Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Summary

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Abstract

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) ma podobne cechy immunologiczne i kliniczne jak stwardnienie rozsiane (SM), dlatego jest szeroko stosowane jako model do identyfikacji nowych celów leków dla lepszego leczenia pacjentów. Stwardnienie rozsiane charakteryzuje się kilkoma różnymi przebiegami choroby: rzutowo-remisyjnym SM (RRMS), pierwotnie postępującym SM (PPMS), wtórnie postępującym SM (SPMS) i rzadką postępująco-rzutową postacią SM (PRMS). Chociaż modele zwierzęce nie naśladują dokładnie wszystkich tych kontrastujących ze sobą fenotypów chorób ludzkich, istnieją modele EAE, które odzwierciedlają niektóre z różnych objawów klinicznych stwardnienia rozsianego. Na przykład EAE indukowane glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) u myszy C57BL / 6J naśladuje ludzkie PPMS, podczas gdy EAE indukowane białkiem proteolipidowym mieliny (PLP) u myszy SJL / J przypomina RRMS. Inne autoantygeny, takie jak podstawowe białko mieliny (MBP) i wiele różnych szczepów myszy są również wykorzystywane do badania EAE. Aby wywołać chorobę w tych modelach EAE immunizacji autoantygenowej, przygotowuje się emulsję typu woda w oleju i wstrzykuje się ją podskórnie. Większość modeli EAE wymaga również wstrzyknięcia toksyny krztuścowej, aby choroba się rozwinęła. W celu spójnej i powtarzalnej indukcji EAE niezbędny jest szczegółowy protokół przygotowania odczynników do wytworzenia emulsji antygenowych/adiuwantowych. Opisana tutaj metoda wykorzystuje znormalizowaną metodę wytwarzania emulsji typu woda w oleju. Jest prosty i szybki, a do przygotowania emulsji o kontrolowanej jakości wykorzystuje homogenizator wstrząsający zamiast strzykawek.

Introduction

Załamanie tolerancji immunologicznej może prowadzić do powstania zaburzeń autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Szacuje się, że na całym świecie żyje 2,8 miliona ludzi ze stwardnieniem rozsianym¹. Chociaż dokładna przyczyna stwardnienia rozsianego jest nadal w dużej mierze nieznana, rozregulowanie autoreaktywnych limfocytów T i B, a także defekty funkcji limfocytów Treg, odgrywają ważną rolę w patogenezie choroby^2,3.

Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych są niezbędnymi narzędziami do badania potencjalnych metod terapeutycznych. Eksperymentalny model autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest używany od prawie stu lat przez badaczy zainteresowanych MS⁴. We wczesnych eksperymentach częstość występowania choroby była stosunkowo niska. Wprowadzenie kompletnego adiuwanta Freunda (CFA), zawierającego Mycobacterium i toksynę krztuścową, umożliwiło konsekwentną indukcję EAE u myszy⁴. Co najważniejsze, konieczne jest zmieszanie CFA z antygenem specyficznym dla ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w celu wytworzenia jednorodnej emulsji typu woda w oleju do indukcji EAE. Najpowszechniejsze obecnie dostępne modele EAE opierają się na aktywnym uodparnianiu myszy peptydami encefalitogennymi. Tło genetyczne myszy odgrywa ważną rolę w podatności na choroby, z peptydami glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych (MOG_35-55) i białka proteolipidowego mieliny (PLP_139-151) stosowanych do indukcji EAE u myszy C57BL / 6J i SJL, odpowiednio⁵. Można jednak również stosować inne szczepy myszy i peptydy pochodzące z OUN.

Jakość emulsji CFA/peptydu jest krytycznym czynnikiem, który decyduje o penetracji choroby w modelu aktywnej immunizacji EAE⁶. Jednorodną emulsję typu woda w oleju należy przygotować przez zmieszanie peptydów encefalitogennych rozpuszczonych w buforze wodnym z CFA, w przeciwnym razie u zwierząt nie rozwinie się choroba. Opublikowano liczne protokoły dotyczące przygotowania emulsji CFA/peptydowych. Przykłady obejmują użycie vortex⁷, sonication⁸, strzykawek i trójdrożnego łącznika T⁹, lub tylko jednej strzykawki⁵. Jednak wszystkie te metody są trudne do standaryzacji i często wiążą się z długimi i skomplikowanymi protokołami.

W porównaniu do wszystkich powyższych metod, opisana tutaj prosta metoda przygotowania emulsji oferuje zalety braku różnic między osobami i jest stosunkowo szybka. Emulsja jest generowana przez homogenizator wytrząsający odczynniki z ustaloną prędkością, czasem i temperaturą, zapewniając szybkie i spójne wyniki. Oprócz wywoływania choroby w modelu EAE, metoda ta może być również stosowana do badania innych modeli chorób autoimmunologicznych, takich jak zapalenie stawów wywołane kolagenem (CIA) i zapalenie stawów wywołane antygenem (AIA)⁶. W związku z tym przewiduje się, że metoda ta może być stosowana do konsekwentnego wywoływania choroby w innych modelach zwierzęcych, które zależą od emulsji typu woda w oleju z autoantygenami, takich jak eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwów (EAN)¹⁰, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (EAT)¹¹, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU)¹² i miastenia (MG)¹³. Metoda ta indukuje również ogólne reakcje immunologiczne, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH) konsekwentnie⁶, a zatem może być stosowana do dostarczania szczepionek przeciwko rakowi i malarii (patrz dyskusja).

Tak więc, szybka (całkowity czas przygotowania ~30 min), prosta (wszystkie odczynniki mogą być przygotowane wcześniej i przechowywane) i ustandaryzowana (emulsja jest realizowana za pomocą homogenizatora wstrząsającego) metoda została opracowana i jest tutaj prezentowana. Emulsje CFA/antygenowe przygotowane przy użyciu tego protokołu konsekwentnie indukują chorobę w autoimmunologicznych modelach zwierzęcych.

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z praktykami Szwedzkiej Rady Badań nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt, Lund-Malmö, Szwecja (numer zezwolenia: M126-16).

UWAGA: Schematyczny przebieg metody jest opisany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie materiału

UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki aseptycznie w sterylnym kapturze, a następnie podziel je i przechowuj we wskazanej temperaturze. Odczynniki mogą być przechowywane do 2 lat bez utraty ich działania.

1. Przygotować CFA zawierające 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis zgodnie z poniższym opisem.
   1. Dodać 100 mg liofilizowanego M. tuberculosis H37RA (patrz tabela materiałów) i pięć stalowych kulek o średnicy 3,2 mm do probówki o pojemności 7 ml (patrz tabela materiałów). Potrząsaj probówką w homogenizatorze (patrz tabela materiałów) przez 60 s przy najwyższym ustawieniu prędkości (5 000 obr./min).
   2. Dodać 5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda (IFA) do probówki i ponownie wstrząsać przez 60 s z najwyższą prędkością. Przenieść zawiesinę homogenizowanego M. tuberculosis z IFA (obecnie pod nazwą CFA) do świeżej probówki za pomocą pipety, pozostawiając kulki i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Do liofilizowanego proszku peptydu MOG_35-55 (patrz tabela materiałów) dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcowe stężenie peptydu 10 mg/ml. Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przygotować 60 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
   UWAGA: Peptyd MOG_35-55 użyty w tym eksperymencie ma czystość ImmunoGrade (~70%), jest rozszczepiony TFA, łatwo rozpuszcza się w wodzie i zawiera C-końcowy amid (-NH₂) w celu zwiększenia stabilności in vivo¹⁴. Podwielokrotności peptydów nigdy nie były rozmrażane i ponownie zamrażane więcej niż dwa razy i były przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
3. Przygotuj 100 ml buforu toksyny krztuścowej: Rozpuść 2,9 g NaCl w 80 ml 1x Ca^2+/Mg²⁺ wolnego PBS i dodaj 100 μl 10% Triton X-100. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą PBS i wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm. Przygotować 10 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie emulsji CFA/peptydowych

1. Obliczyć ilość emulsji potrzebną do immunizacji. W tym standardowym protokole każda mysz otrzymuje 50 μg peptydu MOG_35-55 i 300 μg M. tuberculosis rozproszone w adiuwantzie Freunda (CFA). Ilość każdego odczynnika (peptyd MOG_35-55, PBS, CFA i IFA) wymagana do przygotowania emulsji może być obliczona za pomocą pliku uzupełniającego 1. Dodatkowe 20% wszystkich odczynników, aby zrekompensować niewielki ubytek emulsji, jest uwzględniane w obliczeniach.
   UWAGA: Dostępny w handlu zestaw emulsji (patrz Tabela materiałów) używany w tym badaniu składa się z tubki, nakrętki i tłoka w wysterylizowanej torebce. Każda tubka zestawu emulsji mieści maksymalnie 9,6 ml, co umożliwia przygotowanie 8 strzykawek o pojemności 1 ml wystarczających do zaszczepienia 40 myszy (lub 80 myszy w przypadku użycia 100 μl emulsji na zwierzę).
2. Umieść zakręcaną rurkę (z dostępnego w handlu zestawu emulsji) i odczynniki, które mają być użyte, na lodzie.
3. Dodać składniki emulsji w następującej kolejności w objętościach obliczonych w kroku 2.1: PBS, następnie peptyd, następnie M. tuberculosis w CFA, a na końcu IFA.
4. Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5-10 s, aby wstępnie wymieszać odczynniki.
5. Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 s. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na 3 minuty. Powtórz bieg jeszcze raz lub dwa razy z tymi samymi ustawieniami.
6. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję.
7. Zdjąć nakrętkę z tubki, włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji. Zdejmij zatrzaskiwane zamknięcie na dole tuby, przekręcając je.
8. Wyjąć tłok ze strzykawki do wstrzykiwań (1 ml; patrz Tabela materiałów). Dodać igłę (najlepiej 25-27 G) do strzykawki do wstrzykiwań.
9. Przymocować tylny koniec strzykawki do przeznaczonego do tego celu zamka w dolnej części rurki i zablokować go krótkim przekręceniem.
10. Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok. Przerwać, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 ml strzykawki do wstrzykiwań.
11. Oddzielić strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby do strzykawki nie dostało się powietrze. Naciskać tłok tak długo, aż emulsja wyjdzie z igły.
    UWAGA: W tym momencie część emulsji można wykorzystać do kontroli jakości (patrz krok 3).
12. Powtórz kroki 2.8-2.11 dla reszty emulsji obecnej w probówce.
    UWAGA: Aby zminimalizować marnotrawstwo drogich emulsji CFA/antygenowych, należy używać strzykawek o pojemności 1 ml. Można użyć innych strzykawek, które pasują do dedykowanego zamka na dnie tuby; Jednak może być konieczne przygotowanie większej objętości emulsji. Emulsja peptydowa CFA/MOG_35-55 może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 15 tygodni bez utraty zdolności indukowania EAE.

3. Kontrola jakości emulsji

1. Test kroplowy: Dodaj małą kroplę emulsji do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml zimnej wody. Zamknij tubkę i potrząsaj nią ręcznie przez kilka sekund. Pojawienie się maleńkich, wyraźnych kropelek potwierdza tworzenie się emulsji typu woda w oleju.
2. Zbadaj emulsję za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
   1. Aby przeanalizować wielkość cząstek wody w oleju, dodaj niewielką kroplę (2-3 μl) emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję.
   2. Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym (patrz tabela materiałów) z 400-krotnym powiększeniem i skoncentruj się na polu z monowarstwą emulsji. Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite szaro-białe cząstki (Rysunek 2A).
3. Analiza wielkości cząstek emulsji za pomocą dyfrakcji laserowej.
   UWAGA: Dyfrakcja laserowa mierzy rozkład wielkości cząstek za pomocą wiązki laserowej. Jest to ostateczny test kontroli jakości emulsji. Reprezentatywny wynik rozkładu wielkości cząstek przy użyciu opisanej tutaj metody jest pokazany na Rysunek 2B (szczegółowy opis znajduje się w Topping et al.⁶). Niemniej jednak próba upuszczenia i badanie mikroskopowe są wystarczające, aby sprawdzić, czy powstała zadowalająca emulsja.
   1. Ustaw współczynniki załamania światła zarówno dla lasera czerwonego, jak i niebieskiego dla dyspergatora (patrz tabela materiałów) na 1,456, a dla próbki na 1,33 w analizatorze wielkości cząstek (patrz tabela materiałów). Ustaw absorbancję współczynnika załamania światła na 0,02.
   2. Dodać jedną kroplę ze strzykawki zawierającej emulsję peptydową do jednostki dyspersyjnej zawierającej lekki olej mineralny. Akwizycję danych należy rozpocząć natychmiast po dyspersji emulsji.
      UWAGA: Zastosowano model ogólnego przeznaczenia i założono cząstki sferyczne w celu oszacowania rozkładu wielkości cząstek.

4. Indukcja EAE przy użyciu emulsji peptydowej MOG _35-55 u myszy C57BL6/J

UWAGA: We wszystkich eksperymentach użyto pięciu 8-12-tygodniowych samic myszy C57BL6/J.

1. Przed szczepieniem znieczulij myszy za pomocą 2,5% odparowanego izofluranu i potwierdź, mocno szczypiąc palec u nogi.
2. Wstrzyknąć każdej myszy podskórnie za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml w dwa różne miejsca, po prawej i lewej stronie tylnej flanki, 200 μl emulsji zawierającej 50 μg peptydu MOG_35-55 w stosunku 1:1 (v/v) peptydu/CFA.
3. Co najmniej 1,5 godziny po immunizacji emulsją, a następnie ponownie po 24 godzinach, podać łącznie 80 ng toksyny Bordetella pertussis w 200 μl buforu toksyny krztuścowej każdej myszy poprzez wstrzyknięcia dootrzewnowe (100 μl po lewej stronie i 100 μl po prawej stronie brzucha).
   UWAGA: Wykazano, że precyzyjna lokalizacja iniekcji dootrzewnowej z toksyną krztuśca jest niezbędna do aktywacji limfocytów T w drenującym węźle chłonnym¹⁵.
4. Opcjonalnie: Wstrzyknij peptyd MOG_35-55 ponownie w 7 dniu (zgodnie z niektórymi protokołami¹⁶), powtarzając krok 4.2.
   UWAGA: Przede wszystkim należy upewnić się, że strzykawki i igły używane do immunizacji zawierające MOG/CFA lub toksynę krztuścową są odpowiednio utylizowane w workach/pojemnikach stanowiących zagrożenie biologiczne.
5. Oceniaj wynik kliniczny codziennie, używając skali od 0 do 6, jak opisano wcześniej⁶.

Results

Szybki, prosty i ustandaryzowany protokół przygotowania emulsji CFA/MOG jest przedstawiony w Rysunek 1. Ta metoda została niedawno opisana w innym miejscu⁶. Emulsje CFA/MOG mogą być również przygotowywane innymi metodami, takimi jak tradycyjna metoda strzykawkowa lub przez wirowanie. Metody te porównano tutaj, oceniając jakość emulsji. We wszystkich metodach uzyskano emulsje typu woda w oleju; Jednorodność i jakość tych emulsji oceniano poprzez dodanie małej kropli na...

Discussion

Emulsje typu woda w oleju, takie jak antygen/adiuwant Freunda, są używane od ponad pół wieku do indukcji EAE¹⁷. Obecnie nie ma ustandaryzowanej metody przygotowania emulsji antygenowych, która byłaby niezależna od wpływu człowieka. Ręczne mieszanie za pomocą strzykawek jest standardem w większości laboratoriów, jednak metoda ta jest czasochłonna, często skutkuje nadmierną utratą materiału, a jakość różni się w zależności od naukowca go przygotowującego.

Metoda przedstaw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Strzykawka iniekcyjna	B. Braun	9166017V
1 ml Strzykawka iniekcyjna	Sigma-Aldrich	Z683531
7 ml puste probówki z nakrętkami	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	Probówka 7 ml
50 ml sterylna probówka wirówkowa	Fisher Scientific 10788561		50 ml probówka
Bordetella pertussis toksyna	Sigma-Aldrich	P2980	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Dyspergator, lekki olej mineralny	Sigma-Aldrich	M8410	Przechowywać w RT
Zestaw emulsji	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Zawiera rurkę, nasadkę i tłok
Niekompletny adiuwant Freunda	Sigma-Aldrich	F5506	Sklep pod adresem +4 ° C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Przechowywać w temperaturze +4 ° C
Mastersizer 2000	Malvern Panalytical	N/A	Analizator wielkości cząstek
Minilys-Personal Homogenizator	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenizator wstrząsający
MOG 35-55 Peptyd	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	zatwierdzony przez FDA adiuwant olejowy
Pall Acrodisc Filtry strzykawkowe 0,2 i mu;	m Fisher Scientific	17124381	Filtr Sterlie
PBS, wolny od Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14190144	PBS
Mikroskop fazowo-konstrastowy	Olympus	BX40-B
Koraliki stalowe 3,2 mm	Autoklaw Fisher Scientific	NC0445832	i przechowuj w RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Sklep w RT