Artykuł metodologiczny

Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64641

⸱

3 marca 2023

 ,  , 
1Harris Orthopaedics Laboratory, Massachusetts General Hospital, 2Department of Orthopaedic Surgery, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oceny skuteczności przeciwbakteryjnej polimeru uwalniającego antybiotyki do symulacji profilaktycznego zastosowania klinicznego za pomocą dostępnego na rynku testu żywotności mikrobiologicznej luminescencyjnego opartego na ATP w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia monitorowanie aktywności podłużnej materiałów uwalniających leki i może być szeroko stosowana do testowania przeciwdrobnoustrojowych platform dostarczania leków.

Streszczenie

Polietylen o ultrawysokiej masie cząsteczkowej (UHMWPE) jest szeroko stosowany w endoprotezoplastyce stawów jako powierzchnia nośna. Infekcje okołoprotezowe stawów, z których większość występuje wkrótce po endoprotezoplastyce, stanowią prawie 25% wszystkich operacji rewizyjnych stawu kolanowego, a całkowite wyeliminowanie infekcji bakteryjnej stanowi duże wyzwanie. Obiecującym sposobem rozwiązania tego problemu jest zapewnienie miejscowego, stałego dostarczania antybiotyków o stężeniach wystarczających do zahamowania rozwoju bakterii w celu wsparcia rutynowej ogólnoustrojowej profilaktyki antybiotykowej. Prowadzone są intensywne badania nad opracowaniem skutecznych urządzeń do miejscowego dostarczania leków. Chociaż uznane metody testowania przeciwbakteryjnego leków mogą być wykorzystywane do testowania skuteczności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki, brakuje ich pod względem dostarczania w czasie rzeczywistym i podłużnych danych dotyczących skuteczności przeciwbakteryjnej, które można skorelować z profilami elucji antybiotyków z tych urządzeń. W tym miejscu przedstawiamy bezpośrednią i wszechstronną metodologię określania skuteczności przeciwbakteryjnej implantów UHMWPE uwalniających antybiotyki. Metodologia ta może być wykorzystana jako platforma do unikania hodowli bakteryjnej w każdym punkcie czasowym długiego eksperymentu, a także może być dostosowana do innych lokalnych urządzeń do dostarczania leków.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest poważnym schorzeniem zwyrodnieniowym, które dotyka 500 milionów dorosłych na całym świecie1. Złotym standardem w leczeniu schyłkowego stadium zapalenia stawów jest całkowita wymiana stawów, która ma być wykonywana u ponad 2 milionów pacjentów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych do 2030 roku2, przy czym globalny popyt również ogromnie rośnie3,4. Zabieg polega na zastąpieniu przegubowych powierzchni chrzęstnych stawów nośnymi materiałami syntetycznymi wykonanymi z metalu/ceramiki i wysoko usieciowanego polietylenu ultrawysokocząsteczkowego (UHMWPE). Całkowita wymiana stawów znacznie poprawia jakość życia pacjentów cierpiących na zapalenie stawów5, ale poważnym powikłaniem, które zagraża działaniu implantów i zadowoleniu pacjentów, jest infekcja stawu okołoprotezowego (PJI), która stanowi 15%-25% operacji rewizyjnych6. Uważa się, że przyczyną infekcji w większości przypadków jest zanieczyszczenie mikrobiologiczne miejsca implantu podczas zabiegu7. Populacja zanieczyszczająca następnie rozszerza się na powierzchnię implantu i tkanki8. Układ odpornościowy gospodarza jest uruchamiany w odpowiedzi, ale tempo wzrostu i tworzenie biofilmu organizmów zanieczyszczających może umożliwić im uniknięcie komórek odpornościowych, co może prowadzić do zwiększonej burzy cytokin i chemokin, bez eliminacji bakterii9,10,11. Wynikające z tego głębokie zakażenie kości zagraża utrwaleniu i działaniu implantu, a także zdrowiu pacjenta12.

Staphylococcus aureus i gronkowce koagulazo-ujemne są dominującymi organizmami sprawczymi klasy PJI13. Nasilenie zakażeń gronkowcowych jest wysokie ze względu na ich zwiększoną oporność na antybiotyki, tworzenie biofilmu i zdolność do utrzymywania się jako warianty małych kolonii14,15,16. Zakażenia związane z implantem występują w wyniku przylegania mikroorganizmów do powierzchni implantu i tworzenia złożonej matrycy biofilmu, która umożliwia bakteriom unikanie szkodliwych czynników immunologicznych gospodarza i skutecznych stężeń antybiotyków14,15,16. Konwencjonalne metody leczenia obejmują dożylne i doustne kombinacje antybiotyków przez dłuższy czas17. Główną wadą tego podejścia jest niska biodostępność leku w miejscu zakażenia oraz trudność w osiągnięciu wystarczających stężeń antybiotyków do konsekwentnego eliminowania bakterii przez cały okres leczenia, co często skutkuje słabymi wynikami18. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, zaprojektowano w pełni funkcjonalny, zlokalizowany implant UHMWPE, uwalniający leki, aby zapewnić trwałe uwalnianie skutecznych stężeń antybiotyków do przestrzeni stawowej19. Miejscowa elucja z implantu uwalniającego lek jest stosowana jako narzędzie uzupełniające w celu zapobiegania wzrostowi i kolonizacji wszelkich bakterii pozostałych po usunięciu implantu i oczyszczeniu tkanki. Testy przeciwbakteryjne in vitro tego uwalniającego antybiotyki UHMWPE można przeprowadzić, inkubując materiał bezpośrednio z bakteriami i określając ilościowo bakterie metodą płytki rozsiewającej20,21. Alternatywnie, podwielokrotności pożywki eluentowej mogą być testowane przeciwko bakteriom przy użyciu metod takich jak metoda dyfuzji krążków agarowych, metody rozcieńczania bulionu i testowanie zabijania w czasie22. Wszystkie te metody opierają się na obserwacji wzrostu około 16-18 godzin po zebraniu podwielokrotności za pomocą zliczania kolonii i pomiarów zmętnienia. Elucja antybiotyków z takich urządzeń może być długoterminowo określona ilościowo przy użyciu tych metod in vitro; Jednak aby określić wartość translacyjną tych profili stężeń, potrzebna jest solidna metoda in vitro w czasie rzeczywistym do oceny aktywności przeciwbakteryjnej.

Test żywotności mikrobiologicznej użyty w tym badaniu został opracowany do ilościowego oznaczania żywotnych bakterii poprzez pomiar luminescencji odpowiadającej trifosforanowi adenozyny (ATP) uwolnionemu z żywej komórki bakteryjnej przy użyciu technologii wykrywania opartej na lucyferynie i lucyferazie. ATP, jako waluta energetyczna żywych komórek, służy jako bezpośredni wskaźnik komórek fizjologicznie żywotnych. Odczynnik przeprowadza lizę komórek, która uwalnia cząsteczki ATP z żywych komórek, które są następnie wykrywane w postaci luminescencji. Ta luminescencja jest bezpośrednio skorelowana z proporcją żywotnych komórek bakteryjnych w próbce23. Jest to działający w czasie rzeczywistym, prosty, wszechstronny, szybki test oparty na pojedynczym odczynniku, który można dostosować do różnych projektów i warunków testowych zarówno z mikroorganizmami Gram-dodatnimi, jak i Gram-ujemnymi. W tym miejscu przedstawiamy metodę określania w czasie rzeczywistym aktywności przeciwbakteryjnej UHMWPE uwalniającego antybiotyki inkubowanego z laboratoryjnymi i klinicznymi szczepami S. aureus przy użyciu zmodyfikowanego testu zabijania w czasie opartego na teście żywotności drobnoustrojów (np. BacTiter Glo). Chociaż metodologia jest opisana za pomocą określonego materiału implantologicznego i konkretnego zastosowania ortopedycznego, metoda może stanowić platformę do testowania innych urządzeń do uwalniania antybiotyków o zastosowaniach klinicznych.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie bulionu Muellera-Hintona (MHB): Rozpuścić 22 g MHB z dostosowaniem kationowym w 1 l wody dejonizowanej. Autoklawuj podłoże w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 funtów przez 20 minut, upewniając się, że butelka jest luźno zakręcona. Przygotowany sterylny bulion przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Preparat z agarem sojowym tryptycznym (TSA): Rozpuść 20 g proszku TSA w 500 ml wody dejonizowanej. Autoklawować mieszaninę agarową w temperaturze 121 °C i 15 funtów przez 20 minut. Przenieść sterylne podłoże do łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby obniżyć temperaturę stopionego agaru. Wlej schłodzony przygotowany agar na sterylne szalki Petriego (~15 ml) i pozwól mu zastygnąć. Przechowuj zestalone płytki agarowe odwrócone, aby uniknąć kondensacji.
  3. Preparat bulionu sojowego tryptycznego (TSB): Rozpuść 15 g proszku TSB w 500 ml wody dejonizowanej. Autoklawować mieszaninę bulionu w temperaturze 121 °C i 15 funtów przez 20 minut. Przygotowany sterylny bulion przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  4. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Autoklaw zakupiony komercyjnie 1x PBS w temperaturze 121 °C i 15 funtów przez 20 minut przed sterylnym użyciem.
  5. Przygotowanie odczynnika do oznaczania żywotności mikrobiologicznej: Zrównoważyć zawartość testu do temperatury pokojowej. Zmieszać 10 ml buforu z liofilizowanym proszkiem odczynnika luminescencyjnego i przechowywać przygotowany odczynnik w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności o objętości 1 ml. Przed każdym punktem czasowym rozmrozić światłoczuły odczynnik i doprowadzić go do temperatury pokojowej.
  6. Roztwór podstawowy siarczanu gentamycyny: Rozpuścić 80 mg siarczanu gentamycyny (GS) w 10 ml 1x PBS. Dokładnie zmieszać roztwór leku, aby uzyskać roztwór podstawowy GS o stężeniu 8 mg/mL.
  7. Roztwór podstawowy chlorowodorku wankomycyny: Dokładnie rozpuścić 10 mg proszku chlorowodorku wankomycyny w 10 ml wody dejonizowanej, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml.
  8. Roztwór buforowy kwasu borowego: Rozpuścić 24,7 g (0,4 M) kwasu borowego w 900 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić pH roztworu do 10,4 za pomocą 50% (m/v) roztworu wodorotlenku sodu. Idąc dalej tym krokiem, dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać 1 l.
  9. Odczynnik dialdehydu O-pthal (OPA): Rozpuścić 0,2 g OPA w 1 ml metanolu. Dodać 19 ml 0,4 M buforu kwasu borowego (pH 10,4) do roztworu OPA. Dodać 0,4 ml 2-merkaptoetanolu do mieszaniny OPA i kwasu borowego. Przykryj fiolkę z odczynnikiem folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do 2-3 dni po przygotowaniu.
    UWAGA: Unikać kontaktu ze skórą, oczami i odzieżą. Obchodzenie się z odczynnikami OPA i 2 odczynnikami merkaptoetanolu powinno odbywać się wyłącznie pod wyciągiem z odpowiednią wentylacją wyciągową, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej. Unikaj wdychania oparów, kurzu lub aerozoli.

2. Przygotowanie UHMWPE z pierwotnymi i naładowanymi narkotykami

  1. Przesiać po 2 g proszków siarczanu gentamycyny i chlorowodorku wankomycyny przez sito (porów o wielkości 75 μm) i odwodnić w temperaturze 45 °C w piecu próżniowym (<0,1 atm) przez 18-24 godzin.
  2. Odwodniony lek zmiksować z proszkiem UHMWPE o stężeniu 7% m/w (1,12 g antybiotyku + 14,88 g UHMWPE) w pojemniku za pomocą miksera mechanicznego przez 5 min.
  3. Rozgrzej niestandardową formę z brązu aluminiowego (85 mm x 50 mm) z płytkami ze stali nierdzewnej do 180 °C w piecu konwekcyjnym przez 1 godzinę. Rozgrzej płyty prasy do 170 °C.
  4. Dodaj zmiksowany proszek do formy i ściskaj w temperaturze 10 MPa, 170 °C przez 10 minut, a następnie wykonaj 45-minutowy cykl chłodzenia wodą w temperaturze 10 MPa.
  5. Wyjmij uformowany blok UHMWPE (~3,5 mm) z prasy za pomocą prasy hydraulicznej.
  6. Frezuj górną i dolną powierzchnię bloku za pomocą skomputeryzowanego sterowania numerycznego (CNC), aby usunąć wszelkie nierówności powierzchni i zanieczyszczenia.
  7. Pokrój blok na paski o wymiarach 3 mm x 5 mm x 20 mm za pomocą CNC.
  8. Przygotować pierwotny UHMWPE (bez dodatku antybiotyków) przy użyciu tej samej metodyki, która została opisana jako kontrola w badaniu.

Rysunek uzupełniający 1: Części formy używane do formowania próbek UHMWPE. (A) Płyta wkładana ze stali nierdzewnej; (B) jama pleśni; (C) tłok; (D) płyta tylna Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

3. Określanie kinetyki elucji UHMWPE uwalniającego leki

  1. Umieścić pasek o wymiarach 3 mm x 5 mm x 20 mm w strzykawce o pojemności 3 ml z blokadą Luer i igłą 25 G.
  2. Umyć pasek, napełniając strzykawkę wodą dejonizowaną i kilkakrotnie odwracając strzykawkę.
  3. Napełnić strzykawkę wodą dejonizowaną do objętości 2 ml z podziałką.
  4. Umieścić zestaw strzykawki na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min w temperaturze pokojowej.
  5. W każdym punkcie czasowym (6 godzin, 1 dzień, 2 dni, 3 dni, 1 tydzień) zebrać eluent do fiolki o pojemności 2 ml.
  6. W każdym momencie należy umyć pasek, napełniając strzykawkę wodą dejonizowaną i odwracając strzykawkę. Odrzucić roztwór i napełnić strzykawkę wodą dejonizowaną do poziomu 2 ml z podziałką, aby kontynuować eksperyment do następnego punktu czasowego.

4. Oznaczanie stężenia wankomycyny

  1. Wykrywać stężenie wankomycyny spektrofotometrycznie w wodzie dejonizowanej przy szczytowej długości fali absorpcji 280 nm.
  2. Przygotuj znane wzorce zakresu stężeń, dodając 100 μl roztworu podstawowego 1 mg/ml do płytki UV 96-dołkowej i seryjnie rozcieńczając przy użyciu 100 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać sześć poziomów znanych stężeń (1 mg/ml do 0,03125 mg/ml).
  3. Przenieść 100 μl eluentów na przezroczyste dla promieniowania UV 96-dołkowe płytki i oznaczyć stężenie przy 280 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  4. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, wykreślając znane stężenia leku w stosunku do odpowiednich wartości absorbancji. Obliczyć nieznane stężenie leku w eluencie, korzystając z równania liniowego wygenerowanego przez krzywą kalibracyjną
    5. .
  5. Oznaczyć masę leku, mnożąc stężenie przez objętość eluentu (~1,7 ml).
  6. Oblicz skumulowane uwalnianie leku (mg) w określonym punkcie czasowym, sumując uwalnianie leku ze wszystkich poprzednich punktów czasowych.
  7. Znormalizuj uwalnianie leku do powierzchni paska (3,5 cm2), aby określić skumulowane uwalnianie leku na centymetr kwadratowy (cm2) implantu.

5. Oznaczanie stężenia gentamycyny metodą znakowania OPA 27

  1. Przygotuj roztwory wzorcowe GS do wykonania testu OPA.
    1. Przenieść 1 ml roztworu GS o stężeniu 80 μg/ml do probówki wirówkowej.
    2. Dodać 500 μl PBS do pięciu kolejnych probówek wirówkowych.
    3. Wykonaj seryjne rozcieńczanie tymi probówkami, aby uzyskać stężenia GS 80 μg/ml, 40 μg/mL, 20 μg/ml, 10 μg/mL, 5 μg/ml i 2,5 μg/ml. Służą one jako roztwory kalibracyjne do testu.
  2. Na przezroczystej 96-dołkowej płytce dodać 80 μl PBS do dołka A-1 i 80 μl roztworów kalibracyjnych do studzienek A-2 do A-7 w stężeniu rosnącym. Służy to jako wewnętrzna kalibracja testu.
  3. Dodać 80 μl każdej próbki do pustych studzienek w trzech egzemplarzach, które mają być analizowane na tej samej 96-dołkowej płytce. Ograniczyć liczbę próbek na płytkę dołka do <50, tak aby czas dodawania roztworu OPA do próbek był w przybliżeniu taki sam dla wszystkich próbek i aby uniknąć parowania.
  4. Dodaj odczynnik OPA do wszystkich wzorców i roztworów próbek.
    1. W dygestoriach napełnij zbiornik na odczynnik o pojemności 25 ml metanolem.
    2. Dodać 8 ml metanolu i 1 ml przygotowanego roztworu OPA do drugiego zbiornika odczynnika (sekcja 1.8). Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół.
    3. Za pomocą wielokanałowej mikropipety o pojemności 100 μl dodaj 48 μl metanolu z pierwszego zbiornika do wszystkich studzienek zawierających próbkę na płytce 96-dołkowej.
    4. Następnie należy dodać 72 μl rozcieńczonego roztworu OPA z drugiego zbiornika do wszystkich studzienek zawierających próbkę w płytce 96-dołkowej. Inkubować płytkę studzienki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zmierzyć intensywność fluorescencji (wzbudzenie 340 nm, emisja 455 nm) za pomocą czytnika mikropłytek bezpośrednio po 10 minutowej inkubacji.
  6. Wykreślić krzywą kalibracyjną, korzystając z odczytów intensywności dla roztworów o znanych stężeniach GS. Dodaj linię liniową, aby określić najlepsze dopasowanie i wygenerować odpowiednie równanie.
  7. Obliczyć stężenie leku w eluencie na podstawie krzywych kalibracyjnych uzyskanych przez wykreślenie znanych stężeń leku w stosunku do odpowiednich wartości absorbancji.
  8. Obliczyć masę leku, mnożąc stężenie przez objętość eluentu (~1,7 ml).
  9. Określ skumulowane uwalnianie leku (mg) w punkcie czasowym, sumując uwalnianie leku ze wszystkich poprzednich punktów czasowych.
  10. Znormalizuj uwalnianie leku do powierzchni paska (3,5 cm2), aby określić skumulowane uwalnianie leku na centymetr kwadratowy (cm2) implantu.

6. Przygotowanie bakterii

UWAGA: W tym badaniu użyto następujących szczepów S. aureus: szczep typu 12600, szczepy kliniczne L1101 i L1163 (uzyskane od dr Kerry LaPlante z University of Rhode Island). Profile wrażliwości tych szczepów przedstawiono w tabeli 1.

Szczepy bakteryjneMIC gentamycynyMIC wankomycyny
ATCC 12600≤1 μg/ml (wrażliwy)≤0,5 μg/ml (wrażliwy)
L1101 (Szczep kliniczny)≥16 μg/ml (odporny)8 μg/ml (średniozaawansowany)
L1163 (Szczep kliniczny)≤1 μg/ml (wrażliwy)8 μg/ml (średniozaawansowany)

Tabela 1: Profile wrażliwości na antybiotyki kontrolnych i klinicznych szczepów S. aureus.

UWAGA: Wszystkie kroki związane z obsługą kultur bakteryjnych i zawiesin zostały wykonane w przestrzeni laboratoryjnej BSL-2 w Komórce Bezpieczeństwa Biologicznego Klasy II, Typu A2.

  1. Rozmrozić zapasy bakteryjne od -80 °C na płytkach TSA, aby ułatwić wzrost S. aureus. Statycznie inkubować płytki przez noc w temperaturze 35 °C.
  2. Przenieść dwie do trzech kolonii z wyhodowanych przez noc kultur agarowych do 1 ml sterylnego TSB i inkubować statycznie przez noc w temperaturze 35 °C.
  3. Przenieść 100 μl bakterii na przezroczystą 96-dołkową płytkę w celu spektrofotometrycznego pomiaru zmętnienia poprzez określenie absorbancji przy 600 nm.
  4. Rozcieńczyć bakterie 10 000 razy za pomocą sterylnego MHB przed określeniem liczby żywych bakterii za pomocą testu luminescencyjnego.

7. Przeprowadzanie testu żywotności mikrobiologicznej w czasie rzeczywistym

  1. Wykonaj test oparty na luminescencji przy użyciu białych 96-dołkowych płytek z nieprzezroczystym dnem.
  2. Zmieszać 100 μl rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych ze 100 μl odczynnika do oznaczania przygotowanego w sekcji 1.5.
  3. Umieść pokrywkę pokrytą folią aluminiową na przygotowanej 96-dołkowej płytce i inkubuj przez 5 minut, wstrząsając 100 obr./min.
  4. Natychmiast zmierz luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek, korzystając z następujących ustawień w oprogramowaniu Gen5 3.11.
    1. Kliknij przycisk Nowy, aby skonfigurować protokół w oknie Menedżera zadań.
    2. Wybierz opcję Costar 96 white opaque (Biały nieprzezroczysty) z menu rozwijanego Typ blachy.
    3. Kliknij Czytaj w menu Wybierz kroki > Działania.
    4. Kliknij Luminescencja w oknie Metoda odczytu. Pozostaw wybrane opcje światłowodu końcowego/kinetycznego i luminescencyjnego odpowiednio w obszarze typu odczytu i typu optyki. Kliknij OK.
    5. Zachowaj ustawienia w oknie Krok odczytu (wzmocnienie = 135; czas integracji = 1 sekunda; wysokość odczytu = 4,5 mm). Kliknij OK.
    6. Okno układu blachy jest wyświetlane jako gotowe do uruchomienia. Zaznacz pole Użyj pokrywy w oknie płyty obciążeniowej i kliknij OK.
    7. Umieść 96-dołkową płytkę w urządzeniu, aby odczytać wartości luminescencji.

8. Generowanie standardowej krzywej luminescencji w porównaniu z liczbą żywotną dla każdego szczepu bakteryjnego

UWAGA: Hoduj i wyliczaj wszystkie szczepy S. aureus zgodnie z metodologią opisaną w sekcji 6.

  1. Przygotować seryjnie rozcieńczone zawiesiny bakteryjne, które będą służyć jako wzorce.
    1. Policz zawiesinę bakteryjną wyhodowaną przez noc, mierząc spektrofotometrycznie zmętnienie.
    2. Wirować przy 6 000 × g przez 5 minut, aby zagnieździć bakterie, i ponownie zawiesić osad w sterylnym MHB, aby dostosować stężenie do 1 x 109 CFU/ml.
    3. Rozcieńczyć 100 μl czystej zawiesiny za pomocą 900 μl MHB i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie, aby osiągnąć 1 x 101 jtk/ml.
  2. Przeprowadzić test luminescencji na przygotowanych zawiesinach bakteryjnych zgodnie z opisem w sekcji 7.
  3. Użyj sterylnego MHB jako ślepej próby kontrolnej w eksperymencie i odejmij wartość luminescencji ślepej próby od wartości luminescencji próbki testowej.
  4. Wykreśl logarytm (CFU) względem logarytmu (luminescencji), aby wygenerować krzywą standardową. Zapisz równanie i wartość R2
    5. .
  5. Określ CFU/ml odpowiadające wartościom luminescencji, korzystając z równania specyficznego dla szczepu w całym badaniu.

9. Konfiguracja badania aktywności przeciwbakteryjnej zależnej od czasu

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego układu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Hoduj bakterie przez noc w 1 ml bulionu TSB.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę bakterii wyhodowanych przez noc do 105 jtk/ml w sterylnym MHB (sekcja 6) i sprawdzić liczbę żywotnych bakterii przy użyciu jednostek luminescencji przed rozpoczęciem eksperymentu (sekcja 7).
  3. Umieścić pierwotne paski UHMWPE i UHMWPE zawierające lek (3 mm x 5 mm x 10 mm, połowa wymiaru pasków przygotowanych do badań elucji w sekcji 2) w strzykawce o pojemności 3 ml.
  4. Pobrać MHB zawierający 105 jtk/ml do strzykawki przez dołączoną igłę do oznaczenia 1,5 ml, co odpowiada 1,35 ml MHB (Rysunek 1: Krok 1).
  5. Umieścić zestaw strzykawki na inkubatorze z wytrząsaniem (100 obr./min) w temperaturze 37 °C do wskazanych punktów czasowych 6 godzin, Dzień 1, Dzień 2, Dzień 3, Dzień 4, Dzień 5, Dzień 6 i Dzień 7 (Rysunek 1: Krok 2).
  6. W każdym wskazanym punkcie czasowym wyjmij zestaw strzykawki i wykonaj test żywotności mikrobiologicznej w czasie rzeczywistym zgodnie z sekcją 7 na 100 μl zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 1: Krok 3-4).
  7. Określ liczbę żywych bakterii dla punktów czasowych 6 godzin, dnia 1, dnia 2, dnia 3 i dnia 7. Oznaczyć jtk/ml z jednostek luminescencji, używając odpowiedniej krzywej wzorcowej.
  8. Sprawdzić, czy w próbkach, które wykazały wartości luminescencji poniżej granicy wykrywalności, nie ma żywych bakterii, przeprowadzając metodę rozsiewania na płytkach TSA i inkubując w temperaturze 35 °C przez noc. Następnego dnia sprawdź obecność kolonii.
  9. Pozostałą zawiesinę bakteryjną odwirować w ilości 10 000 × g przez 10 minut i delikatnie odessać zużytą pożywkę. W przypadku probówek, w których granulki nie są widoczne wizualnie ze względu na przeciwbakteryjne działanie leków, należy pozostawić 100 μl w probówce, aby upewnić się, że niewidoczna osadka nie zostanie zakłócona (Rysunek 1: Krok 5).
  10. Ponownie zawiesić granulowane bakterie w świeżym MHB i wciągnąć zawiesinę bakteryjną z powrotem do tej samej strzykawki przez dołączoną igłę (Rysunek 1: Krok 6).

10. Kwantyfikacja przylegających bakterii na powierzchni UHMWPE

  1. Pobrać pierwotne powierzchnie UHMWPE i UHMWPE obciążone lekiem z zestawu strzykawki po zakończeniu badania w dniu 7.
  2. Przenieś powierzchnie do probówek o pojemności 1,5 ml i spłucz 1 ml sterylnego PBS (trzykrotnie).
  3. Sonikować powierzchnię przez 40 minut w 1 ml sterylnego PBS. Określić żywotność bakterii przylegających, wykonując test luminescencji na 100 μl próbki poddanej sonikacji, jak opisano w sekcji 7.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, UHMWPE został uformowany z gentamycyny i wankomycyny w stężeniu 7% w/w i wymyty do wody dejonizowanej. Stężenie leku w eluencie z materiału określono po 6 godzinach, 1 dniu, 2 dniach, 3 dniach i 1 tygodniu. Uwalnianie leku z wankomycyny i UHMWPE obciążonego gentamycyną wykazało uwolnienie impulsowe po 6 godzinach, po którym następowała stała szybkość uwalniania ze stężeniem uwalniania większym niż minimalne stężenie hamujące (MIC) przez 7 dni (Rysunek 2, Tabela 2).

Przed badaniem przeciwbakteryjnym wygenerowano standardową krzywą, aby skorelować jednostki luminescencji z CFU/ml bakterii dla każdego szczepu S. aureus (ATCC 12600, L1101 i L1163). Odpowiednie wartości logarytmu (luminescencji) zostały wykreślone w stosunku do logarytmu (CFU/ml) w celu wygenerowania krzywej standardowej (Rysunek 3). Obliczone wartości R2 wynosiły 0,997, 0,996 i 0,994 odpowiednio dla ATCC 12600, L1101 i L1163, co wskazuje na silne dopasowanie do zakresu stężeń. Otrzymane równanie wykorzystano następnie do obliczenia żywotności bakterii we wszystkich eksperymentach. ATCC 12600 i L1101 wykazały granicę wykrywalności w zakresie 1 x 102-1 x 103 CFU/ml. Z drugiej strony wykazano, że granica wykrywalności dla szczepu L1163 wynosi 1 x 104 jtk/ml.

Test aktywności przeciwbakteryjnej zależny od czasu został przeprowadzony przy użyciu 1 x 105 CFU/ml jako inokulum wyjściowego dla 12600, L1163 i L1101, które były wystawione na działanie 7% w/w materiałów uwalniających leki przez okres 1 tygodnia. W każdym punkcie czasowym (6 godzin, 1 dzień, 2 dni, 3 dni, 1 tydzień) pożywka była odświeżana, a populacja bakterii była ponownie zawieszana. Ekspozycja bakterii na późniejsze uwolnienie leków z materiału była kontynuowana aż do następnego punktu czasowego. UHMWPE z 7% w/w wankomycyną i UHMWPE z 7% w/w gentamycyną wykazały redukcję >3log dla podatnego ATCC 12600 począwszy od 6 godzin, a całkowitą eliminację (brak wzrostu kolonii) zaobserwowano pod koniec 3 dni (Ryc. 4A). W przypadku szczepu L1163 wrażliwego na gentamycynę i pośredniego wankomycyny, oba materiały uwalniające leki spowodowały redukcję >3log po 6 godzinach, a w pierwszym dniu eksperymentu zaobserwowano całkowitą eradykację (brak wzrostu kolonii) (Figura 4B). W przypadku szczepu L1101 opornego na gentamycynę i pośredniego wankomycyny, elucja gentamycyny z UHMWPE nie wpłynęła na żywotność bakterii L1101 (Rysunek 4C). Bakterie namnażały się, a populacja ustabilizowała się w ciągu 6 godzin w obecności pierwotnego UHMWPE bez elucji antybiotyków. W obecności UHMWPE uwalniającego gentamycynę, populacja osiągnęła podobny poziom wzrostu w 2 dniu. Wręcz przeciwnie, elucja wankomycyny z UHMWPE znacznie zmniejszyła żywotność bakterii (>3log) po 6 godzinach, a całkowitą utratę żywotności (brak wzrostu kolonii) wykazano do 4 dnia.

Powierzchnie zarówno UHMWPE uwalniającego gentamycynę, jak i uwalniającego wankomycynę nie wykazywały żadnych żywotnych bakterii przylegających, gdy były wystawione na działanie szczepów podatnych i średnio opornych po 7 dniu lub całkowitym wyeliminowaniu, w zależności od tego, co nastąpiło wcześniej. Niektóre żywe bakterie (1 x 105 CFU/ml) były obecne na UHMWPE uwalniającym gentamycynę wystawionym na działanie opornego na gentamycynę L1101. Podobnie, około 1 x 105 CFU/ml żywotnych bakterii przylegających odzyskano z kontrolnego pierwotnego PE (Ryc. 5).

figure-results-1
Rysunek 2: Zależne od czasu średnie uwalnianie antybiotyku z 7% w/w naładowanego antybiotykiem paska UHMWPE. Średnie uwalnianie antybiotyku między punktami czasowymi z jednego 7% w/w paska UHMWPE obciążonego gentamycyną i wankomycyną (3 mm,3 x 5 mm,3 x 10 mm,3 ~ 2cm2 powierzchni). Wartość MIC przeciwko szczepowi kontrolnemu ATCC 12600 jest pokazana jako linia przerywana dla gentamycyny i linia ciągła dla wankomycyny. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe średniej z sześciu powtórzeń (n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Standardowa krzywa testu luminescencyjnego w czasie rzeczywistym dla wszystkich szczepów S. aureus. Log (luminescencja) wykreślono w stosunku do logarytmu (CFU/mL) w celu wygenerowania krzywych wzorcowych dla kontroli, (A) ATCC 12600 i odkształceń klinicznych, (B) L1101 i (C) L1163. Równania opisujące linię najlepszego dopasowania i odpowiadające jej wartości R2 są wskazane na wykresach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Żywotność bakterii określona za pomocą testu luminescencyjnego dla 7% w/w elucji gentamycyny i 7% w/w uwalniającej wankomycynę. Wykazano zależną od czasu aktywność przeciwbakteryjną gentamycyny i wankomycyny eluowanej z UHMWPE przeciwko szczepom kontrolnym, (A) ATCC 12600 i szczepom klinicznym, (B) L1163 i (C) L1101. Virgin 1020 PE służył jako kontrola w eksperymencie. Żółta linia na wykresach wskazuje granicę wykrywalności dla danego szczepu S. aureus. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Żywotność bakterii adherentnych określona za pomocą testu luminescencyjnego Glo dla 7% w/w eluującego gentamycynę i 7% w/w uwalniającego wankomycynę UHMWPE przeciwko wszystkim szczepom S. aureus. Wykres słupkowy wskazuje bakterie przylegające (CFU) odzyskane na centymetr kwadratowy (cm2) z 7% UHMWPE obciążonego gentamycyną i 7% wankomycyny pod koniec okresu badania dla wszystkich badanych szczepów. Słupki pokazują dane jako średnią ± odchylenie standardowe (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Punkty czasoweWankomycynaGentamycyna
Stężenie szczytowe (μg/ml)Stężenie szczytowe (μg/ml)
0 - 6 godzin336 ± 72263 ± 24
6 h -1 dzień57 ± 1816 ± 2
1 dzień - 2 dzień60 ± 187 ± 1
2 dzień - 3 dzień23 ± 65 ± 0,4
3 dzień - 7 dzień49 ± 2015 ± 1

Tabela 2: Szczytowe stężenie leku (μg/ml) w różnych punktach czasowych. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 6).

Rysunek uzupełniający 2: Spadek sygnału luminescencji w okresie 10 minut od dodania odczynnika do próbki. Różnica ±5% w sygnale jest pokazana jako linia przerywana Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Miejscowe, stałe podawanie antybiotyków jest niezbędnym narzędziem w leczeniu zakażeń stawów okołoprotezowych. Antybiotyki ogólnoustrojowe są podstawową strategią zwalczania infekcji bakteryjnych, a miejscowa elucja jest stosowana jako narzędzie uzupełniające w celu zapobiegania wzrostowi i kolonizacji wszelkich bakterii pozostałych po usunięciu implantu i oczyszczeniu tkanki. Cel dotyczący efektywnego obszaru pod krzywą (stężenie w pewnym okresie) dla antybiotyków podawanych miejscowo nie jest dobrze poznany. Wymywanie antybiotyków z takich urządzeń można określić ilościowo in vitro; Jednak aby określić wartość translacyjną tych profili stężeń, potrzebna jest solidna metoda in vitro do oceny aktywności przeciwbakteryjnej. W tym artykule opisano jedną z takich metod w czasie rzeczywistym w celu określenia aktywności przeciwbakteryjnej UHMWPE uwalniającego leki, który ma być stosowany jako urządzenie do przedłużonego dostarczania w endoprotezoplastykach stawów.

Monitorowanie żywotności bakterii w czasie rzeczywistym jest kluczowym parametrem zainteresowania klientów, a konwencjonalnym metodom mikrobiologicznym brakuje ram, które uwzględniałyby ten konkretny aspekt badania. Test żywotności mikrobiologicznej zastosowany w tym badaniu został opracowany do ilościowego oznaczania żywotnych bakterii poprzez pomiar luminescencji odpowiadającej trifosforanowi adenozyny (ATP). Aby bezpośrednio zbadać zależną od czasu aktywność antybiotyków wymytych z materiałów implantów, inkubowano z nimi trzy różne szczepy o różnych profilach wrażliwości na antybiotyki. Uzasadnieniem dla stosowania laboratoryjnych i klinicznych szczepów o różnej oporności na gentamycynę i wankomycynę było zrozumienie zakresu działania danej postaci implantu. Co więcej, aktywność przeciwbakteryjna i skuteczność przeciwko tym odrębnym populacjom zależy od czasu podawania. Metoda koncentruje się na możliwości profilaktyki przeciwko tym szczepom w oparciu o >70% zakażeń stawów okołoprotezowych spowodowanych zanieczyszczeniem rany w momencie operacji24.

Jako inokulum wyjściowe do opracowania tej metody użyto 1 x 105 jtk/ml. Różne stężenia zanieczyszczeń zostały wykorzystane w modelach zwierzęcych, chociaż niewiele wiadomo na temat klinicznie istotnego obciążenia infekcją dla PJI. Modele infekcji zwierzęcych PJI zostały rutynowo ustalone przy użyciu 1 x 105 CFU, a podobny zakres jest szeroko stosowany w metodach standaryzowanych (CLSI) w celu określenia aktywności przeciwbakteryjnej 25,26,27. Użycie 1 x 105 CFU/ml jako początkowego stężenia zanieczyszczenia pozwoliło nam ocenić zarówno parametry wzrostu, jak i eliminacji w tym samym czasie.

Konwencjonalnie wartości MIC są określane dla stałego stężenia antybiotyku dla określonej liczby bakterii i nie wykazują szybkości działania przeciwbakteryjnego. Ze względu na ten aspekt wartości MIC nie zapewniają zróżnicowania ilościowego w celu opisania profilu aktywności przeciwdrobnoustrojowej28. Dane z obecnej metody podkreślają korzyści płynące z oceny kinetyki zabijania antybiotyków zależnej od szczepu, a nie wykorzystywania MIC do podejmowania decyzji dotyczących dawkowania. Za pomocą tej metody możliwe było zróżnicowanie zarówno zakresu, jak i tempa, w jakim materiały implantów wpływały na różne szczepy. Gentamycyna wymywana z pasków materiału implantu była skuteczna w eliminowaniu L1163 w ciągu 1 dnia i eliminowaniu ATCC 12600 w ciągu 2-3 dni, ale była nieskuteczna w eliminowaniu L1101 (ryc. 4). Oprócz spodziewanego braku aktywności elucji gentamycyny przeciwko L1101 (MIC >32 μg/ml) ze względu na jej nieodłączną oporność na gentamycynę (Figura 4C), zaobserwowano utrzymywanie się subpopulacji po ekspozycji na wankomycynę, dla której L1101 wykazuje oporność pośrednią. W przeciwieństwie do tego, L1163 został ostatecznie wyeliminowany w obecności UHMWPE uwalniającego wankomycynę, mimo że wykazywał podobną pośrednią oporność na wankomycynę jak L1101 (dla obu szczepów zaobserwowano MIC 8 μg/ml).

Obserwacje, że szybkość aktywności gentamycyny wobec 12600 i L1163, które są wrażliwe na gentamycynę o podobnych wartościach MIC (dla obu szczepów zaobserwowano MIC 1 μg/ml), były różne, jak również, że zakres aktywności wankomycyny wobec średnio opornych L1101 i L1163 był różny (ryc. 4A,B) potwierdził hipotezę, że ta metoda działająca w czasie rzeczywistym w obecności materiału eluującego może różnicować podłużne różnice w aktywności.

Oprócz wartości translacyjnej wyników w interpretacji skuteczności danego eluowanego stężenia przeciwko tym bakteriom, istnieje kilka eksperymentalnych zalet metodologicznych. (1) Stężenie bakterii określa się natychmiast w określonym czasie, w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, w których bakterie inkubuje się w bulionie lub na agarze przez 18-24 godziny w celu określenia żywotności. Ten okres wzrostu może zapewnić bakteriom dodatkowy czas na regenerację po stresie antybiotykowym, wprowadzając dodatkowe możliwe źródło błędów/zmienności. (2) Pożywka jest stale wymieniana przy zachowaniu bakterii, co bardziej przypomina warunki in vivo niż warunki statyczne. (3) Test ten z natury obejmuje kinetykę uwalniania leku z implantu, co pozwala na lepsze przewidywanie działania. (4) Metoda została opracowana przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów eksploatacyjnych bez potrzeby stosowania specjalnych lub drogich maszyn.

Przed przystąpieniem do badań in vivo na zwierzętach i badań klinicznych konieczne są solidne metody testowania in vitro w celu oceny zastosowań leków. Test ten może być modyfikowany i dostosowywany do różnych podejść i platform dostarczania leków, takich jak cząstki, żele, folie i inne materiały uwalniające leki, w celu określenia skuteczności eradykacji bakterii w symulowanej konfiguracji in vitro. Modyfikacje układu próbki można przeprowadzić poprzez zmianę na odpowiednie środowisko podłoża in vitro, które, jak wykazano, wpływa na aktywność kilku antybiotyków29,30.

Metoda ta ułatwia również określenie żywotnych bakterii przylegających, co jest obiecujące, ponieważ konwencjonalne metody określania minimalnego stężenia eliminacji biofilmu są czasochłonne i dają niespójne wyniki. Metoda ta ma być jednak rygorystycznie testowana na biofilmach w celu opracowania wiarygodnej i solidnej metodologii określania jej czułości. Metoda luminescencyjna oparta na ATP może być wystarczająco czuła, aby wykrywać żywe formy bakterii w biofilmach, w tym substancje trwałe, które mogą, ale nie muszą, być wykryte na płytce agarowej jako widoczne kolonie. Podsumowując, ta wszechstronna platforma ma potencjał, aby włączyć odpowiednie parametry do rejestrowania w czasie rzeczywistym obserwacji aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwbiofilmowej leków będących przedmiotem zainteresowania.

Skuteczność tej metody zależy od następujących aspektów:

Wstępnie określona charakterystyka elucji i wielkość próbki
Profil elucyjny materiału uwalniającego antybiotyki można określić w oddzielnym doświadczeniu przed pomiarem aktywności przeciwbakteryjnej, tak aby można było określić ilość materiału wymaganą do aktywnego przeprowadzenia eksperymentu w określonym czasie.

Określanie pojemnika i objętości
Ważne jest, aby opracować konfigurację, w której objętość pożywki w eksperymencie może pomieścić całą powierzchnię tego samego materiału i zapewnić wystarczającą objętość do niezakłóconego uwalniania leku z powierzchni obciążonej lekiem. Zastosowana konfiguracja została oparta na wcześniejszych eksperymentach, zapewniając "idealne warunki zlewu" dla tych hydrofilowych leków, tak aby ich dyfuzja nie była utrudniona przez ograniczenia rozpuszczalności.

Charakterystyka podłoża wzrostowego
Należy zbadać wybór pożywek wzrostowych w celu zapewnienia stabilności i optymalnego działania wybranego leku (leków)29. Bulion Muellera Hintona skorygowany kationami (CAMHB), który jest szeroko stosowany w metodzie rozcieńczania bulionu, został użyty do określenia wartości MIC znanych antybiotyków. Pożywka umożliwia optymalną aktywność leku bez ingerencji w akumulację toksycznych metabolitów wtórnych31. Odczynnik testowy został przetestowany i zgłoszono jako stabilny w różnych typach pożywek, w tym tych ze składnikami surowicy23,28. Chociaż względne wartości jednostek luminescencji mogą się różnić w różnych ośrodkach, wykazano, że składniki ośrodków nie zakłócają testu32,33. Objętość eksperymentalna została dodatkowo zoptymalizowana do 1,5 ml, co jest zbliżone do objętości płynu maziowego obecnego w przestrzeni stawu kolanowego osoby dorosłej34.

Stabilność temperatury dla testu
Obchodzenie się z odczynnikiem luminescencyjnym i dodawanie go do testu należy przeprowadzać w sposób spójny we wszystkich doświadczeniach. Zmiany temperatury zmieniają czułość testu, dlatego ważne jest, aby inkubować odczynnik w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przed dodaniem go do bakterii23.

Czas inkubacji odczynnika
Luminescencja z odczynnika zanika z czasem. Sygnał luminescencyjny ma okres półtrwania wynoszący ponad 30 minut, co jest w dużej mierze zależne od pożywki i rodzaju bakterii użytej w eksperymencie23. Dodatkowo, wszelkie różnice w czasie inkubacji (tj. czasie między dodaniem odczynnika do bakterii a odczytem luminescencji) spowodują niespójne odczyty dla tego samego stężenia bakterii. Zaobserwowano 5% różnicę w sygnale luminescencyjnym, gdy został pobrany w ciągu 1 minuty po 5-minutowym czasie inkubacji zgodnie z instrukcjami producenta (rysunek uzupełniający 2). Biorąc pod uwagę te dane, odczyty luminescencji były rejestrowane w ciągu 1 minuty przez cały czas trwania badania, aby upewnić się, że utrata sygnału nie przekracza 5%. Ponadto ważne jest, aby ograniczyć liczbę próbek na płytkę, aby zmniejszyć błąd wynikający z zaniku luminescencji od pierwszego do ostatniego dołka.

Utrzymanie populacji bakterii przez cały czas trwania badania
W ramach tej metody podjęto próbę modelowania klirensu leku i obrotu objętościowego błony maziowej poprzez ciągłe oddzielanie zużytych pożywek od populacji bakterii w każdym punkcie czasowym przy użyciu wirowania z dużą prędkością przy 10 000 x g przez 10 minut35. Ten krytyczny krok zapewnia sedymentację wszystkich żywotnych i nieżywotnych komórek bakteryjnych. Ponadto osadzone bakterie są równomiernie odtwarzane w świeżym MHB i przenoszone do zestawu strzykawki, ułatwiając całkowite przeniesienie dotkniętej populacji drobnoustrojów z powrotem do układu eksperymentalnego. Powtarzalność i wiarygodność tej metody w dużym stopniu opiera się na symulacji długotrwałej ekspozycji antybiotyków na populację drobnoustrojów pochodzącą z początkowego inokulum.

Kluczowym ograniczeniem tej metody jest to, że jest to test półstatyczny, który nie symuluje dokładnie okresów półtrwania leku i ciągłego obrotu błony maziowej. Jednak ciągła wymiana medium częściowo kompensuje to ograniczenie. Czułość testu żywotności drobnoustrojów była zależna od szczepu i wynosiła od 1 x 102-1 x 104 CFU/ml, co ogranicza zdolność wykrywania. Ponadto dla każdego organizmu należy wykreślić krzywą standardową, ponieważ typ szczepu przyczynia się do czułości i wydajności odczynnika luminescencyjnego. Zarówno na dynamikę wzrostu bakterii, jak i na aktywność zastosowanego związku leczniczego mogą mieć wpływ składniki pożywki, które powinny być dalej badane.

Oświadczenia

Starszy autor (E.O.) otrzymuje tantiemy pochodzące z licencjonowania własności intelektualnej następującym firmom: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Nie ma konfliktu interesów z żadnym z przedstawionych tu badań.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health Grant No. AR077023 (R01) oraz przez Harris Orthopaedic Laboratory. Autorzy dziękują dr Kerry Laplante i jej zespołowi z University of Rhode Island za dostarczenie klinicznych szczepów L1101 i L1163.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Płytki 96-dołkowe - polistyren, High Bind, białe studzienki z płaskim dnem, niesterylne, białe, 100/csCorning, NY, USACLS3922-100EA
2-merkaptoetanolSigma Aldrich, Niemcy
ATCC 12600Kolekcja kultur typu amerykańskiego, VA, USA
Test żywotności komórek mikrobiologicznych BacTiter-GloPromega Corporation, USAG8231
BD Bacto Tryptic Soy Bulion (Soybean-Casein Digest Medium)Becton-Dickinson, USABD 211825zakupiony w Fisher Scientific, USA
Strzykawka BD Luer-Lok sterylna, jednorazowego użytku, 3 mLBD, USA
Igła BD 5/8 cala jednorazowego użytku, sterylna, 25 GBD, USA
BD  BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Bulion (dostosowany do kationów)Becton-Dickinson, USAB12322zakupiony od Fisher Scientific, USA
BD  Odwodnione podłoża hodowlane Difco: Tryptyczny agar sojowy (agar sojowo-kazeinowy)Becton-Dickinson, USADF0369-17-6zakupiony od Fisher Scientific, USA
Kwas borowy Fisher Chemical, NJ, USA
Kąpiel ultradźwiękowa Branson 1800Emerson, MO, Stany Zjednoczone
Corning  Bakteriologiczne szalki Petriego Falcon z pokrywkąFisher Scientific, USA08-757-100D
Siarczan gentamycyny Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, Chiny
Greiner UV-Star  Płytki 96-dołkoweSigma Aldrich, NiemcyM3812-40EA
Prasa hydraulicznaCarver, Inc. Wabash, IN, USA
L1101 Szczep kliniczny od dr Kerry Laplante, University of Rhode Island
L1163 Szczep kliniczny od dr Kerry Laplante, University of Rhode Island, LSE laboratoryjny
inkubator z wytrząsaniemCorning, NY, USA
Metanol, Optima dla HPLC, Fisher ChemicalFisher Scientific, NJ, USAA454-1
Napco CO2 6000Thermo Scientific, MA, USA
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X roztwór, pH 7,4, Fisher BioReagentsFisher Scientific, USABP24384
Ftaldiadehyd ≥ 97% (HPLC)Sigma Aldrich, NiemcyP1378-5g
Czytnik płytek (Synergy H1Biotek, VT, USA
pressCarver, Inc. Wabash, IN, USA
shaker Innova 2100New Brunswick Scientific, NJ, USA
ShopBot D2418ShopBot Tools, Inc., NC, USA
Wodorotlenek sodu Sigma Aldrich, Niemcy
Thermo Scientific  Odczynnik do wody dejonizowanejFisher Scientific, USA23-751628
UHMWPEGUR1020, Celanese, TX, USA
Chlorowodorek wankomycyny Fagron, Holandia804148
WAB TurbulaWAB Turbula, Szwajcaria
309657 305122

Bibliografia

  1. Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
  2. Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
  3. Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190(2020).
  4. UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
  5. Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871(2016).
  6. Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
  7. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  8. Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
  9. de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
  10. Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243(2016).
  11. González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023(2018).
  12. Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
  13. Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
  14. Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
  15. Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131(2021).
  16. Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
  17. Li, C., Renz, N., Trampuz, A. Management of periprosthetic joint infection. Hip & Pelvis. 30 (3), 138-146 (2018).
  18. Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
  19. Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080(2017).
  20. Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
  21. Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031(2021).
  22. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  23. BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
  24. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  25. López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
  26. Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25(2017).
  27. Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934(2018).
  28. Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
  29. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
  30. Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790(2021).
  31. Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192(2018).
  32. Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777(2020).
  33. Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191(2019).
  34. Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
  35. Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Implanty z UHMWPEbadania skuteczno ci pod u nejperiprotetyczne zaka enie stawutest ywotno ci w czasie rzeczywistymelucja antybiotykuywotno bakteryjnajednostki tworz ce kolonieprzed u one uwalnianie leku

Powiązane artykuły