Jednym z głównych czynników wpływających na fenotypy komórkowe u eukariontów jest ekspresja genów. Kontrola ekspresji genów jest niezbędna i opiera się na wielu białkach i RNA, od procesów transkrypcji po translację1. Zmiany na tych etapach mogą wywołać kilka różnych chorób. Przetwarzanie i splicing RNA stanowią ważną grupę reakcji odpowiedzialnych za generowanie dojrzałych cząsteczek RNA 2,3,4,5. Splicing usuwa introny i łączy eksony w celu wytworzenia dojrzałej cząsteczki RNA zdolnej do wykonywania czynności funkcjonalnych i strukturalnych. Wydajność i tempo splicingu mają ogromny wpływ na fenotypy obserwowane w różnych warunkach6.
Splicing jest wykonywany przez złożoną maszynerię makromolekularną zwaną spliceosomem, która składa się z pięciu snRNA i ponad 100 białek 5,7. Oprócz podstawowych składników białkowych, spliceosomy zawierają białka transaktywne, które mogą bezpośrednio wpływać na regulację tego procesu 8,9. Znaczenie splicingu znajduje odzwierciedlenie w szerokim spektrum chorób spowodowanych zmianami w tym procesie, w tym zaburzeń neurodegeneracyjnych, chorób nerwowo-mięśniowych i kilku rodzajów nowotworów 3,10,11. Badania nad dynamiką splicingu i składaniem spliceosomów mogą znacznie wpłynąć na zrozumienie biologii tych zaburzeń.
Składanie spliceosomu rozpoczyna się od asocjacji snRNP U1 z określonym regionem niedawno transkrybowanego pre-mRNA, miejscem splicingu 5' 5,8. Efektywne parowanie i rozpoznawanie miejsc splicingu 5' przez snRNA U1 nie tylko definiuje miejsca splicingu, które należy zastosować, ale także kontroluje, które pre-RNA zostaną połączone jako pierwsze lub bardziej efektywnie 6,12,13. Zastosowanie różnych miejsc splicingu może wygenerować wiele alternatywnych izoform dojrzałych RNA z tego samego genu. Alternatywny splicing jest głównym źródłem różnorodności proteomicznej, umożliwiając wytwarzanie RNA i białek wymaganych podczas rozwoju lub w różnych komórkach i tkankach14,15. Alternatywne transkrypty RNA mogą generować skrócone lub niefunkcjonalne izoformy białek, które mogą powodować choroby10,16. Dlatego składniki białkowe kompleksu U1 snRNP odgrywają ważną rolę regulacyjną w splicingu1. Galektyna-1 i galektyna-3 (Gal1 i Gal3) są składnikami U1 snRNP17,18. Voss i wsp.19 proponują metodę frakcjonowania ekstraktu jądrowego w celu uzyskania kompleksów wzbogaconych w Gal3-U1 snRNP, zdolnych do ratowania aktywności splicingu w komórkach pozbawionych U1. Analiza ta przyczynia się do zrozumienia mechanizmu asocjacji Gal3 do spliceosomów, a podobne podejścia można wykorzystać do zbadania innych potencjalnych białek regulatorowych splicingu.
Wiązanie U1 snRNP z miejscami splicingu 5' jest ważnym mediatorem wierności splicingu20. Mutacje w miejscach splicingu 5' są krytyczne i powodują utratę parowania U1 snRNP, co skutkuje defektami splicingu2. Na przykład mukowiscydoza jest spowodowana przez zmutowane miejsce splicingu 5' w genie CFTR21. Wong i wsp.22 opisują metodę kompensacji mutacji w miejscu splicingu 5' z komplementarnymi mutacjami w snRNA U1. Podejście to skutecznie promuje inkluzję eksonów, generując dojrzałe RNA i prowadząc do ratowania przed defektami splicingu. Oprócz zaoferowania możliwej terapii opartej na RNA dla tych chorób, podejście to może być przydatne do analizy poszczególnych sekwencji regulatorowych w pre-mRNA23.
Wierność asocjacji U1 snRNA do miejsc splicingu jest również badana w systemie modelu drożdży przez van der Feltza24. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są szeroko stosowane do badania kinetyki splicingu i składania spliceosomów25. Kinetyka splicingu i skład spliceosomów są dobrze zachowane u eukariontów, a drożdże są szeroko stosowane do monitorowania tworzenia kompleksów pośrednich podczas składania26. Test reporterowy ACT1-CUP1 opiera się na ekspresji pary genów: ACT1, który zawiera jeden intron z optymalnymi sekwencjami miejsca splicingu, oraz CUP1, który wyraża chelator miedzi, chroniąc komórkę przed uszkodzeniem spowodowanym przez ten jon metalu. CUP1 jest wyrażany tylko wtedy, gdy ACT1 jest prawidłowo spleciony, tworząc w ten sposób system reporterowy27. Wzrost komórek w warunkach o różnych stężeniach miedzi może być monitorowany w celu uwzględnienia wydajności splicingu różnych sekwencji intronów lub przy użyciu różnych białek regulatorowych. van der Feltz24 przedstawia metodę analizy wpływu białka regulatorowego splicingu przy użyciu tego systemu reporterowego i testów żywotności miedzi. Podobne podejście można zastosować do projektowania zmian w sekwencjach intronów w połączeniu z różnymi białkami, aby odnieść sukces splicingu u drożdży.
Oprócz asocjacji snRNP, wiązanie białek jest niezbędne podczas składania spliceosomów1. Kontrola aktywności spliceosomu jest bezpośrednio zależna od jego składu białkowego i interakcji zachodzących podczas jego powstawania. Cechy strukturalne i funkcjonalne składników białkowych są ważne dla aktywacji kompleksu 5,7. Carvalho i wsp.28 stosują podejście oparte na metodzie Grafix, która opiera się na nieodwracalnym sieciowaniu białek w analizie gradientu glicerolu. Analiza ta dotyczy składu białek i przejściowych oddziaływań zachodzących podczas składania, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla złożenia kompleksu aktywnego i powodzenia splicingu. Analiza innych dynamicznych kompleksów makromolekularnych przy użyciu tego podejścia może być bardzo przydatna i dostarczyć informacji na temat organizacji i interakcji białek.
Na skład chemiczny i szybkość splicingu wpływa również dynamiczne asocjacje różnych składników spliceosomów8. Ostatnio zastosowanie małocząsteczkowych inhibitorów splicingu ujawniło, że określone etapy mogą zostać zatrzymane in vitro ze względu na zmniejszoną szybkość reakcji splicingu29,30. Basei i wsp.31 przedstawiają metodę analizy alternatywnego splicingu na wpływ czynnika regulatorowego splicingu, Nek4. Omówiono występowanie izoform transkryptu prowadzących do fenotypów pro- lub przeciwnowotworowych w komórkach HEK293 za pomocą minigenu. Niewłaściwa regulacja splicingu lub różne zastosowania miejsc splicingu mogą prowadzić do alternatywnego generowania transkryptów, powodując różne rodzaje raka16. Zastosowanie modulatorów lub inhibitorów splicingu podczas terapii może determinować wybór miejsca splicingu, a tym samym definiować alternatywne generowane izoformy, zarówno pro-, jak i przeciwnowotworowe. Paklitaksel i cisplatyna są obecnie stosowane jako chemioterapeutyki. Za pomocą minigenu E1A bada się wpływ tych leków na alternatywny splicing. Alternatywna analiza splicingu z wykorzystaniem minigenów jest ważną strategią monitorowania wpływu białek transaktywnych i zmian splicingu na terapię i stosowanie określonych leków.
W tej linii doniesiono, że wiele intronowych mikroRNA (miRNA) jest związanych z fenotypami guza32,33. Kontrola i regulacja syntezy i biogenezy intronów miRNA może być związana z kontrolą reakcji splicingu. miRNA może modulować stabilność i częstość występowania mRNA w komórkach, wpływając na stabilność RNA i szybkość translacji34 . Gatti da Silva i Coltri35 opisują system reporterowy do oceny biogenezy i dojrzewania intronicznego miRNA, które mogą być bezpośrednio związane ze zmianami w fenotypach komórkowych i określeniem cech pro- lub przeciwnowotworowych. Dzięki modulacji splicingowego białka regulatorowego HuR, system umożliwia analizę biogenezy i aktywności funkcjonalnej intronowego onkogennego miRNA.
Analiza splicingu pre-RNA i dojrzewania różnych RNA w określonych komórkach będzie niezbędna do zrozumienia i interpretacji informacji genomicznych. Drożdże i sliceosomy ssaków są konserwowane, a badania podstawowe mogą poprawić wykorzystanie różnych metod stosowanych w terapii i biomedycynie. Pomimo dużej ilości dostępnych obecnie danych genomicznych, ekspresja tych informacji w fenotypach może być specyficzna dla komórki i zależeć od przetwarzania i splicingu RNA. Zrozumienie złożonej regulacji tego procesu będzie miało zasadnicze znaczenie dla przyszłych badań.