Artykuł metodologiczny

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

DOI:

10.3791/64655

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2UMR CNRS 7369, Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire-MEDyC, Université de Reims Champagne-Ardenne Reims, 3BASF Beauty Care Solutions, 4Service Biochimie-Pharmacologie-Toxicologie, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Reims

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasyczne analizy pośredniej komunikacji między różnymi typami komórek wymagają użycia kondycjonowanych mediów. Co więcej, produkcja kondycjonowanych pożywek pozostaje czasochłonna i daleka od stanów fizjologicznych i patologicznych. Chociaż na rynku dostępnych jest kilka modeli kohodowli, pozostają one ograniczone do określonych testów i dotyczą głównie dwóch typów komórek.

Tutaj używane są drukowane w 3D wkładki, które są kompatybilne z wieloma testami funkcjonalnymi. Wkład umożliwia rozdzielenie jednego dołka płytki 6-dołkowej na cztery komory. Można ustawić szeroki zakres kombinacji. Ponadto w każdej ścianie przedziałów zaprojektowano okienka, dzięki czemu możliwa jest potencjalna komunikacja międzykomórkowa między każdym przedziałem w pożywce hodowlanej w sposób zależny od objętości. Na przykład parakrynna komunikacja międzykomórkowa może być badana między czterema typami komórek w jednej warstwie, w 3D (sferoidy) lub poprzez połączenie obu. Ponadto w tej samej komorze można wysiewać mieszankę różnych typów komórek w formacie 2D lub 3D (organoidy). Brak dna w wkładkach wydrukowanych w 3D pozwala na zwykłe warunki hodowli na płytce, możliwe powlekanie na płytce zawierającej wkładkę oraz bezpośrednią wizualizację za pomocą mikroskopii optycznej. Wiele przedziałów daje możliwość niezależnego zbierania różnych typów komórek lub używania, w każdym przedziale, różnych odczynników do ekstrakcji RNA lub białek. W tym badaniu przedstawiono szczegółową metodologię wykorzystania nowej wkładki wydrukowanej w 3D jako systemu kohodowli. Aby zademonstrować kilka możliwości tego elastycznego i prostego modelu, w nowych wkładkach wydrukowanych w 3D przeprowadzono wcześniej opublikowane testy funkcjonalne komunikacji komórkowej, które okazały się powtarzalne. Drukowane w 3D wkładki i konwencjonalna hodowla komórkowa przy użyciu kondycjonowanych pożywek doprowadziły do podobnych wyników. Podsumowując, wkładka wydrukowana w 3D jest prostym urządzeniem, które można dostosować do wielu modeli kokultur z przylegającymi typami komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, komórki komunikują się ze sobą albo bezpośrednio (kontakt komórkowy), albo pośrednio (poprzez wydzielanie molekuł). Aby zbadać komunikację komórkową, można opracować różne modele kohodowli, takie jak bezpośrednia kokultura (różne typy komórek są w bezpośredniej interakcji w tym samym dołku) i kokultura z podziałem na przedziały (różne typy komórek są w pośredniej interakcji w różnych przedziałach systemu hodowli)1. Co więcej, kondycjonowane pożywki mogą być stosowane w systemach kohodowli, w których pośrednia interakcja jest możliwa dzięki wydzielanym cząsteczkom zawartym w kondycjonowanym pożywce typu komórki efektorowej, które są przenoszone do odpowiadającej komórki typu 1.

W przypadku badań nad komunikacją komórkową w warstwie parakrynnej, pośrednie systemy kohodowli dostarczają modeli, które silnie odzwierciedlają interakcje komórkowe in vivo. Systemy kokultury pośredniej zostały opracowane i skomercjalizowane, co pozwoliło na ustanowienie modeli współkultury pośredniej2,3. Niestety, większość pośrednich systemów kokultur zapewnia tylko dwa przedziały. Inne pośrednie systemy kokultur zapewniają wiele przedziałów, ale są one mniej skalowalne w porównaniu z systemem opisanym w niniejszym manuskrypcie. Niektóre z nich nie pozwalają na klasyczną wizualizację pod mikroskopem, a często prezentują konkretne metody aplikacji. W kilku badaniach komunikacja parakrynna między różnymi typami komórek jest badana przez model mediów warunkowych4,5,6,7. Jest to łatwiejszy sposób badania w porównaniu z pośrednimi systemami współhodowli, ponieważ nie wymaga ustanawiania konkretnych metod ani materiałów1. Z drugiej strony, przygotowanie kondycjonowanych pożywek jest czasochłonne i dostarcza informacji tylko na temat jednokierunkowej sygnalizacji komórkowej (efektor do odpowiedzi)1.

W tym artykule zaproponowano nowy, prosty sposób badania komunikacji komórkowej. Umożliwiając łączenie kilku typów komórek w bezpośredniej lub pośredniej interakcji oraz w formatach 2D lub 3D, drukowane wkładki oferują wiele korzyści w łatwym tworzeniu modeli współhodowli. Przystosowana do umieszczenia w dołkach płytek 6-dołkowych, wkładka wydrukowana w 3D jest okrągła i umożliwia podział studni na cztery komory (dwie duże komory i dwie małe komory; Rysunek 1A). Wkładki drukowane w 3D charakteryzują się brakiem dna. W ten sposób ogniwa są w bezpośrednim kontakcie z płytką, na której umieszczona jest wkładka. Ponadto każda komora może być powlekana niezależnie od pozostałych. Co więcej, zachowanie komórek można łatwo śledzić pod mikroskopami optycznymi. Obecność okien komunikacyjnych w każdej ścianie wkładu pozwala na dodanie, w optymalnym czasie, wspólnego medium do wykonywania różnych eksperymentów kokultury. Można przeprowadzić liczne kombinacje kohodowli w celu zbadania bezpośredniej i/lub pośredniej komunikacji między kilkoma typami komórek. Na przykład można zaprojektować model pośredniej kohodowli między czterema różnymi typami komórek w monowarstwie i/lub 3D (sferoidy). Połączenie bezpośrednich i pośrednich modeli kohodowli można również przeprowadzić poprzez mieszanie różnych typów komórek w tym samym komorze. Wpływ złożonych struktur (organoidów, eksplantatów tkanek itp.) na różne typy komórek może być kolejnym przykładem modeli, które można wykonać. Co więcej, drukowane w 3D wkładki są kompatybilne z testami funkcjonalnymi biologii komórki (proliferacja, migracja, tworzenie pseudotubek, różnicowanie itp.) oraz z testami biochemicznymi (ekstrakcja DNA, RNA, białka, lipidów itp.). Wreszcie, drukowane w 3D wkładki zapewniają szeroki zakres schematów eksperymentalnych modeli kokultur z możliwością jednoczesnego łączenia różnych testów w tym samym eksperymencie w różnych przedziałach.

Niektóre pojemności wkładek wydrukowanych w 3D są prezentowane, aby potwierdzić je jako szybki i łatwy w użyciu model współkultury. W porównaniu z wcześniej opublikowanym badaniem przeprowadzonym na temat komunikacji komórek parakrynnych, wykazano zdolność wydrukowanych w 3D wkładek do bycia cennym modelem kohodowli. Aby ocenić ten punkt, porównano regulację proliferacji i migracji komórek śródbłonka przez keratynocyty między systemem wkładek drukowanych w 3D a klasycznym systemem wykorzystującym kondycjonowane pożywki. Wkładki drukowane w 3D pozwalają na szybkie uzyskanie podobnych rezultatów w porównaniu z konwencjonalnym systemem wykorzystującym kondycjonowane media. Rzeczywiście, drukowane w 3D wkładki zapewniają solidny model do badania interakcji komórek w obu kierunkach bez konieczności produkcji kondycjonowanych pożywek i z możliwością równoległego wykonywania testów proliferacji i migracji w tym samym eksperymencie.

Podsumowując, w tym artykule zaproponowano nowy i gotowy do użycia model do badania komunikacji komórkowej. Kompatybilne ze wszystkimi przylegającymi typami komórek, drukowane w 3D wkładki pozwalają na wykonywanie licznych kombinacji kohodowli, które mają na celu zbliżenie się do warunków in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wkładki 3D (Rysunek 1A) są zamawiane komercyjnie i są drukowane przy użyciu żywicy fotopolimerowej, która jest biokompatybilna z hodowlą komórkową i autoklawowaniem (patrz Tabela Materiałów). W tej sekcji opisano szczegółowy protokół ustanawiania modelu kokultury przez wstawki (patrz Rysunek 1B). Podano również kilka przykładów zastosowań.

1. Umieszczenie wysterylizowanej wkładki w płytkach 6-dołkowych

  1. Wymieszaj dwa składniki dostarczone w zestawie (patrz tabela materiałów), krzem spożywczy (odczynnik A) i katalizator (odczynnik B), w stosunku 10:1 (v/v) zgodnie z instrukcjami producenta. (Rysunek 1Ba). Użyj szpatułki sterylizowanej 70% etanolem, aby wymieszać dwa składniki.
    UWAGA: Objętość przygotowywanej mieszaniny krzemu zależy od liczby wkładek do zamocowania. Nadmiar katalizatora może spowodować zbyt szybkie krzepnięcie mieszaniny krzemu.
  2. Nałóż wkładki na silikonową mieszankę za pomocą pęsety tak, aby mieszanina była równomiernie rozprowadzona na dolnej krawędzi wkładek (Rysunek 1Bb). Umieść wkładki w dołkach płytki 6-dołkowej i delikatnie dociśnij wkładki, aby upewnić się, że wkładki są w bliskim kontakcie z płytką, aby uniknąć wycieku pożywki do hodowli komórkowej (Rysunek 1Bc).
  3. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C, aby wspomóc proces krzepnięcia krzemu przez 1 h.
    UWAGA: Czas krzepnięcia zależy od ilości dodanego katalizatora.
  4. Po zestaleniu wysterylizować płytki z wkładkami, zanurzając je w kąpieli etanolowej 70% na 30 min do 1 h.
  5. Alkohol należy odpipetować i pozostawić płytkę do wyschnięcia (z otwartą pokrywą) na noc w kapturze do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Alkohol musi zostać całkowicie odparowany przed wykonaniem następnego kroku, aby uniknąć utrwalenia komórek i toksyczności. Gotowa do użycia płytka zawierająca wkłady może być przechowywana przez kilka dni przed użyciem w suchych i sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej.

2. Powłoki takie jak poli-L-lizyna lub poli-HEMA (Opcjonalny krok)

UWAGA: W tym eksperymencie nie przeprowadza się powlekania, a kroki są podane w celu poinformowania o możliwości pokrycia wkładek.

  1. Przygotuj roztwór powlekający zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Weź pod uwagę objętość 200-400 μl dla największych przegródek i objętość 50-100 μl dla najmniejszych przegródek do powlekania wkładki. Dodaj roztwór powlekający do poszczególnych przegródek.
  3. Pozostaw powłokę do wyschnięcia zgodnie ze wskazaniami producenta w sterylnych warunkach.

3. Rozmieszczenie komórek

  1. Hodowlę keratynocytów zewnętrznej osłonki korzenia (KORS) i ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry (HDMEC) zgodnie z zaleceniami producenta. Przygotować zawiesinę komórkową, gdy komórki osiągną zbieżność.
    1. Wyrzucić pożywkę z kolb i dodać 5 ml trypsyny w celu odłączenia komórek (patrz tabela materiałów).
    2. Umieścić kolbę zawierającą KORS w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5 minut. Inkubować kolbę zawierającą HDMEC przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Roztwór trypsyny zawierający KORS zmieszać z 5 ml pożywki z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCM) uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i czynnikami wzrostu (podłoże podstawowe z zestawem suplementów, patrz tabela materiałów). Roztwór trypsyny zawierający HDMEC zmieszać z 5 ml pożywki z komórek śródbłonka (ECM) uzupełnionej 5% FBS i czynnikami wzrostu (patrz tabela materiałów).
    4. Przenieś komórki do 15 ml sterylnej stożkowej probówki. Odwirować zawiesiny KORS i HDMEC o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml odpowiedniej pożywki.
    6. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl barwnika błękitu trypanowego (patrz tabela materiałów).
    7. Dodać 10 μl mieszanki do komory szkiełka liczącego.
    8. Włóż szkiełko zliczające do systemu liczenia komórek (patrz tabela materiałów) i wykryj numer komórki oraz żywotność.
    9. Przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 0,5 x 105 komórek/ml w odpowiednim podłożu.
      UWAGA: Jeśli różne typy komórek wymagają różnych czasów przylegania i/lub osiągnięcia idealnej konfluencji, wysiewanie komórek można wykonać w różnych punktach czasowych w zależności od typu komórek.
  2. Rozprowadzić 800 μl do 1 ml zawiesiny komórek do poszczególnych dużych komór i 100-150 μl do poszczególnych małych komór za pomocą pipety.
    1. Wysiewaj KORS w 1 x 105 komórek/ml w MSCM uzupełnionym 5% FBS i czynnikami wzrostu w jednym z dużych kompartmentów.
    2. Nasiona HDMEC w ECM uzupełnione 5% FBS i czynnikami wzrostu w ilości 2,5 x 103 komórek/ml w małych przedziałach i 1,25 x 105 komórek/ml w drugiej dużej komorze.
      UWAGA: Test proliferacji można przeprowadzić w małych kompartmentach, a testy migracji i żywotności można przeprowadzić w dużych komorach. Zagęszczenie wysiewanych komórek zostało zoptymalizowane zgodnie z zaleceniami producenta. Takie stężenie pozwala na dobrą żywotność komórek po 24-48 godzinach inkubacji.
  3. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 lub w zwykłych warunkach, aby umożliwić przyleganie komórek i/lub dojrzewanie.
    UWAGA: Inkubować komórki przez 24-48 godzin bez zmiany pożywki. W razie potrzeby medium w komorach można zmienić niezależnie.

4. Implementacja kokultury ( Rysunek 1Bd)

UWAGA: Implementacja kokultury odpowiada czasowi, w którym dodawane jest wspólne medium. Dodanie unikalnego podłoża dla wszystkich typów komórek w różnych przedziałach zapewnia możliwość parakrynnej komunikacji między komórkami ze względu na obecność okien komunikacyjnych (jajowatych otworów w ściankach wkładek wydrukowanych w 3D). Aby zaimplementować kokulturę, wykonaj kroki 4.1–4.3.

  1. Opróżnij pożywkę hodowlaną z różnych przegródek wkładek za pomocą pipety. W przypadku hodowli komórek sferoidalnych 3D pożywkę należy bardzo delikatnie wyrzucić.
  2. Przepłukać komórki 1 ml ciepłego PBS o temperaturze 37 °C w dużych komorach i 200 μl ciepłego PBS o temperaturze 37 °C w małych komorach. Zapewnij delikatne mycie, aby nie odczepić komórek.
  3. Dodaj 3 ml popularnego podłoża wybranego tak, aby było kompatybilne ze wszystkimi typami komórek.
    UWAGA: W tym badaniu stosuje się podstawowy ECM (bez FBS i czynników wzrostu). Upewnij się, że nośnik zakrywa wszystkie przedziały (poziom powyżej okien komunikacyjnych [jajowate otwory w ścianach], jak pokazano na Rysunek 1A).
  4. Umieścić płytkę zawierającą kokultury w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24-48 godzin.

5. Obserwacja, liczenie i skrobanie komórek

  1. Obserwuj morfologię i policz liczbę komórek różnych kompartmentów podczas eksperymentu pod mikroskopem optycznym po 24-48 godzinach inkubacji.
    UWAGA: Oczekiwana liczba komórek zależy od użytych typów komórek (rozmiar, morfologia itp.) oraz od wielkości komory. W tym eksperymencie w dużych komorach liczy się od 0,5 x 106-1 x 106 KORS / ml do 0,25 x 10 6-0,75 x 106 HDMEC / ml.
  2. Odłącz komórki za pomocą trypsyny do liczenia zawiesiny komórek.
    UWAGA: W przypadku roztworu do oddzielania komórek należy wziąć pod uwagę objętość 100-500 μl dla największych przegródek i objętość 10-50 μl dla najmniejszych przegródek.
  3. Sprawdź żywotność, stosując barwienie błękitem trypanowym (patrz kroki 3.1.6-3.1.8).

6. Czyszczenie wkładek do recyklingu

  1. Wyjmij wkładki z płytki 6-dołkowej pod koniec eksperymentu, lekko przekręcając (Rysunek 1Be).
  2. Usuń silikon z wkładek, ściągając go. W razie potrzeby użyj szpatułki, aby usunąć pozostały silikon przyklejony do ścianek wkładek (Rysunek 1Bf).
  3. Umyj wkładki konwencjonalnymi detergentami do hodowli komórkowych i środkami czyszczącymi (example podane w Tabeli Materiałów).
  4. Wysterylizuj wkładki do wykorzystania w przyszłości w autoklawie (cykl stały, 121 °C przez 20 min) lub zanurzając je w kąpieli 70% etanolowej na 1 h.
    UWAGA: Na tym etapie opisano dwa przykłady możliwych testów (testy proliferacji i migracji) przy użyciu wkładek wydrukowanych w 3D (Rysunek 1Bd).

7. Test proliferacji komórek - Test WST-1

  1. Wykonaj kroki 1-3.1, aby wyhodować komórki.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z krokiem opisanym w tej sekcji, aby wdrożyć system kohodowli w celu zbadania wpływu sekretomu KORS na proliferację HDMEC. Komórki KORS służą do porównywania danych opublikowanych wcześniej8.
    1. Wysiewaj KORS w 1 x 105 komórek/ml w mezenchymalnym podłożu komórek macierzystych (MSCM) uzupełnionym 5% FBS i czynnikami wzrostu w dużych kompartmentach.
    2. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny.
    3. Zasiać HDMEC w pożywce z komórkami śródbłonka (ECM) uzupełnionymi o 5% FBS i czynniki wzrostu w ilości 2,5 x 103 komórek/ml w małych przedziałach.
    4. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24-48 godzin.
    5. Wyrzucić pożywkę ze wszystkich komór i wdrożyć system kohodowli poprzez dodanie 3 ml nieuzupełnionej podstawowej pożywki ECM (wspólna pożywka do hodowli komórkowych dla wszystkich komór wkładek wydrukowanych w 3D).
  2. Rozcieńczyć WST-1 w pożywce ECM do hodowli komórek powszechnych (końcowe rozcieńczenie 1:10) w celu przygotowania roztworu WST-1.
    UWAGA: Dla objętości roztworu WST-1 należy przygotować co najmniej 500 μl dodatkowego roztworu do ślepej próby.
  3. Wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z wkładki przez pipetowanie.
  4. Dodaj roztwór WST-1 do wybranych przegródek (150 μl dla małych przegródek i 600 μl dla dużych komór). Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. Po optymalnym 30-minutowym czasie inkubacji komórek przenieś 100 μl pożywki inkubacyjnej z każdego warunku na 96-dołkową płytkę.
  6. Ocenić reakcję kolorymetryczną za pomocą czytnika mikropłytek w zakresie od 420 nm do 480 nm.
    1. Umieść płytkę na czytniku mikropłytek i kliknij przycisk edytuj nowy protokół.
    2. Należy wybrać konkretny typ płytki 96-dołkowej (patrz Tabela materiałów) i długość fali 450 nm.
    3. Kliknij przycisk rozpocznij pomiar.

8. Test migracji komórek - urządzenie z dwiema komorami migracyjnymi

  1. Wykonaj kroki 1-3.1, aby wyhodować komórki.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w tej sekcji, aby wdrożyć system kohodowli w celu zbadania wpływu sekretomu KORS na proliferację HDMEC.
    1. Wysiewaj KORS w 1 x 105 komórek/ml w MSCM uzupełnionym 5% FBS i czynnikami wzrostu w jednym z dużych kompartmentów.
    2. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny.
    3. Umieść urządzenie z dwiema komorami migracyjnymi w drugiej dużej komorze wkładek.
    4. Wysiewaj HDMEC w ECM uzupełnionym 5% FBS i czynnikami wzrostu w 7 x 105 komórek / studzienka urządzenia z dwiema komorami migracyjnymi.
    5. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 24 godziny.
    6. Wyrzuć pożywkę i urządzenie z dwiema komorami migracyjnymi po 24 godzinach lub w optymalnym czasie, w zależności od typu komórki, która migruje. Wdrożyć system kohodowli poprzez dodanie 3 ml nieuzupełnionego podstawowego ECM.
      UWAGA: Postępuj ostrożnie, aby nie odłączyć komórek. Jeśli komórki są naprawdę wrażliwe na oderwanie wywołane dodaniem wspólnej pożywki, po dodaniu wspólnej pożywki zdejmij urządzenie z dwiema komorami migracyjnymi.
  2. Obserwuj i zrób zdjęcie powierzchni pokrytej przez komórki w różnych punktach czasowych pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Zdjęcia są wykonywane za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym (patrz Tabela materiałów). Zdjęcia są zapisywane w pamięci USB, a następnie analizowane przez wtyczkę narzędzia do gojenia ran w oprogramowaniu (patrz Spis materiałów).
  3. Zmierz odsłoniętą powierzchnię za pomocą klasycznego oprogramowania do analizy ilościowej.
    1. Otwórz obraz w oprogramowaniu i aktywuj narzędzie do gojenia ran dostępne na liście makr.
    2. Kliknij przycisk m, aby zmierzyć odsłoniętą powierzchnię obrazu migracji.
    3. Odsłoniętą powierzchnię oblicza się według następującego wzoru:
      Procent pokrycia = ([średni obszar bez komórek w T0 − obszar bez komórek w czasie T]/średni obszar bez komórek w T0) × 100.
      UWAGA: Wkładki drukowane w 3D są całkowicie przystosowane do większości technik biologii komórki (takich jak test tworzenia pseudotubek, hodowle 3D) oraz do eksperymentów biochemicznych (takich jak ekstrakcja DNA, RNA, białka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisano zoptymalizowany system kohodowli, aby uzyskać solidne, wiarygodne i znaczące dane porównywalne z klasycznymi metodami dzięki użyciu kondycjonowanych pożywek. Drukowane w 3D wkładki naśladują warunki mikrośrodowiska in vivo różnych typów komórek w interakcji, pokonując trudności i czasochłonną produkcję kondycjonowanych pożywek przed eksperymentami. Wcześniej opublikowane badanie zostało ponownie przeprowadzone w celu przeanalizowania pośrednich interakcji między dwoma typami komórek ob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pośrednia komunikacja komórkowa jest powszechnie badana przy użyciu kondycjonowanych pożywek lub urządzeń systemu kohodowli. Przygotowanie kondycjonowanych pożywek jest czasochłonne na wczesnym etapie eksperymentów, a metoda ta ogranicza się do jednostronnych analiz efektów. Poprzednie badanie przeprowadzone przez Colin-Pierre i wsp.8 przy użyciu kondycjonowanych pożywek przeprowadzono na pośredniej komunikacji komórkowej między dwoma typami komórek (HDMEC i KORS). Dane z tego poprzednieg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone we współpracy z BASF Beauty Care Solutions. Pani Charlie Colin-Pierre jest doktorantką finansowaną przez BASF /CNRS.

Pragniemy podziękować Panu Mehdi Sellami za koncepcję wkładek drukowanych w 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AutoklawGetingeAPHPCykl stały, 121 ° C przez 20 min
Biomed ClearFormlabsRS-F2-BMCL-01Wycisk wykonany przez firmę 3D-Morphoz (Reims, Francja)
Detergenty do hodowli komórkowych TounettA18590/0116
Odczynnik do proliferacji komórek WST-1Roche11,64,48,07,001
Szkiełko licząceNanoEnTekEVE-050
Wkładka do hodowli 2 dołki w μ-naczyniu 35 mmIbidi80206urządzenie z dwiema komorami migracyjnymi. 
Pożywka dla komórek śródbłonkaScienCell1001Pożywka podstawowa +/- 25 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 0025), 5 ml suplementu na wzrost komórek śródbłonka (EKGS, 1052) i 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny (P/S, 0503).
EVE Automatyczny licznik komórek NanoEnTekNESCT-EVE-001E 
EVOS XL CoreFisher ScientificAMEX120010-krotne powiększenie
Zestaw odczynników i katalizatorów do żywności silikonowejArtificinaRTV 3428 A i B (10:1)
Drukarka FORM 3BFormlabsPKG-F3B-WSVC-DSP-BASICWycisk wykonany przez firmę 3D-Morphoz
Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry (HDMEC)ScienCell2000
Keratynocyty zewnętrznej osłonki korzenia (KORS)ScienCell2420
Macro Wound Healing Tool SoftwareImageJOprogramowanie służące do pomiaru odsłoniętej powierzchni (dla testy migracji)
Pożywka dla mezenchymalnych komórek macierzystych ScienCell7501Pożywka podstawowa +/- 25 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, 0025), 5 ml suplementu na wzrost mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGS, 7552) i 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny (P/S, 0503)
Czytnik mikropłytek Spectro star NANOBMG LabtechBMG Oprogramowanie BMG LABTECH
PBSPromocellC-40232Bez Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue StainNanoEnTekEBT-001
Trypsyna / EDTAPromocellC-41020Inkubacja KORS w temperaturze 37 & stopni; C z 5% CO2 przez 5 min. Inkubacja HDMEC przez 5 minut w temperaturze pokojowej
96-dołkowa płytka Nunclon Delta SurfaceThermoscientific167008

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
  2. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).
  3. Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).
  4. Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
  5. Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).
  6. Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  7. Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
  8. Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).
  9. Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
  10. Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).
  11. Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
  12. Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
  13. Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).
  14. Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D Printed InsertCell Co CultureIntercellular CommunicationConditioned MediaKeratinocyte CultureEndothelial CellsSpheroid CultureOrganoid CultureCell Migration AssayOptical Microscopy

Powiązane artykuły