę. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje budowę i zastosowanie zbudowanego we własnym zakresie wydajnego systemu do pomiaru i manipulowania rytmicznym przyjmowaniem pokarmu przez myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rytmiczna ekspresja genów jest cechą charakterystyczną rytmu okołodobowego i jest niezbędna do napędzania rytmiczności funkcji biologicznych o odpowiedniej porze dnia. Badania przeprowadzone w ciągu ostatnich kilku dekad wykazały, że rytmiczne przyjmowanie pokarmu (tj. czas, w którym organizmy spożywają pokarm w ciągu 24 godzin na dobę) znacząco przyczynia się do rytmicznej regulacji ekspresji genów w różnych narządach i tkankach w całym ciele. Wpływ rytmicznego przyjmowania pokarmów na zdrowie i fizjologię jest od tego czasu szeroko badany i ujawnił, że ograniczenie spożycia pokarmu przez 8 godzin w fazie aktywnej łagodzi choroby metaboliczne wynikające z różnych diet otyłych. Badania te często wymagają stosowania kontrolowanych metod określania czasu dostarczania pokarmu zwierzętom. Manuskrypt ten opisuje projekt i zastosowanie taniego i wydajnego systemu, zbudowanego we własnym zakresie do pomiaru dziennego spożycia pokarmu, a także manipulowania rytmicznym przyjmowaniem pokarmu przez myszy. System ten zakłada wykorzystanie przystępnych cenowo surowców do budowy klatek przystosowanych do dostarczania żywności, zgodnie z przyjazną dla użytkownika procedurą obsługi. System ten może być skutecznie stosowany do karmienia myszy różnymi schematami żywienia, takimi jak ad libitum, harmonogramy ograniczone czasowo lub arytmiczne, a także może obejmować dietę wysokotłuszczową w celu zbadania jej wpływu na zachowanie, fizjologię i otyłość. Przedstawiono opis, w jaki sposób myszy typu dzikiego (WT) przystosowują się do różnych schematów żywienia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zegar okołodobowy występuje powszechnie u różnych gatunków i dostarcza mechanizmu odmierzającego czas, który pomaga organizmom dostosować się do ich rytmicznie zmieniającego się środowiska. Główny rozrusznik okołodobowy znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) podwzgórza. SCN jest przede wszystkim porywany przez środowiskowy cykl światło-ciemność i synchronizuje zegary peryferyjne obecne w prawie każdej komórce ciała za pomocą wielu wskazówek, w tym sygnałów neuronalnych i hormonalnych, karmienia i temperatury ciała1,2,3,4,5,6,7,8. U ssaków molekularny zegar okołodobowy opiera się na heterodimerycznym czynniku transkrypcyjnym CLOCK: BMAL19,10, który kontroluje ekspresję genów zegara rdzeniowego o nazwach Period (Per1, Per2 i Per3) i Cryptochrome (Cry1 i Cry2) w celu zainicjowania transkrypcyjnej pętli sprzężenia zwrotnego, która ma kluczowe znaczenie dla generowania rytmów okołodobowych9,11,12. Zegar molekularny reguluje również rytmiczną transkrypcję tysięcy genów, które kontrolują rytmiczność praktycznie każdej funkcji biologicznej13,14,15. Ponad 50% genomu u ssaków ulega rytmicznej ekspresji w co najmniej jednym typie tkanki16,17,18, a tkanki takie jak wątroba u myszy mają około 25%-30% transkryptomu wyrażonego rytmicznie18,19. Rytmiczna ekspresja genów ma kluczowe znaczenie dla aktywacji ważnych procesów biologicznych, takich jak kontrola cyklu komórkowego20, homeostaza glukozy21 i metabolizm aminokwasów22 o odpowiedniej porze dnia w celu zwiększenia sprawności organizmu.

W ciągu ostatnich kilku dekad pojawiło się coraz więcej dowodów sugerujących, że przyjmowanie pokarmu może działać jako silna wskazówka synchronizująca do utrwalania rytmów ekspresji genów w wielu tkankach, w tym w wątrobie23,24. Co ważne, wykazano, że karmienie porywa rytmy w wątrobie niezależnie od SCN lub cyklu światło-ciemność25, a rytmiczne karmienie może napędzać rytmiczną ekspresję genów bez angażowania zegara molekularnego26,27,28,29,30,31. Karmienie ograniczone do okresu nieaktywności myszy (w ciągu dnia) odwraca fazę ekspresji genów zegara rdzeniowego i wielu genów rytmicznych31. Wykazano, że żywienie ograniczone czasowo (TRF), które jest interwencją żywieniową, w której dzienne spożycie kalorii jest ograniczone do okresu 8-10 godzin, chroni przed otyłością, hiperinsulinemią, stłuszczeniem wątroby i zespołem metabolicznym32,33. Wszystkie powyższe eksperymenty polegające na manipulacji przyjmowaniem pokarmu wymagają od eksperymentatora wykorzystania skutecznych metod dostarczania pokarmu o odpowiedniej porze dnia.

Opracowano różne metody dostarczania żywności, które mają kilka zalet i wad29,34,35,36,37,38,39 (Tabela 1). Niektóre automatyczne karmniki zostały zaprojektowane do działania w oparciu o oprogramowanie, które kontroluje ilość, czas trwania i czas dostępności pokarmu, jednocześnie rejestrując karmienie i dobrowolną aktywność biegania na kółkach u myszy34. Kilka innych metod polega na umieszczeniu myszy w różnych klatkach dla różnych warunków karmienia, przy czym eksperymentator ręcznie dodaje granulki pokarmu w wymaganym czasie38,39. Inny system wykorzystuje zautomatyzowany system podajnika sterowany przez komputer, w którym pneumatycznie napędzana osłona uniemożliwia dostęp do żywności i która może być kontrolowana przez odstępy czasowe lub masę żywności35. Wszystkie te metody albo wymagają użycia i konfiguracji skomputeryzowanego oprogramowania, które może być drogie i wymagać pewnego szkolenia w zakresie prawidłowego działania instrumentu, albo są pracochłonne, ponieważ eksperymentator musi być obecny w określonych godzinach, aby ręcznie zmienić warunki karmienia. Systemy komputerowe również mają swój udział w problemach, w tym nieprawidłowe działanie dźwigni lub drzwi, które wypuszczają żywność, granulki żywności utknęły w gniazdkach i awaria oprogramowania. Co więcej, dźwięk, który może być wytwarzany podczas otwierania drzwi lub dźwigni, stwarza ryzyko uwarunkowania myszy do kojarzenia ich z dostarczaniem jedzenia, utrudniając w ten sposób interpretację skutków manipulacji jedzeniem jako spowodowanych wyłącznie dostępem do pożywienia lub wpływem na inne rytmy behawioralne, takie jak cykl snu / czuwania. Ogólnym celem tego badania było opracowanie niedrogiego i wydajnego systemu manipulowania długoterminowym rytmicznym przyjmowaniem pokarmu, który pomógłby złagodzić wiele z tych wyżej wymienionych problemów. Po pierwsze i najważniejsze, urządzenie podające, które zostało opracowane i opisane poniżej, może być zbudowane przy bardzo minimalnych kosztach w porównaniu z maszynami zautomatyzowanymi (tabela 2) i nie wymaga zaawansowanego szkolenia w zakresie obsługi, obsługi i konserwacji. Po drugie, system karmienia wytwarza tylko biały szum w tle i nie słychać głośnych dźwięków podczas dostarczania pokarmu, zapobiegając w ten sposób warunkowaniu Pawłowa. Ogólnie rzecz biorąc, ten system żywienia jest ekonomiczny, bardziej dostępny i niezawodny dla badaczy, a jednocześnie skuteczny w manipulowaniu rytmicznym przyjmowaniem pokarmu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie tematy zwierzęce są używane zgodnie z wytycznymi określonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University (AUP #2022-0050). Wykorzystuje się tu zarówno samce, jak i samice myszy C57BL/6 w wieku 2-4 miesięcy. Procedura budowy systemu żywienia jest opisana poniżej, a surowce potrzebne do budowy aparatury są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Budowa systemu żywienia

  1. Budowa podłoża z polichlorku winylu (PVC)
    1. Zaopatrz się w cztery kawałki arkuszy PVC o wymiarach 0,25 cala przyciętych według następujących wymiarów: 4,875 cala x 4,5 cala; 4,875 cala x 2,125 cala; 9,5 cala x 2,125 cala (dwie sztuki). Wywierć cztery otwory w podstawie o wymiarach 4,875 cala x 4,5 cala do zamocowania 24-godzinnego timera, korzystając z pomiarów podanych w Rysunek 1A. Przyklej cztery kawałki PVC, aby uzyskać podstawę, jak w Rysunek 1A.
  2. Zabezpieczenie timera na podstawie z PCV
    1. Otwórz timer, aby wyjąć wtyczkę. Nawiąż połączenie za pomocą standardowego przedłużacza/przewodu elektrycznego (Rysunek 1B).
    2. Umieść timer na podstawie z PVC, aby wyrównać go z otworami wywierconymi w podstawie w kroku 1.1.1. Użyj 1.5 cala, aby zamocować timer na podstawie z PVC. Upewnij się, że timer leży płasko i jest stabilny na podstawie z PVC.
    3. Wywierć cztery otwory na górze timera i przykręć 0,75 cala, aby przytrzymać ośmiokomorowy pojemnik na żywność (Rysunek 1B). Baza systemu jest kompletna i wygląda następującoRysunek 1C.
      UWAGA: Nie wiercić otworów w całym timerze.
  3. Konfiguracja koszyka
    1. Wytnij 4-calową rurkę PVC (średnica zewnętrzna 4.5 cala) na wysokości 3.125 cala. Wywierć otwór o długości około 0.5 cala w dolnej części rury, aby przepuścić elektryczny.
    2. Przeszlifuj górną część rury (np. za pomocą frezarki górnowrzecionowej lub narzędzia obrotowego), aby umożliwić łatwe zdjęcie nakrętki podczas wymiany pojemnika na żywność.
    3. Użyj klatki na mysz o szerokości większej niż 4.5 cala i wytnij 4.5-calowy otwór na dnie klatki za pomocą piły otwornicowej.
      UWAGA: Lokalizacja otworu zależy od ustawienia klatki (np. położenie górnej części klatki i butelki z wodą, dodanie koła jezdnego itp.).
  4. Konfiguracja pojemnika do karmienia
    1. Zrób dozownik żywności z 4-calowego, ośmiokomorowego organizera na biżuterię, jak pokazano na Rysunek 1D. Przetnij krawędź pojemnika tak, aby dobrze pasowała do rury.
    2. Użyj 4-calowej zaślepki rury PVC i wytnij otwór odpowiadający rozmiarowi pojedynczej komory dozownika (np. za pomocą narzędzia obrotowego), aby utworzyć otwór, który odsłania tylko jedną z ośmiu komór na raz. Gdy zegar się porusza, otwór odsłania nową komorę co 3 godziny. Elementy systemu żywienia są teraz gotowe do użycia. Po ustawieniu wszystkich klatek, ostateczna konfiguracja przypomina tę pokazaną na Rysunek 1E.
    3. Transport wielu pojemników na żywność jednocześnie może być uciążliwy. Aby ułatwić transport, weź trzy kawałki rury PVC o średnicy 0,25 cala. Wywierć otwór o średnicy 0,625 cala w środku dwóch kawałków i sklej je ze sobą. Następnie użyj wąskiej rury PVC o średnicy 0,625 cala, która mieści się w otworze i przechodzi przez środek kubków na żywność, aby ułożyć kubki na żywność, aby ułatwić ich transport, jak pokazano na Rysunek 1F.
    4. Przetestuj timery przed wprowadzeniem myszy, podłączając zestaw do gniazdek elektrycznych, umieszczając kawałek gniazda w jednej komorze w nagranym czasie i monitorując pozycję gniazda 12 godzin później, aby upewnić się, że zegar obraca się szybko.

2. Zastosowanie systemu żywienia

  1. Ciągły pomiar spożycia pokarmu przez myszy
    1. Przenieś myszy do pomieszczenia eksperymentalnego i zaaklimatyzuj je do cyklu światło-ciemność (LD) ustawionego w pomieszczeniu na co najmniej 1 tydzień i na 2 tygodnie, jeśli cykl jasny-ciemny jest przesunięty o więcej niż 3 godziny. W tym eksperymencie zebrano dane od samców i samic myszy C57BL/6 w wieku 2-4 miesięcy narażonych na LD 12:12 (n = 7 samców i 4 samice).
    2. Rejestruj wagę myszy przed umieszczeniem ich indywidualnie w klatkach karmowych (waga była rejestrowana o godzinie 15:00, tj. w czasie, gdy przeprowadzano wymianę pokarmu). Upewnij się, że myszy mają ad libitum dostęp do wody oraz wystarczającą ilość ściółki i gniazd.
    3. Dodaj 1,5 g karmy (rutynowo używane 45 mg bezpyłowych precyzyjnych granulek) do wszystkich ośmiu przegródek kubka karmowego. Umieść kubek podajnika na timerze. Następnie załóż pokrywkę na kubek karmnika tak, aby odsłonięta była tylko jedna komora i zanotuj czas prezentacji pokarmu. Cztery przedziały reprezentują punkty nocne, a pozostałe cztery reprezentują punkty dzienne.
      UWAGA: Ze względu na zachowanie związane z gromadzeniem zaobserwowane po prezentacji nadmiaru żywności, 1,5 g zostało zoptymalizowane jako początkowa waga żywności. Myszy mają tendencję do gromadzenia granulek na pokrywkach kubków z jedzeniem lub w ściółce w klatce. To zniekształca dane, prowadząc do ich błędnej interpretacji. Samce myszy nie gromadzą granulek, gdy są karmione 1,5 g lub mniej na komorę. Samice mają tendencję do gromadzenia pożywienia więcej niż samce, ale jest to specyficzne dla myszy i można je osłabić, jeśli dostarczysz 1 g granulki na komorę.
    4. Zmieniaj karmę codziennie o tej samej porze i policz liczbę granulek pozostałych w każdej komorze, aby obliczyć ilość spożytego pokarmu. Monitoruj profil żywieniowy przez tydzień, aby uzyskać wyjściowy profil żywieniowy myszy karmionych ad libitum.
    5. Na podstawie ilości spożywanego pokarmu w każdej przegródce oblicz średnie dzienne spożycie pokarmu dla każdej myszy (Rysunek 2).
  2. Leczenie dietą wysokotłuszczową (HFD)
    UWAGA: Ten system żywienia może być również używany do badania wpływu HFD na choroby metaboliczne i ostatecznie może być stosowany w ograniczonych czasowo harmonogramach karmienia. HFD nie jest dostępny na rynku jako granulki o precyzyjnym rozmiarze i wadze, a granulki do karmienia są zwykle kupowane jako granulki 0,5 cala.
    1. Umieść granulki HFD na czystej powierzchni lub przezroczystej folii i pokrój je na 6-7 mniejszych kawałków o równej wielkości za pomocą żyletki. Pokrój granulki na tyle małe, aby przypominały normalne granulki karmy, jak użyto w sekcji 2.1 powyżej.
      UWAGA: Myszy mają tendencję do gromadzenia większych granulek w swoich klatkach, co prowadzi do błędnego obliczania spożywanego pokarmu.
    2. Odważ 1,5 g pokrojonych kawałków HFD i umieść w każdej z 8 przegródek na żywność. Do wymiany żywności co drugi dzień wystarczy 1,5 g HFD na komorę.
    3. Zmieniaj karmę codziennie lub co drugi dzień zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi i zapisuj wagę pozostałego jedzenia.
    4. Oblicz ilość spożytego pokarmu, odejmując pozostałą masę pokarmu od początkowej ilości podanego pokarmu. Powtarzaj ten proces przez okres 1 tygodnia, aby uzyskać punkt odniesienia dla spożycia pokarmu z HFD (Rysunek 2).
  3. Aklimatyzacja samców myszy do diety ograniczonej nocą (NR)
    1. Wykonaj kroki 2.1.1-2.1.4, aby uzyskać punkt odniesienia karmienia ad libitum. W tym eksperymencie dane zebrano od samców myszy C57BL/6 w wieku od 2 do 4 miesięcy narażonych na LD 12:12 (n = 18 samców).
    2. Po 3-7 dniach diety ad libitum należy wprowadzić myszy na dietę przejściową, stopniowo zmniejszając liczbę granulek w przedziałach dziennych. Aby to zrobić, miej pięć granulek na komorę w 1 dniu przejścia (0,225 g na komorę), 3 granulki w dniu 2 (0,135 g na komorę), 1 pastylkę w dniu 3 (0,045 g na komorę), a następnie żadnej, aby całkowicie przejść myszy na dietę ograniczoną nocą.
      UWAGA: Upewnij się, że myszy nie mają ograniczeń kalorycznych. Uśrednij dzienne spożycie pokarmu myszy na przedział w oparciu o linię bazową ad libitum i podaj im taką samą ilość pokarmu, rozprowadzając go tylko w przedziałach na cztery noce.
    3. Monitoruj spożycie pokarmu przez 2 tygodnie po tym, jak myszy przystosują się do schematu ograniczonego nocowania. W tym okresie dostosuj ilość jedzenia podawanego każdej myszy, aby lepiej odpowiadała jej całkowitemu spożyciu pokarmu (Rysunek 3A). Zazwyczaj dodaje się granulki pokarmu (1 pastylka na każdą z czterech komór nocnych), gdy myszy zjadają całe swoje pożywienie przez dwie kolejne noce.
    4. Zważ myszy pod koniec 2-tygodniowego okresu, aby monitorować wszelkie zmiany masy ciała spowodowane schematem karmienia. Pod koniec tego okresu znieczulij myszy izofluranem i poddaj je eutanazji przez dekapitację. Zbierz tkanki i przeanalizuj je pod kątem codziennych zmian wynikających z paradygmatu żywienia.
  4. Aklimatyzacja samców myszy do diety arytmicznej (AR)
    1. Wykonaj kroki 2.1.1-2.1.4, aby uzyskać punkt odniesienia karmienia ad libitum. W tym eksperymencie dane zebrano od samców myszy C57BL/6 w wieku od 2 do 4 miesięcy narażonych na LD 12:12 (n = 18 samców).
    2. Po tygodniu diety ad libitum oblicz średnie dzienne spożycie pokarmu i podziel tę liczbę przez 8, aby uzyskać ilość pokarmu, która ma być dostarczana w każdym przedziale. Osiągnij karmienie AR, upewniając się, że myszy otrzymują równą ilość pokarmu we wszystkich ośmiu przedziałach w ciągu dnia.
    3. Następnie umieść myszy na diecie przejściowej, stopniowo zmniejszając, przez 3-5 dni, ilość pokarmu podawanego na przedział, aby ostatecznie znieść jakikolwiek rytm przyjmowania pokarmu (jak pokazano w Rysunek 3B). Będąc na diecie AR, upewnij się, że myszy mają dostęp do 1/8 dziennego spożycia pokarmu w każdym z ośmiu przedziałów, a tym samym dostęp do pożywienia co 3 godziny. Upewnij się, że myszy nie mają ograniczeń kalorycznych.
    4. Utrzymuj myszy na diecie AR przez 2 tygodnie lub dłużej (Ryc. 3B).
    5. Podczas diety AR codziennie dostosowuj pokarm, aby upewnić się, że myszy zostawiają tylko kilka granulek (zwykle mniej niż 5). Gwarantuje to, że myszy otrzymują odpowiednią ilość pożywienia i nie mają ograniczeń kalorycznych. Dokonaj korekty, zmniejszając lub dodając granulki we wszystkich ośmiu komorach lub zmniejszając lub dodając granulki w dwóch przeciwległych komorach, aby nie wywoływać żadnych rytmów przyjmowania pokarmu.
      UWAGA: Myszy karmione dietą AR pozostawiają pokarm prawie wyłącznie między ZT3 a ZT9 (od 3 do 9 godzin po włączeniu światła), ale są głodne w nocy i gryzą dozownik pokarmu, aby uzyskać dostęp do następnej komory. Niemniej jednak myszy karmione AR nie mają ograniczeń kalorycznych i w rzeczywistości z czasem przybierają na wadze więcej niż myszy karmione NR.
    6. Zważ myszy pod koniec 2-tygodniowego okresu, aby monitorować wszelkie zmiany masy ciała spowodowane schematem karmienia. Pod koniec tego okresu znieczulij myszy izofluranem i poddaj je eutanazji przez dekapitację. Zbierz tkanki i przeanalizuj je pod kątem codziennych zmian wynikających z paradygmatu żywienia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej system żywienia może być używany do długotrwałego manipulowania rytmicznym przyjmowaniem pokarmu u myszy. System ten zasadniczo odsłania nową komorę na żywność myszy co 3 godziny, umożliwiając badaczowi specyficzne manipulowanie jedzeniem w każdej komorze. Jedno z zastosowań miało na celu analizę profilu spożycia pokarmu w okresie 24 godzin. Dane wskazują, że myszy WT karmione normalną karmą ad libitum zjadają około 75% swojego jedzenia w nocy (Rysunek 2A). Co więcej, większość pokarmów spożywanych w ciągu dnia ma miejsce w ciągu 3 godzin przed zgaszeniem światła.

Myszy karmione HFD ad libitum jadły więcej jedzenia w pierwszych 2 dniach ekspozycji, prawdopodobnie z powodu nowości HFD (Rysunek 2A). Po 2 dniach spożycie HFD pozostało rytmiczne, ale ze zmniejszoną amplitudą w porównaniu do karmienia normalną karmą ad libitum. Podczas gdy zarówno samce, jak i samice myszy WT były karmione HFD, stwierdzono, że samice myszy gromadziły dużą ilość pożywienia na pokrywie aparatu do karmienia i w klatce, podczas gdy samce nie wykazywały zauważalnego gromadzenia. Jak wspomniano powyżej, gromadzenie żywności może skutkować błędnym obliczaniem spożycia żywności i prowadzić do błędnej interpretacji danych. Ponadto samice myszy częściej wgryzają się w plastikowe krawędzie kubków na jedzenie, zwłaszcza w przegródkach nocnych. Samce myszy wykazały znaczny przyrost masy ciała po 1 tygodniu normalnej karmy ad libitum i po 1 tygodniu HFD (Rysunek 2E). Podobny trend zaobserwowano u samic myszy, ale nie osiągnięto znaczących wartości p, prawdopodobnie częściowo z powodu mniejszej liczby użytych samic w porównaniu z samcami.

Myszy przeszły na dietę NR jedzą swoje dzienne całkowite kalorie tylko w nocy, bez znaczącego spadku spożycia kalorii przez pierwsze 3-5 tygodni (Rysunek 3A). Dłuższa ekspozycja na harmonogram NR zmniejsza średnie dzienne spożycie kalorii o 10%-15% w porównaniu z myszami karmionymi ad libitum, jak opisano w innym miejscu34. Myszy przeszły na dietę AR spożywały swoje dzienne całkowite kalorie w równych ilościach w ciągu dnia, co prowadziło do dramatycznego osłabienia dziennego rytmu przyjmowania pokarmu (Rysunek 3B). Jeśli chodzi o harmonogram karmienia NR, średnia dzienna ilość spożywanych kalorii nie ma wpływu na harmonogram karmienia AR przez pierwsze 3-5 tygodni ekspozycji, ale zmniejsza się wraz z dłuższą ekspozycją. Myszy wykazywały przyrost masy ciała po harmonogramach NR (Rysunek 3C) i AR (Figura 3C).

figure-results-1
Rysunek 1: Projekt i budowa systemu aparatury zasilającej. (A) Wymiary podstawy z PVC dla systemu karmienia oraz opis miejsc, w których należy wykonać otwory do zamocowania timera. (B) 24-godzinny zegar przed i po ponownym wykorzystaniu drutu i wierceniu w celu umieszczenia kubka na żywność. (C) Zmontowana szara podstawa i timer wraz z 4-calową rurą PVC. (D) Ośmiokomorowy kubek na żywność po przycięciu zewnętrznych krawędzi. (E) Ostateczny układ klatek z kubkiem na żywność pokrytym 4-calową nakrętką, tak aby w danym momencie dostępna była tylko jedna komora. (F) Transport wielu kubków z jedzeniem podczas eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Profile żywieniowe w różnych reżimach żywieniowych. (A) Profil żywieniowy samców myszy WT karmionych ad libitum z normalną karmą (NC) przez 7 dni i dietą wysokotłuszczową (HFD) przez dodatkowe 7 dni. Kolorowe linie reprezentują poszczególne profile myszy (n = 7), a linia oznacza średnią ± SEM siedmiu myszy. (B) Dieta wysokotłuszczowa przed i po krojeniu. (C) Średnie dzienne spożycie pokarmu co 3 godziny ± SEM (n = 7). Średnia została obliczona z ostatnich 5 dni harmonogramu karmienia NC lub HFD. (D) Średnia (po lewej) i procent (po prawej) spożycia pokarmu w ciągu dnia i nocy dla myszy karmionych NC lub HFD. Wartości reprezentują średnią z siedmiu myszy ± SEM i zostały obliczone na podstawie danych dotyczących spożycia pokarmu w ciągu ostatnich 5 dni harmonogramów karmienia NC lub HFD. * p < 0,05 między dwiema grupami (sparowany test t). (E) Średnia masa ciała myszy wykorzystanych w eksperymencie po 1 tygodniu NC i 1 tygodniu HFD. Dane dla mężczyzn (po lewej) i kobiet (po prawej) są pokazane z * p < 0,05 między dwiema grupami (sparowany test t). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Manipulowanie codziennym rytmem przyjmowania pokarmu. (A) Profil żywieniowy samców myszy WT karmionych normalną karmą ad libitum przez 2 dni, przestawiony na reżim żywienia ograniczonego nocą (NR) przez 3 dni i utrzymywany w ramach karmienia NR przez 8 nocy. Kolorowe linie reprezentują poszczególne profile myszy (n = 18), a linia oznacza średni ± SEM 18 myszy. Szara gwiazdka oznacza nieprawidłowe działanie timera dla tej myszy w tym pojedynczym dniu, w którym czasomierz przestał się obracać. (B) Profil żywieniowy samców myszy WT karmionych normalną karmą ad libitum przez 2 dni, przejściem na arytmiczny (AR) reżim karmienia przez 1 dzień i utrzymywany w ramach karmienia AR przez 8 nocy. Kolorowe linie reprezentują poszczególne profile myszy (n = 18), a linia wskazuje średnią ± SEM 18 myszy. (C) Średnia masa ciała myszy wykorzystanych w eksperymencie po 2 tygodniach ekspozycji na diety NR i AR. Dane są pokazane z * p < 0,05 między dwiema grupami (sparowany test t). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zalety i wady istniejących systemów żywienia. Tabela przedstawiająca różne systemy żywienia używane do manipulowania pobieraniem pokarmu, z krótkim opisem zalet i wad każdego systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Koszt materiałów potrzebnych do budowy systemu karmienia. Tabela zawierająca koszt elementów niezbędnych do budowy systemu żywienia opisanego w tym artykule wraz z szacunkowym kosztem budowy w przeliczeniu na klatkę. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad manipulacją rytmami karmienia i ich wpływem na fizjologię. Opisana tutaj konstrukcja i wykorzystanie systemu żywienia może być wykorzystana jako skuteczna metoda manipulowania pobieraniem pokarmu. Protokół wykorzystuje wspólny 24-godzinny timer i kubek na żywność zaprojektowany jako ośmiokomorowy organizer jako kluczowe elementy systemu. Koszyki można z łatwością zbudować przy użyciu zaledwie kilku łatwo dostępnych narzędzi, a obsługa systemu jest przyjazna dla użytkownika. Niektóre z kluczowych aspektów protokołu dostosowania systemu do manipulowania rytmicznym przyjmowaniem pokarmu obejmują codzienną zmianę kubków z jedzeniem od momentu przekręcenia zegara w ciągu 24 godzin, ręczne liczenie lub ważenie pozostałego pokarmu oraz codzienną regulację liczby granulek do karmienia AR. Zazwyczaj plastikowe wióry są widoczne, gdy myszy są głodne i nie otrzymują odpowiedniego pożywienia. Ten problem można rozwiązać, dodając kilka dodatkowych granulek żywności, przestrzegając schematu karmienia, aż nie będzie widać żadnych plastikowych wiórów. W przypadku żywienia AR, w którym należy dostosować codzienny pokarm, należy uważać, aby nie indukować rytmu przyjmowania pokarmu (ryc. 3B). Dlatego lepiej jest dodawać lub odejmować granulki w przeciwległych przedziałach, aby myszy były karmione arytmicznie.

System ten można dodatkowo ulepszyć, pokrywając kubki na żywność warstwą żywicy epoksydowej, aby zapobiec gryzieniu plastiku przez myszy, a tym samym przedłużyć żywotność kubków na żywność. Powierzchnię timera do umieszczania kubka na żywność można również zmodyfikować, aby kubek na żywność był płasko i stabilnie osadzony na zegarze. Może to zapobiec przypadkowemu zatrzymaniu timera spowodowanemu nierównomiernie umieszczonym timerem. Niektóre elementy klatki, takie jak kubki na żywność, można również wydrukować w 3D w celu obniżenia kosztów i dostosować do upodobań badacza. Może to obejmować kubki na żywność z więcej niż ośmioma przegródkami, co może zapewnić lepszą rozdzielczość czasową niż obecne okno 3 godziny.

Chociaż system ten jest bardzo wydajny, ma pewne ograniczenia, takie jak pracochłonność, ponieważ badacz nadal musi zmieniać kubki z jedzeniem co 24 godziny i wymaga od niego ręcznego liczenia/ważenia pozostałej żywności. Ponadto zegary muszą być od czasu do czasu monitorowane w celu zidentyfikowania potencjalnych problemów i/lub tego, czy przestały działać. Można to osiągnąć, licząc granulki pokarmu pozostałe po karmieniu (np. poprzez określenie, czy niektóre myszy jadły pokarm tylko w kilku komorach, a niektóre komory pozostawiały nietknięte). Innym ograniczeniem tego systemu jest to, że może on nie działać tak dobrze z samicami myszy, ponieważ kilka eksperymentów przeprowadzonych na samicach wykazało, że mają one tendencję do gromadzenia pożywienia i żucia plastiku bardziej niż samce myszy.

Niemniej jednak ten system żywienia jest bardzo skuteczny w manipulowaniu pobieraniem pokarmu, jest łatwy w budowie, obsłudze, utrzymaniu i jest niedrogi w porównaniu z drogimi automatycznymi podajnikami dostępnymi na rynku. Można go łatwo dostosować i zmodyfikować w celu dostosowania do wymagań badacza i nie wymaga specjalnego szkolenia do obsługi systemu. Co ważne, timery wytwarzają tylko niewielką ilość stałego białego szumu, co uniemożliwia myszom kojarzenie jakichkolwiek dźwięków z dostępnością pożywienia.

Podsumowując, w artykule opisano innowacyjny system żywienia, który może być stosowany do monitorowania dziennego spożycia pokarmu u myszy i może być dostosowany do karmienia myszy według różnych paradygmatów, takich jak karmienie ograniczone czasowo, karmienie arytmiczne i karmienie na diecie wysokotłuszczowej. System ten uzupełnia listę narzędzi, które można wykorzystać do odpowiedzi na ważne pytania w dziedzinie rytmicznego przyjmowania pokarmów i jego wpływu na fizjologię.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez R01DK128133 grantowe od NIH/NIDDK (dla J.S.M.) oraz fundusze startowe z Texas A&M University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#6 x 0,75 cala śruba z blachy ze stali nierdzewnej z stożkowym Phillips (50 sztuk)Everbilt#800172
#8 x 1,5 cala śruba z blachy ocynkowanej Phillips z stożkowym (100 sztuk)Everbilt #801622
0,25 cala szary arkusz PVC (24 cale x 48 cali)USPlastic#45088
4-calowa rura PVC (10 stóp)Home Depot#531103
45 mg bezpyłowe precyzyjne peletyBio-Serv#F0165
6 ft. PrzedłużaczHDXHD#145-017
Pojemnik na żywność (ośmiokomorowy organizer na biżuterię) JewelrySupply#PB8301
Indoor Basic TimerGeneral Electric# 15119
Oatey 4-calowa nasadka testowa do rur ABS z nokautemHome Depot#39103D
Dieta dla gryzoni z 45 kcal% tłuszczu (z czerwonym barwnikiem)Diety badawcze#D12451

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of light and temperature in the regulation of circadian gene expression in Drosophila. PLoS Genetics. 3 (4), 0492-0507 (2007).
  2. Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
  3. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
  4. Kawamoto, T., et al. Effects of fasting and re-feeding on the expression of Dec, Per1, and other clock-related genes. Journal of Biochemistry. 140 (3), 401-408 (2006).
  5. Lamia, K. A., Storch, K. F., Weitz, C. J. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (39), 15172-15177 (2008).
  6. Oosterman, J. E., Kalsbeek, A., La Fleur, S. E., Belsham, D. D. Impact of nutrients on circadian rhythmicity. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 308 (5), 337-350 (2015).
  7. Pitts, S. N., Perone, E., Silver, R. Food-entrained circadian rhythms are sustained in arrhythmic Clk/Clk mutant mice. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 285, 57-67 (2003).
  8. Sheward, W. J., et al. Entrainment to feeding but not to light: Circadian phenotype of VPAC 2 receptor-null mice. Journal of Neuroscience. 27 (16), 4351-4358 (2007).
  9. Gekakis, N., et al. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280 (5369), 1564-1569 (1998).
  10. King, D. P., et al. Positional cloning of the mouse circadian Clock gene. Cell. 89 (4), 641-653 (1997).
  11. Kume, K., et al. mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98 (2), 193-205 (1999).
  12. Shearman, L. P., et al. Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock. Science. 288 (5468), 1013-1019 (2000).
  13. Beytebiere, J. R., et al. Tissue-specific BMAL1 cistromes reveal that rhythmic transcription is associated with rhythmic enhancer-enhancer interactions. Genes and Development. 33 (5-6), 294-309 (2019).
  14. Menet, J. S., Pescatore, S., Rosbash, M. CLOCK: BMAL1 is a pioneer- like transcription factor. Genes and Development. 28 (1), 8-13 (2014).
  15. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
  16. Mure, L. S., et al. Diurnal transcriptome atlas of a primate across major neural and peripheral tissues. Science. 359 (6381), (2018).
  17. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Translational Medicine. 10 (458), 1-8 (2018).
  18. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: Implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16219-16224 (2014).
  19. Menet, J. S., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Rosbash, M. Nascent-Seq reveals novel features of mouse circadian transcriptional regulation. eLife. 2012 (1), 1-25 (2012).
  20. Miller, B. H., et al. Circadian and CLOCK-controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3342-3347 (2007).
  21. Cailotto, C., et al. The suprachiasmatic nucleus controls the daily variation of plasma glucose via the autonomic output to the liver: Are the clock genes involved. European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2531-2540 (2005).
  22. Eckel-Mahan, K. L., et al. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5541-5546 (2012).
  23. Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development. 14 (23), 2950-2961 (2000).
  24. Saini, C., et al. Real-time recording of circadian liver gene expression in freely moving mice reveals the phase-setting behavior of hepatocyte clocks. Genes and Development. 27 (13), 1526-1536 (2013).
  25. Stokkan, K. A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., Menaker, M. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science. 291 (5503), 490-493 (2001).
  26. Atger, F., et al. Circadian and feeding rhythms differentially affect rhythmic mRNA transcription and translation in mouse liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 6579-6588 (2015).
  27. Greenwell, B. J., et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the hepatic circadian clock in mice. Cell Reports. 27 (3), 649-657 (2019).
  28. Izumo, M., et al. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant. eLife. 3, 04617(2014).
  29. Mange, F., et al. Diurnal regulation of RNA polymerase III transcription is under the control of both the feeding-fasting response and the circadian clock. Genome Research. 27 (6), 973-984 (2017).
  30. Van Der Veen, D. R., et al. Impact of behavior on central and peripheral circadian clocks in the common vole Microtus arvalis, a mammal with ultradian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (9), 3393-3398 (2006).
  31. Vollmers, C., et al. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21453-21458 (2009).
  32. Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted feeding prevents obesity and metabolic syndrome in mice lacking a circadian clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
  33. Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metabolism. 15 (6), 848-860 (2012).
  34. Acosta-Rodríguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metabolism. 26 (1), 267-277 (2017).
  35. Chung, H., et al. Time-restricted feeding improves insulin resistance and hepatic steatosis in a mouse model of postmenopausal obesity. Metabolism: Clinical and Experimental. 65 (12), 1743-1754 (2016).
  36. Sen, S., et al. Ultradian feeding in mice not only affects the peripheral clock in the liver, but also the master clock in the brain. Chronobiology International. 34 (1), 17-36 (2017).
  37. Xie, X., et al. Natural food intake patterns do not synchronize peripheral clocks. BMC Biology. 18 (160), 1-11 (2020).
  38. Swamy, S., et al. Circadian disruption of food availability significantly reduces reproductive success in mice. Hormones and Behavior. 105, 177-184 (2018).
  39. Xin, H., et al. Protocol for setup and circadian analysis of inverted feeding in mice. STAR Protocols. 2 (3), 100701(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Schematy ywieniarytm oko odobowyywienie ograniczone czasowodieta wysokot uszczowasystem karmienia myszychoroby metabolicznepomiar spo ycia pokarmuywienie arytmicznemyszy typu dzikiego

Powiązane artykuły