Artykuł metodologiczny

Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64641

⸱

3 marca 2023

 ,  , 
1Harris Orthopaedics Laboratory, Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oceny skuteczności przeciwbakteryjnej polimeru uwalniającego antybiotyki do symulacji profilaktycznego zastosowania klinicznego za pomocą dostępnego na rynku testu żywotności mikrobiologicznej luminescencyjnego opartego na ATP w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia monitorowanie aktywności podłużnej materiałów uwalniających leki i może być szeroko stosowana do testowania przeciwdrobnoustrojowych platform dostarczania leków.

Streszczenie

Polietylen o ultrawysokiej masie cząsteczkowej (UHMWPE) jest szeroko stosowany w endoprotezoplastyce stawów jako powierzchnia nośna. Infekcje okołoprotezowe stawów, z których większość występuje wkrótce po endoprotezoplastyce, stanowią prawie 25% wszystkich operacji rewizyjnych stawu kolanowego, a całkowite wyeliminowanie infekcji bakteryjnej stanowi duże wyzwanie. Obiecującym sposobem rozwiązania tego problemu jest zapewnienie miejscowego, stałego dostarczania antybiotyków o stężeniach wystarczających do zahamowania rozwoju bakterii w celu wsparcia rutynowej ogólnoustrojowej profilaktyki antybiotykowej. Prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem skutecznych urządzeń do miejscowego dostarczania leków. Chociaż uznane metody testowania przeciwbakteryjnego leków mogą być wykorzystywane do testowania skuteczności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki, brakuje ich pod względem dostarczania w czasie rzeczywistym i podłużnych danych dotyczących skuteczności przeciwbakteryjnej, które można skorelować z profilami elucji antybiotyków z tych urządzeń. W tym miejscu przedstawiamy bezpośrednią i wszechstronną metodologię określania skuteczności przeciwbakteryjnej implantów UHMWPE uwalniających antybiotyki. Metodologia ta może być wykorzystana jako platforma do unikania hodowli bakteryjnej w każdym punkcie czasowym długiego eksperymentu, a także może być dostosowana do innych lokalnych urządzeń do dostarczania leków.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest poważnym schorzeniem zwyrodnieniowym, które dotyka 500 milionów dorosłych na całym świecie1. Złotym standardem w leczeniu schyłkowego stadium zapalenia stawów jest całkowita wymiana stawów, która ma być wykonywana u ponad 2 milionów pacjentów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych do 2030 roku2, przy czym globalny popyt również ogromnie rośnie3,4. Zabieg polega na zastąpieniu przegubowych powierzchni chrzęstnych stawów nośnymi materiałami syntetycznymi wykonanymi z metalu/ceramiki i wysoko usieciowanego polietylenu ultrawysokocząsteczkowego (UHMWPE). Całkowita wymiana stawów znacznie poprawia jakość życia pacjentów cierpiących na zapalenie stawów5, ale poważnym powikłaniem, które zagraża działaniu implantów i zadowoleniu pacjentów, jest infekcja stawu okołoprotezowego (PJI), która stanowi 15%-25% operacji rewizyjnych6. Uważa się, że przyczyną infekcji w większości przypadków jest zanieczyszczenie mikrobiologiczne miejsca implantu podczas zabiegu7. Populacja zanieczyszczająca następnie rozszerza się na powierzchnię implantu i tkanki8. Układ odpornościowy gospodarza jest uruchamiany w odpowiedzi, ale tempo wzrostu i tworzenie biofilmu organizmów zanieczyszczających może umożliwić im uniknięcie komórek odpornościowych, co może prowadzić do zwiększonej burzy cytokin i chemokin, bez eliminacji bakterii9,10,11. Wynikające z tego głębokie zakażenie kości zagraża utrwaleniu i działaniu implantu, a także zdrowiu pacjenta12.

Staphylococcus aureus i gronkowce koagulazo-ujemne są dominującymi organizmami sprawczymi klasy PJI13. Nasilenie zakażeń gronkowcowych jest wysokie ze względu na ich zwiększoną oporność na antybiotyki, tworzenie biofilmu i zdolność do utrzymywania się jako warianty małych kolonii14,15,16. Zakażenia związane z implantem występują w wyniku przylegania mikroorganizmów do powierzchni implantu i tworzenia złożonej matrycy biofilmu, która umożliwia bakteriom unikanie szkodliwych czynników immunologicznych gospodarza i skutecznych stężeń antybiotyków14,15,16. Konwencjonalne metody leczenia obejmują dożylne i doustne kombinacje antybiotyków przez dłuższy czas17. Główną wadą tego podejścia jest niska biodostępność leku w miejscu zakażenia oraz trudność w osiągnięciu wystarczających stężeń antybiotyków do konsekwentnego eliminowania bakterii przez cały okres leczenia, co często skutkuje słabymi wynikami18. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, zaprojektowano w pełni funkcjonalny, zlokalizowany implant UHMWPE, uwalniający leki, aby zapewnić trwałe uwalnianie skutecznych stężeń antybiotyków do przestrzeni stawowej19. Miejscowa elucja z implantu uwalniającego lek jest stosowana jako narzędzie uzupełniające w celu zapobiegania wzrostowi i kolonizacji wszelkich bakterii pozostałych po usunięciu implantu i oczyszczeniu tkanki. Testy przeciwbakteryjne in vitro tego uwalniającego antybiotyki UHMWPE można przeprowadzić, inkubując materiał bezpośrednio z bakteriami i określając ilościowo bakterie metodą płytki rozsiewającej20,21. Alternatywnie, podwielokrotności pożywki eluentowej mogą być testowane przeciwko bakteriom przy użyciu metod takich jak metoda dyfuzji krążków agarowych, metody rozcieńczania bulionu i testowanie zabijania w czasie22. Wszystkie te metody opierają się na obserwacji wzrostu około 16-18 godzin po zebraniu podwielokrotności za pomocą zliczania kolonii i pomiarów zmętnienia. Elucja antybiotyków z takich urządzeń może być długoterminowo określona ilościowo przy użyciu tych metod in vitro; Jednak aby określić wartość translacyjną tych profili stężeń, potrzebna jest solidna metoda in vitro w czasie rzeczywistym do oceny aktywności przeciwbakteryjnej.

Test żywotności mikrobiologicznej użyty w tym badaniu został opracowany do ilościowego oznaczania żywotnych bakterii poprzez pomiar luminescencji odpowiadającej trifosforanowi adenozyny (ATP) uwolnionemu z żywej komórki bakteryjnej przy użyciu technologii wykrywania opartej na lucyferynie i lucyferazie. ATP, jako waluta energetyczna żywych komórek, służy jako bezpośredni wskaźnik komórek fizjologicznie żywotnych. Odczynnik przeprowadza lizę komórek, która uwalnia cząsteczki ATP z żywych komórek, które są następnie wykrywane w postaci luminescencji. Ta luminescencja jest bezpośrednio skorelowana z proporcją żywotnych komórek bakteryjnych w próbce23. Jest to działający w czasie rzeczywistym, prosty, wszechstronny, szybki test oparty na pojedynczym odczynniku, który można dostosować do różnych projektów i warunków testowych zarówno z mikroorganizmami Gram-dodatnimi, jak i Gram-ujemnymi. W tym miejscu przedstawiamy metodę określania w czasie rzeczywistym aktywności przeciwbakteryjnej UHMWPE uwalniającego antybiotyki inkubowanego z laboratoryjnymi i klinicznymi szczepami S. aureus przy użyciu zmodyfikowanego testu zabijania w czasie opartego na teście żywotności drobnoustrojów (np. BacTiter Glo). Chociaż metodologia jest opisana za pomocą określonego materiału implantologicznego i konkretnego zastosowania ortopedycznego, metoda może stanowić platformę do testowania innych urządzeń do uwalniania antybiotyków o zastosowaniach klinicznych.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie bulionu Mueller-Hintona (MHB): Rozpuścić 22 g MHB z dostosowaną zawartością kationów w 1 L wody dejonizowanej. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb przez 20 min, upewniając się, że butelka jest lekko zakręcona. Przechowywać przygotowany sterylny bulion w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Przygotowanie agaru tryptowo-sojowego (TSA): Rozpuścić 20 g proszku TSA w 500 mL wody dejonizowanej. Autoklawować mieszaninę agaru w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb przez 20 min. Przenieść sterylną pożywkę do kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C, aby obniżyć temperaturę stopionego agaru. Wlać schłodzony, przygotowany agar na sterylne szalki Petriego (~15 mL) i pozostawić do stężenia. Przechowywać zestalone płytki z agarem w pozycji odwróconej, aby uniknąć kondensacji.
  3. Przygotowanie bulionu tryptowo-sojowego (TSB): Rozpuścić 15 g proszku TSB w 500 mL wody dejonizowanej. Autoklawować mieszaninę bulionu w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb przez 20 min. Przechowywać przygotowany sterylny bulion w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  4. Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS): Autoklawować zakupiony komercyjnie 1x PBS w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 lb przez 20 min przed sterylnym użyciem.
  5. Przygotowanie odczynników do testu żywotności drobnoustrojów: Doprowadzić zawartość zestawu testowego do temperatury pokojowej. Wymieszać 10 mL buforu z liofilizowanym proszkiem odczynnika luminescencyjnego i przechowywać przygotowany odczynnik w temperaturze −20 °C w aliquotach po 1 mL. Przed każdym punktem czasowym rozmrozić światłoczuły odczynnik i doprowadzić go do temperatury pokojowej.
  6. Roztwór stokowy siarczanu gentamycyny: Rozpuścić 80 mg siarczanu gentamycyny (GS) w 10 mL 1x PBS. Dokładnie wymieszać roztwór leku na wirówce typu vortex, aby uzyskać roztwór stokowy GS o stężeniu 8 mg/mL.
  7. Roztwór stokowy chlorowodorku wankomycyny: Dokładnie rozpuścić 10 mg proszku chlorowodorku wankomycyny w 10 mL wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór stokowy o stężeniu 1 mg/mL.
  8. Bufor borowy: Rozpuścić 24,7 g (0,4 M) kwasu borowego w 900 mL wody dejonizowanej. Dostosować pH roztworu do poziomu 10,4 za pomocą 50% (w/v) roztworu wodorotlenku sodu. Następnie dodać wodę dejonizowaną do osiągnięcia objętości 1 L.
  9. Odczynnik O-ftalaldehyd (OPA): Rozpuścić 0,2 g OPA w 1 mL metanolu. Dodać 19 mL buforu borowego 0,4 M (pH 10,4) do roztworu OPA. Dodać 0,4 mL 2-merkaptoetanolu do mieszaniny OPA i kwasu borowego. Owinąć fiolkę z odczynnikiem folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C; odczynnik można stosować do 2-3 dni po przygotowaniu.
    UWAGA: Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Prace z odczynnikami OPA i 2-merkaptoetanolem należy przeprowadzać wyłącznie pod wyciągiem z odpowiednią wentylacją, stosując właściwe środki ochrony osobistej. Unikać wdychania oparów, pyłów lub aerozoli.

2. Przygotowanie czystego i obciążonego lekiem UHMWPE

  1. Przesiać przez sito (rozmiar oczek 75 µm) po 2 g proszków siarczanu gentamycyny oraz chlorowodorku wankomycyny, a następnie odwadniać w temperaturze 45 °C w piecu próżniowym (<0.1 atm) przez 18-24 h.
  2. Wymieszać odwadniony lek z proszkiem UHMWPE w stężeniu 7% w/w (1,12 g antybiotyku + 14,88 g UHMWPE) w pojemniku za pomocą mieszadła mechanicznego przez 5 min.
  3. Podgrzać niestandardową formę z brązu glinowego (85 mm x 50 mm) z wkładkami ze stali nierdzewnej do 180 °C w piecu konwekcyjnym przez 1 h. Podgrzać płyty prasy do 170 °C.
  4. Wprowadzić wymieszany proszek do formy i prasować pod ciśnieniem 10 MPa w temperaturze 170 °C przez 10 min, a następnie przeprowadzić 45-minutowy cykl chłodzenia wodą przy ciśnieniu 10 MPa.
  5. Wyjąć uformowany blok UHMWPE (~3,5 mm) z prasy, używając prasy hydraulicznej.
  6. Frezować górną i dolną powierzchnię bloku za pomocą obrabiarki CNC (sterowanie numeryczne komputerowe), aby usunąć wszelkie nierówności powierzchniowe i zanieczyszczenia.
  7. Wyciąć z bloku paski o wymiarach 3 mm x 5 mm x 20 mm za pomocą obrabiarki CNC.
  8. Przygotować czysty UHMWPE (bez dodatku antybiotyków) z zastosowaniem tej samej metodologii, opisanej powyżej, jako kontrolę dla badania.

Rycina uzupełniająca 1: Części formy użytej do formowania próbek UHMWPE. (A) Wkładka z stali nierdzewnej; (B) otwór formy; (C) tłok; (D) płyta tylna Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

3. Określanie kinetyki elucji leku z UHMWPE

  1. Umieść pasek o wymiarach 3 mm x 5 mm x 20 mm w strzykawce 3 mL z końcówką Luer lock i igłą 25 G.
  2. Przemyj pasek, napełniając strzykawkę wodą dejonizowaną i kilkukrotnie ją odwracając.
  3. Napełnij strzykawkę wodą dejonizowaną do skali 2 mL.
  4. Umieść zestaw ze strzykawką na wytrząsarce przy 100 rpm w temperaturze pokojowej.
  5. W każdym punkcie czasowym (6 h, 1 dzień, 2 dni, 3 dni, 1 tydzień) zbierz eluent do fiolki 2 mL.
  6. W każdym punkcie czasowym przemyj pasek, napełniając strzykawkę wodą dejonizowaną i odwracając ją. Wylej roztwór, a następnie napełnij strzykawkę wodą dejonizowaną do skali 2 mL, aby kontynuować eksperyment do następnego punktu czasowego.

4. Oznaczanie stężenia wankomycyny

  1. Oznacz stężenie wankomycyny spektrofotometrycznie w wodzie dejonizowanej przy maksymalnej długości fali absorpcji 280 nm.
  2. Przygotuj standardy o znanych stężeniach, dodając 100 µL roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/mL do płytki UV 96-dołkowej i wykonując rozcieńczenia seryjne przy użyciu 100 µL wody dejonizowanej, aby uzyskać sześć poziomów znanych stężeń (od 1 mg/mL do 0.03125 mg/mL).
  3. Przenieś 100 µL eluentów do przezroczystych płytek UV 96-dołkowych i wyznacz stężenie przy 280 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  4. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, nanosząc znane stężenia leku w funkcji odpowiadających im wartości absorbancji. Oblicz nieznane stężenie leku w eluencie, korzystając z równania liniowego wyznaczonego z krzywej kalibracyjnej.
  5. Wyznacz masę leku, mnożąc stężenie przez objętość eluentu (~1.7 mL).
  6. Oblicz skumulowane uwalnianie leku (mg) w danym punkcie czasowym, sumując ilość leku uwolnioną we wszystkich poprzednich punktach czasowych.
  7. Znormalizuj uwalnianie leku do powierzchni paska (3.5 cm2), aby wyznaczyć skumulowane uwalnianie leku na centymetr kwadratowy (cm2) implantu.

5. Oznaczanie stężenia gentamycyny metodą znakowania OPA27

  1. Przygotować roztwory wzorcowe GS do przeprowadzenia analizy OPA.
    1. Przenieść 1 mL roztworu GS o stężeniu 80 µg/mL do probówki wirówkowej.
    2. Dodać 500 µL PBS do pięciu kolejnych probówek wirówkowych.
    3. Przeprowadzić rozcieńczenia szeregowe w tych probówkach, aby uzyskać stężenia GS wynoszące 80 µg/mL, 40 µg/mL, 20 µg/mL, 10 µg/mL, 5 µg/mL oraz 2,5 µg/mL. Będą one służyć jako roztwory kalibracyjne dla analizy.
  2. Do przezroczystej płytki 96-dołkowej dodać 80 µL PBS do dołka A-1 oraz 80 µL roztworów kalibracyjnych do dołków od A-2 do A-7 w kolejności rosnących stężeń. Służy to jako wewnętrzna kalibracja analizy.
  3. Dodać 80 µL każdej próbki do pustych dołków w trzech powtórzeniach do analizy na tej samej płytce 96-dołkowej. Ograniczyć liczbę próbek na płytce do <50, aby czas dodawania roztworu OPA do próbek był zbliżony dla wszystkich analizowanych materiałów oraz aby uniknąć odparowania.
  4. Dodać odczynnik OPA do wszystkich wzorców i roztworów próbek.
    1. W dygestorium napełnić 25 mL zbiornik na odczynniki metanolem.
    2. Dodać 8 mL metanolu i 1 mL przygotowanego roztworu OPA do drugiego zbiornika na odczynniki (sekcja 1.8). Dokładnie wymieszać roztwór poprzez wielokrotne pipetowanie.
    3. Za pomocą wielokanałowej mikropipety 100 µL dodać 48 µL metanolu z pierwszego zbiornika do wszystkich dołków zawierających próbki na płytce 96-dołkowej.
    4. Następnie dodać 72 µL rozcieńczonego roztworu OPA z drugiego zbiornika do wszystkich dołków zawierających próbki na płytce 96-dołkowej. Inkubować płytkę przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  5. Niezwłocznie po 10-minutowej inkubacji zmierzyć intensywność fluorescencji (wzbudzenie 340 nm, emisja 455 nm) przy użyciu czytnika mikropłytek.
  6. Wykreślić krzywą kalibracyjną, wykorzystując odczyty intensywności dla roztworów o znanych stężeniach GS. Dodać linię liniową, aby wyznaczyć najlepsze dopasowanie i wygenerować odpowiednie równanie.
  7. Obliczyć stężenie leku w eluentcie na podstawie krzywych kalibracyjnych wygenerowanych poprzez zestawienie znanych stężeń leku z odpowiadającymi im wartościami absorbancji.
  8. Obliczyć masę leku, mnożąc stężenie przez objętość eluentu (~1,7 mL).
  9. Wyznaczyć skumulowane uwalnianie leku (mg) w danym punkcie czasowym poprzez zsumowanie ilości leku uwolnionego we wszystkich poprzednich punktach czasowych.
  10. Znormalizować uwalnianie leku do powierzchni paska (3,5 cm2), aby wyznaczyć skumulowane uwalnianie leku na centymetr kwadratowy (cm2) implantu.

6. Przygotowanie bakterii

UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano następujące szczepy S. aureus: szczep wzorcowy 12600 oraz szczepy kliniczne L1101 i L1163 (otrzymane od dr Kerry LaPlante z University of Rhode Island). Profile wrażliwości tych szczepów przedstawiono w Tabeli 1.

Szczepy bakteryjneMIC gentamycynyMIC wankomycyny
ATCC 12600≤1 µg/mL (Wrażliwy)≤0.5 µg/mL (Wrażliwy)
L1101 (szczep kliniczny)≥16 µg/mL (Oporny)8 µg/mL (Poziom średniozaawansowany)
L1163 (szczep kliniczny)≤1 µg/mL (Wrażliwy)8 µg/mL (Poziom średniozaawansowany)

Tabela 1: Profile wrażliwości na antybiotyki szczepów kontrolnych i klinicznych S. aureus.

UWAGA: Wszystkie etapy obejmujące pracę z kulturami i zawiesinami bakteryjnymi były wykonywane w laboratorium poziomu BSL-2 w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2.

  1. Rozmrozić szczepy bakterii z −80 °C na płytkach TSA, aby umożliwić wzrost S. aureus. Inkubować płytki statycznie przez noc w temperaturze 35 °C.
  2. Przenieść od dwóch do trzech kolonii z kultur na płytkach agarowych wyhodowanych przez noc do 1 mL sterylnego TSB i inkubować statycznie przez noc w temperaturze 35 °C.
  3. Przenieść 100 µL bakterii do przezroczystej płytki 96-dołkowej, aby spektrofotometrycznie zmierzyć mętność poprzez oznaczenie absorbancji przy 600 nm.
  4. Rozcieńczyć bakterie 10 000x w sterylnym MHB przed oznaczeniem liczby żywych bakterii za pomocą testu luminescencyjnego.

7. Wykonywanie testu żywotności drobnoustrojów w czasie rzeczywistym

  1. Należy przeprowadzić test luminescencyjny z użyciem białych płytek 96-dołkowych z nieprzezroczystym dnem.
  2. Wymieszaj 100 µL rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych z 100 µL odczynnika do analizy przygotowanego w sekcji 1.5.
  3. Przykryć przygotowaną płytkę 96-dołkową pokrywką owiniętą folią aluminiową i inkubować przez 5 min przy wstrząsaniu z prędkością 100 obr./min.
  4. Należy niezwłocznie zmierzyć luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek, stosując następujące ustawienia w oprogramowaniu Gen5 3.11.
    1. Kliknij Nowy aby opracować protokół w Menedżer zadań okno
    2. Wybierz Costar 96 białe nieprzezroczyste w menu rozwijanym dla Typ płytki.
    3. Kliknij w Przeczytaj pod Wybierz kroki > Działania menu
    4. Kliknij w Luminescencja w obrębie Metoda okno. Zachować Pomiar końcowy/kinetyczny oraz światłowód luminescencyjny opcje wybrane odpowiednio w polach read type oraz optics type. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
    5. Zachowaj ustawienia w Przeczytaj krok okno (wzmocnienie = 135; czas integracji = 1 s; wysokość odczytu = 4,5 mm). Kliknij w Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
    6. Okno układu płytek jest gotowe do uruchomienia badania. Zaznacz pole Use Lid w oknie ładowania płytki i kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    7. Umieść płytkę 96-dołkową w urządzeniu w celu odczytu wartości luminescencji.

8. Tworzenie krzywej wzorcowej luminescencji w stosunku do liczby komórek żywych dla każdego szczepu bakteryjnego

UWAGA: Wszystkie szczepy S. aureus należy hodować i enumerować zgodnie z metodologią opisaną w sekcji 6.

  1. Przygotować rozcieńczenia szeregowe zawiesin bakteryjnych, które będą służyć jako standardy.
    1. Oznaczyć liczbę komórek w zawiesinie bakteryjnej hodowanej przez noc poprzez spektrofotometryczny pomiar mętności.
    2. Wirować z prędkością 6,000 × g przez 5 min w celu osadzenia bakterii, a następnie zawiesić osad w sterylnym MHB, aby dostosować stężenie do 1 x 109 CFU/mL.
    3. Rozcieńczyć 100 µL czystej zawiesiny w 900 µL MHB, a następnie wykonać dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe do uzyskania stężenia 1 x 101 CFU/mL.
  2. Przeprowadzić test luminescencji na przygotowanych zawiesinach bakteryjnych zgodnie z opisem w sekcji 7.
  3. Użyć sterylnego MHB jako kontroli ślepej dla eksperymentu, a następnie odjąć wartość luminescencji kontroli ślepej od wartości luminescencji próbek badawczych.
  4. Wykreślić zależność log (CFU) od log (luminescencji) w celu wygenerowania krzywej standardowej. Zapisać równanie oraz wartość R2.
  5. Wyznaczyć wartość CFU/mL odpowiadającą wartościom luminescencji, korzystając z równania specyficznego dla danego szczepu w trakcie całego badania.

9. Konfiguracja badania aktywności przeciwbakteryjnej zależnej od czasu

Schemat testu żywotności bakterii: inkubacja S. aureus, wirowanie, proces analizy luminescencji.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Hodować bakterie przez noc w 1 mL bulionu TSB.
  2. Rozcieńczyć nocną zawiesinę bakteryjną do stężenia 105 CFU/mL w sterylnym MHB (sekcja 6) i zweryfikować liczbę żywych bakterii za pomocą jednostek luminescencji przed rozpoczęciem eksperymentu (sekcja 7).
  3. Umieścić paski czystego UHMWPE oraz paski UHMWPE załadowane lekiem (3 mm x 5 mm x 10 mm, połowa wymiarów pasków przygotowanych do badań elucji w sekcji 2) w strzykawce 3 mL.
  4. Nabrać MHB zawierający 105 CFU/mL do strzykawki przez dołączoną igłę do kreski 1,5 mL, co odpowiada 1,35 mL MHB (Rysunek 1: Krok 1).
  5. Umieścić zestaw ze strzykawką w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) w temperaturze 37 °C do wskazanych punktów czasowych: 6 h, Dzień 1, Dzień 2, Dzień 3, Dzień 4, Dzień 5, Dzień 6 oraz Dzień 7 (Rysunek 1: Krok 2).
  6. W każdym wskazanym punkcie czasowym wyjąć zestaw ze strzykawką i przeprowadzić analizę żywotności drobnoustrojów w czasie rzeczywistym zgodnie z sekcją 7 na 100 µL zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 1: Kroki 3-4).
  7. Wyznaczyć liczbę żywych bakterii dla punktów czasowych 6 h, Dzień 1, Dzień 2, Dzień 3 oraz Dzień 7. Obliczyć CFU/mL z jednostek luminescencji, korzystając z odpowiedniej krzywej wzorcowej.
  8. Zweryfikować brak żywych bakterii w próbkach, które wykazały wartości luminescencji poniżej granicy wykrywalności, wykonując metodę posiewu powierzchniowego na płytkach TSA i inkubując przez noc w temperaturze 35 °C. Następnego dnia sprawdzić obecność kolonii.
  9. Odwirować pozostałą zawiesinę bakteryjną przy 10 000 × g przez 10 min i ostrożnie odessać zużyte podłoże. W przypadku probówek, w których osad nie jest widoczny ze względu na aktywność przeciwbakteryjną leków, pozostawić w probówce 100 µL, aby upewnić się, że niewidoczny osad nie zostanie naruszony (Rysunek 1: Krok 5).
  10. Resuspendować osad bakteryjny w świeżym MHB i ponownie nabrać zawiesinę bakteryjną do tego samego zestawu strzykawki przez dołączoną igłę (Rysunek 1: Krok 6).

10. Ilościowe oznaczenie bakterii przylegających do powierzchni UHMWPE

  1. Wyjąć powierzchnie czystego UHMWPE oraz UHMWPE obciążonego lekiem z układu strzykawkowego po zakończeniu badania w 7. dniu.
  2. Przenieść powierzchnie do probówek o pojemności 1,5 mL i wypłukać 1 mL sterylnego PBS (trzykrotnie).
  3. Poddać powierzchnię sonikacji przez 40 min w 1 mL sterylnego PBS. Określić żywotność przytwierdzonych bakterii, wykonując pomiar luminescencji na 100 µL sonikowanej próbki, zgodnie z opisem w sekcji 7.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, UHMWPE uformowano z gentamycyną i wankomycyną w stężeniu 7% w/w, a następnie poddano elucji do wody dejonizowanej. Stężenie leku w eluciancie z materiału oznaczano po 6 h, 1 dniu, 2 dniach, 3 dniach i 1 tygodniu. Uwalnianie leków z UHMWPE obciążonego wankomycyną i gentamycyną wykazało gwałtowny wyrzut w 6 h, po którym nastąpiła stała szybkość uwalniania, przy czym stężenie uwalnianego leku było wyższe niż minimalne stężenie hamujące (MIC) aż do 7 dnia (Rysunek 2, Tabela 2).

Przed badaniem przeciwbakteryjnym sporządzono krzywą wzorcową w celu skorelowania jednostek luminescencji z liczbą CFU/mL bakterii dla każdego szczepu S. aureus (ATCC 12600, L1101 oraz L1163). Odpowiadające im wartości log (luminescencji) naniesiono na wykres w funkcji log (CFU/mL), aby wyznaczyć krzywą wzorcową (Rysunek 3). Obliczone wartości R2 wyniosły odpowiednio 0,997, 0,996 i 0,994 dla szczepów ATCC 12600, L1101 i L1163, co wskazuje na wysoką zgodność w badanym zakresie stężeń. Wyprowadzone równanie wykorzystano następnie do obliczenia żywotności bakterii we wszystkich eksperymentach. W przypadku szczepów ATCC 12600 i L1101 granica wykrywalności mieściła się w zakresie 1 x 102-1 x 103 CFU/mL. Z kolei granica wykrywalności dla szczepu L1163 wyniosła 1 x 104 CFU/mL.

Test aktywności przeciwbakteryjnej zależnej od czasu przeprowadzono, przyjmując 1 x 105 CFU/mL jako początkowy inokulum dla szczepów 12600, L1163 i L1101, które poddano działaniu materiałów uwalniających lek w stężeniu 7% w/w przez okres 1 tygodnia. W każdym punkcie czasowym (6 h, 1 dzień, 2 dni, 3 dni, 1 tydzień) odświeżano medium i ponownie resuspendowano populację bakterii. Ekspozycję bakterii na następujące po sobie uwalnianie leków z materiału kontynuowano aż do kolejnego punktu czasowego. UHMWPE z 7% w/w wankomycyną oraz UHMWPE z 7% w/w gentamycyną wykazały redukcję >3log dla wrażliwego szczepu ATCC 12600 począwszy od 6 h, a całkowitą eradykację (brak wzrostu kolonii) zaobserwowano po 3 dniach (Rycina 4A). W przypadku szczepu L1163, wrażliwego na gentamycynę i pośrednio opornego na wankomycynę, oba materiały uwalniające lek spowodowały redukcję >3log w 6 h, a całkowitą eradykację (brak wzrostu kolonii) zaobserwowano w 1. dniu eksperymentu (Rycina 4B). Dla szczepu L1101, opornego na gentamycynę i pośrednio opornego na wankomycynę, uwalnianie gentamycyny z UHMWPE nie wpłynęło na żywotność bakterii L1101 (Rycina 4C). Bakterie namnażały się, a populacja ustabilizowała się w ciągu 6 h w obecności czystego UHMWPE bez uwalniania antybiotyku. W obecności UHMWPE uwalniającego gentamycynę populacja osiągnęła podobny poziom wzrostu w 2. dniu. Przeciwnie, uwalnianie wankomycyny z UHMWPE znacząco zmniejszyło żywotność bakterii (>3log) w 6 h, a całkowitą utratę żywotności (brak wzrostu kolonii) wykazano do 4. dnia.

Powierzchnie UHMWPE uwalniającego gentamycynę oraz UHMWPE uwalniającego wankomycynę nie wykazały obecności żywych bakterii przylegających po wystawieniu na działanie szczepów wrażliwych i o pośredniej oporności po 7. dniu lub po całkowitej eradykacji, w zależności od tego, co nastąpiło wcześniej. Niektóre żywe bakterie (1 x 105 CFU/mL) były obecne na UHMWPE uwalniającym gentamycynę wystawionym na działanie opornego na gentamycynę szczepu L1101. Podobnie, około 1 x 105 CFU/mL żywych bakterii przylegających odizolowano z kontrolnego pierwotnego PE (Rysunek 5).

Wykres stężenia antybiotyków; wykres słupkowy; poziomy wankomycyny i gentamycyny; badanie farmakokinetyczne.
Rysunek 2: Zależne od czasu średnie uwalnianie antybiotyków z paska UHMWPE z 7% m/m zawartością antybiotyku. Średnie uwalnianie antybiotyków w określonych punktach czasowych z jednego paska UHMWPE z 7% m/w zawartością gentamycyny i wankomycyny (3 mm3 x 5 mm3 x 10 mm3 ~ 2 cm2 powierzchni). MIC przeciwko szczepowi kontrolnemu ATCC 12600 przedstawiono jako linię przerywaną dla gentamycyny i linię ciągłą dla wankomycyny. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej z sześciu powtórzeń (n = 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres luminescencji względem CFU/ml; wielomianowe linie trendu; wartości R² wskazują dopasowanie danych.
Rycina 3: Krzywa wzorcowa testu luminescencji w czasie rzeczywistym dla wszystkich szczepów S. aureus. Log (luminescencja) został naniesiony względem log (CFU/mL) w celu wygenerowania krzywych wzorcowych dla szczepu kontrolnego (A) ATCC 12600 oraz szczepów klinicznych (B) L1101 i (C) L1163. Równania opisujące linię najlepszego dopasowania oraz odpowiadające im wartości R2 są wskazane na wykresach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy hamowania wzrostu bakterii porównujące czyste PE, gentamycynę i wankomycynę w czasie; CFU/mL.
Rycina 4: Żywotność bakterii określona za pomocą testu luminescencyjnego dla UHMWPE uwalniającego 7% m/m gentamycyny i 7% m/m wankomycyny. Przedstawiono zależną od czasu aktywność przeciwbakteryjną gentamycyny i wankomycyny uwalnianych z UHMWPE przeciwko szczepom kontrolnym, (A) ATCC 12600, oraz szczepom klinicznym, (B) L1163 i (C) L1101. Czyste 1020 PE służyło jako kontrola w eksperymencie. Żółta linia na wykresach wskazuje granicę wykrywalności dla odpowiedniego szczepu S. aureus. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający adhezję bakterii (CFU/cm²) wobec antybiotyków VPE, gentamycyny, wankomycyny.
Rysunek 5: Żywotność bakterii adherentnych określona za pomocą luminescencyjnego testu Glo dla UHMWPE uwalniającego 7% w/w gentamycyny i 7% w/w wankomycyny wobec wszystkich szczepów S. aureus. Wykres słupkowy przedstawia liczbę odzyskanych bakterii adherentnych (CFU) na centymetr kwadratowy (cm2) UHMWPE z dodatkiem 7% gentamycyny i 7% wankomycyny na koniec okresu badania dla wszystkich badanych szczepów. Słupki prezentują dane jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Punkty czasoweWankomycynaGentamycyna 
Stężenie szczytowe (µg/mL)Stężenie szczytowe (µg/mL)
0 – 6 h336 ± 72263 ± 24
6 h – 1 doba57 ± 1816 ± 2
dzień 1 – dzień 260 ± 187 ± 1
dzień 2. – dzień 3.23 ± 65 ± 0.4
3. dzień – 7. dzień49 ± 2015 ± 1

Tabela 2: Szczytowe stężenie leku (μg/mL) w różnych punktach czasowych. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 6).

Rysunek uzupełniający 2: Zanik sygnału luminescencji w okresie 10 min od dodania odczynnika analitycznego do próbki. Różnica sygnału wynosząca ±5% jest przedstawiona jako linia przerywana Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Miejscowe, stałe podawanie antybiotyków jest niezbędnym narzędziem w leczeniu zakażeń stawów okołoprotezowych. Antybiotyki ogólnoustrojowe są podstawową strategią zwalczania infekcji bakteryjnych, a miejscowa elucja jest stosowana jako narzędzie uzupełniające w celu zapobiegania wzrostowi i kolonizacji wszelkich bakterii pozostałych po usunięciu implantu i oczyszczeniu tkanki. Cel dotyczący efektywnego obszaru pod krzywą (stężenie w pewnym okresie) dla antybiotyków podawanych miejscowo nie jest dobrze poznany. Wymywanie antybiotyków z takich urządzeń można określić ilościowo in vitro; Jednak aby określić wartość translacyjną tych profili stężeń, potrzebna jest solidna metoda in vitro do oceny aktywności przeciwbakteryjnej. W tym artykule opisano jedną z takich metod w czasie rzeczywistym w celu określenia aktywności przeciwbakteryjnej UHMWPE uwalniającego leki, który ma być stosowany jako urządzenie do przedłużonego dostarczania w endoprotezoplastykach stawów.

Monitorowanie żywotności bakterii w czasie rzeczywistym jest kluczowym parametrem zainteresowania klientów, a konwencjonalnym metodom mikrobiologicznym brakuje ram, które uwzględniałyby ten konkretny aspekt badania. Test żywotności mikrobiologicznej zastosowany w tym badaniu został opracowany do ilościowego oznaczania żywotnych bakterii poprzez pomiar luminescencji odpowiadającej trifosforanowi adenozyny (ATP). Aby bezpośrednio zbadać zależną od czasu aktywność antybiotyków wymytych z materiałów implantów, inkubowano z nimi trzy różne szczepy o różnych profilach wrażliwości na antybiotyki. Uzasadnieniem dla stosowania laboratoryjnych i klinicznych szczepów o różnej oporności na gentamycynę i wankomycynę było zrozumienie zakresu działania danej postaci implantu. Co więcej, aktywność przeciwbakteryjna i skuteczność przeciwko tym odrębnym populacjom zależy od czasu podawania. Metoda koncentruje się na możliwości profilaktyki przeciwko tym szczepom w oparciu o >70% zakażeń stawów okołoprotezowych spowodowanych zanieczyszczeniem rany w momencie operacji24.

Jako inokulum wyjściowe do opracowania tej metody użyto 1 x 105 jtk/ml. Różne stężenia zanieczyszczeń zostały wykorzystane w modelach zwierzęcych, chociaż niewiele wiadomo na temat klinicznie istotnego obciążenia infekcją dla PJI. Modele infekcji zwierzęcych PJI zostały rutynowo ustalone przy użyciu 1 x 105 CFU, a podobny zakres jest szeroko stosowany w metodach standaryzowanych (CLSI) w celu określenia aktywności przeciwbakteryjnej 25,26,27. Użycie 1 x 105 CFU/ml jako początkowego stężenia zanieczyszczenia pozwoliło nam ocenić zarówno parametry wzrostu, jak i eliminacji w tym samym czasie.

Konwencjonalnie wartości MIC są określane dla stałego stężenia antybiotyku dla określonej liczby bakterii i nie wykazują szybkości działania przeciwbakteryjnego. Ze względu na ten aspekt wartości MIC nie zapewniają zróżnicowania ilościowego w celu opisania profilu aktywności przeciwdrobnoustrojowej28. Dane z obecnej metody podkreślają korzyści płynące z oceny kinetyki zabijania antybiotyków zależnej od szczepu, a nie wykorzystywania MIC do podejmowania decyzji dotyczących dawkowania. Za pomocą tej metody możliwe było zróżnicowanie zarówno zakresu, jak i tempa, w jakim materiały implantów wpływały na różne szczepy. Gentamycyna wymywana z pasków materiału implantu była skuteczna w eliminowaniu L1163 w ciągu 1 dnia i eliminowaniu ATCC 12600 w ciągu 2-3 dni, ale była nieskuteczna w eliminowaniu L1101 (ryc. 4). Oprócz spodziewanego braku aktywności elucji gentamycyny przeciwko L1101 (MIC >32 μg/ml) ze względu na jej nieodłączną oporność na gentamycynę (Figura 4C), zaobserwowano utrzymywanie się subpopulacji po ekspozycji na wankomycynę, dla której L1101 wykazuje oporność pośrednią. W przeciwieństwie do tego, L1163 został ostatecznie wyeliminowany w obecności UHMWPE uwalniającego wankomycynę, mimo że wykazywał podobną pośrednią oporność na wankomycynę jak L1101 (dla obu szczepów zaobserwowano MIC 8 μg/ml).

Obserwacje, że szybkość aktywności gentamycyny wobec 12600 i L1163, które są wrażliwe na gentamycynę o podobnych wartościach MIC (dla obu szczepów zaobserwowano MIC 1 μg/ml), były różne, jak również, że zakres aktywności wankomycyny wobec średnio opornych L1101 i L1163 był różny (ryc. 4A,B) potwierdził hipotezę, że ta metoda działająca w czasie rzeczywistym w obecności materiału eluującego może różnicować podłużne różnice w aktywności.

Oprócz wartości translacyjnej wyników w interpretacji skuteczności danego eluowanego stężenia przeciwko tym bakteriom, istnieje kilka eksperymentalnych zalet metodologicznych. (1) Stężenie bakterii określa się natychmiast w określonym czasie, w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, w których bakterie inkubuje się w bulionie lub na agarze przez 18-24 godziny w celu określenia żywotności. Ten okres wzrostu może zapewnić bakteriom dodatkowy czas na regenerację po stresie antybiotykowym, wprowadzając dodatkowe możliwe źródło błędów/zmienności. (2) Pożywka jest stale wymieniana przy zachowaniu bakterii, co bardziej przypomina warunki in vivo niż warunki statyczne. (3) Test ten z natury obejmuje kinetykę uwalniania leku z implantu, co pozwala na lepsze przewidywanie działania. (4) Metoda została opracowana przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów eksploatacyjnych bez potrzeby stosowania specjalnych lub drogich maszyn.

Przed przystąpieniem do badań in vivo na zwierzętach i badań klinicznych konieczne są solidne metody testowania in vitro w celu oceny zastosowań leków. Test ten może być modyfikowany i dostosowywany do różnych podejść i platform dostarczania leków, takich jak cząstki, żele, folie i inne materiały uwalniające leki, w celu określenia skuteczności eradykacji bakterii w symulowanej konfiguracji in vitro. Modyfikacje układu próbki można przeprowadzić poprzez zmianę na odpowiednie środowisko podłoża in vitro, które, jak wykazano, wpływa na aktywność kilku antybiotyków29,30.

Metoda ta ułatwia również określenie żywotnych bakterii przylegających, co jest obiecujące, ponieważ konwencjonalne metody określania minimalnego stężenia eliminacji biofilmu są czasochłonne i dają niespójne wyniki. Metoda ta ma być jednak rygorystycznie testowana na biofilmach w celu opracowania wiarygodnej i solidnej metodologii określania jej czułości. Metoda luminescencyjna oparta na ATP może być wystarczająco czuła, aby wykrywać żywe formy bakterii w biofilmach, w tym substancje trwałe, które mogą, ale nie muszą, być wykryte na płytce agarowej jako widoczne kolonie. Podsumowując, ta wszechstronna platforma ma potencjał, aby włączyć odpowiednie parametry do rejestrowania w czasie rzeczywistym obserwacji aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwbiofilmowej leków będących przedmiotem zainteresowania.

Skuteczność tej metody zależy od następujących aspektów:

Wstępnie określona charakterystyka elucji i wielkość próbki
Profil elucyjny materiału uwalniającego antybiotyki można określić w oddzielnym doświadczeniu przed pomiarem aktywności przeciwbakteryjnej, tak aby można było określić ilość materiału wymaganą do aktywnego przeprowadzenia eksperymentu w określonym czasie.

Określanie pojemnika i objętości
Ważne jest, aby opracować konfigurację, w której objętość pożywki w eksperymencie może pomieścić całą powierzchnię tego samego materiału i zapewnić wystarczającą objętość do niezakłóconego uwalniania leku z powierzchni obciążonej lekiem. Zastosowana konfiguracja została oparta na wcześniejszych eksperymentach, zapewniając "idealne warunki zlewu" dla tych hydrofilowych leków, tak aby ich dyfuzja nie była utrudniona przez ograniczenia rozpuszczalności.

Charakterystyka podłoża wzrostowego
Należy zbadać wybór pożywek wzrostowych w celu zapewnienia stabilności i optymalnego działania wybranego leku (leków)29. Bulion Muellera Hintona skorygowany kationami (CAMHB), który jest szeroko stosowany w metodzie rozcieńczania bulionu, został użyty do określenia wartości MIC znanych antybiotyków. Pożywka umożliwia optymalną aktywność leku bez ingerencji w akumulację toksycznych metabolitów wtórnych31. Odczynnik testowy został przetestowany i zgłoszono jako stabilny w różnych typach pożywek, w tym tych ze składnikami surowicy23,28. Chociaż względne wartości jednostek luminescencji mogą się różnić w różnych ośrodkach, wykazano, że składniki ośrodków nie zakłócają testu32,33. Objętość eksperymentalna została dodatkowo zoptymalizowana do 1,5 ml, co jest zbliżone do objętości płynu maziowego obecnego w przestrzeni stawu kolanowego osoby dorosłej34.

Stabilność temperatury dla testu
Obchodzenie się z odczynnikiem luminescencyjnym i dodawanie go do testu należy przeprowadzać w sposób spójny we wszystkich doświadczeniach. Zmiany temperatury zmieniają czułość testu, dlatego ważne jest, aby inkubować odczynnik w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przed dodaniem go do bakterii23.

Czas inkubacji odczynnika
Luminescencja z odczynnika zanika z czasem. Sygnał luminescencyjny ma okres półtrwania wynoszący ponad 30 minut, co jest w dużej mierze zależne od pożywki i rodzaju bakterii użytej w eksperymencie23. Dodatkowo, wszelkie różnice w czasie inkubacji (tj. czasie między dodaniem odczynnika do bakterii a odczytem luminescencji) spowodują niespójne odczyty dla tego samego stężenia bakterii. Zaobserwowano 5% różnicę w sygnale luminescencyjnym, gdy został pobrany w ciągu 1 minuty po 5-minutowym czasie inkubacji zgodnie z instrukcjami producenta (rysunek uzupełniający 2). Biorąc pod uwagę te dane, odczyty luminescencji były rejestrowane w ciągu 1 minuty przez cały czas trwania badania, aby upewnić się, że utrata sygnału nie przekracza 5%. Ponadto ważne jest, aby ograniczyć liczbę próbek na płytkę, aby zmniejszyć błąd wynikający z zaniku luminescencji od pierwszego do ostatniego dołka.

Utrzymanie populacji bakterii przez cały czas trwania badania
W ramach tej metody podjęto próbę modelowania klirensu leku i obrotu objętościowego błony maziowej poprzez ciągłe oddzielanie zużytych pożywek od populacji bakterii w każdym punkcie czasowym przy użyciu wirowania z dużą prędkością przy 10 000 x g przez 10 minut35. Ten krytyczny krok zapewnia sedymentację wszystkich żywotnych i nieżywotnych komórek bakteryjnych. Ponadto osadzone bakterie są równomiernie odtwarzane w świeżym MHB i przenoszone do zestawu strzykawki, ułatwiając całkowite przeniesienie dotkniętej populacji drobnoustrojów z powrotem do układu eksperymentalnego. Powtarzalność i wiarygodność tej metody w dużym stopniu opiera się na symulacji długotrwałej ekspozycji antybiotyków na populację drobnoustrojów pochodzącą z początkowego inokulum.

Kluczowym ograniczeniem tej metody jest to, że jest to test półstatyczny, który nie symuluje dokładnie okresów półtrwania leku i ciągłego obrotu błony maziowej. Jednak ciągła wymiana medium częściowo kompensuje to ograniczenie. Czułość testu żywotności drobnoustrojów była zależna od szczepu i wynosiła od 1 x 102-1 x 104 CFU/ml, co ogranicza zdolność wykrywania. Ponadto dla każdego organizmu należy wykreślić krzywą standardową, ponieważ typ szczepu przyczynia się do czułości i wydajności odczynnika luminescencyjnego. Zarówno na dynamikę wzrostu bakterii, jak i na aktywność zastosowanego związku leczniczego mogą mieć wpływ składniki pożywki, które powinny być dalej badane.

Oświadczenia

Starszy autor (E.O.) otrzymuje tantiemy pochodzące z licencjonowania własności intelektualnej następującym firmom: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Nie ma konfliktu interesów z żadnym z przedstawionych tu badań.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) oraz przez Harris Orthopaedic Laboratory. Autorzy dziękują dr Kerry Laplante i jej zespołowi z University of Rhode Island za dostarczenie klinicznych szczepów L1101 i L1163.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Płytki 96-dołkowe - polistyren, High Bind, białe studzienki z płaskim dnem, niesterylne, białe, 100/csCorning, NY, USACLS3922-100EA
2-merkaptoetanolSigma Aldrich, Niemcy
ATCC 12600Kolekcja kultur typu amerykańskiego, VA, USA
Test żywotności komórek mikrobiologicznych BacTiter-GloPromega Corporation, USAG8231
BD Bacto Tryptic Soy Bulion (Soybean-Casein Digest Medium)Becton-Dickinson, USABD 211825zakupiony w Fisher Scientific, USA
Strzykawka BD Luer-Lok sterylna, jednorazowego użytku, 3 mLBD, USA
Igła BD 5/8 cala jednorazowego użytku, sterylna, 25 GBD, USA
BD  BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Bulion (dostosowany do kationów)Becton-Dickinson, USAB12322zakupiony od Fisher Scientific, USA
BD  Odwodnione podłoża hodowlane Difco: Tryptyczny agar sojowy (agar sojowo-kazeinowy)Becton-Dickinson, USADF0369-17-6zakupiony od Fisher Scientific, USA
Kwas borowy Fisher Chemical, NJ, USA
Kąpiel ultradźwiękowa Branson 1800Emerson, MO, Stany Zjednoczone
Corning  Bakteriologiczne szalki Petriego Falcon z pokrywkąFisher Scientific, USA08-757-100D
Siarczan gentamycyny Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, Chiny
Greiner UV-Star  Płytki 96-dołkoweSigma Aldrich, NiemcyM3812-40EA
Prasa hydraulicznaCarver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101 Szczep kliniczny od dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163 Szczep kliniczny od dr Kerry Laplante, University of Rhode Island, LSE laboratoryjny
inkubator z wytrząsaniemCorning, NY, USA
Metanol, Optima dla HPLC, Fisher ChemicalFisher Scientific, NJ, USAA454-1
Napco CO2 6000Thermo Scientific, MA, USA
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X roztwór, pH 7,4, Fisher BioReagentsFisher Scientific, USABP24384
Ftaldiadehyd ≥ 97% (HPLC)Sigma Aldrich, NiemcyP1378-5g
Czytnik płytek (Synergy H1Biotek, VT, USA
pressCarver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Wodorotlenek sodu Sigma Aldrich, Niemcy
Thermo Scientific  Odczynnik do wody dejonizowanejFisher Scientific, USA23-751628
UHMWPEGUR1020, Celanese, TX, USA
Chlorowodorek wankomycyny Fagron, Holandia804148
WAB TurbulaWAB Turbula, Szwajcaria
309657 305122

Bibliografia

  1. Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
  2. Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
  3. Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190(2020).
  4. UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
  5. Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871(2016).
  6. Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
  7. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  8. Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
  9. de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
  10. Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243(2016).
  11. González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023(2018).
  12. Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
  13. Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
  14. Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
  15. Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131(2021).
  16. Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
  17. Li, C., Renz, N., Trampuz, A. Management of periprosthetic joint infection. Hip & Pelvis. 30 (3), 138-146 (2018).
  18. Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
  19. Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080(2017).
  20. Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
  21. Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031(2021).
  22. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  23. BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
  24. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  25. López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
  26. Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25(2017).
  27. Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934(2018).
  28. Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
  29. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
  30. Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790(2021).
  31. Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192(2018).
  32. Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777(2020).
  33. Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191(2019).
  34. Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
  35. Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Implanty z UHMWPEbadania skuteczno ci pod u nejperiprotetyczne zaka enie stawutest ywotno ci w czasie rzeczywistymelucja antybiotykuywotno bakteryjnajednostki tworz ce kolonieprzed u one uwalnianie leku
Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.