Artykuł metodologiczny

Stosowanie minimalnie inwazyjnych metod do oceny zużycia paliwa i rytmu okołodobowego u osób starszych

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64628

⸱

5 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Aging, University of Florida, 2Department of Clinical and Health Psychology, College of Public Health and Health Professions, University of Florida, 3Department of Health Outcomes and Bioinformatics, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono nowatorski i minimalnie inwazyjny protokół do oceny synergicznego wpływu zużycia paliwa i rytmu okołodobowego na starzejące się osoby, wykorzystując komórki jednojądrzaste krwi obwodowej.

Streszczenie

Starzenie się wiąże się z wieloma zmianami fizjologicznymi, które synergistycznie i niezależnie przyczyniają się do niepełnosprawności fizycznej i ryzyka chorób przewlekłych. Chociaż etiologia niepełnosprawności fizycznej związanej z wiekiem jest złożona i wieloczynnikowa, spadek funkcji mitochondriów wydaje się zbiegać z postępem pogorszenia funkcji u wielu osób starszych. Powód, dla którego wraz ze starzeniem się następuje spadek funkcji mitochondriów, pozostaje nieuchwytny, ale pojawiające się badania naukowe wskazują, że zarówno metabolizm paliw, jak i rytmy okołodobowe mogą wpływać na funkcjonowanie mitochondriów.

Ostatnie badania wykazały, że rytmy okołodobowe zostają zaburzone wraz z wiekiem, a zakłócone rytmy okołodobowe mają patologiczne konsekwencje, które wpływają na funkcje mitochondriów i pokrywają się z wieloma przewlekłymi chorobami związanymi z wiekiem. Obecne ilościowe metody bezpośredniej oceny funkcji mitochondriów są inwazyjne i zazwyczaj wymagają biopsji mięśni, co może stwarzać trudności z rekrutacją uczestników i przestrzeganiem zaleceń dotyczących badania, biorąc pod uwagę postrzegany poziom potencjalnego bólu i ryzyka. W ten sposób dostosowano innowacyjny i stosunkowo nieinwazyjny protokół oceny zmian funkcji mitochondriów na poziomie komórkowym i wzorców okołodobowych u osób starszych. W szczególności analizator strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym służy do oceny bioenergetycznej funkcji bioenergetycznej mitochondriów białych krwinek w warunkach zróżnicowanej dostępności substratów.

Analizowane są również ekspresje genów zegara okołodobowego w białych krwinkach w celu korelowania krzyżowego z bioenergetyką mitochondriów oraz wyniki rytmu okołodobowego. Uważa się, że te innowacyjne podejścia metodologiczne pomogą w przyszłych badaniach klinicznych, zapewniając minimalnie inwazyjne metody badania preferencji substratów mitochondrialnych i rytmów okołodobowych u osób starszych.

Wprowadzenie

Postęp w minionym stuleciu doprowadził do wzrostu średniej długości życia i populacji starzejących się dorosłych. Patrząc w przyszłość, przewiduje się, że odsetek dorosłych w wieku 65 lat i starszych wzrośnie o 5% w latach 2020-2050 w Stanach Zjednoczonych1. Ten wzrost średniej długości życia nie oznacza wydłużenia okresu zdrowia – okresu życia związanego z niezależnym funkcjonowaniem. Rzeczywistość jest taka, że starzeniu się towarzyszą niezliczone zmiany biologiczne, które wpływają na metabolizm komórkowy i fizjologię, powodując stopniowe pogorszenie funkcji poznawczych i fizycznych2,3. Ponieważ oczekiwana długość życia człowieka stale rośnie, istnieje większa potrzeba zachowania zdolności funkcjonalnych i niezależności wraz z wiekiem4.

Od dawna wiadomo, że spadek sprawności fizycznej i niezależności wraz z wiekiem jest wieloczynnikowy, choć często wiąże się z początkiem choroby przewlekłej i ostrymi zdarzeniami wywołującymi5. Z drugiej strony, wykazano, że te spadki sprawności fizycznej i charakterystyki mięśni są związane z rozwojem niepełnosprawności wraz z wiekiem bez wyraźnego związku z pojedynczą chorobą6. Ze względu na trudności w poznaniu dokładnej etiologii chorób przewlekłych i niepełnosprawności fizycznej, uważa się, że upośledzenie funkcji mitochondriów zbiega się z początkiem i postępem choroby przewlekłej oraz utratą funkcji fizycznych u starzejących się dorosłych7,8.

Mitochondria dostarczają większość trifosforanu adenozyny (ATP), niezbędnego dla wielu procesów komórkowych9. Wysoce oksydacyjne tkanki polegają na mitochondriach w celu odpowiedniej produkcji energii; wraz ze starzeniem się, spadkiem zdolności oksydacyjnych i syntezy mitochondrialnej ATP. Spadek ten jest częściowo spowodowany oksydacyjnym uszkodzeniem mitochondrialnego DNA (mtDNA), które powoduje przyrostową akumulację mutacji i delecji mtDNA10. Nagromadzenie mutacji i delecji mtDNA powoduje zmniejszenie powstawania funkcjonalnych białek łańcucha transportu elektronów, powodując tym samym zmniejszoną zdolność komórek do wytwarzania ATP. Związany z wiekiem spadek funkcji mitochondriów jest najbardziej zauważalny w tkankach silnie oksydacyjnych, takich jak serce i mięśnie szkieletowe11. Badania wykazały, że mitochondria mięśni brzuchatych łydki w starszych próbkach szczurów wykazują około 50% zmniejszenie produkcji i zawartości ATP w porównaniu z młodszymi próbkami12. Ponadto wykazano, że zdolność mitochondrialnej produkcji ATP w ludzkich mięśniach szkieletowych zmniejsza się o około 8% na dekadę życia13. Odkrycia te sugerują, że związane z wiekiem spadki funkcji mitochondriów mogą przyczyniać się do zmniejszenia produkcji energii w organizmach.

Za kluczowy regulator aktywności mitochondriów uważa się aktywowany przez proliferatory peroksysomów receptor γ (PPARγ) koaktywator-1 (PGC-1α)14. Pogorszenie aktywności PGC-1α lub spadek jej liczebności prowadzi do zmniejszenia aktywności oksydacyjnej mitochondriów, a w konsekwencji do upośledzenia produkcji energii. Ponadto spadek jakości mitochondriów może wpływać na jakość mięśni szkieletowych, a następnie prowadzić do rozwoju lub zaostrzenia sarkopenii, dynapenii i spadku zdolności funkcjonalnej15,16. Dowody na związany z wiekiem jednoczesny spadek funkcji mitochondriów i jakości mięśni szkieletowych sugerują związek między upośledzeniem mitochondriów a patogenezą pogorszenia funkcjonalności17. Ostatnio zostało to potwierdzone u funkcjonalnych osób starszych mieszkających w społecznościach, pokazując, że zmniejszenie metabolizmu mitochondriów mięśni szkieletowych przewiduje spadek mobilności w tej populacji18. Chociaż dokładny mechanizm prowadzący do spadku mitochondriów wraz z wiekiem jest niejasny, ostatnie dowody wskazują na wzajemne oddziaływanie między zegarem okołodobowym a funkcją mitochondriów, co ma konsekwencje dla wykorzystania paliwa mitochondrialnego i biogenezy19.

Zużycie paliwa
Wydaje się, że na funkcję mitochondriów wpływa metabolizm paliwa i rodzaj paliwa wykorzystywanego na poziomie komórkowym w tkance mięśni szkieletowych11. W okresach wyczerpywania się paliwa, w szczególności niedoboru węglowodanów u ludzi, zmienia się preferencja paliwa do produkcji energii (mitochondrialnej). Przy niskim poziomie glukozy preferencja paliwowa przesuwa się z glukozy na kwasy tłuszczowe i ciała ketonowe pochodzące z kwasów. Ten przełącznik metaboliczny charakteryzuje się zwiększeniem metabolizmu lipidów w adipocytach, po którym następuje zwiększone uwalnianie ketonów do krwi4. Zmiana wykorzystania paliwa z glukozy na ketony przy diecie ketogenicznej wydaje się mieć korzystny wpływ na produkcję reaktywnych form tlenu w mitochondriach, obronę antyoksydacyjną, syntezę ATP i biogenezę20.

Metaboliczne przejście z metabolizmu węglowodanów na metabolizm lipidów następuje w okresach niskiej dostępności składników odżywczych w środowisku i gdy zapasy glikogenu zostały wyczerpane. Po zainicjowaniu tego przełącznika zmagazynowane trójglicerydy są rozkładane na glicerol, substrat do glukoneogenezy, i wolne kwasy tłuszczowe, które są transportowane do wątroby w celu utlenienia przez β-oksydację do acetylokoenzymu A (acetylo-CoA). Ciała ketonowe są syntetyzowane, głównie w wątrobie, przez dwuetapową kondensację trzech cząsteczek acetylo-CoA do β-hydroksy-β-metyloglutarylo-CoA, które są następnie dalej przetwarzane na ciała ketonowe, w tym acetooctan i hydroksymaślan 3-βety21. Te ciała ketonowe są rozprowadzane do tkanek w całym ciele, przy czym największe zużycie występuje w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych21. Wraz z wiekiem utlenianie mitochondrialnych kwasów tłuszczowych ulega osłabieniu, co wpływa na przełącznik metaboliczny22. Zaproponowano, że upośledzenie wykorzystania paliwa mitochondrialnego prowadzi do dalszej dysfunkcji mitochondriów, co z kolei przyczynia się do chorób związanych z wiekiem i pogorszenia funkcjonalności23.

Zmiany w zużyciu tlenu w mitochondriach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostały zbadane w celu oceny wzorców związanych z dysfunkcją i unaczynieniem. Hartman i wsp. przeprowadzili badanie, które miało na celu określenie korelacji między zużyciem tlenu a dylatacją o zróżnicowanym pośrednictwie, co sugeruje związek między dysfunkcją mitochondriów a dysfunkcją komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych24. Jeśli chodzi o inne narządy, PBMC zostały skorelowane z wyższymi funkcjami poznawczymi i funkcjonowaniem mózgu, co określono za pomocą respirometrii25. W związku z tym bioenergetyka PBMC i zdolność oddechowa mogą służyć jako potencjalne biomarkery do oceny zdolności funkcjonalnej narządów lub tkanek w całym ciele.

Rytm okołodobowy
Innym ważnym czynnikiem wpływającym na zdrowie mitochondriów jest rytm okołodobowy. Rytmy okołodobowe to ~24-godzinne oscylacje w zachowaniu i fizjologii, które występują przy braku sygnałów środowiskowych26. Rytmy te funkcjonują w sposób predykcyjny, wspierając homeostazę systemu i tkanek. Mechanizmem, który leży u podstaw rytmów okołodobowych, jest pętla sprzężenia zwrotnego transkrypcji-translacji zwana zegarem okołodobowym27. W ciągu ostatnich 15 lat wykazano, że mechanizm zegara okołodobowego istnieje praktycznie we wszystkich komórkach w całym ciele28. Oprócz utrzymywania czasu, mechanizm zegara molekularnego przyczynia się również do codziennego programu ekspresji genów, określanego jako wyjście zegara okołodobowego29. Geny wyjściowe zegara są unikalne dla każdego typu tkanki i są funkcjonalnie związane ze szlakami ważnymi dla metabolizmu komórkowego, autofagii, naprawy i homeostazy. Ostatnie dowody wykazały, że zdrowie mitochondriów zależy od funkcji zegara okołodobowego i wpływa na funkcję mitochondriów, w tym biogenezę mitochondriów, wykorzystanie paliwa i mitofagię30.

Pojawiające się dowody zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych wykazały, że wraz z wiekiem występują zaburzenia rytmu okołodobowego31. Należą do nich zakłócenia w normalnych cyklach snu i czuwania, zmniejszona amplituda rytmów temperatury ciała oraz opóźniona zdolność do dostosowania się do zmian w fazie31. Jedno z badań, na przykład, rzuciło wyzwanie systemowi okołodobowemu dorosłych i starszych (20+ miesięcy) myszy, przesuwając harmonogram światła o 6 godzin. Okazało się, że stare myszy potrzebowały więcej czasu, aby ponownie przystosować swoje wzorce aktywności do nowego harmonogramu światła32. Zgodnie ze zmianami w zachowaniu okołodobowym, analiza zegarów tkankowych wykazała, że zarówno centralne, jak i obwodowe zegary tkankowe były upośledzone w starzejącej się kohorcie.

Ostatnio kilka grup przeprowadziło analizę transkryptomiczną zegara okołodobowego i wyjścia zegara w różnych tkankach z wiekiem33. Wyniki tych badań podkreślają, że wraz z wiekiem dochodzi do przeprogramowywania mocy wyjściowej zegara okołodobowego. Oznacza to, że nawet jeśli zegar rdzeniowy zachowuje funkcję pomiaru czasu, geny ukierunkowane na codzienną ekspresję są w dużej mierze różne. Na przykład w dwóch badaniach pobrano biopsje mięśni od ludzi co 4 godziny przez 24 godziny, a wyniki wykazały, że szczyt i dołek ekspresji genów zegarowych są odwrócone między gryzoniami prowadzącymi nocny tryb życia a ludźmi prowadzącymi dobowy tryb życia34,35,36. Wskazuje to, że gdy ekspresja genów zegara jest porównywana wyłącznie na podstawie fazy aktywnej i spoczynkowej (a nie światła i ciemności), wzorce ekspresji genów zegarowych w mięśniach są praktycznie takie same między gatunkami. Sugeruje się, że ta związana z wiekiem zmiana w wyjściu zegara powoduje upośledzenie regulacji szlaków, które obejmują znane cechy starzenia, takie jak funkcja mitochondriów, uszkodzenie i naprawa DNA oraz autofagia37.

Uzasadnienie badania
Związek między funkcją mitochondriów a spadkiem funkcji fizycznych jest dobrze znany. Jednak podstawowa przyczyna dysfunkcji mitochondriów pozostaje przedmiotem debaty. Ostatnie badania sugerują, że wykorzystanie paliwa komórkowego i rytmy okołodobowe mogą odgrywać rolę w tym procesie. Tradycyjne metody oceny funkcji mitochondriów, takie jak pomiar zużycia tlenu w mitochondriach w próbce biopsji mięśni, są często postrzegane jako bolesne i inwazyjne, co może zniechęcać do uczestnictwa, szczególnie w populacjach o niskiej masie mięśniowej, takich jak osoby dorosłe z osłabieniem i sarkopenią38.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia, istnieje potrzeba mniej inwazyjnej metody oceny zmian w wykorzystaniu paliwa komórkowego i rytmie dobowym u osób starszych. Badanie to ma na celu ocenę nowatorskiego, minimalnie inwazyjnego protokołu, który można wykorzystać do oceny metabolizmu paliw i rytmu okołodobowego w tej populacji. Wyniki tego badania przyczynią się do lepszego zrozumienia zmian związanych z wiekiem i reakcji na interwencje medyczne lub behawioralne, służąc jako model dla przyszłych badań w tej dziedzinie.

Protokół

Procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez komisję etyki badań (Polityka Etyki Florydy 1.0104) oraz Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Florydy.

1. Funkcja mitochondriów

  1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)
    1. Zebrać PBMC za pomocą specjalnych probówek do pobierania krwi o pojemności 8 ml (16 mm x 125 mm; zawierających 0,1 M antykoagulant cytrynianu sodu lub antykoagulant heparyny sodu) (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Probówki do pobierania krwi zawierają pożywki do separacji krwi składające się z tiksotropowego żelu poliestrowego i podłoża gradientowego (patrz Tabela materiałów) w celu zwiększenia separacji białych krwinek.
    2. Przetworzone probówki do przygotowania komórek o pojemności 8 ml w ciągu 2 godzin po pobraniu, aby uzyskać realne wyniki.
    3. Wymieszać probówki do pobierania krwi po napełnieniu ich krwią (przez delikatne odwrócenie lub na mikserze) i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez maksymalnie 2 godziny.
    4. Odwirować probówki do pobierania krwi w odpowiednim rotorze wychylnym o stężeniu 2 000 × g przez 15 minut (lub równowartość 30 000 g / min; nie przekraczać 2 000 × g) w temperaturze RT.
      UWAGA: Probówki te są wyższe niż zwykła probówka wirówkowa o pojemności 15 ml; Dlatego należy zwrócić dodatkową uwagę na użycie odpowiedniego wirnika.
    5. Odessać i wyrzucić do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie ~80% warstwy osocza, a następnie zebrać warstwę komórek z probówki do pobierania krwi (za pomocą pipety transferowej) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: W przypadku korzystania z probówki o pojemności 15 ml dodaj 7 ml warstwy komórek i napełnij do 14 ml sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Stosunek komórek do PBS powinien wynosić 1:1. W razie potrzeby użyj wielu rurek. Delikatnie wymieszaj, odwracając światło.
    6. Wirować w odchylanym wirniku o natężeniu 900 × g przez 5 minut (lub równowartość 4 500 g min) w temperaturze pokojowej.
    7. Nie naruszając osadu komórkowego, odessać roztwór PBS i wyrzucić go do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml podłoża podstawowego (BM; patrz tabela materiałów) przez delikatne rozcieranie. Dodaj BM do całkowitej objętości 10 ml i delikatnie wymieszaj, odwracając. Wykonaj zliczanie komórek.
    9. Zawiesinę komórek odwirować w odchylanym rotorze o masie 900 × g przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Gdy komórki są używane tego samego dnia do oceny bioenergetycznej, przejdź do kroku 1.1.10; Jeśli komórki są zamrożone do przechowywania, przejdź do kroku 1.1.13.
    10. Obliczyć objętość pożywki do oznaczania (AM; patrz tabela materiałów) do ponownego zawieszenia następnego osadu komórkowego w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek.
      UWAGA: Na przykład dla gęstości wysiewu 150 000 komórek/studzienkę w 50 μl, pożądane stężenie zawiesiny komórkowej wynosi 3 miliony komórek/ml.
    11. Nie naruszając osadu komórkowego, odessać supernatant i wyrzucić go do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.
    12. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lub mniej AM. Dodaj AM do całkowitej objętości obliczonej dla żądanego stężenia komórek. Komórki są teraz gotowe do wysiewu na powlekanej płytce do hodowli komórkowej (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Poniższe kroki służą do zamrażania komórek do przechowywania (1.1.13-1.1.16) i nie mają zastosowania do procedury tego samego dnia.
    13. W przypadku zamrażania komórek należy odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i wyrzucić go do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.
    14. Delikatnie zawiesić komórki w pożywce do zamrażania (patrz Tabela materiałów) w żądanym stężeniu (5-10 milionów komórek/ml). Podwielokrotność żądanych objętości w oznaczonych kriowialach.
    15. Zawiesinę komórkową należy powoli zamrażać przy użyciu pojemnika do zamrażania (patrz tabela materiałów) przez co najmniej 4 godziny lub przez noc w temperaturze -80 °C.
    16. Po 4 godzinach lub następnego ranka przenieś kriowiale do magazynu ciekłego azotu, gdzie powinny znajdować się w fazie gazowej.
    17. Dzień przed pomiarem pokryj dno studzienki mikropłytki do hodowli komórkowej (patrz Tabela materiałów) klejem komórkowym (patrz Tabela materiałów). Przygotować klej zgodnie z instrukcją producenta, o zalecanym stężeniu 22,4 μg/μl, rozcieńczając odpowiednią objętość roztworu podstawowego kleju w 0,1 M wodorowęglanie sodu (pH 8,0). Nałożyć 25 μl kleju na każdą studzienkę mikropłytki do hodowli komórkowej.
    18. Po 20 minutach odsysać pozostałą ciecz z każdej studzienki i dwukrotnie umyć studzienki 200 μl sterylnej, oczyszczonej wody. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego (przez ~2 godziny).
    19. Zawiń talerz w folię aluminiową lub umieść go w zamkniętym pojemniku wtórnym i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Ocena bioenergetyczna PBMC za pomocą analizatora strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym
    UWAGA: Za pomocą analizatora strumienia i czytnika wielomodowego (patrz Tabela materiałów) określono optymalną gęstość wysiewu 150 000 PBMC na studzienkę, końcowe stężenie cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP) w unsprzęgaczu wynoszące 2 μM oraz końcowe stężenie Hoechst 33342 wynoszące 4 μM (przy czasie inkubacji wynoszącym co najmniej 20 minut po wstrzyknięciu).
    1. Aby nawodnić wkłady czujników za pomocą hydroboostera, wyjmij wkład z czujnikiem wraz z tabliczką użytkową z pudełka i umieść wkład "sensor do góry" na stole. Wlej 200 μl kalibru (patrz Tabela materiałów) do każdej studzienki płytki użytkowej i mocno umieść hydrobooster na płytce użytkowej, a następnie wkład czujnika. Sprawdź i usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza i umieść na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °Cbez emisji CO2
      2. .
    2. Włącz analizator strumienia, a następnie otwórz oprogramowanie do analizy testowej (patrz Tabela materiałów). Ustaw temperaturę na 37 °C. Pozostaw instrument włączony na noc, aby umożliwić ustabilizowanie się ustawionej temperatury.
      UWAGA: Następujące kroki programowania (1.2.4-1.2.10) można wykonać dzień przed lub w dniu eksperymentu
    3. Aby zaprogramować plik oprogramowania do analizy testów (patrz tabela materiałów), otwórz szablon testu stresu utleniania substratu. Przejdź do Definicje grup, otwórz kartę Strategie wstrzykiwania, edytuj Test stresu Inhibitor + Sub Ox na Test stresu Sub Ox na Test stresu Sub Ox i dodaj dwie kolejne strategie iniekcji: UK5099 + Sub Ox Stress Test i BTPES + test warunków skrajnych sub ox. W ramach każdej strategii wstrzykiwania, w oknie Warunek wstrzyknięcia, należy kliknąć na A dla portu A i wprowadzić końcowe stężenie odpowiedniego inhibitora (Etomoxir: 4 μM; UK5099: 2 μM; BTPES: 3 μM).
    4. Kliknij porty B, C i D i wprowadź odpowiednie stężenia końcowe (port B: stężenie oligomycyny [1,50 μM], port C: FCCP [2,0 μM]; port D: Rotenon + antymycyna A [0,5 μM]). Dodać Hoechst 33342, 4 μM do okna związków dla portu D.
    5. Otwórz kartę Obróbka wstępna i wybierz obróbkę wstępną, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład: kontrolne, eksperymentalne lub zwyczajowe (np. linia bazowa i kontynuacja). W razie potrzeby dodaj opisy w oknie poniżej.
    6. Otwórz zakładkę Pożywka testowa i z menu rozwijanego Pożywka RPMI wybierz Pożywkę RPMI, pH 7,4, wprowadź numer partii, personel przygotowujący pożywkę, czas przygotowania oraz suplementy dodane do pożywki (10 mM glukozy, 2 mM glutamina, 1 mM pirogronian; patrz Tabela Materiałów).
    7. Otwórz kartę Typ komórki i wprowadź PBMC-Identyfikator podmiotu jako Nazwę, PBMC jako Typ komórki, 150000 jako Gęstość zasiewu, Identyfikator podmiotu jako Źródło, personel, który przygotował komórki, datę przygotowania i dzień rozmrożenia komórki, jeśli dotyczy.
    8. Kliknij Generuj grupy, przejdź do Mapa płyt i przypisz dołki 96-dołkowej płyty do odpowiednich grup. Utrzymuj studnie A1, A12, H1 i H12 przypisane jako studnie tła.
    9. Przejdź do Protocol (Protokół), zaznacz pole Equilibrate (ustawienie domyślne) i wprowadź następujące informacje: Linia bazowa: pięć cykli pomiaru: 3 min mieszania, 0 min oczekiwania i 3 min pomiaru; Pożywka lub inhibitor (port A): sześć cykli pomiarowych: 3 min mieszania, 0 min oczekiwania i 3 min pomiaru; Oligomycyna (port B): trzy cykle pomiarowe: 3 min mieszanie, 0 min oczekiwania i 3 min pomiaru; FCCP (port C): trzy cykle pomiarowe: 3 minuty mieszania, 0 min oczekiwania i 3 minuty pomiaru; Rotenon + antymycyna A + Hoechst 33342 (port D): trzy cykle pomiarowe: 3 minuty mieszania, 0 minut oczekiwania i 3 minuty pomiaru.
    10. W dniu oceny bioenergetycznej należy wyjąć z lodówki powlekaną mikropłytkę do hodowli komórkowej i pozostawić ją do rozgrzania do temperatury cieplnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    11. Przygotować pożywkę testową (AM) przez zmieszanie 97 ml wstępnie podgrzanego BM i suplementów: 1 ml pirogronianu (stężenie końcowe: 1 mM), 1 ml glukozy (stężenie końcowe 10 mM) i 1 ml glutaminy (stężenie końcowe: 2 mM). Umieścić AM w temperaturze 37 °C w inkubatorze innym niż CO2 do czasu użycia.
    12. Aby wysiać komórki, dodaj 50 μl zawiesiny komórkowej (z 1.1.12) zawierającej 150 000 PBMC do każdej studzienki, z wyjątkiem A1, H1, A12 i H12 (przypisanych jako studzienki tła).
      KRYTYCZNE: Optymalna gęstość wysiewu została już wcześniej określona.
    13. Przykryj płytkę ogniwa pokrywką i pozostaw 60 minut na spoczynek komórek w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie komórek.
      KRYTYCZNE: Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby zapewnić pożądany jednorodny rozkład komórek w studzience.
    14. W przypadku obrazowania komórek włącz czytnik wielomodowy (patrz Spis materiałów) na kilka godzin przed pierwszą inkubacją komórek; poczekaj na zakończenie protokołu inicjacji czytnika przed otwarciem oprogramowania do obrazowania (patrz Spis materiałów). Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw temperaturę podgrzewania na 37 °C.
    15. Aby przygotować odczynniki do oznaczania, postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do oznaczania, aby rozpuścić odczynniki, z niewielkimi modyfikacjami, jak przedstawiono w tabeli 1.
      KRYTYCZNE: Optymalne końcowe stężenia FCCP i Hoechst33342 zostały określone wcześniej.
    16. Po 60-minutowym odpoczynku komórek należy sprawdzić studzienki za pomocą mikroskopu do hodowli komórkowych i zwrócić uwagę na wszelkie nieprawidłowości wizualne, takie jak agregacje komórek.
    17. Odwirować płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej w wirówce z odchylanym wirnikiem do mikropłytek o masie 60 × g przez 1 minutę, z minimalnym przyspieszeniem i minimalną przerwaniem; obrócić płytkę i ponownie odwirować przy 40 × g przez 1 minutę. Ustawić przyspieszenie i przerwę na minimum. Inkubować komórki przez 25–30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze innym niżCO2.
      UWAGA: Podczas obrazowania komórek, płytka komórkowa jest inkubowana w podgrzewanym czytniku wielomodowym (patrz Tabela materiałów), a podczas tego okresu inkubacji (inkubacja pierwszej komórki) wykonywany jest obraz w jasnym polu każdej studzienki.
    18. Zeskanuj kod kreskowy płytki do hodowli komórkowej za pomocą skanera kodów kreskowych (patrz Tabela materiałów), wybierz opcję Rozpocznij skanowanie w jasnym polu, umieść płytkę do hodowli komórkowej na tacy na płytkę i rozpocznij wysuwanie tacy. Wybierz studzienki zawierające komórki do skanowania i rozpocznij skanowanie.
    19. Podczas pierwszej inkubacji komórek należy załadować porty wkładu czujnika odczynnikami, jak wskazano w tabeli 1: port (A): 20 μl AM (kontrole), etomoksyr (inhibitor transportu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do mitochondriów), UK 5099 (kwas 2-cyjano-3-(1-fenylo-1H-indol-3-ylo)-2-propenowy; inhibitor mitochondrialnego nośnika pirogronianu) lub BPTES (Bis-2-(5-fenyloacetamido-1, siarczek 3,4-tiadiazolu-2-ylo)etylu; inhibitor przemiany glutaminy w glutaminian); port (B): 22 μl oligomycyny (inhibitora syntazy ATP); port (C): 25 μl FCCP (rozprzęgający cyjanek karbonylu-4 (trifluorometoksy)fenylohydrazon); port (D): 27 μl rotenonu/antymycyny A/Hoechst 33342 (inhibitory odpowiednio kompleksu mitochondrialnego I i III oraz barwnik jądrowy). Włóż wkład czujnika do inkubatora o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2 na kolejne 5 minut.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi ładowania portów.
    20. Wyjąć płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora lub czytnika płytek po pierwszej inkubacji komórek i po zakończeniu obrazowania komórek (jeśli ma to zastosowanie) i dodać ciepłą dawkę AM do każdej studzienki do końcowej objętości 180 μl na studzienkę. Umieścić płytkę komórkową w temperaturze 37 °C w inkubatorze innym niż CO2 2 na kolejne 15-25 minut (inkubacja drugiej komórki).
    21. Rozpocznij test metaboliczny, rozpoczynając kalibrację czujnika podczas inkubacji drugiej komórki. Kliknij Uruchom test, gdy test jest gotowy do rozpoczęcia z kalibracją wkładu czujnika. Po wyświetleniu monitu przenieś wkład czujnika z inkubatora o temperaturze 37 °C bez zawartościCO2 do tacy analizatora strumienia i rozpocznij kalibrację. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania do analizy testowej i po zakończeniu kalibracji wymień tabliczkę użytkową na płytkę kuwe.
      UWAGA: Kalibracja trwa około 20 minut.
    22. Po teście metabolicznym postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i wyjmij wkład czujnika i płytkę ogniwa z urządzenia. Wyjmij wkład czujnika z płytki ogniwa i przykryj płytkę ogniwa pokrywką.
    23. Po ustaleniu czasu inkubacji barwnika Hoechst we wstępnych eksperymentach, zeskanuj kod kreskowy płytki i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby uzyskać fluorescencyjny obraz każdej studzienki zawierającej komórkę za pomocą czytnika wielomodowego.
      UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania i analizy testów jest połączone, co pozwala na importowanie danych dotyczących liczby komórek do pliku danych analizy testu w celu normalizacji danych do liczby komórek.

2. Ekspresja genów zegara okołodobowego

UWAGA: Ekspresja genów zegarowych z PBMC u uczestników zostanie sprawdzona poprzez wyizolowanie RNA za pomocą zestawu krwi RNA (patrz Tabela Materiałów).

  1. Pobierz 3 ml krwi uczestnika bezpośrednio do probówki RNA (patrz tabela materiałów) z 6 ml odczynników stabilizujących. Wiruj przez 10 s, aby w pełni wymieszać.
    UWAGA: Jeśli odczynniki stabilizujące nie zostaną dokładnie wymieszane z próbką krwi uczestnika, istnieje zwiększone ryzyko błędu badania.
  2. Przenieś 1,0 ml ustabilizowanej próbki krwi do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml buforu do lizy erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 10-15 minut. Wiruj probówkę 2x podczas inkubacji. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C przy 400 × g przez 10 minut.
  3. Zidentyfikować osad i ostrożnie wylać supernatant zawierający lizowane krwinki czerwone. Dodać 2 ml buforu do lizy erytrocytów (patrz tabela materiałów), ponownie zawiesić komórki, krótko odwirować i odwirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odlej supernatant i pozostaw probówkę odwróconą do góry dnem na bibułze chłonnej na 1-2 minuty. Przed następnym krokiem zetrzyj płyn wokół brzegu probówki czystym papierem.
  5. Ostrożnie dodać 600 μl buforu do lizy RNA (patrz Tabela materiałów). Postępując zgodnie z protokołem producenta, dodaj β-merkaptoetanol i ponownie zawieś granulkę.
  6. Odpipetować lizat bezpośrednio do jednorazowego homogenizatora z lizatem komórkowym (patrz tabela materiałów), kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością w celu homogenizacji. Wyrzuć jednorazową kolumnę wirową homogenizatora lizatu komórkowego i zachowaj homogenizowany lizat.
  7. Dodać 1 objętość (600 μl) 70% etanolu do homogenizowanego lizatu i wymieszać pipetując. Ostrożnie odpipetować próbkę, łącznie z osadem, który mógł się uformować, do nowej kolumny wirowej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, ale nie zwilżać krawędzi. Wirować przez 15 s przy >8 000 × g.
  8. Przenieść kolumnę wirową (patrz Tabela materiałów) do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Nanieść 700 μl rygorystycznego buforu płuczącego (patrz tabela materiałów) na kolumnę wirową i wirować przez 15 s przy >8 000 × g w celu przemycia. Odrzuć przepływ.
  9. Ostrożnie otworzyć kolumnę wirującą i dodać 500 μl łagodnego buforu myjącego (patrz tabela materiałów). Zamknij nakrętkę i odwiruj z pełną prędkością (20 000 × g) przez 3 minuty.
  10. Przenieś kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odpipetuj 30-50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na membranę krzemionkową. Wirować przez 1 minutę przy >8 000 × g, aby wymyć RNA. Powtórz jeszcze raz.
    UWAGA: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C.
  11. Przeprowadzić obróbkę DNazy na kolumnie przy użyciu zestawu DNazy wolnego od RNaz (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.
  12. Wygeneruj cDNA przy użyciu 500 ng całkowitego RNA i systemu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć wszystkie próbki cDNA w stosunku 1:25 w wodzie wolnej od RNaz i użyć 4 ml do przeprowadzenia ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).
  13. Użyj metody dodawania startera (patrz tabela materiałów), aby zakończyć qRT-PCR z 10 mM każdego ze starterów pokazanych w tabeli 2. Kompletny qRT-PCR przy użyciu systemu czasu rzeczywistego (patrz tabela materiałów).
  14. Normalizuj poziomy mRNA wybranych genów za pomocą poziomów mRNA Rpl26. Użyj metody 2-DDCt, aby obliczyć względną kwantyfikację.
  15. Aby określić, czy ekspresja danego mRNA wykazywała oscylację okołodobową, użyj testu opartego na prawdopodobieństwie LR_rhythmicity39 (przy użyciu p≤ 0,01) do wykrywania rytmu okołodobowego w jednym warunkach eksperymentalnych40.

3. Plan analizy danych

UWAGA: Inwentarz medyczny zostanie użyty do kategoryzacji uczestników na podstawie zużycia leków43.

  1. Użyj modelu liniowego o mieszanych efektach, w którym wiek, płeć, waga, wzrost, ciśnienie krwi, tętno i inne czynniki ryzyka powinny być uwzględnione jako współzmienne.
  2. Należy dołączyć termin efektu losowego, aby wyjaśnić korelację danych wewnątrzobiektowych.
  3. W celu dopasowania modelu należy zaimplementować wsteczny wybór zmiennych z zasadą hierarchiczną.
  4. Z dopasowanego modelu zmierz zmiany od punktu czasowego 1 do punktu czasowego 2, biorąc pod uwagę wszystkie współzmienne w dopasowanym modelu.

Wyniki

Proponowany protokół zawiera wstępne dane, które służą jako walidacja metodologii. Protokół zawiera analizator strumienia metabolicznego w czasie rzeczywistym do badania funkcji mitochondriów i wykorzystania paliwa komórkowego oraz ekstrakcję RNA i qRT-PCR do analizy genów rytmu okołodobowego (np. BMAL1, CLOCK, Nfil2, Nr1d1, Dbp, Cry1, Per2).

Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) izolowanych ludzkich PBMC od pięciu kontrolnych uczestników, 10 dni po wstępnej analizie, jest przedstawiony w Rysunek 1. Dane służą do porównywania wartości wstępnych i końcowych oraz pokazują średnie wartości dla oddychania podstawowego, odpowiedzi ostrej, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności po wstrzyknięciu kontroli, etomosiru, UK5099 i BPTES. Warto zauważyć, że Rysunek 1C pokazuje znaczącą negatywną ostrą odpowiedź po wstrzyknięciu etomosiru, ale nie zaobserwowano żadnych znaczących efektów dla oddychania podstawowego, maksymalnego oddychania lub wolnej pojemności.

figure-results-1
Rysunek 1: Zużycie tlenu przez izolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). (A) Wskaźnik zużycia tlenu w czasie rzeczywistym (OCR; pmol/(min∙150 000 komórek) PBMC wyizolowanych od osoby kontrolnej, mierzone za pomocą analizatora strumienia i oceniane za pomocą testu utleniania substratu. Komórki wysiewano w gęstości 150 000 komórek/dołek. Pierwsze wstrzyknięcie było albo pożywką (kontrola), albo inhibitorem (etomoxir, UK5099 lub BPTES; szczegóły w tekście) i nastąpiło po zmierzeniu podstawowej częstości oddychania komórkowego. Ostrą odpowiedź na ograniczenie substratu mitochondrialnego określono jako różnicę podstawowego OCR przed i po wstrzyknięciu inhibitora. Oligomycyna, inhibitor syntazy ATP, hamuje oddychanie sprzężone z wytwarzaniem ATP i powoduje oddychanie wycieku protonów. FCCP, rozprzęgacz, indukuje maksymalne, niesprzężone oddychanie; rotenon i antymycyna A (inhibitory odpowiednio kompleksu I i III) hamują wszystkie oddychanie z wyjątkiem niemitochondrialnego (szczegóły w tekście). (B-E) Kwantyfikacja oddychania komórkowego (n = 5; dane są przedstawione jako średnia ± SD). (B) podstawowy OCR przed wstrzyknięciem inhibitora, (C) ostra odpowiedź na inhibitor (zmiana OCR w stosunku do dawki podstawowej przed wstrzyknięciem inhibitora), (D) maksymalny OCR i (E) zapasowa pojemność (różnica między maksymalnym OCR a podstawowym OCR po pierwszym wstrzyknięciu). Ostra odpowiedź (C) na wstrzyknięcie etomosiru może sugerować większą zależność OCR od kwasu tłuszczowego jako substratu energetycznego w warunkach podstawowych w porównaniu z innymi grupami substratów, bez zauważalnego wpływu na OCR podczas wysokiego zapotrzebowania na energię (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. ) szt. szt. szt. szt. TGL Rozdział szt. szt.
związekAM (μl) dodany do związkuZapas (μM)zapas (μl) dla zapasu roboczegoAM (μl) dla zapasu roboczegoZapas roboczy (μM)Zapas roboczy (μL) [port]Stężenie końcowe (μM)
Etomoksyr7001605001500Rozdział 4020 [A]4
UK5099700Rozdział 8050015002020 [A]cyfra arabska
Schematy BPTES7001205001500Rozdział 3020 [A]3
oligo (oligo)42015030027001522 [B]1,5
FCCP (Protokół FCCP72010060024002025 [C]cyfra arabska
Rot/AA/HOkręg wyborczy 540503002700527 [D]0,5

Tabela 1: Przygotowanie odczynników do testu utleniania substratu oraz stężenia roztworów wyjściowych, roboczych i końcowych. Wszystkie odczynniki są częścią testu wytrzymałościowego mito komórki lub zestawu do testów wytrzymałościowych utleniania substratu. Skróty: oligo = oligomycyna; FCCP = rozprzęgający cyjanek karbonylu-4 (trifluorometoksy)fenylohydrazon; Rot/AA/H = rotenon/antymycyna A/Hoechst 33342. Etomoxir, UK5099, BTPES: inhibitory odpowiednio utleniania kwasów tłuszczowych, glukozy i glutaminy.

Bmal1Naprzód – GCACGACGTTCTTTCTTCTGT
Rewers – GCAGAAGCTTTTTCGATCTGCTTTT
ZegarNaprzód – CGTCTCAGACCCTTCCTCAAC
Rewers – GTAAATGCTGCCTGGGGA
Płacz1Naprzód – ACTGCTATTGCCCTGTTGGT
Rewers – GACAGGCAAATAACGCCTGA
Per1Naprzód – ATTCGGGTTACGAAGCTCCC
Rewers – GGCAGCCCTTTCATCCACAT
Per2Naprzód – CATGTGCAGTGGAGCAGATTC
Rewers – GGGGTGGTAGCGGATTTCAT
Rev-erb αNaprzód – ACAGATGTCAGCAATGTCGC
Rewers – CGACCAAACCGAACAGCATC

Tabela 2: Startery genów zegara okołodobowego.

Dyskusja

Spadek funkcji mitochondriów i regulacja rytmu okołodobowego wraz z wiekiem są coraz częściej postrzegane jako czynniki przyczyniające się do chorób związanych z wiekiem. Zmiana rytmu okołodobowego poprzez modyfikacje stylu życia, takie jak dieta i aktywność fizyczna, stanowi potencjalną strategię promowania zdrowego starzenia się i zmniejszania spadku mobilności związanego ze starzeniem się. Jednak obecne metody bezpośredniej oceny funkcji mitochondriów są inwazyjne i często wymagają biopsji mięśni, co może stanowić wyzwanie dla rekrutacji i utrzymania uczestników ze względu na odczuwany ból i ryzyko.

Ocena markerów zdrowia okołodobowego i metabolicznego za pomocą mniej inwazyjnych metod, takich jak pobieranie krwi, dostarczyłaby cennych wyników do badania i testowania celów terapeutycznych w przyszłych badaniach. Te minimalnie inwazyjne metody mają potencjał, aby znacznie posunąć naprzód tę dziedzinę, dostarczając nowych informacji na temat złożonych zależności między rytmem okołodobowym a zdrowiem metabolicznym i ich wpływem na funkcjonowanie. Celem tego badania jest ocena związku między metabolizmem energii komórkowej a rytmem okołodobowym. W szczególności analiza strumienia bioenergetycznego jest wykorzystywana do oceny funkcji mitochondriów w różnych warunkach dostępności substratów, wraz z monitorowaniem ekspresji genów grupy genów okołodobowych w białych krwinkach uczestników. Wykorzystując oba aspekty analizy, bioenergetykę i ekspresję genów, można osiągnąć kompleksowe zrozumienie związku między tymi dwoma podstawowymi procesami.

Analiza statystyczna danych tego szeregu czasowego z perspektywy okołodobowej daje wgląd w siłę, zakres i czas rytmów okołodobowych. Podsumowując, integracja analizy ekspresji genów, bioenergetyki komórkowej i pomiarów metabolicznych na poziomie organizmu stanowi nowe i innowacyjne podejście, które rzuci światło na wzajemne zależności między metabolizmem energetycznym a rytmami okołodobowymi u ludzi.

W badaniu pilotażowym wykryliśmy ostrą odpowiedź w OCR PBMC na ograniczenie wykorzystania kwasów tłuszczowych (po wstrzyknięciu etomoksyru, inhibitora palmitoilotransferazy karnityny 1a). Odkrycie to sugeruje, że w PBMC z tej konkretnej grupy uczestników może istnieć zależność od kwasów tłuszczowych jako substratu energetycznego podczas oddychania podstawowego. Jednak maksymalne oddychanie nie zostało naruszone, co sugeruje, że alternatywne źródła energii, takie jak glukoza i glutamina, mogą kompensować zmniejszone wykorzystanie kwasów tłuszczowych podczas wysokiego zapotrzebowania na energię. Przyszłe badania powinny zbadać, czy a) bioenergetyka PBMC odzwierciedla energetykę całego ciała i b) czy interwencje, takie jak ograniczone czasowo jedzenie, mogą wpływać na preferencje dotyczące substratów energetycznych.

Istnieje kilka krytycznych etapów dotyczących analizy strumienia PBMC. Po pierwsze, przed oceną próbek doświadczalnych należy zoptymalizować gęstość wysiewu komórek (komórki na studzienkę) poprzez upewnienie się, że istnieje ciągły równomierny rozkład komórek w każdym dołku i na każdej płytce, końcowe stężenie FCCP należy zoptymalizować, przeprowadzając testy stężeń przy użyciu stężeń 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 i 2,0 μM, i, w razie potrzeby, barwienie Hoechst 33342 należy zoptymalizować, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Po drugie, normalizacja danych metabolicznych do parametrów komórkowych ma kluczowe znaczenie dla porównywalności danych między eksperymentami. W niniejszym protokole opisano liczbę komórek po zakończeniu testu analizatora strumienia przy użyciu komórek barwionych Hoechst 33342 i urządzenia do obrazowania komórek. Jeśli odpowiednie urządzenie nie jest dostępne, można zastosować alternatywne metody normalizacji, takie jak całkowita zawartość białka komórkowego lub jądrowego DNA na studzienkę. Zauważono modyfikację, którą można wykorzystać w protokole, w porównaniu z tymi, które zostały zaproponowane. W szczególności protokół można wypełnić przy użyciu indywidualnego zestawu testowego dla każdego z trzech inhibitorów, w porównaniu z tylko dwoma proponowanymi tutaj zestawami (patrz tabela materiałów).

Stosowanie PBMC jako substytutu do badania wzajemnych zależności między metabolizmem energetycznym a rytmem okołodobowym u osób starszych jest ograniczone przez założenie, że ich odpowiedź na leczenie może dokładnie odzwierciedlać odpowiedź w innych tkankach i narządach. Chociaż podejście to jest nowatorskie i minimalnie inwazyjne, ważne jest, aby przyznać, że różne tkanki i narządy, takie jak mózg, wątroba i mięśnie szkieletowe, mogą reagować różnie w różnych warunkach. Badanie przedkliniczne wykazało, że ekspresja genu zegara została zmieniona u myszy karmionych i poszczonych, co prowadziło do częściowej regulacji w górę genów docelowych BMAL1 w wątrobie i tkance mięśniowej, ale do obniżenia innych41. Te obwodowe tkanki i narządy są wysoce reprezentatywne dla procesów metabolicznych i mogą być pod wpływem sygnałów środowiskowych, które wpływają na mechanizmy ekspresji genów zegara42. Potrzebne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć związek między tkankami obwodowymi, narządami a centralnym zegarem okołodobowym.

Innym ograniczeniem jest to, że uczestnicy nie są dyskwalifikowani za przyjmowanie jakichkolwiek recept, co może stanowić ograniczenia dla analizy statystycznej. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, w przyszłych badaniach zostanie wykorzystany inwentarz medyczny, który został zwalidowany w populacjach osób starszych, które przyjmują leki43. Uczestnicy zostaną skategoryzowani na podstawie zalecanych leków zapisanych w sekcji przeglądu danych protokołu. Istnieją w sumie trzy kategorie, jeśli chodzi o leki, które, jak wykazano, 1) przyspieszają spadek funkcjonalny, 2) spowalniają spadek funkcjonalny i 3) wpływają na funkcję mięśni szkieletowych.

Wreszcie, ludzka zdolność oksydacyjna mitochondriów mięśni szkieletowych wykazuje rytm dnia i nocy, osiągając szczyt między 18:00 a 23:00 i spadając między 08:00 a 11:0044. Nie jest jeszcze jasne, czy dotyczy to mitochondrialnej zdolności oksydacyjnej PBMC. Jednak wstępne dane sugerują, że PBMC i metabolizm mitochondrialny są ze sobą powiązane45. Biorąc pod uwagę, że informacje na temat biopsji mięśni i zmian w PBMC nie są tak jasne, należy zachować ostrożność podczas analizy wyników. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, ważne jest, aby pamiętać o tych informacjach podczas oceny i opracowywania protokołu, ponieważ mogą one dostarczyć cennego kontekstu i informacji, które mogą pomóc w zapewnieniu ważności i skuteczności protokołu.

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadne wcześniejsze badania nie oceniały wzorców wykorzystania paliwa lub rytmów okołodobowych za pomocą metod zaproponowanych w tym projekcie. Naszym celem jest zbadanie reakcji markerów wykorzystania paliwa mitochondrialnego i zdrowia okołodobowego na zmiany. W badaniu tym przedstawiono minimalnie inwazyjną metodę pomiaru bardzo czułego biomarkera, która może służyć jako alternatywa w przyszłych badaniach interwencyjnych, w których biopsja mięśni nie jest możliwa.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Older American's Independence Center (NIH/NIA P30AG028740), z pomocą Clinical and Translational Science Institute (NIH/NCRR UL1TR000064).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obrazowanie komórek firmy Agilent Technologies Agilent TechnologiesOprogramowanie do obrazowania komórek
Program komputerowy Agilent/Seahorse WaveAgilent Technologies5994-0039ENOprogramowanie służące do analizy danych z analizatora komórkowego i testu warunków skrajnych
Analizator strumienia Agilent/Seahorse XFe96AgilentTechnologies S7800BAnalizator strumienia komórkowego w czasie rzeczywistym; Analizator strumienia 
Czytnik kodów kreskowychAgilent TechnologiesG2615-90007
Oprogramowanie komputerowe Seahorse WaveTechnologie Agilent Oprogramowaniedo akwizycji danych; analiza testowa; Program falowy 
Seahorse XF 1.0 M Roztwór glukozyAgilent Technologies103577-100Suplement do podłoża podstawowego do przygotowania podłoża testowego
Seahorse XF 100 mM Roztwór pirogronianuAgilent Technologies103578-100Suplement do podłoża podstawowego do przygotowania podłoża testowego
Konik morski XF 200 mM roztwór glutaminyAgilent Technologies103579-100Suplement do podłoża podstawowego w celu przygotowania podłoża
testowegoTest warunków skrajnych Seahorse XF Cell MitoAgilent Technologies103015-100Test funkcji bioenergetycznych mitochondriów
Test elastyczności paliwa Seahorse XF Mito Agilent Technologies103260-100Test funkcji bioenergetycznych mitochondriów
Seahorse XF RPMI MediumAgilentTechnologies 103576-100Podłoże podstawowe dla PBMC
Seahorse XFe96 FluxPak miniAgilent Technologies102601-100Wkłady czujników i mikropłytki do hodowli komórkowych
Cytacja 1 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy Czytnik wielomodowy Agilent/BioTekdo obrazowania komórek
CPT Probówka z heparyną sodową, 16 x 125 mm x 8,0 mlBecton Dickinson362753Probówki do pobierania krwi do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
Klej komórkowy i tkankowy CellTakCorning354240Komórka przylegająca do mikropłytki do hodowli komórek płaszczowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Corning21-040-CVBufor do płukania krwinek
Ficoll Paque PlusCytivaGE17-1440-02Gradientowy średni
skaner Lunar Prodigy DXAGeneral ElectricEN 60601-2-7 5.1Masa beztłuszczowa całego ciała i stosunek masy tkanki tłuszczowej do beztłuszczowej
Pojemnik do zamrażania, Nalgene Mr. FrostyMilliporeSigmaC1562Pojemnik do zamrażania służy do powolnego zamrażania zawiesiny komórek
Bufor EL.Qiagen79217Bufor do lizy erytrocytów
Bufor RLTQiagen79216Bufor do lizy RNA
Bufor RPEQiagen1018013Łagodny bufor do płukania
Bufor RW1 Qiagen1053394Rygorystyczny bufor myjący
QIAamp DNA Micro KitQiagen56304Preparaty DNA: Kolumny QIAamp MinElute, proteinaza K, nośnik RNA,, probówki zbiorcze (2 ml)
QIAamp RNA Blood Mini KitQiagen52304zestaw do krwi RNA; Służy do izolacji RNA
QIAshredderQiagen79656jednorazowe homogenizatory lizatu komórkowego
Zestaw DNazy bez RNazQiagen79254Służy do trawienia DNA
2-merkaptoetanol (odczynnik)Thermo Fisher ScientificMFCD00004890
2-mL probówki zbiorcze, 100 sztukThermo Fisher ScientificAM12480
Fast SYBR Zielony Thermo Fisher Scientific4385612Primery i stosuje się je do przeprowadzenia qRT-PCR 
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlThermo Fisher Scientific69715Służy do przechowywania filtra oczyszczającego RNA podczas oczyszczania RNA
Wąskie końcówki do pipet p1000Thermo Fisher Scientific02-707-402
QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistym, termocykler MiniAmp Plus i pakiet płytek 96-dołkowychThermo Fisher ScientificA40393
Probówka RNA krwi TempusThermo Fisher Scientific4342792Rurka RNA
Tempus Spin Zestaw do izolacji RNAThermo Fisher Scientific4380204ekstrakcji i izolacji RNA
Dodaje się do tego podkłady Master Mix

Bibliografia

  1. UN Department of Economic and Social Affairs. Population Division 2019, World Population Prospects. UN Department of Economic and Social Affairs. , (2019).
  2. Anton, S., Leeuwenburgh, C. Fasting or caloric restriction for healthy aging. Experimental Gerontology. 48 (10), 1003-1005 (2013).
  3. Dziechciaż, M., Filip, R. Biological psychological and social determinants of old age: Bio-psycho-social aspects of human aging. Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 21 (4), 835-838 (2014).
  4. Anton, S. D., et al. Flipping the metabolic switch: understanding and applying the health benefits of fasting. Obesity. 26 (2), 254-268 (2018).
  5. Fried, L. P., Guralnik, J. M. Disability in older adults: evidence regarding significance, etiology, and risk. Journal of the American Geriatrics Society. 45 (1), 92-100 (1997).
  6. Manini, T. Development of physical disability in older adults. Current Aging Science. 4 (3), 184-191 (2011).
  7. Chung, H. Y., et al. Molecular inflammation: underpinnings of aging and age-related diseases. Ageing Research Reviews. 8 (1), 18-30 (2009).
  8. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  9. Tarasov, A. I., Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Regulation of ATP production by mitochondrial Ca2. Cell Calcium. 52 (1), 28-35 (2012).
  10. Chistiakov, D. A., Sobenin, I. A., Revin, V. V., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Mitochondrial aging and age-related dysfunction of mitochondria. Biomed Research International. 2014, 238463(2014).
  11. Boengler, K., Kosiol, M., Mayr, M., Schulz, R., Rohrbach, S. Mitochondria and ageing: role in heart, skeletal muscle and adipose tissue. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 8 (3), 349-369 (2017).
  12. Drew, B., et al. Effects of aging and caloric restriction on mitochondrial energy production in gastrocnemius muscle and heart. American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 284 (2), R474-R480 (2003).
  13. Short, K. R., et al. Decline in skeletal muscle mitochondrial function with aging in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (15), 5618-5623 (2005).
  14. Musci, R. V., Hamilton, K. L., Miller, B. F. Targeting mitochondrial function and proteostasis to mitigate dynapenia. European Journal of Applied Physiology. 118 (1), 1-9 (2018).
  15. Picca, A., et al. Targeting mitochondrial quality control for treating sarcopenia: lessons from physical exercise. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 23 (2), 153-160 (2019).
  16. Fernandez-Marcos, P. J., Auwerx, J. Regulation of PGC-1α, a nodal regulator of mitochondrial biogenesis. The American Journal of Clinical Nutrition. 93 (4), 884-890 (2011).
  17. Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of aging and exercise on mitochondrial quality control in skeletal muscle. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3165396(2017).
  18. Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80 (1), 22-27 (1999).
  19. Tian, Q., et al. Muscle mitochondrial energetics predicts mobility decline in well-functioning older adults: The baltimore longitudinal study of aging. Aging Cell. 21 (2), e13552(2022).
  20. Sardon Puig, L., Valera-Alberni, M., Cantó, C., Pillon, N. J. Circadian rhythms and mitochondria: connecting the dots. Frontiers in Genetics. 9, 452(2018).
  21. Gano, L. B., Patel, M., Rho, J. M. Ketogenic diets, mitochondria, and neurological diseases. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2211-2228 (2014).
  22. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metabolism. 17 (4), 491-506 (2013).
  23. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Hoppel, C. L. Mitochondrial metabolism in aging heart. Circulation Research. 118 (10), 1593-1611 (2016).
  24. Hartman, M. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
  25. Mahapatra, G., et al. Blood-based bioenergetic profiling is related to differences in brain morphology in African Americans with Type 2 diabetes. Clinical Science. 132 (23), 2509-2518 (2018).
  26. Moore-Ede, M. C. Physiology of the circadian timing system: predictive versus reactive homeostasis. The American Journal of Physiology. 250 (5), R737-R752 (1986).
  27. Young, M. W. Life's 24-hour clock: molecular control of circadian rhythms in animal cells. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 601-606 (2000).
  28. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  29. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16219-16224 (2014).
  30. de Goede, P., Wefers, J., Brombacher, E. C., Schrauwen, P., Kalsbeek, A. Circadian rhythms in mitochondrial respiration. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), R115-R130 (2018).
  31. Hood, S., Amir, S. The aging clock: circadian rhythms and later life. The Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 437-446 (2017).
  32. Sellix, M. T., et al. Aging differentially affects the re-entrainment response of central and peripheral circadian oscillators. The Journal of Neuroscience. 32 (46), 16193-16202 (2012).
  33. Sato, S., et al. Circadian reprogramming in the liver identifies metabolic pathways of aging. Cell. 170 (4), 664-677 (2017).
  34. Lundell, L. S., et al. et al. feeding alters lipid and amino acid metabolite rhythmicity without perturbing clock gene expression. Nature Communications. 11 (1), 4643(2020).
  35. Perrin, L., et al. Transcriptomic analyses reveal rhythmic and CLOCK-driven pathways in human skeletal muscle. eLife. 7, e34114(2018).
  36. Gutierrez-Monreal, M. A., Harmsen, J. -F., Schrauwen, P., Esser, K. A. Ticking for metabolic health: the skeletal-muscle clocks. Obesity. 28, S46-S54 (2020).
  37. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. bioRxiv. 42 (1), 111982(2023).
  38. Wilson, D., Breen, L., Lord, J. M., Sapey, E. The challenges of muscle biopsy in a community based geriatric population. BMC Research Notes. 11 (1), 830(2018).
  39. Ding, H., et al. Likelihood-based tests for detecting circadian rhythmicity and differential circadian patterns in transcriptomic applications. Briefings in Bioinformatics. 22 (6), 224(2021).
  40. Ding, Z., Lamb, T. M., Boukhris, A., Porter, R., Bell-Pedersen, D. Circadian clock control of translation initiation factor eIF2α activity requires eIF2γ-dependent recruitment of rhythmic PPP-1 phosphatase in Neurospora crassa. mBio. 12 (3), e00871(2021).
  41. Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
  42. Kalfalah, F., et al. Crosstalk of clock gene expression and autophagy in aging. Aging. 8 (9), 1876-1895 (2016).
  43. Psaty, B. M., et al. Assessing the use of medications in the elderly: methods and initial experience in the cardiovascular health study. Journal of Clinical Epidemiology. 45 (6), 683-692 (1992).
  44. van Moorsel, D., et al. Demonstration of a day-night rhythm in human skeletal muscle oxidative capacity. Molecular Metabolism. 5 (8), 635-645 (2016).
  45. Janssen, J. J. E., et al. Extracellular flux analyses reveal differences in mitochondrial PBMC metabolism between high-fit and low-fit females. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 322 (2), E141-E153 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

funkcja mitochondri wanaliza strumienia metabolicznegobia e krwinkifunkcja bioenergetycznageny zegara biologicznegopreferencje substratowe
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły