Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa hodowla unaczynionej termogenicznej tkanki tłuszczowej z fragmentów mikronaczyniowych

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64650

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół opisujący wykorzystanie fragmentów mikronaczyniowych wyizolowanych z gryzoni lub ludzkiej tkanki tłuszczowej jako prostego podejścia do inżynierii funkcjonalnej, unaczynionej beżowej tkanki tłuszczowej.

Streszczenie

Inżynieria termogenicznej tkanki tłuszczowej (np. beżowej lub brązowej tkanki tłuszczowej) została zbadana jako potencjalna terapia chorób metabolicznych lub do projektowania spersonalizowanych mikrotkanek do badań przesiewowych i testów narkotykowych. Obecne strategie są często dość złożone i nie są w stanie dokładnie w pełni zobrazować wielokomórkowych i funkcjonalnych właściwości termogenicznej tkanki tłuszczowej. Fragmenty mikronaczyniowe, małe nienaruszone mikronaczynia składające się z tętniczki, żyłek i naczyń włosowatych odizolowanych od tkanki tłuszczowej, służą jako pojedyncze autologiczne źródło komórek, które umożliwiają unaczynienie i tworzenie tkanki tłuszczowej. W artykule opisano metody optymalizacji warunków hodowli w celu umożliwienia wytwarzania trójwymiarowych, unaczynionych i funkcjonalnych termogenicznych tkanek tłuszczowych z fragmentów mikronaczyniowych, w tym protokoły izolacji fragmentów mikronaczyniowych z tkanki tłuszczowej i warunków hodowli. Ponadto omówiono najlepsze praktyki, techniki charakteryzowania zmodyfikowanych tkanek, a także przedstawiono wyniki próbek zarówno z fragmentów mikronaczyniowych gryzoni, jak i ludzi. Podejście to ma potencjał do wykorzystania do zrozumienia i opracowania metod leczenia otyłości i chorób metabolicznych.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do rozwoju unaczynionej beżowej tkanki tłuszczowej z pojedynczego, potencjalnie autologicznego źródła, fragmentu mikronaczyniowego (MVF). Wykazano, że brązowa i beżowa tkanka tłuszczowa wykazuje korzystne właściwości związane z regulacją metaboliczną; Jednak niewielka objętość tych magazynów tkanki tłuszczowej u dorosłych ogranicza potencjalny wpływ na metabolizm ogólnoustrojowy, szczególnie w stanach chorobowych, takich jak otyłość lub cukrzyca typu 21,2,3,4,5,6,7. Istnieje duże zainteresowanie brązowym/beżowym tłuszczem jako celem terapeutycznym w zapobieganiu szkodliwym skutkom metabolicznym związanym z otyłością i chorobami współistniejącymi8,9,10,11,12.

MVFs to struktury naczyń, które mogą być bezpośrednio izolowane z tkanki tłuszczowej, hodowane i utrzymywane w trójwymiarowej konfiguracji przez dłuższy okres czasu13,14,15. Wcześniejsze prace naszej grupy, a także innych, zaczęły wykorzystywać wielokomórkową i multipotencjalną zdolność MVF, szczególnie w odniesieniu do tworzenia tkanki tłuszczowej16,17,18. W ramach tej pracy wykazaliśmy niedawno, że MVF pochodzące z modeli gryzoni zdrowych i chorych na cukrzycę typu 2 19 oraz od ludzi (dorośli powyżej 50 roku życia)20 zawierały komórki zdolne do indukowania do tworzenia termogenicznej lub beżowej tkanki tłuszczowej.

To jest innowacyjne podejście, z którego wykorzystuje się MVF z jednego źródła, nie tylko zdolne do tworzenia beżowej tkanki tłuszczowej, ale także jej powiązanego i krytycznego składnika naczyniowego21. Zastosowanie tej techniki może być bardzo cenne dla badań poszukujących prostego podejścia do termogenicznego tworzenia tkanki tłuszczowej za pomocą inżynierii tkankowej. W przeciwieństwie do innych metod dążących do inżynierii beżowej tkanki tłuszczowej22,23,24,25,26,27,28, proces opisany w tym badaniu nie wymaga stosowania wielu typów komórek ani złożonych schematów indukcji. Unaczynione beżowe i białe modele tłuszczowe mogą być tworzone za pomocą MVF pochodzących ze źródeł gryzoni i ludzi, wykazując duży potencjał translacyjny. Produktem końcowym tego protokołu jest zmodyfikowana beżowa termogeniczna tkanka tłuszczowa o budowie i funkcji metabolicznej porównywalnej do brunatnej tkanki tłuszczowej. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten przedstawia ideę, że łatwo dostępne i możliwie autologiczne źródło MVF może być wartościową interwencją terapeutyczną i narzędziem do badania zaburzeń metabolicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act) oraz wykonawczymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, zgodnie z zasadami zawartymi w przewodniku Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie procedury z użyciem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Teksańskim w San Antonio.

UWAGA: W poniższych krokach wykorzystano samce szczurów szczepu Lewis. W przypadku samic, a także podczas pobierania fragmentów mikronaczyniowych (MVF) od myszy, należy wprowadzić niewielkie modyfikacje protokołu29. W przypadku protokołów z wykorzystaniem ludzkich MVF (h-MVFs), jedynymi wymaganymi krokami są: resuspensja h-MVFs zgodnie z protokołem producenta, przygotowanie pożywki wzrostowej (1.3), formowanie hydrożeli fibrynowych (5) oraz hodowla (6). Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat procesu izolacji fragmentów mikro naczyniowych i tworzenia hydrożelu fibrynowego do hodowli komórkowych.
Rycina 1: Schemat eksperymentalny. Podział na sześć kluczowych etapów, poprzedzających analizę, w procesie tworzenia termogenicznej tkanki tłuszczowej z wykorzystaniem MVF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Poniższe odczynniki są przeznaczone dla jednego szczura, odważone i przygotowane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotowanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    1. Przygotuj roztwór BSA w PBS o stężeniu 10 mg/mL (1,0%), który zostanie rozcieńczony do etapów płukania (1 mg/mL, 0,1%) i trawienia (4 mg/mL, 0,4%).
    2. Przygotuj różne stężenia BSA, wspomniane w punkcie 1.1.1, zgodnie z krokami 1.1.3–1.1.5.
    3. BSA 10 mg/mL w PBS (1% BSA w PBS)
      1. Do probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodaj 500 mg BSA i 500 mL PBS, a następnie wymieszaj roztwór na wirówce typu vortex, aby rozpuścić BSA.
      2. W przypadku powstania nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza, odwiruj roztwór z prędkością 350 x g przez 2 min. Przesącz roztwór przez filtr membranowy z nylonu o rozmiarze oczek 0,22 µm w celu sterylizacji.
    4. BSA 1 mg/mL w PBS (0,1% BSA w PBS)
      1. Rozcieńcz 15 mL roztworu BSA 10 mg/mL w PBS w stosunku 1:10 przy użyciu PBS, dodając 15 mL BSA 10 mg/mL w PBS do 135 mL PBS w sterylnej butelce o pojemności 500 mL, a następnie delikatnie potrząśnij butelką, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
    5. BSA 4 mg/mL w PBS (0,4% BSA w PBS)
      1. Rozcieńcz 35 mL roztworu BSA 10 mg/mL w PBS w stosunku 1:2,5 przy użyciu PBS, dodając 35 mL BSA 10 mg/mL w PBS oraz 57,5 mL PBS do sterylnej butelki o pojemności 100 mL, a następnie delikatnie potrząśnij butelką, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
  2. Przygotowanie kolagenazy w BSA do trawienia rozdrobnionych poduszek tłuszczowych.
    1. Przygotuj kolagenazę w stężeniu 6 mg/mL.
      1. W probówce stożkowej o pojemności 50 mL odważ 72 mg kolagenazy (oznacz jako „for Epi”).
      2. W trzech probówkach stożkowych o pojemności 50 mL odważ po 144 mg kolagenazy w każdej (oznacz odpowiednio jako „for Ing 1”, „for Ing 2” oraz „for SubQ”).
      3. Odważoną kolagenazę przechowuj w temperaturze 4 ˚C do momentu użycia.
        UWAGA: Nie dodawaj BSA/PBS aż do momentu bezpośrednio przed trawieniem.
      4. Do probówki zawierającej 72 mg kolagenazy dodaj 12 mL BSA 4 mg/mL w PBS.
      5. Do probówek zawierających 144 mg kolagenazy dodaj 24 mL BSA 4 mg/mL w PBS.
      6. Wstrząśnij probówkami, aby uzyskać jednorodny roztwór, a następnie przesącz roztwór przez filtr membranowy z nylonu o rozmiarze oczek 0,22 µm w celu sterylizacji.
  3. Przygotowanie pożywek wzrostowych uzupełnionych kwasem aminokapronowym (ACA) do zasilania/różnicowania wyizolowanych MVF.
    1. Pożywka wzrostowa (GM): Uzupełnij DMEM o 20% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny (pen strep), 0,2% profilaktyki przeciwmykoplazmatycznej oraz 1 mg/mL ACA.
    2. Przygotuj białej pożywkę adipogenną (WAM).
      1. Indukcja WAM: Uzupełnij DMEM/F12 o 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% profilaktyki przeciwmykoplazmatycznej, 10 µg/mL insuliny, 10 µm forskoliny, 1 µm deksametazonu i 1 mg/mL ACA.
        UWAGA: W przypadku h-MVF dodaj dodatkowo 125 µM indometacyny.
      2. Utrzymanie WAM: Uzupełnij DMEM/F12 o 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% profilaktyki przeciwmykoplazmatycznej, 5 µg/mL insuliny i 1 mg/mL ACA.
        UWAGA: W przypadku h-MVF zmień stężenie insuliny na 10 µg/mL.
    3. Przygotuj beżową pożywkę adipogenną (BAM).
      1. Indukcja BAM: Uzupełnij DMEM/F12 o 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% profilaktyki przeciwmykoplazmatycznej, 10 µg/mL insuliny, 10 µm forskoliny, 1 µm deksametazonu, 1 µm roziglitazonu, 20 nM 3,3′,5-jodotyroniny (T3) i 1 mg/mL ACA.
        UWAGA: W przypadku h-MVF zmień stężenie T3 na 120 nM.
      2. Utrzymanie BAM: Uzupełnij DMEM/F12 o 20% FBS, 1% pen strep, 0,2% profilaktyki przeciwmykoplazmatycznej, 5 µg/ml insuliny, 10 µm forskoliny, 1 µm roziglitazonu, 20 nM T3 i 1 mg/mL ACA.
        UWAGA: W przypadku h-MVF zmień stężenie insuliny na 10 µg/mL, a stężenie T3 na 120 nM.
  4. Przygotowanie trombiny (wyłącznie w przypadku braku dostępnego roztworu stokowego w aliquotach) do wytworzenia czynnika krzepnięcia stosowanego w żelach fibrynowych.
    1. Trombina 10 U/mL w ddH2O:
      1. Resuspenduj proszek trombiny, używając 1–5 mL ddH2O w fiolce od producenta, a następnie przenieś resuspensję do zlewki o pojemności 250 mL.
      2. Uzupełnij objętość roztworu do 100 mL i kilkukrotnie pipetuj go w górę i w dół, aby zapewnić jednorodność mieszaniny. Rozdziel roztwór do probówek stożkowych o pojemności 15 mL (~10 mL/probówka) i przechowuj aliquoty w zamrażarce w temperaturze -20 ˚C.
        UWAGA: Przed użyciem rozmroź trombinę w temperaturze pokojowej (RT).

2. Przygotowanie narzędzi i materiałów

UWAGA: Wszystkie instrumenty powinny zostać autoklawowane/sterylizowane przed użyciem.

  1. Izolacja tłuszczu nadjajowodowego/pachwinowego/podskórnego (operację należy przeprowadzić w wyznaczonym obszarze chirurgicznym)
    1. Należy zapewnić dostępność jednorazowych podkładów chłonnych, dwóch par nożyczek, jednego zacisku hemostatycznego (opcjonalnie), dwóch pęset oraz czterech stożkowych probówek 50 mL zawierających 10-15 mL 1 mg/mL BSA (0.1%) w PBS.
  2. Izolacja fragmentów mikronaczyniowych
    1. Do rozdrabniania (wykonywanego w komorze z laminarnym przepływem powietrza) należy zapewnić trzy niepowlekane sterylne szalki Petriego 100 mm, jedną pęsetę i jedną parę zakrzywionych nożyczek.
    2. Do trawienia i izolacji (wykonywanych w komorze z laminarnym przepływem powietrza) należy zapewnić jedną parę nożyczek, jedną pęsetę, osiem niepowlekanych sterylnych szalek Petriego 100 mm, trzy niepowlekane sterylne szalki Petriego 35 mm, odważoną kolagenazę w temperaturze 4 ˚C, cztery kolby 250 mL, jeden plastikowy uchwyt z otworem w centrum, cztery sita 500 µM (wycięte na 3 zaokrąglone kwadraty), cztery sita 37 µM (wycięte na 3 zaokrąglone kwadraty) oraz 11 stożkowych probówek 50 mL.
  3. Resuspensja fibryny
    1. Do przygotowania hydrożeli fibrynowych (wykonywanego w komorze z laminarnym przepływem powietrza) należy upewnić się, że dostępne są fibrynogen, trombina oraz pożywka wzrostowa (przygotowane podczas etapu przygotowania odczynników).

3. Protokół izolacji tłuszczu

  1. Kroki wstępne
    1. Napełnić zlewkę etanolem w celu umycia i dezynfekcji narzędzi chirurgicznych przed ich użyciem. Następnie przygotować stół do pracy ze szczurem oraz odkurzacz do odsysania sierści powstającej podczas golenia.
    2. Przygotować wiadro z lodem, w którym zostaną umieszczone wcześniej przygotowane probówki stożkowe 50 mL, z których każda zawiera 10 mL 1 mg/mL BSA. Odpowiednio oznakować probówki.
      UWAGA: Może być konieczne użycie dwóch oddzielnych probówek stożkowych dla tkanki tłuszczowej pachwinowej, ponieważ należy wyciąć tkankę z obu stron, a ilość tłuszczu zebranego z tego regionu ma tendencję do bycia największą w porównaniu z tłuszczem przywidłużnikowym i tylnym podskórnym.
    3. Zacząć od uśmierconego szczura w wyznaczonym obszarze chirurgicznym z niezbędnymi narzędziami chirurgicznymi. Zazwyczaj do uśmiercania szczurów stosuje się CO2 zgodnie z protokołami IACUC.
    4. Za pomocą maszynki do golenia ogolić szczura wokół obszaru zainteresowania. W szczególności ogolić obszar między pachwinami a połową brzucha w celu izolacji tłuszczu przywidłużnikowego i pachwinowego (użyć mniejszej głowicy do sierści w tym regionie). Ogolić całe grzbiet, aby pozyskać tylną tkankę tłuszczową podskórną znajdującą się między łopatkami (najlepiej użyć większej głowicy, ponieważ sierść na grzbiecie szczura jest gęstsza).
    5. Przygotować szczura aseptycznie, spryskując go 70% etanolem. Zazwyczaj zaleca się dwukrotne oczyszczenie obszaru, który będzie nacinany.
  2. Izolacja różnych depotów tłuszczowych
    1. Pachwinowa (podskórna)
      1. W pozycji na plecach unieść skórę poniżej prącia za pomocą nożyczek. Rozpocząć nacięcie nożyczkami od środka, tnąc bocznie, tworząc kształt litery „V” i zapętlając cięcie ku tylnej części ciała szczura, aby uzyskać dostęp do całego depotu tłuszczowego. Należy pamiętać o płytkim cięciu, aby tłuszcz pod spodem pozostał nienaruszony. Podczas nacinania zapewnić oddzielenie skóry od tłuszczu poprzez przecięcie łączącej je tkanki powięziowej (Ryc. 2A).
      2. Po odpowiednim przecięciu powięzi upewnić się, że obie strony tłuszczu pachwinowego są widoczne (tłuszcz pachwinowy rozciąga się od obszaru pachwin w stronę grzbietu). Następnie usunąć tłuszcz z obu stron do dwóch oddzielnych probówek stożkowych zawierających 10 mL 1 mg/mL BSA (Ryc. 2B).
    2. Przywidłużnikowa (trzewna)
      1. Pozyskać tłuszcz przywidłużnikowy, przecinając skórę brzucha i ostrożnie cienką warstwę otaczającą jądra (Ryc. 2C).
      2. Za pomocą pęsety delikatnie wyciągnąć tkankę tłuszczową i wyciąć ją nożyczkami. Unikać przecinania dużych, widocznych naczyń krwionośnych (jeśli jądro i naddatek są pobrane, usunąć je podczas etapu oczyszczania w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
      3. Ostrożnie umieścić usunięty tłuszcz w probówce stożkowej 50 mL z 10 mL 1 mg/mL BSA w PBS.
        UWAGA: Usuwanie tłuszczu przywidłużnikowego powinno być wykonane po usunięciu tłuszczu pachwinowego. Tłuszcz przywidłużnikowy ma zazwyczaj mniejszą objętość i znajduje się poniżej tłuszczu pachwinowego, pod skórą brzucha otaczającą jądro i naddatek.
    3. Tylna podskórna
      1. Położyć szczura na brzuchu (grzbietem do góry) i za pomocą dużych nożyczek naciąć skórę grzbietu (skóra w tym regionie jest gruba) aż do skóry głowy, uważając, aby nie ciąć zbyt głęboko, jedynie tuż pod skórą (Ryc. 2D).
      2. Przeciąć powięź łączącą skórę z tkanką; tłuszcz znajduje się w regionie międzyłopatkowym. Należy zwrócić uwagę na rozróżnienie/oddzielenie tłuszczu podskórnego od tłuszczu brunatnego. Tłuszcz brunatny znajduje się bliżej kręgosłupa (Ryc. 2E).
      3. Wyizolować i umieścić tłuszcz w odpowiedniej probówce lub probówkach stożkowych 50 mL z 10 mL 1 mg/mL BSA w PBS.

Schemat sekcji tkanki tłuszczowej myszy; zaznaczone nacięcia dla tłuszczu pachwinowego i nadjajowodowego oraz podskórnego.
Rycina 2: Izolacja różnych depot tkanki tłuszczowej. (A) Wstępne nacięcia niezbędne do wycięcia tkanki tłuszczowej pachwinowej. (B) Lokalizacja depot tłuszczu pachwinowego. (C) Lokalizacja depot tłuszczu nadjajowodowego, z zaznaczeniem nacięcia skóry zewnętrznej niezbędnego do uzyskania dostępu. (D) Dodatkowe nacięcia niezbędne po ułożeniu myszy na brzuchu w celu uzyskania dostępu do pozostałego tłuszczu. (E) Lokalizacja tylnego depot tłuszczu podskórnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Protokół izolacji fragmentów mikro naczyniowych

  1. Umieścić probówki stożkowe 50 mL zawierające wycięty tłuszcz szczura w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Za pomocą pęsety przenieść tłuszcz do standardowej szalki Petriego 100 mm (z dodatkiem ~0,5 mL BSA 1 mg/mL w PBS w celu nawilżenia tkanki).
  3. Oczyścić tłuszcz, usuwając wszelkie widoczne naczynia krwionośne oraz tkankę mięśniową lub obcą.
  4. Siekieć tłuszcz nożyczkami przez ~10 min (do momentu, gdy będzie można go przenieść pipetą 10 mL).
  5. Sprawdzić obecność grudek, dodając ~0,5 mL BSA 1 mg/mL w PBS; w razie potrzeby kontynuować siekanie.
  6. Przenieść posiekaną tkankę tłuszczową do sterylnej kolby 250 mL za pomocą pipety 10 mL.
    UWAGA: Odmierzyć objętość za pomocą pipety.
  7. Dodać odpowiednią ilość BSA (1 mg/mL), aby objętość końcowa wyniosła 20 mL.
  8. Dodać BSA 4 mg/mL w PBS do kolagenazy (końcowe stężenie kolagenazy: 6 mg/mL) (np. 12 mL dla 72 mg kolagenazy lub 24 mL dla 144 mg kolagenazy).
    UWAGA: Nie dodawać do momentu zakończenia siekania, ponieważ roztwór jest wrażliwy na czas.
  9. Delikatnie wstrząsnąć probówką stożkową, aby zapewnić jednorodność roztworu, a następnie wysterylizować roztwór poprzez filtrację przez nylonowy filtr membranowy 0,22 µm.
  10. W przypadku tłuszczu nadjajowego trawić przez ~8-10 min; w przypadku tłuszczu pachwinowego i tylnego podskórnego trawić przez ~15-20 min w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, cały czas potrząsając kolbą ruchem okrężnym (zatrzymać proces w momencie, gdy w tkance tłuszczowej pozostaną jedynie nieliczne grudki).
  11. Przenieść strawiony tłuszcz do probówki stożkowej 50 mL (powinno być ~30 mL/probówkę) i oznaczyć probówkę jako „strawiony tłuszcz”.
  12. Wirować probówkę przy 400 x g przez 4 min; po wirowaniu osad musi mieć czerwony kolor (Rysunek 3A).
  13. Podczas wirowania umieścić sterylne sita 37 µM i 500 µM w sterylnej szalce Petriego z 5 mL BSA 1 mg/mL w PBS w celu wstępnego namoczenia przed użyciem.
  14. Po wirowaniu odlać nadsącz do probówki stożkowej 50 mL oznaczonej jako „odpady”. Dekantację przeprowadzać delikatnie, aby usunąć powierzchowny tłuszcz i nie zaburzyć osadu złożonego z MVF.
  15. Dodać 10 mL BSA 1 mg/mL w PBS do probówki zawierającej osad („strawiony tłuszcz”). Triturować (pipetować w górę i w dół) osad 2x.
  16. Unikać zbyt gwałtownego traktowania osadu, aby nie uszkodzić fragmentów.
  17. Umieścić sito 500 µM w nowej szalce Petriego nad plastikowym uchwytem do sita (Rysunek 3B).
  18. Nanieść 10 mL z probówki z „osadem strawionym” na sito 500 µM, wykonując ruchy po koncentrycznych okręgach (Rysunek 3C).
  19. Przemyć filtr dodatkowymi 5 mL BSA 1 mg/mL w PBS. Pożądane komórki przefiltrują się do szalki Petriego; należy zatem wyrzucić sito 500 µM, ale zachować przefiltrowany płyn w szalce.
  20. Umieścić sito 37 µM w nowej szalce Petriego nad plastikowym uchwytem do sita.
  21. Wymienić końcówkę pipety, aby wyeliminować wszelkie grudki przed użyciem sita 37 µM.
  22. Nanieść płyn uzyskany z pierwszej filtracji na sito 37 µM, wykonując ruchy po koncentrycznych okręgach.
  23. Przemyć filtr dodatkowymi 5 mL BSA 1 mg/mL w PBS. Pożądane komórki pozostaną na filtrze, dlatego należy wyrzucić przefiltrowany płyn, a zachować sito 37 µM.
  24. Wsunąć sito 37 µM do nowej szalki Petriego zawierającej 5 mL BSA 1 mg/mL w PBS.
  25. Wstrząsnąć szalką, uderzając nią o uchwyt stożkowy, aby uwolnić fragmenty. Nie wstrząsać zbyt mocno, aby płyn/komórki nie wypłynęły z szalki Petriego.
  26. Przepłukać filtr dodatkowymi 5 mL BSA 1 mg/mL w PBS. Pożądane komórki pozostaną w roztworze płynnym w szalce Petriego. Zachować sito 37 µM oraz płyn zawierający uwolnione fragmenty w szalce Petriego do kolejnych etapów.
  27. Przenieść płyn zawierający BSA i fragmenty do sterylnej probówki stożkowej 50 mL.
  28. Powtórzyć płukanie sita 37 µM jeszcze kilka razy (za każdym razem ~5 mL BSA 1 mg/mL w PBS) i dodać do probówki stożkowej. Powtarzać do momentu, aż całkowita zebrana objętość wyniesie ~15-20 mL. Ostatecznie pożądane komórki zostaną zebrane z roztworu płynnego w szalce Petriego i umieszczone w probówce stożkowej; w tym momencie, po ostatnim płukaniu, wyrzucić sito 37 µM, ale zachować płyn zawierający uwolnione fragmenty w probówce stożkowej 50 mL.
  29. Odciąć końcówkę końcówki pipety 200 µL za pomocą nożyczek. Delikatnie wstrząsnąć probówką 50 mL, pobrać dwie próbki po 20 µL i umieścić je w czystej szalce Petriego 35 mm.
  30. Policzyć liczbę fragmentów w każdej próbce w szalce Petriego, aby uzyskać całkowitą liczbę wyizolowanych MVF.
    Całkowita liczba fragmentów = Wzór na całkowitą zawiesinę: ((Suma próbki 1 + Suma próbki 2)/2) * 50 mL w probówce stożkowej.
  31. Wirować pozostały płyn zawierający uwolnione fragmenty w probówce stożkowej 50 mL przy 400 x g przez 4 min, aby zebrać MVF.

Schemat metody wirowania w celu oddzielenia tłuszczu; zestaw obejmuje filtr oraz układ szalek Petriego.
Rysunek 3: Izolacja MVF. (A) Po trawieniu tkanki tłuszczowej, przedstawienie oddzielenia MVF zawierającego osad oraz nadsącz po wirowaniu. (B) Układ materiałów do filtracji i wychwytywania MVF. (C) Ilustracja metody koncentrycznych kręgów dla etapów filtracji/płukania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Tworzenie hydrożeli fibrynowych

  1. Przykładowe obliczenia:
    UWAGA: Poniżej znajdują się obliczenia dla MVF wysianych w zagęszczeniu ~15,000-20,000 MVF/mL przy stosunku żeluyńymy fibrinogenu do trombiny wynoszącym 2:5, przy zastosowaniu fibrinogenu o stężeniu 20 mg/mL.
    1. Aby przygotować pięć żeli o objętości 250 µL, wymagana jest całkowita objętość 1,250 µL. Zawsze należy uwzględnić błędy pipetowania, dlatego należy przygotować ilość wystarczającą na 1,5 mL żelu.
      1. Objętość wymaganego fibrinogenu oblicza się w następujący sposób:
        Równanie proporcji chemicznej \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \) dla analizy objętościowej., X1 = 428,57 µL fibrinogenu
      2. Objętość wymaganej trombiny oblicza się w następujący sposób:
        Wzór na obliczenie proporcji, \(5/7 = X_2/1500 \, \mu\text{L}\), równanie bilansu stężeń., X2 = 1,071,43 µL trombiny
      3. Dla wymaganej objętości 428,57 µL przygotowuje się 500 µL fibrinogenu w następujący sposób:
        20 mg/mL * 0,5 mL = 10 mg fibrinogenu. Należy go resuspender w 500 µL DMEM
      4. Aby uzyskać każdy żel, należy obliczyć objętość fibrinogenu i trombiny w następujący sposób:
        1. Fibrinogen:
          Równanie proporcji, 2/7 = X₁/250μL, wzór na obliczenie rozcieńczenia, schemat edukacyjny., X1 = 71,43 µL fibrinogenu (w DMEM) + MVF
        2. Trombina:
          Równanie obrazujące proporcjonalność w rozcieńczeniu; 5/7 = X₂/250μL; przydatne w obliczeniach chemicznych., X2 = 178,57 µL trombiny
  2. Odlewanie żelu fibrynowego z MVF
    1. Odlać większość cieczy z odwirowanego osadu w 50 mL probówce stożkowej. Za pomocą pipety usunąć niewielką objętość cieczy zalegającą na krawędzi probówki.
    2. Dodać trombinę do dołków, w których będą przygotowywane żele (Rycina 4A).
    3. Odciąć końcówkę końcówki do pipety 200 µL i delikatnie resuspender MVF w fibrinogenie, aby uzyskać końcowe zagęszczenie ~15,000-20,000 MVF/mL po utworzeniu żelu.
    4. Odciąć końcówkę końcówki do pipety 200 µL i delikatnie nanieść mieszaninę MVF+fibrinogen do roztworu trombiny. Szybko pipetować w górę i w dół, aby zapewnić homogeniczność mieszaniny. Powtarzać czynność, aż wszystkie żele zostaną przygotowane (Rycina 4B).
    5. Umieścić płytkę(i) wielodołkową w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na ~15 min, aby umożliwić sieciowanie żelu (Rycina 4C).
    6. Dodać 100-150 µL pożywki wzrostowej do każdego dołka.

Schemat tworzenia hydrożelu fibrynowego: trombina, fibrynogen, MVFs; proces biochemiczny.
Rycina 4: Tworzenie żeli fibrynowych MVF. (A) Do odpowiedniej studni pipetuje się mieszaninę trombiny w proporcji 5/7. (B) Następnie, za pomocą przyciętego końcówki pipety (aby nie zakłócić MVFs), do studni pipetuje się mieszaninę fibrynogenu i MVF w proporcji 2/7, a następnie delikatnie miesza. (C) Na koniec wszystkie gotowe żele umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby hydrożel całkowicie stężał przed nałożeniem pożywki na wierzch. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

6. Warunki hodowli MVF

  1. W przypadku hodowli nieunaczynionej białej i beżowej tkanki tłuszczowej (+ GM Control), należy zastosować harmonogramy19 przedstawione na Rysunku 5.
  2. W przypadku hodowli unaczynionej białej i beżowej tkanki tłuszczowej (+ GM Control), należy zastosować harmonogramy19 przedstawione na Rysunku 6.
  3. Hydrożele powinny być utrzymywane w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez cały czas trwania hodowli w badaniu, przy czym pożywkę należy wymieniać co drugi dzień. W celu utrwalenia i przygotowania próbek do analizy należy odnieść się do wcześniej opublikowanych prac16,19,20.

Schemat osi czasu angiogenezy i adipogenezy przedstawiający fazy indukcji i dojrzewania GM, WAM i BAM.
Rysunek 5: Harmonogram tworzenia nieunaczynionej tkanki tłuszczowej. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Acosta et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat osi czasu angiogenezy: ścieżki GM-GM, GM-WAM, GM-BAM; proces indukcji i dojrzewania.
Rysunek 6: Harmonogram formowania unaczynionej tkanki tłuszczowej. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Acosta et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tkanka tłuszczowa beżowa/brunatna posiada kilka kluczowych fenotypowych cech morfologicznych: jest wielokomórkowa/zawiera małe krople lipidów, posiada dużą liczbę mitochondriów (co jest przyczyną jej charakterystycznego „brunatnego” wyglądu in vivo), co wiąże się z wysokim wskaźnikiem zużycia tlenu/bioenergetyką mitochondrialną, jest silnie unaczyniona, wykazuje zwiększoną lipolizę/stymulowany insuliną wychwyt glukozy oraz, co najważniejsze, wykazuje wysoką ekspresję białka rozprzęgającego 1 (UCP1), białka mitoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dziedzina inżynierii brunatno-beżowej tkanki tłuszczowej jest w dużej mierze niedojrzała 22,23,24,25,26,27,28, przy czym większość modeli tkanki tłuszczowej jest opracowywana dla białej tkanki tłuszczowej 8,22,31

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dr Acosta jest wspierany przez granty National Institutes of Health CA148724 a TL1TR002647. Dr Gonzalez Porras jest wspierany przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health, pod numerem nagrody F32-0DK122754. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health (5SC1DK122578) oraz Wydział Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Figury zostały częściowo stworzone za pomocą Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas aminokapronowySigma AldrichA2504-100GDodany do DMEM w stężeniu 1 mg / ml
Nożyczki z końcówkamiFisher scientific12-000-172Sterylizuj w autoklawie
Bovin Albumina surowicy (BSA)Milipor126575-10GMRozcieńczony w PBS do 4 mg / ml i 1 mg / ml
Kolagenaza typu 1Fisher scientificNC9633623Rozcieńczony do 6 mg/ml w BSA 4 mg/ml, Trawienie tłuszczu mielonego
DeksametazonThermo ScientificAC230302500Rozcieńczony w etanolu w stężeniu podstawowym 2 mg/ml
Podkładki jednorazoweFisher scientific23-666-062Do wchłaniania płynów podczas operacji
Nożyczki preparacyjneFisher scientific08-951-5Sterylizuj w autoklawie
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium (DMEM)Fisher naukowy11885092
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Mieszanka pożywki i składników odżywczych Szynka F-12 (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
Surowica bydlęca płodu Fisher scientific16140089Dodano DMEM do 20% v/v.
Fibrynogen Sigma AldrichF8630-25GRozpuszczony w DMEM w stężeniu 20 mg/mL, Białko znajdujące się w osoczu krwi i główny składnik kolby hydrożelowej
, 250 mlFisher scientificFB500250Pozwala na trawienie tłuszczu przy użyciu dużej powierzchni
KleszczeFisher scientific50-264-21Sterylizować w autoklawie, Do pracy z tkankami i filtrami
ForskolinSigma AldrichF6886Rozcieńczony w etanolu przy stężeniu podstawowym 10 mM
Human MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsW obecnym badaniu zastosowano ludzkie MVF (hMVF) wyizolowane od trzech różnych pacjentów (52-, 54- i 56-letnie kobiety).
Indometacyna Sigma AldrichI7378Rozcieńczony w etanolu w stężeniu podstawowym 12,5 mM
Insulina z trzustki świniSigma AldrichI5523Rozcieńczony w 0,01 N HCl przy stężeniu podstawowym 5 mg/ml
MycoZapFisher scientificNC9023832Dodany w DMEM do 0,2% w/v, Mycoplasma Prophylactictic 
Pennycylina/Streptomycyna (10 000 U/ml)Fisher Scientific15140122Dodano do DMEM do 1% v/v.
szalki Petriego, polistyren (100 mm x 15 mm).Fisher scientific3510293 do usuwania naczyń krwionośnych i mielenia mięsa, 8 (pokrywka) do wstępnego namaczania sit i 8 (naczynie) do stosowania podczas filtrowania za pomocą 500 lub 37 &mikro; M sita
szalki Petriego, polistyren (35 mm x 10 mm).Fisher scientific50-202-036Do liczenia fragmentów
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS)Fisher scientific14-190-250Rozcieńczony do 1x sterylną wodą dejonizowaną.
Maszynki do strzyżenia szczurów (trymer do zwierząt Andwin Mini Arco)Fisher naukowyNC0854141
RosiglitazoneFisher R0106200MGRozcieńczony w DMSO przy stężeniu zapasu 10 mM
NożyczkiFine Science Tools14059-111 do początkowego nacięcia, 1 do nacięcia najądrza, 1 do przycinania końcówki
Ekran  37 &mikro; M Carolina Biological Supply Company652222RPocięte na 3-calowe zaokrąglone kwadraty i wysterylizowane w tlenku etylenu, Uwięzienie fragmentów i usuwanie bardzo małych fragmentów / pojedynczych komórek i zanieczyszczeń
Screen 500 µ M Carolina Biological Supply Company652222FPocięte na 3-calowe zaokrąglone kwadraty i wysterylizowane w tlenku etylenu, Usuwa większe fragmenty/zanieczyszczenia
Ząbkowany HemostatFisher scientific12-000-171Sterylizuj w autoklawie, Do zaciskania skóry przed nacięciem
Filtr Steriflip 0,22 μ m MilliporeSE1M179M6
TrombinFisher scientific6051601KURozcieńczony w wodzie dejonizowanej do 10 U/ml, Stosowany jako czynnik krzepnący zamieniający fibrynogen w fibrynę
Hormon tarczycy (T3)Sigma AldrichT2877Rozcieńczony w 1N NaOH przy stężeniu zapasowym 0,02 mM
Szczury tłuszczowe cukrzycowe (ZDF) - otyłe (FA/FA) lub chude (FA/+) samce Charles Riverhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		Otrzymywany z Charles River (Wilmington, MA). Szczury zostały nabyte w wieku 4 tygodni i karmione Puriną 5008 aż do eutanazji (15-19 tygodnia życia). Poziomy glukozy (krew z bocznej żyły odpiszczelowej) były większe niż 300 mg/dl u wszystkich szczurów FA/FA wykorzystanych w badaniu. Wszystkie zwierzęta były trzymane w środowisku o kontrolowanej temperaturze z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności i karmione ad libitum.
naukowy

Bibliografia

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114(2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Unaczyniona tkanka t uszczowain ynieria tkanki t uszczowejbe owa tkanka t uszczowatrawienie kolagenazmikroskopia konfokalnar nicowanie adipocyt wtempo zu ycia tlenu
Trójwymiarowa hodowla unaczynionej termogenicznej tkanki tłuszczowej z fragmentów mikronaczyniowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.