Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Podsumowanie

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Streszczenie

Mycoplasma pneumoniae to prokariota z niedoborem ściany komórkowej, znana głównie z kolonizacji dróg oddechowych człowieka i endemiczna, ze szczytami epidemii co 6 lat, u starszych dzieci i młodych dorosłych. Rozpoznanie M. pneumoniae jest trudne ze względu na wybredny charakter patogenu i możliwość bezobjawowego nosicielstwa. Diagnostyka laboratoryjna zakażenia M. pneumoniae na podstawie miareczkowania przeciwciał w próbkach surowicy pacjentów pozostaje najczęściej praktykowaną metodą. Ze względu na potencjalny problem immunologicznej reaktywności krzyżowej z użyciem surowicy poliklonalnej dla M. pneumoniae, opracowano test immunoenzymatyczny z wychwytywaniem antygenu (ELISA) w celu poprawy swoistości diagnostyki serologicznej. Płytki ELISA są pokryte poliklonalnymi przeciwciałami M. pneumoniae, hodowanymi u królików i swoistymi po adsorpcji przeciwko panelowi heterologicznych bakterii, które mają wspólne antygeny z gatunkami M. pneumoniae i/lub o których wiadomo, że kolonizują drogi oddechowe. Przereagowane antygeny homologiczne M. pneumoniae są następnie specyficznie rozpoznawane przez odpowiadające im przeciwciała w próbkach surowicy. Dalsza optymalizacja parametrów fizykochemicznych, którym poddawany jest test ELISA do wychwytywania antygenu, doprowadziła do uzyskania wysoce specyficznego, czułego i powtarzalnego testu ELISA.

Wprowadzenie

Mykoplazmy należą do najmniejszych i najprostszych znanych prokariontów. Od innych bakterii odróżnia je przede wszystkim brak struktury ściany komórkowej. W związku z tym Mykoplazmy zostały sklasyfikowane w osobnej klasie o nazwie Mollicutes¹. Niedobór ściany komórkowej nadaje tym mikroorganizmom wewnętrzną odporność na niektóre środki przeciwdrobnoustrojowe i jest w dużej mierze odpowiedzialny za ich polimorfizm. Mykoplazmy mają mały genom i zmniejszony rozmiar, co ogranicza ich zdolności metaboliczne i biosyntetyczne oraz wyjaśnia ich pasożytniczą i saprofityczną naturę¹.

Mycoplasma pneumoniae jest jednym z Mykoplazm, które infekują człowieka i jest uważana za najbardziej zjadliwą². M. pneumoniae kolonizuje górne drogi oddechowe, prowadząc do nietypowego zapalenia płuc u dzieci i młodych dorosłych. Objawy kliniczne wywołane zakażeniem M. pneumoniae są grypopodobne, z bólem głowy, gorączką i kaszlem³. Cytadherencja M. pneumoniae do komórek gospodarza jest pośredniczona przez organellę przyłączeniową, w tym główną adhezję P1 i kilka białek dodatkowych^4,5. Więcej objawów klinicznych może wystąpić z powodu miejscowego stanu zapalnego i stymulacji układu odpornościowego gospodarza wynikającego z bliskiego przylegania M. pneumoniae do błony śluzowej dróg oddechowych⁶. Chociaż zapalenie płuc jest cechą charakterystyczną zakażenia M. pneumoniae, ujawniono, że zakażenie tą bakterią może być również odpowiedzialne za szerokie spektrum objawów pozapłucnych w różnych miejscach anatomicznych, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, serce, skóra i stawy⁷.

Jeśli chodzi o wszystkie gatunki Mycoplasma, diagnoza M. pneumoniae jest wyzwaniem. Objawy kliniczne wywołujące mykoplazmozę są w większości niewidoczne i niecharakterystyczne⁸. Ponieważ bardzo trudno jest zdiagnozować zakażenie M. pneumoniae, opierając się wyłącznie na objawach klinicznych i objawach, szczególnie interesujące są badania laboratoryjne⁹. Wykrywanie kolonii M. pneumoniae za pomocą hodowli jest złotą metodą prawidłowego diagnozowania. Jednak wybredne wymagania dotyczące wzrostu i długi czas potrzebny na dostarczenie ostatecznych wyników (1-2 tygodnie) komplikują hodowlę, a tym samym oznaczają, że rzadko jest ona używana do rutynowej diagnozy¹⁰. Technologie amplifikacji kwasów nukleinowych zostały zweryfikowane pod względem szybkości i wydajności, chociaż ze względu na ich stosunkowo wysoki koszt i niedostępność w niektórych placówkach opieki zdrowotnej, te techniki molekularne nie są uważane za testy diagnostyczne pierwszego rzutu. Prawdą jest, że komercyjne testy PCR są szeroko stosowane do diagnozowania zakażeń M. pneumoniae, ale nadal nie mogą zastąpić serologii. Ponadto częste występowanie zarówno wyników fałszywie ujemnych, jak i fałszywie dodatnich ograniczyło użycie PCR⁹. Rutynowo serologia pozostaje najbardziej praktykowana w laboratoriach w diagnostyce zakażenia M. pneumoniae. Od dziesięcioleci opisywanych jest kilka podejść serologicznych, takich jak zimne hemaglutyniny, test wiązania dopełniacza¹¹, pośredni test hemaglutynacji¹², immunofluorescencja¹³, oraz technologia ELISA, która została po raz pierwszy zastosowana w serologii mykoplazmy na początku lat 1980-tych^14,15,16. Jednym z głównych problemów napotykanych podczas wykonywania serodiagnostyki ELISA zakażenia M. pneumoniae są reakcje krzyżowe, co znacznie obniża swoistość techniki. Wcześniej donoszono o niespecyficznej adsorpcji ludzkich surowic antygenami M. pneumoniae; w rzeczywistości wiele przeciwciał wykrytych przez test ELISA w surowicach ludzkich może nie zawsze być związanych z antygenami mykoplazmatycznymi¹⁷, ze względu na podobieństwo M. pneumoniae z niektórymi bakteriami^18,19 oraz niektóre tkanki zwierzęce i ludzkie²⁰.

Ze względu na wysokie odczyty tła obserwowane w konwencjonalnym teście ELISA, który był praktykowany w laboratorium, interpretacja wyników była często skomplikowana, a zatem dostarczenie właściwej diagnozy M. pneumoniae było trudnym zadaniem. Stawiając czoła temu problemowi, zdecydowaliśmy się na poprawę testu ELISA M. pneumoniae poprzez usunięcie niespecyficznych reakcji antygenów M. pneumoniae z przeciwciałami, które mają być badane. W tym celu pracowaliśmy nad selektywnym zubożeniem niespecyficznych antygenów M. pneumoniae za pomocą techniki adsorpcji. W rzeczywistości głównym celem testu ELISA wychwytującego antygen jest specyficzne wykrycie immunoglobuliny (Ig) G M. pneumoniae w próbkach ludzkiej surowicy. Koncepcja tego testu ELISA polega głównie na selektywnym wychwytywaniu antygenów specyficznych dla M. pneumoniae przed dodaniem próbek surowicy ludzkiej. Selektywność ta jest zapewniona przez inkubację surowego antygenu M. pneumoniae z poliklonalną surowicą odpornościową M. pneumoniae, wyprodukowaną u królików w laboratorium i nadanie mu specyficzności gatunkowej poprzez adsorpcję przeciwko panelowi bakterii heterologicznych, należących lub nienależących do klasy Mollicutes, dzielących antygeny z M. pneumoniae gatunki i/lub o których wiadomo, że kolonizują drogi oddechowe. Procedurę adsorpcji powtórzono trzykrotnie, a jej skuteczność w eliminowaniu reaktywności krzyżowej przetestowano za pomocą immunoblottingu. Opracowany test ELISA jest połączeniem testu ELISA typu sandwich i pośredniego. Krótko mówiąc, studzienki płytki ELISA są najpierw pokryte poliklonalną surowicą specyficzną dla M. pneumoniae. Następnie dodaje się antygen M. pneumoniae i wychwytuje go między surowicą a przeciwciałami obecnymi w próbce surowicy, która ma być poddana badaniu. Utworzony kompleks immunologiczny jest wykrywany przez drugorzędowe przeciwciało sprzężone z enzymem (IgG sprzężone z peroksydazą). Reakcje są wizualizowane przez dodanie substratu chromogenicznego, a absorbancja jest mierzona spektrofotometrycznie. Ten wewnętrzny test ELISA jest schematycznie przedstawiony w Rysunek 1. Test ELISA domowej roboty okazał się skuteczny w wykrywaniu zakażenia M. pneumoniae i jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych testów w rutynowej diagnostyce.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z etycznymi aspektami ustalonymi przez komisję etyczną Instytutu Pasteura w Tunisie.

1. Etapy pre-ELISA: Wymagania wstępne i wstępne przetwarzanie

1. Szczepy bakteryjne i pożywki wzrostowe
   UWAGA: Gatunki Mollicutes i bakterie o ściankach użyte w niniejszym badaniu oraz ich podłoża wzrostowe są wymienione w Tabeli 1.
   1. Wzrost gatunków Mollicutes
      1. Zaszczepić 200 μl z zapasu glicerolu każdego gatunku w 1 800 μl pożywki.
      2. Gatunki Mollicutes należy uprawiać statycznie w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2-4 dni, aż do zaobserwowania zmiany pH (wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa).
      3. Zwiększ rozcieńczenie kultur do 10 ml, dodając 1/10 rozcieńczenia kultury do pożywki i pozwól im ponownie rosnąć w tych samych warunkach.
         UWAGA: W zależności od metabolizmu, niektóre ludzkie gatunki Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium i M. fermentans) zakwaszają pożywkę w wyniku fermentacji glukozy, a inne (M. hominis i Ureaplasma) alkalizują pożywkę odpowiednio przez hydrolizę argininy lub hydrolizę mocznika. Jeśli chodzi o ptasie mykoplazmy, zakwaszenie pożywki Freya wskazuje na obecność M. gallisepticum, podczas gdy jego alkalizacja dowodzi wzrostu M. imitans.
      4. Rozprowadź 50 μl kultur na płytkach agarowych, aby potwierdzić wzrost bakterii. Utrzymywać płytki agarowe w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i regularnie obserwować je pod mikroskopem pod kątem pojawienia się typowych kolonii jaj sadzonych (Mycoplasmas) i ciemnych kolonii jeżowców (Ureaplasmas).
   2. Wzrost gatunków innych niż Mollicutes
      1. Wyhodować bakterie inne niż Mollicutes w 3 ml pożywki w temperaturze 37 °C przez noc (wstrząsając z prędkością 200 obr./min).
      2. Porównaj zmętnienie kultur z pożywką kontrolną, aby potwierdzić wzrost.
      3. Zwiększ rozcieńczenie kultur do 10 ml, dodając 1/100 rozcieńczenia kultury do pożywki i pozwól im ponownie rosnąć w tych samych warunkach.
2. Przygotowanie antygenu
   1. Preparat antygenowy z gatunków Mollicutes
      1. Zebrać całe białka (obecne w potwierdzonych kulturach M. pneumoniae i innych gatunków Mollicutes) przez odwirowanie w temperaturze 40 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      2. Odrzucić supernatant i przemyć granulki trzykrotnie 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) przez serię trzech wirowań w tych samych warunkach.
      3. Zawiesić każdy antygen w 500 μl PBS.
   2. Preparat antygenowy z gatunków innych niż Mollicutes
      1. Odwirować wyhodowane przez noc kultury bakterii innych niż Mollicutes w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut.
      2. Zawiesić każdą osadkę bakteryjną w 500 μl PBS.
         UWAGA: Stężenie białka określa się przy użyciu klasycznej metody kwantyfikacji Bradforda z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem²¹. Stężenie białka w gatunkach Mollicutes zwykle waha się między 0,7-4,8 mg/ml. W przypadku innych gatunków bakterii stężenie białka może osiągnąć 20 mg/ml. Wszystkie antygeny są przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu ich późniejszego użycia.
3. Badania przesiewowe reaktywności krzyżowej za pomocą immunoblottingu
   1. Denaturować białka bakteryjne przez zmieszanie 8 μl każdego antygenu z równą objętością buforu próbki (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glicerolu [v/v], 10% SDS [w/v] i 0,2% błękitu bromofenolowego), inkubować mieszaninę w temperaturze 100 °C przez 5 min.
      UWAGA: Denaturację przeprowadza się w celu pokrycia białek ładunkiem ujemnym i rozbicia ich struktur drugorzędowych, co pozwala im przepłynąć przez żel poliakrylamidowy i rozdzielić je zgodnie z ich masą cząsteczkową.
   2. Poddaj zdenaturowane białka (100 μg białka/studzienkę) elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE) metodą Laemmliego²² z 12% żelem rozdzielającym i 5% żelem do układania. Następnie przenieś białka elektroforetycznie do membrany nitrocelulozowej za pomocą metody Towbina i wsp.²³.
   3. Zanurz membranę nitrocelulozową w 5% odtłuszczonym mleku w PBS na 30 minut, aby zablokować wolne powierzchnie. Inkubować bloty białkowe w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z poliklonalną surowicą króliczą M. pneumoniae (wyprodukowaną w Instytucie Pasteura w Tunisie) rozcieńczoną do 1/200 w PBS-Tween 20, a następnie z anty-króliczą IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczoną do 1/2000 w PBS-Tween 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Zmyć niezwiązane przeciwciała PBS i uzyskać wyniki, wystawiając arkusz nitrocelulozy na działanie roztworu substratu (4-chloro-1-naftol,_H2O2). Zatrzymaj reakcję, dodając wodę po 5-15 min.
4. Procedura adsorpcji
   UWAGA: W celu wyeliminowania reakcji krzyżowych między poliklonalną surowicą odporności M. pneumoniae a antygenami bakterii heterologicznych, stosuje się procedurę adsorpcji opisaną wcześniej przez Bena Abdelmoumena i Roya²⁴.
   1. Przygotuj pulę antygenów 12 heterologicznych bakterii (podejrzewa się, że dzielą antygeny z M. pneumoniae), wymieszaj ją w probówce do mikrowirówki i dostosuj stężenie białka odpowiadające połowie surowicy, która ma być zaadsorbowana w doświadczeniu.
      UWAGA: Objętość i stężenie różnią się w zależności od różnych testów. Ten etap zależy głównie od stężenia przeciwciała, które ma być adsorbowane. Na przykład, jeśli stężenie przeciwciał = 3,56 mg/ml, stężenie puli antygenów (składającej się z 12 bakterii heterologicznych) powinno wynosić 1,78 mg/ml (a więc około 0,148 mg każdego antygenu).
   2. Odwirować mieszaninę antygenu przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zebrać zebrany osad i inkubować go z oczyszczonym poliklonalnym anty-M. pneumoniae IgG przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z powolnym mieszaniem.
   3. Po inkubacji odwirować zawiesinę o stężeniu 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant (który odpowiada specyficznej poliklonalnej surowicy odpornościowej M. pneumoniae).
      UWAGA: Aby zapewnić swoistość poliklonalnej surowicy przeciw M. pneumoniae, należy powtórzyć procedurę adsorpcji trzy razy. Przed zastosowaniem w teście ELISA, zaadsorbowana poliklonalna surowica odpornościowa M. pneumoniae powinna zostać przetestowana przez immunoblotting pod kątem braku reakcji krzyżowych przeciwko dołączonemu zestawowi bakterii.

2. Etapy ELISA: Sam test

1. Powlekanie mikropłytką przeciwciałem wychwytującym
   1. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące (wstępnie zaadsorbowaną surowicę poliklonalną M. pneumoniae) do stężenia 10 μg/ml w 0,1 M buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6).
   2. Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA, dodając 100 μl rozcieńczonego przeciwciała wychwytującego do każdej studzienki.
   3. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 4 °C usunąć roztwór powlekający i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem płuczącym (skład [na l]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g tiomersalu i 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
2. Blokowanie
   1. Zablokować pozostałe powierzchnie wiążące powlekanych studzienek, dodając 100 μl roztworu blokującego (0,5% kazeiny w PBS) do każdego dołka.
   2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Usunąć roztwór blokujący za pomocą pipety i umyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.
3. Zastosowanie antygenu
   1. Dodać równą ilość całych białek M. pneumoniae do wszystkich powlekanych studzienek (10 ng/basenik).
   2. Pozostawić reakcję na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   3. Usunąć nadmiar roztworu antygenu i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem myjącym.
4. Stosowanie badanych próbek i kontroli
   1. Rozcieńczyć próbki testowe (surowice ludzkie) i kontrolne (surowice referencyjne dodatnie i ujemne) do 1/200, 1/400 i 1/800 w PBS-Tween 20.
   2. Dodać 100 μl rozcieńczonych próbek i próbek kontrolnych do odpowiednich studzienek. Każdą reakcję należy przeprowadzić w dwóch egzemplarzach. Oznaczyć studzienki niezawierające ani antygenu, ani surowic jako puste.
   3. Po inkubacji płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej usunąć roztwory surowicy i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.
5. Zastosowanie przeciwciała detekcji sprzężonego z enzymem
   1. Rozcieńczyć przeciwciała detekcyjne sprzężone z enzymami, przeciwciała anty-królicze sprzężone z HRP i anty-ludzkie IgG do 1/10 000 w PBS-Tween 20.
   2. Do każdej studzienki należy pobrać pipetą 100 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała wykrywającego.
   3. Po inkubacji płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, usunąć niezwiązane przeciwciała wykrywające i przemyć płytkę pięciokrotnie buforem do mycia.
6. Wykrywanie i analiza danych
   1. Dodać 100 μl roztworu chromogenu 3,3', 5,5' tetrametylobenzydyny (TMB), aby uwidocznić wiązanie antygen-przeciwciało.
   2. Pozostawić płytkę do rozwinięcia się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (7,5%_H2SO4), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
   3. Odczytaj absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i posortuj wyniki na podstawie obliczenia wskaźnika dodatniości (IP).
      IP = Absorbancja badanej surowicy / Absorbancja punktu odcięcia
      IP < 0,7: Wynik negatywny
      IP = 0,7: Test należy powtórzyć w ciągu 2 tygodni
      IP > 0,7: Wynik pozytywny
      UWAGA: Wzór IP jest opracowywany w laboratorium, a wartość 0,7 jest ustalana po optymalizacji. Dla powtarzających się reakcji oblicza się średnią wartość absorbancji. Optymalne rozcieńczenie surowicy i stężenie antygenu ustala się metodą miareczkowania ELISA w szachownicę (dane nie są pokazane). Wartość graniczna = OD (gęstość optyczna) dodatniej surowicy referencyjnej (rozcieńczonej w tym samym rozcieńczeniu co próbka). Ten OD powinien być co najmniej trzy razy wyższy niż wartość OD kontroli ujemnej.

3. Etapy po teście ELISA: ocena wyników i walidacja testu

1. Zdolność wewnętrznego testu ELISA do specyficznego diagnozowania zakażenia M. pneumoniae u badanych pacjentów jest oceniana za pomocą dodatkowych immunoblotów przy użyciu antygenów M. pneumoniae i bakterii heterologicznych w celu potwierdzenia dodatniości badanych surowic ludzkich w przeciwciałach M. pneumoniae i ich negatywności w innych podejrzanych bakteriach (dane nie pokazane).

Wyniki

Aktywność immunoblottingu niezaadsorbowanej poliklonalnej surowicy Mycoplasma pneumoniae przeciwko bakteriom heterologicznym
Reaktywność krzyżowa rzeczywiście istnieje, jak pokazano w wynikach immunoblottingu (Ryc. 2) i w porównaniu z kontrolą pozytywną (tor 1), niektóre antygeny M. pneumoniae są wspólne z bakteriami przebadanymi przesiewowo. Intensywność tych reakcji krzyżowych była zmienna. Na przykład antygeny M. gallisep...

Dyskusja

W artykule przedstawiono ogólny opis wewnętrznego testu ELISA, opracowanego głównie w celu zapewnienia specyficznych badań przesiewowych w kierunku zakażenia M. pneumoniae. Podano szczegółowe informacje na temat protokołu samego testu ELISA, a także niektórych etapów przetwarzania wstępnego i końcowego. Specyficzność tego testu zapewnia technika adsorpcji. Procedura ta została wcześniej opisana w testach ELISA opracowanych do diagnozowania mykoplazm ludzi i ptaków ^17,24

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4-chloro-1-naftol	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
Pepton Bacto	BD	211677
Bacto trypton	BD	211705
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
Bufor wodorowęglanowy węglanowy	Sigma-Aldrich	C3041-50 Kazeina Cap
	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066	VWR	P0058-N1L
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO Bulion	BD	255420	Frey media
Czytnik płytek ELISA	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Ref: 51119200
Surowica bydlęca	Capricorn Scientific	FBS-12A
Anty-ludzka IgG sprzężona z peroksydazą kozią	Abcam	ab6759
IgG IgG Life sprzężone z peroksydazą kozią		656120
Kwas solny 37%	Prolab	2025.290
Nadtlenek wodoru (H2O2), roztwór 30%	Scharlau	HI01361000
L-arginina	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB bulion	Przygotowane w Instytucie Pasteura w Tunisie		Dostarczone przez laboratorium bakteriologii Instytutu Pasteura w Tunisie
Mycoplasma pneumoniae poliklonalna surowica wytwarzana u królika	Wyprodukowano w Instytucie Pasteura w Tunisie		Surowica została wyprodukowana w wyniku immunizacji królików w Instytucie Pasteura w Tunisie
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Płaska 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania Nunc Maxisorp z płaskim dnem	Invitrogen	44-2404-21
Penicylina G sodu (1 MIU)	PANPHARMA
Fenol red	fluka chemika	77660
Mleko odtłuszczone	MP Biomedicals	902887
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
Chlorek sodu (NaCl)	Novachim	PS02805
Kwas siarkowy (H2SO4) 95-97%	Merck	1007311011
Tiomersal	USB	22215
Podłoże TMB (3,3', 5,5' Roztwór tetrametylobenzydyny)	Abcam	ab142042
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
Tween 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
Ekstrakt drożdżowy, proszek, Ultrapure	Thermo Scientific	J23547