Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie C. elegans do monitorowania nierównowagi proteostazy

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64643

⸱

24 sierpnia 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

W tym artykule

Streszczenie

Sieć proteostazy to system kontroli jakości białek komórkowych, który zapewnia funkcjonalność proteomu, promując zdrowie komórek i organizmów. Wraz z wiekiem jego wierność spada, co prowadzi do zwiększonej podatności proteomu na stres, a ostatecznie do chorób, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i nowotwory. Aby podkreślić badania nad tą ewolucyjnie zachowaną siecią, Journal of Visualized Experiments (JoVE) przedstawia zbiór metod opracowanych przez naukowców wykorzystujących C. elegans do monitorowania nierównowagi proteostazy. Niniejsze wydanie zawiera krótki przegląd tych różnych podejść eksperymentalnych mających na celu zrozumienie sieci proteostazy na poziomie komórkowym, tkankowym i organizmu.

OMAWIANE ARTYKUŁY:

Golden, NL, Plagens, RN, Kim Guisbert, KS, Guisbert, E. Standaryzowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny w Caenorhabditis elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. i wsp. Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. i wsp. Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align i Worm_CP, dwa potoki typu open source do prostowania i kwantyfikacji danych obrazu fluorescencji uzyskanych z Caenorhabditis elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, AB, Samuelson, AV Kwantyfikacja specyficznego tkankowo spadku proteostatycznego w Caenorhabditis elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, TD, Karady, I., Ben-Zvi, A. Używanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanki. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Specyficzne tkankowo narzędzia RNAi do identyfikacji składników sygnalizacji stresu systemowego. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnej dendry2. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, ML, Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, ML, Cooper, J., Grant, BD, Driscoll, M. Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

Artykuł redakcyjny

Homeostaza białek lub proteostaza ma fundamentalne znaczenie dla zdrowia komórek i organizmów 1,2. Konserwatywne procesy komórkowe współpracują ze sobą w celu utrzymania prawidłowo pofałdowanego proteomu poprzez wpływ na syntezę, fałdowanie i klirens białek 3,4. Zaburzenia proteostazy zostały powiązane z chorobami neurodegeneracyjnymi i nowotworami związanymi z wiekiem 5,6. Opierając się na wysokim poziomie ochrony, organizmy modelowe, takie jak nicienie Caenorhabditis elegans (C. elegans), odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu roli proteostazy w zdrowiu i chorobie człowieka 7,8. C. elegans posiada wiele cech, które czynią go idealnym modelem eksperymentalnym, w tym krótki cykl życia, przezroczysty naskórek oraz łatwość manipulacji chemicznych i genetycznych9. Ten zbiór metod zawiera szczegółowe protokoły monitorowania nierównowagi proteostazy na poziomie molekularnym, komórkowym i organizmowym u C. elegans.

Komórki reagują na zakłócenia proteostazy poprzez aktywację różnych reakcji na stres, w tym reakcji na szok cieplny (HSR), odpowiedzi na niesfałdowane białko (UPR) i odpowiedzi na stres oksydacyjny (OxSR) w celu dostosowania proteomu komórkowego10. Aby zwiększyć odtwarzalność w terenie, Golden i współpracownicy opisali ustandaryzowane praktyki w zakresie solidnej indukcji HSR11. RT-qPCR jest szeroko stosowaną, czułą metodą analizy ekspresji genów poprzez ilościowe oznaczanie mRNA, a test ten może być stosowany do pomiaru poziomów mRNA w komórkach różnych genów indukowanych szokiem cieplnym11. Aby rozszerzyć to podejście na wielkoskalową, wysokoprzepustową analizę, Chauve i wsp.12 opisują nowatorską adaptację do przygotowania cDNA, sprzężoną z nanofluidyczną platformą RT-qPCR, która jest solidna i bardzo czuła. Precyzyjne pomiary ekspresji genów można wykonywać na pojedynczych robakach lub próbkach masowych12. Zalecane cele genów odpowiedzi na stres wraz z parami starterów do pomiaru regulacji w górę transkrypcji genów odpowiedzi na stres są wymienione w odpowiednich protokołach 12,13.

Jednym z ograniczeń stosowania RT-qPCR do oceny aktywacji reakcji na stres jest to, że może to być kosztowne, trudne technicznie i wymaga użycia specjalistycznego sprzętu. W związku z tym, specyficzne dla szlaku transkrypcyjne szczepy reporterowe wyrażające białko fluorescencyjne pod wpływem promotora indukowanego stresem (np. hsp-16.2p::gfp do monitorowania HSR) są często wykorzystywane do oceny komórkowych reakcji na stres11. Korzystając z prostego przepływu pracy opartego na oprogramowaniu open source o nazwie Worm-align o nazwie Worm-align w połączeniu z Worm_CP potoku CellProfiler, Okkenhaug i jego współpracownicy opisują14 kroków do szybkiego ilościowego określenia fluorescencji poszczególnych robaków. Ponadto Bar-Ziv i wsp.13 opisują metodę wysokoprzepustową wykorzystującą cytometr przepływowy o dużych cząstkach, który umożliwia uchwycenie intensywności fluorescencji, rozmiaru i rozkładu przestrzennego (2D) dla tysięcy zwierząt. Podano informacje na temat reporterów transkrypcyjnych do oceny aktywacji odpowiedzi na stres komórkowy wraz z zalecanymi ustawieniami mikroskopii fluorescencyjnej i kwantyfikacji przy użyciu biosortera robaków13. Co ważne, te reportery mogą być sparowane ze specyficznymi testami przeżycia w stresie fizjologicznym, które monitorują stan zdrowia zwierzęcia zgodnie z określonym schematem stresu11,13. Chociaż reportery fluorescencyjne mają tę zaletę, że ujawniają różnice specyficzne dla tkanki, mogą wykryć indukcję tylko powyżej pewnego progu, a stabilność niektórych fluoroforów, takich jak GFP, wyklucza wykrycie dynamicznych zmian w ekspresji genów. Ponadto większość testów fizjologicznych jest czasochłonna, a tym samym ma ograniczoną skalowalność. Pomimo tych ograniczeń, metody te pozwalają na kompleksową charakterystykę komórkowych i fizjologicznych skutków wewnętrznych i zewnętrznych stresorów.

Przewlekłe zaburzenia proteotoksyczne są związane z załamaniem się sieci proteostazy (PN), maszynerii kontroli jakości odpowiedzialnej za utrzymanie funkcjonalnego proteomu 5,6. Postępujący spadek proteostazy jest związany z wieloma chorobami związanymi z wiekiem. C. elegans jest doskonałym systemem modelowym do badania podatności określonych tkanek na awarie proteostazy. Lazaro-Pena i wsp.15 opisują podejście do monitorowania funkcji ścian ciała, mięśni lub neuronów w miarę starzenia się robaka. Podejście to można zaadaptować do wysokoprzepustowych analiz genetycznych lub badań przesiewowych leków15. Głównym wyzwaniem jest zrozumienie, w jaki sposób działają interakcje między różnymi składnikami PN in vivo. Aby zaradzić temu brakowi, Drori współpracownicy opracowali system do zbierania szczegółowych informacji na temat interakcji molekularnych białek opiekuńczych, kluczowych składników PN, w określonych tkankach w trakcie rozwoju i starzenia. Poprzez sprzężenie specyficznych tkankowo zaburzeń równowagi fałdowania z dostępnymi mutantami lub szczepami transgenicznymi, które umożliwiają specyficzne tkankowo wyciszanie docelowych genów przez RNAi, można zbadać sieć opiekuńczą w danej tkance. Uzupełnienie tej strategii prostymi testami behawioralnymi, które oceniają funkcjonalność określonych tkanek lub typów komórek, może odkryć biologicznie istotne interakcje PN in vivo15,16. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że nierównowaga proteostazy w jednej tkance lub typie komórki może wpływać na system kontroli jakości dodatkowych tkanek w sposób nieautonomiczny komórkowy. Miles i van-Oosten-Hawle17 opisują podejście do identyfikacji mechanizmów i składników nieautonomicznego PN komórki przy użyciu metod RNAi specyficznych dla tkanek w połączeniu z szeregiem reporterów stresu i czujników proteostazy17. Strategia ta pozwala na badanie pojemności PN w różnych tkankach w wyniku mechanizmów nieautonomicznie aktywowanej przez komórkę odpowiedzi na stres.

C. elegans jest powszechnie stosowany do modelowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem spowodowanych mutacjami ekspansji powtórzeń poliglutaminy, takich jak choroba Huntingtona18. Czujnikiem proteostazy, który jest intensywnie wykorzystywany, jest fragment poliglutaminy (polyQ) połączony z białkiem fluorescencyjnym, które tworzy ogniska in vivo w zależności od długości polyQ i wieku19 lat. Poprawa odtwarzalności w badaniach biologicznych, między osobami i między laboratoriami wymaga zdefiniowania, co jest oceniane jako ogniska. Lazaro-Pena i wsp.15 opisują strategię dokładnego pomiaru powstawania ognisk polyQ::YFP w neuronach lub mięśniach ściany ciała podczas starzenia. Aby monitorować tempo obrotu podatnego na agregację zmutowanego białka huntingtyny wykazującego ekspansję poliglutaminy, Pigazzini i Kirsteinopisują nieinwazyjną technikę, która wymaga użycia fotokonwertowalnego fluoroforu Dendra2. Korzystając z mikroskopii konfokalnej i szczepu C. elegans wykazującego ekspresję zmutowanej huntingtyny połączonej z Dendra2, możliwe jest monitorowanie i ilościowe określenie degradacji tego podatnego na agregację białka w starzejącym się organizmie20. Aby określić ilościowo fibrylizację amyloidu białek podatnych na agregację, takich jak zmutowana huntingtyna, można zastosować mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM)21. FLIM umożliwia nieinwazyjną analizę procesu agregacji poprzez monitorowanie wygaszania fluoroforów w bliskim sąsiedztwie struktur amyloidowych, skracając w ten sposób czas życia fluorescencji21. Czas trwania fluorescencji ujemnie koreluje z agregacją skondensowanego białka amyloidu i jest niezależny od poziomów ekspresji fluoroforu. Technika ta pozwala badaczowi śledzić wpływ starzenia się i upośledzenia PN na skłonność do agregacji dowolnego białka. Jeśli jednak intensywność fluoroforu jest niska, może to stać się problematyczne, ponieważ FLIM wymaga pozyskania stosunkowo dużej liczby fotonów. W związku z tym potrzebna jest wyższa moc lasera wzbudzenia, co prowadzi do szybszego fotowybielania i niewiarygodnej krzywej zaniku. Co więcej, technika ta wymaga wyrafinowanego i kosztownego sprzętu jako dodatku do istniejących już systemów mikroskopowych. Ważnym ustandaryzowanym podejściem jest uwzględnione dla innego protokołu badającego niezależnej od AUG (RAN) translacji związanej z powtórzeniami związanej z RNA, która zawiera wielokrotne ekspansje. Ponieważ translacja RAN nie wymaga kodonu start do określenia ramki odczytu, liczba możliwych toksycznych peptydów związanych z chorobą wzrasta. Rudich i współpracownicy22 dostarczają szczegółowych informacji na temat ilościowego określania toksyczności peptydów RAN za pomocą ruchu i reprodukcji C. elegans.

Brak równowagi w proteostazie prowadzi do nieprawidłowego fałdowania białek i akumulacji agregatów białkowych, które zostały powiązane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi związanymi z wiekiem 5,6. Szczepy C. elegans wykazujące ekspresję różnych białek podatnych na agregację połączonych z fluorescencyjnymi reporterami zostały wykorzystane do monitorowania nierównowagi proteostazy w różnych typach komórek i tkanek. Analiza tych modeli doprowadziła do szeregu nowatorskich obserwacji; Monica Driscoll i jej współpracownicy zauważyli, że neurony uwalniają agregaty PolyQ i inne szczątki komórkowe, takie jak uszkodzone organelle, w "egzoferach", odsłaniając wcześniej nierozpoznaną gałąź proteostazy neuronalnej. Ponieważ jest to nowe zjawisko, ważne jest, aby zapewnić jasne instrukcje dotyczące monitorowania produkcji ekspoferów, aby zapewnić odtwarzalność w terenie. Arnold i wsp.24 nakreślają cechy fizyczne egzoferów C. elegans, strategie ich wykrywania, kryteria identyfikacji i optymalny czas na kwantyfikację. Ponadto protokół ten podkreśla krytyczną uwagę potrzebną do ścisłej kontroli warunków wzrostu w celu wyeliminowania niezamierzonych stresów, które mogą modulować poziomy eksopherów w celu uzyskania powtarzalnej oceny produkcji eksoferów.

Kolekcja ta zawiera wiele strategii metodologicznych do monitorowania nierównowagi proteostazy na poziomie molekularnym, komórkowym i organizmów u C. elegans. Czynniki stresogenne, takie jak nieprawidłowo sfałdowane białka chorobowe, mogą być eksperymentalnie wprowadzane do określonych typów tkanek, podczas gdy odpowiedź komórkowa i organizmu na proteotoksyczność jest monitorowana w czasie. Kolekcja ta zawiera zestaw narzędzi do sondowania i monitorowania proteostazy, oceny systemów kontroli jakości, które utrzymują pofałdowany proteom oraz badania rozregulowania tych systemów, które prowadzą do choroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy naszym kolegom za ich bardzo cenny wkład w tę kolekcję metod.

Bibliografia

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (11), 777-788 (2010).
  4. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  6. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), 004440(2011).
  7. Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Model Mechanism. 13 (10), (2020).
  8. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  9. Girard, L. R., et al. WormBook: the online review of Caenorhabditis elegans biology. Nucleic Acids Research. 35, 472-475 (2007).
  10. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cellular stress response pathways and ageing: intricate molecular relationships. The EMBO Journal. 30 (13), 2520-2531 (2011).
  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
  12. Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
  13. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
  14. Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
  15. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
  16. Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
  17. Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Proteostasis NetworkProtein Quality ControlNeurodegenerative DisordersCellular HealthHeat Shock ResponsePhysiological Stress ResponsesTissue-specific ProteostasisRNAi ToolsProtein TurnoverPhotoconvertible Dendra2Experimental Approaches
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.