Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) ma podobne cechy immunologiczne i kliniczne jak stwardnienie rozsiane (SM), dlatego jest szeroko stosowane jako model do identyfikacji nowych celów leków dla lepszego leczenia pacjentów. Stwardnienie rozsiane charakteryzuje się kilkoma różnymi przebiegami choroby: rzutowo-remisyjnym SM (RRMS), pierwotnie postępującym SM (PPMS), wtórnie postępującym SM (SPMS) i rzadką postępująco-rzutową postacią SM (PRMS). Chociaż modele zwierzęce nie naśladują dokładnie wszystkich tych kontrastujących ze sobą fenotypów chorób ludzkich, istnieją modele EAE, które odzwierciedlają niektóre z różnych objawów klinicznych stwardnienia rozsianego. Na przykład EAE indukowane glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) u myszy C57BL / 6J naśladuje ludzkie PPMS, podczas gdy EAE indukowane białkiem proteolipidowym mieliny (PLP) u myszy SJL / J przypomina RRMS. Inne autoantygeny, takie jak podstawowe białko mieliny (MBP) i wiele różnych szczepów myszy są również wykorzystywane do badania EAE. Aby wywołać chorobę w tych modelach EAE immunizacji autoantygenowej, przygotowuje się emulsję typu woda w oleju i wstrzykuje się ją podskórnie. Większość modeli EAE wymaga również wstrzyknięcia toksyny krztuścowej, aby choroba się rozwinęła. W celu spójnej i powtarzalnej indukcji EAE niezbędny jest szczegółowy protokół przygotowania odczynników do wytworzenia emulsji antygenowych/adiuwantowych. Opisana tutaj metoda wykorzystuje znormalizowaną metodę wytwarzania emulsji typu woda w oleju. Jest prosty i szybki, a do przygotowania emulsji o kontrolowanej jakości wykorzystuje homogenizator wstrząsający zamiast strzykawek.
Wprowadzenie
Załamanie tolerancji immunologicznej może prowadzić do powstania zaburzeń autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Szacuje się, że na całym świecie żyje 2,8 miliona ludzi ze stwardnieniem rozsianym1. Chociaż dokładna przyczyna stwardnienia rozsianego jest nadal w dużej mierze nieznana, rozregulowanie autoreaktywnych limfocytów T i B, a także defekty funkcji limfocytów Treg, odgrywają ważną rolę w patogenezie choroby2,3.
Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych są niezbędnymi narzędziami do badania potencjalnych metod terapeutycznych. E....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z praktykami Szwedzkiej Rady Badań nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt, Lund-Malmö, Szwecja (numer zezwolenia: M126-16).
UWAGA: Schematyczny przebieg metody jest opisany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie materiału
UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki aseptycznie w sterylnym kapturze, a następnie podziel je i przechowuj we wskazanej temperaturze. Odczynniki mogą być przechowywane do 2 lat bez utraty ich działania.
- Przygotować CFA zawie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Szybki, prosty i zestandaryzowany protokół przygotowania emulsji CFA/MOG przedstawiono na Ryc. 1. Metoda ta została niedawno opisana w innym opracowaniu6. Emulsje CFA/MOG można przygotować również innymi metodami, takimi jak tradycyjna metoda strzykawki lub mieszanie w wibratorze laboratoryjnym (vortexowaniu). Metody te porównano tutaj poprzez ocenę jakości otrzymanych emulsji. Wszystkie metody pozwoliły na otrzymanie emulsji typu woda w oleju; jednorodność i jakość t.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Emulsje typu woda w oleju, takie jak antygen/adiuwant Freunda, są używane od ponad pół wieku do indukcji EAE17. Obecnie nie ma ustandaryzowanej metody przygotowania emulsji antygenowych, która byłaby niezależna od wpływu człowieka. Ręczne mieszanie za pomocą strzykawek jest standardem w większości laboratoriów, jednak metoda ta jest czasochłonna, często skutkuje nadmierną utratą materiału, a jakość różni się w zależności od naukowca go przygotowującego.
Metoda przedstaw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
BTB Emulsions AB złożyła wniosek patentowy na zastosowanie urządzenia i metody przygotowania emulsji do immunizacji zwierząt i ludzi (numer europejskiego zgłoszenia patentowego: EP3836884A1). BTB jest dyrektorem generalnym i założycielem firmy oraz udziałowcem BTB Emulsions. Firma Bertin-Instruments zajmuje się dystrybucją zestawów emulsji użytych w tej publikacji na całym świecie.
Podziękowania
Autor chciałby podziękować jednostkom trzymania zwierząt na Uniwersytecie w Lund, Camilli Björklöv i Agnieszce Czopek, za ich wsparcie, oraz Richardowi Williamsowi, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, za konstruktywną krytykę i wsparcie językowe przy tworzeniu tego manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml Strzykawka iniekcyjna | B. Braun | 9166017V | |
| 1 ml Strzykawka iniekcyjna | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml puste probówki z nakrętkami | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | Probówka 7 ml |
| 50 ml sterylna probówka wirówkowa | Fisher Scientific 10788561 | 50 ml probówka | |
| Bordetella pertussis toksyna | Sigma-Aldrich | P2980 | Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| Dyspergator, lekki olej mineralny | Sigma-Aldrich | M8410 | Przechowywać w RT |
| Zestaw emulsji | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Zawiera rurkę, nasadkę i tłok |
| Niekompletny adiuwant Freunda | Sigma-Aldrich | F5506 | Sklep pod adresem +4 ° C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Przechowywać w temperaturze +4 ° C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Analizator wielkości cząstek |
| Minilys-Personal Homogenizator | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenizator wstrząsający |
| MOG 35-55 Peptyd | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | zatwierdzony przez FDA adiuwant olejowy |
| Pall Acrodisc Filtry strzykawkowe 0,2 i mu; | m Fisher Scientific | 17124381 | Filtr Sterlie |
| PBS, wolny od Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Mikroskop fazowo-konstrastowy | Olympus | BX40-B | |
| Koraliki stalowe 3,2 mm | Autoklaw Fisher Scientific | NC0445832 | i przechowuj w RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Sklep w RT |
Bibliografia
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
