Artykuł metodologiczny

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

DOI:

10.3791/64647

⸱

30 listopada 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria, będące elektrowniami komórki, odgrywają ważną rolę w bioenergetyce, generowaniu wolnych rodników, homeostazie wapnia i apoptozie. Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów i jest zwykle badana za pomocą obserwacji mikroskopowej, jednak testy mitofagii in vivo są trudne do wykonania. Ocena mitofagii poprzez obrazowanie żywych organelli jest alternatywną i niezbędną metodą badań mitochondrialnych. Protokół ten opisuje procedury stosowania barwnika mitochondriów o zielonej fluorescencji MitoTracker Green i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji LysoTracker Red w żywych komórkach, w tym ładowanie barwników, wizualizację mitochondriów i lizosomu oraz oczekiwane wyniki. Przedstawiono również szczegółowe kroki oceny mitofagii w żywych komórkach, a także uwagi techniczne dotyczące ustawień oprogramowania mikroskopu. Ta metoda może pomóc naukowcom w obserwacji mitofagii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Ponadto może być stosowany do ilościowego oznaczania mitochondriów i lizosomów oraz oceny morfologii mitochondriów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są elektrowniami prawie wszystkich komórek eukariotycznych1,2. Oprócz produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, mitochondria odgrywają istotną rolę w innych procesach, takich jak bioenergetyka, homeostaza wapnia, wytwarzanie wolnych rodników, apoptoza i homeostaza komórkowa3,4,5. Ponieważ mitochondria generują reaktywne formy tlenu (ROS) z wielu kompleksów w łańcuchu transportu elektronów, są one stale stymulowane przez potencjalny stres oksydacyjny, który może ostatecznie prowadzić do uszkodzeń strukturalnych i dysfunkcji, gdy załamie się system obrony antyoksydacyjnej6,7. Stwierdzono, że dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do wielu chorób, w tym zaburzeń metabolicznych, neurodegeneracji i chorób sercowo-naczyniowych8. Dlatego tak ważne jest utrzymanie zdrowych populacji mitochondriów i ich prawidłowego funkcjonowania. Mitochondria są wysoce plastycznymi i dynamicznymi organellami; ich morfologia i funkcja są kontrolowane przez mechanizmy kontroli jakości mitochondriów, w tym modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek mitochondrialnych, biogenezę mitochondriów, fuzję, rozszczepienie i mitofagię9,10. Rozszczepienie mitochondriów, w którym pośredniczy białko 1 związane z dynaminą (DRP1), GTPaza z nadrodziny białek dynaminy, powoduje powstanie małych i okrągłych mitochondriów i izoluje dysfunkcyjne mitochondria, które mogą zostać oczyszczone i zdegradowane przez mitofagię11,12.

Mitofagia to proces komórkowy, który selektywnie degraduje mitochondria przez autofagię, zwykle występującą w uszkodzonych mitochondriach po urazie, starzeniu się lub stresie. Następnie mitochondria te są dostarczane do lizosomów w celu degradacji10. Tak więc mitofagia jest procesem katabolicznym, który pomaga utrzymać ilość i jakość mitochondriów w zdrowym stanie w szerokim zakresie typów komórek. Odgrywa kluczową rolę w przywracaniu homeostazy komórkowej w normalnych warunkach fizjologicznych i stresowych13,14. Komórki charakteryzują się złożonym mechanizmem mitofagii, który jest indukowany przez różne sygnały stresu komórkowego i zmian rozwojowych. Szlaki regulacyjne mitofagii są klasyfikowane jako zależne od ubikwityny lub zależne od receptora15,16; autofagia zależna od ubikwityny jest pośredniczona przez kinazę PINK1 i rekrutację ligazy ubikwityny Parkin E3 do mitochondriów17,18, podczas gdy autofagia zależna od receptora obejmuje wiązanie receptorów autofagii z łańcuchem lekkim białka LC3 związanym z mikrotubulami, który pośredniczy w mitofagii w odpowiedzi na uszkodzenie mitochondriów19.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest najczęściej używaną metodą i nadal jedną z najlepszych metod obserwacji i wykrywania mitofagii20. Cechami morfologicznymi mitofagii są autofagosomy lub autolizosomy powstałe w wyniku fuzji autofagosomów z lizosomami, które można zaobserwować na obrazach z mikroskopii elektronowej21. Słabością mikroskopii elektronowej (EM) jest jednak niemożność monitorowania dynamicznych procesów mitofagii, takich jak depolaryzacja mitochondriów, rozszczepienie mitochondriów oraz fuzja autofagosomów i lizosomów, w żywej komórce20. Tak więc ocena mitofagii poprzez obrazowanie żywych organelli jest atrakcyjną alternatywną metodą badań mitochondrialnych. Opisana tutaj technika obrazowania żywych komórek wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne do barwienia mitochondriów i lizosomów. Kiedy zachodzi mitofagia, uszkodzone lub zbędne mitochondria pochłonięte przez autofagosomy są zabarwione na zielono przez barwnik mitochondrialny, podczas gdy czerwony barwnik barwi lizosomy. Fuzja tych autofagosomów i lizosomów, określanych jako autolizosomy, powoduje, że zielona i czerwona fluorescencja nakładają się na siebie i manifestują się jako żółte kropki, wskazując w ten sposób na występowanie mitofagii22. Barwnik mitochondriów przenikany przez komórkę (MitoTracker Green) zawiera łagodnie reagujące z tiolami ugrupowanie chlorometylowe, które oznacza mitochondria23. Aby oznaczyć mitochondria, komórki są po prostu inkubowane z barwnikiem, który dyfunduje pasywnie przez błonę plazmatyczną i gromadzi się w aktywnych mitochondriach. Ten barwnik mitochondriów może łatwo barwić żywe komórki i jest mniej skuteczny w barwieniu komórek utrwalonych aldehydem lub martwych. Barwnik lizosomowy (LysoTracker Red) to fluorescencyjna sonda kwasotropowa służąca do znakowania i śledzenia organelli kwasowych w żywych komórkach. Barwnik ten wykazuje wysoką selektywność w stosunku do organelli kwaśnych i może skutecznie znakować żywe komórki w stężeniach nanomolowych24.

Procedury użycia tych barwników fluorescencyjnych w żywych komórkach, w tym ładowanie barwników oraz wizualizacja mitochondriów i lizosomów, są przedstawione tutaj. Ta metoda może pomóc naukowcom w obserwacji mitofagii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Może być również stosowany do ilościowego określania mitochondriów i lizosomów oraz oceny morfologii mitochondriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i pasażowanie

UWAGA: Protokół jest opisany na przykładzie rutynowo hodowanych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF).

  1. Hodować komórki MEF w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i monitorować komórki pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu.
  2. Wykonaj rutynowe pasażowanie komórek.
    1. Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90% (co 3 dni), przemyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Następnie dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA przez 1 minutę, aby zdysocjować komórki, a następnie 2 ml DMEM, aby zatrzymać działanie trypsyny-EDTA. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM.
    2. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i szkiełek w komorze do liczenia komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie zaszczepić 1,5 x 106 komórek w nowej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml DMEM.
  3. Do testu mitofagicznego należy przygotować zawiesinę komórkową jak w kroku 1.2.1. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1 x 105 komórek/ml w świeżym DMEM.
  4. Dodać 2 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do naczynia konfokalnego o średnicy 20 mm (patrz tabela materiałów) i wstrząsnąć szalką hodowlaną na "krzyż". Inkubować naczynie do hodowli komórkowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

2. Barwienie mitochondriów

  1. Z zamrażarki w temperaturze -20 °C wyjąć porcje roztworu podstawowego barwnika mitochondrialnego o barwie fluorescencyjnej na zielono i barwnika lizosomu o czerwonej fluorescencji (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować roztwory robocze barwników, rozcieńczając roztwory podstawowe w stosunku 1:1,000 w DMEM i dobrze wymieszać. Na przykład dodaj po 2 μl po 1 mM barwnika mitochondrialnego i barwnika lizosomowego do 2 ml DMEM, aby uzyskać stężenie robocze 1 μM dla obu barwników.
  3. Usunąć pożywkę z naczynia do hodowli konfokalnej (krok 1.4). Dodać 1 ml roztworu barwiącego (przygotowanego w kroku 2.2), aby pokryć komórki. Umieścić naczynie do hodowli komórkowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 20-30 minut.

3. Obrazowanie konfokalne

  1. Przygotować 1 l buforu Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO, 4,7H2 O, 15 mM glukozy i 21,85 mM HEPES; końcowe pH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 miesiąca).
  2. W dniu obrazowania konfokalnego należy wcześniej wyjąć bufor KH z lodówki i podgrzać go do temperatury pokojowej (20 do 25 °C).
  3. Ustaw parametry oprogramowania do obrazowania mikroskopii konfokalnej (patrz tabela materiałów): W przypadku obrazów z podwójnym wzbudzeniem należy użyć wzbudzenia sekwencyjnego przy 488 nm i 543 nm i zbierać emisję odpowiednio przy 505-545 nm i >560 nm.
    UWAGA: Ustaw ustawienia obrazowania w następujący sposób. Tryb skanowania: ramka; Prędkość: 9; Średnia: liczba, 1; Przyrost: od 450 do 600; Otworek: od 30 do 200; Laser: <10%. Najlepiej jest najpierw uruchomić oprogramowanie do obrazowania, a następnie całkowicie włączyć laser 488 nm. Laser o długości fali 543 nm musi być włączony i ustabilizowany przez 3-5 minut przed użyciem (Rysunek 1A).
  4. Wyjąć pożywkę zawierającą barwnik z inkubatora (krok 2.3) i dodać 1 ml buforu KH do naczynia.
  5. Aby wywołać mitofagię, należy potraktować komórki cyjankiem karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonem (FCCP) w stężeniu 1 μM (stężenie końcowe) w buforze KH przez 10 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast przystąpić do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  6. Nałóż odpowiednią ilość oleju na górną część soczewki olejowej 63x (patrz Tabela materiałów). Umieść próbkę komórki na stoliku na próbkę mikroskopu konfokalnego i przesuń ją bezpośrednio nad soczewkę obiektywu.
  7. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby znaleźć próbkę, klikając zakładkę Zlokalizuj w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania (Rysunek 1B). Wybierz zestaw filtrów zielonych dla eksperymentu.
  8. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej, aby szybko ustawić ostrość, przesuwając soczewkę obiektywu w górę iw dół. Po tym, jak próbka komórki jest wyraźnie widoczna przez okular, wyszukaj i ustaw ostrość na obszarze pojedynczych komórek, a następnie przesuń go do środka pola view.
  9. Kliknij kartę Akwizycja w lewym górnym rogu interfejsu oprogramowania, aby uzyskać obrazy. Wybierz tylko kanał 488 nm i rozdzielczość klatki 1024 x 1024 dla podglądu.
  10. Kliknij kartę Na żywo w lewym górnym rogu, aby rozpocząć skanowanie na żywo. Dostosuj pole widzenia do najostrzejszego i dostosuj moc lasera, przesuwając suwak w lewo lub w prawo (Rysunek 1A). Utrzymuj ustawienie wzmocnienia poniżej 600, aby uniknąć prześwietlenia.
  11. Ustaw wartość otworka na 156, wartość wzmocnienia na 545, a wartość przesunięcia cyfrowego na 0.
  12. Wybierz najlepsze pole widzenia, sprawdź dwa kanały (488 nm i 543 nm) i wybierz rozdzielczość klatki 1024 x 1024. Kliknij przycisk Przyciągaj, aby uzyskać obrazy 2D. Zapisz pobrane obrazy.
    UWAGA: Zielony barwnik mitochondriów ma pik wzbudzenia przy 490 nm i pik emisji przy 516 nm; Można go wzbudzić za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Czerwony barwnik lizosomowy ma pik wzbudzenia przy 576 nm i pik emisji przy 590 nm; Można go wzbudzić za pomocą lasera o długości fali 543 nm.

4. Analiza obrazu

  1. Otwórz zapisany obraz za pomocą ImageJ i zaimportuj do niego scalony obraz.
  2. Ręcznie policz liczbę żółtych kropek w każdej komórce, które wskazują, że lizosom pochłania mitochondria.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MitoTracker Green to zielono-fluorescencyjne barwniki mitochondrialne, które są w stanie dokładnie zlokalizować mitochondria. Barwnik może łatwo barwić żywe komórki i jest mniej skuteczny w barwieniu komórek utrwalonych aldehydem lub martwych (Rysunek 2). Czerwono-fluorescencyjny barwnik lizosomowy LysoTracker Red jest zdolny do znakowania i śledzenia kwaśnych organelli lizosomalnych i może barwić tylko żywe komórki (Rysunek 2). Obrazowanie mikroskopem konfokalnym pozwala na wizual...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia metodę oceny i monitorowania dynamicznego procesu mitofagii w żywych komórkach, obejmującego autofagosomy, lizosomy i rozszczepienie mitochondriów, poprzez jednoczesne barwienie mitochondriami peromondrycznymi i barwnikami lizosomowymi. Metoda może być również stosowana do identyfikacji mitochondriów i oceny morfologii mitochondriów. Oba barwniki użyte w tym badaniu powinny być chronione przed światłem, należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, a barwniki powinny być prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81970333,31901044,) oraz Program dla Profesora Specjalnego Mianowania w Szanghajskich Instytucjach Szkolnictwa Wyższego (GZ2020008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny licznik komórekCountstarIC1000
Szkiełka z komorą do liczenia komórekCountstar12-0005-50
Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco (DPBS)Corning21-031-CVC
Naczynie do hodowli komórek ze szklanym dnem (naczynie konfokalne)NEST801002
Obraz J (Rasband, NIH)NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs– Bufor Henseleit(KHB)Samodzielnie przygotowany
mol/L, barwnik lizosomowy o czerwonej fluorescencji
MitoTracker GreenInvitrogen1842298200 µ mol/L zapas, zielony fluorescencyjny barwnik mitochondrialny
Mysz FibroblastySamodzielnie przygotowany
obiektyw (63-krotna soczewka olejowa)ZEISSZEISS LSM 880
Trypsyna-EDTA 0,25%GibicoCat# 25200056
ZEISS LSM 880 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZEISSZEISS LSM 880
ZEN Oprogramowanie mikroskopowe 2.1 (konfokalne oprogramowanie do obrazowania mikroskopem)ZEISSZEN 2.1
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µ embrionalne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912(2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252(2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070(2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705(2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitophagy AssayMitochondria VisualizationLysosome StainingConfocal MicroscopyLive Cell ImagingMitoTracker GreenLysoTracker RedMitochondrial MorphologyMitochondrial Dynamics

Powiązane artykuły