Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wielofunkcyjnych limfocytów T u dzieci zaszczepionych szczepionką przeciwko japońskiemu zapaleniu mózgu za pomocą techniki cytometrii przepływowej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64671

⸱

23 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, National Center for Children’s Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of Pediatric Rehabilitation, Beijing Boai Hospital, School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, China Rehabilitation Research Center, 4Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół łączy stymulację ex vivo i cytometrię przepływową do analizy profili wielofunkcyjnych limfocytów T (TPF) w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) u dzieci zaszczepionych wirusem japońskiego zapalenia mózgu (JEV). Metoda wykrywania i schemat kolorów cytometrii przepływowej TPF specyficznych dla JEV zostały przetestowane w celu zapewnienia odniesienia dla podobnych badań.

Streszczenie

Odporność oparta na limfocytach T odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu infekcji flawiwirusowej, zarówno po szczepieniu, jak i po naturalnej infekcji. "Jakość" limfocytów T musi być oceniana na podstawie funkcji, a wyższa funkcja wiąże się z silniejszą ochroną immunologiczną. Limfocyty T, które mogą jednocześnie wytwarzać dwie lub więcej cytokin lub chemokin na poziomie pojedynczej komórki, nazywane są wielofunkcyjnymi limfocytami T (TPFs), które pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych poprzez różne mechanizmy molekularne w celu ekspresji markerów degranulacji (CD107a) i wydzielania interferonu (IFN)-γ, czynnika martwicy nowotworu (TNF)-α, interleukiny (IL)-2 lub białka zapalnego makrofagów (MIP)-1α. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że TPFsą ściśle związane z utrzymaniem długotrwałej pamięci immunologicznej i ochroną oraz że ich zwiększony udział jest ważnym markerem odporności ochronnej i jest ważny w skutecznej kontroli infekcji wirusowej i reaktywacji. Ocena ta dotyczy nie tylko specyficznych odpowiedzi immunologicznych, ale także oceny krzyżowych odpowiedzi immunologicznych. Tutaj, biorąc za przykład wirusa japońskiego zapalenia mózgu (JEV), przetestowano metodę wykrywania i schemat kolorów cytometrii przepływowej specyficznych dla JEV TPFwytwarzanych przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej dzieci zaszczepionych przeciwko japońskiemu zapaleniu mózgu, aby zapewnić odniesienie dla podobnych badań.

Wprowadzenie

Wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV) jest ważnym wirusem przenoszonym przez komary, należącym do rodzaju Flavivirus w rodzinie Flaviviridae1. Wiele krajów Azji i Pacyfiku od dawna boryka się z ogromnymi wyzwaniami związanymi ze zdrowiem publicznym ze względu na ogromne obciążenie chorobami spowodowanymi przez japońskie zapalenie mózgu (JE), ale sytuacja uległa radykalnej poprawie wraz z rosnącą dostępnością różnych rodzajów szczepień2. Adaptacyjne ochronne odpowiedzi immunologiczne wywołane przez naturalną infekcję lub szczepienie przyczyniają się do zapobiegania i regulacji przeciwwirusowej. Odporność humoralna i odporność komórkowa są klasyfikowane jako odporność adaptacyjna, a indukcja tej pierwszej zawsze była uważana za kluczową strategię w projektowaniu szczepionek, choć w przeszłości ze stosunkowo ograniczonym zrozumieniem3. Jednak rola odporności za pośrednictwem limfocytów T w ograniczaniu rozprzestrzeniania się flawiwirusa i jego usuwania jest coraz bardziej skoncentrowana i szeroko badana4. Co więcej, odporność limfocytów T jest nie tylko niezbędna w odpowiedziach przeciwwirusowych specyficznych dla JEV, ale także odgrywa znaczącą rolę w ochronie krzyżowej przed wtórnym zakażeniem heterologicznymi flawiwirusami, co wykazano w poprzednich badaniach5. Spekuluje się, że efekt ten może ominąć potencjalne efekty wzmacniające za pośrednictwem przeciwciał w infection5. Warto zauważyć, że taka krzyżowa odporność limfocytów T jest ważna, zwłaszcza przy braku szczepionek i leków przeciwwirusowych przeciwko flawiwirusom. Chociaż przeprowadzono wiele badań w celu określenia udziału limfocytów T w zakażeniu JEV w odniesieniu do limfocytów T CD4 + i CD8 + 6,7, odpowiednie linie wydzielające cytokiny i ich funkcjonalne zróżnicowanie pozostają nieokreślone, co oznacza, że wyjaśnienie dokładnych funkcji limfocytów T pomocniczych i zabójczych jest utrudnione.

Skala ich obrony przeciwwirusowej określa jakość odpowiedzi limfocytów T. Limfocyty T CD4 + lub CD8 +, które mogą zgodnie przekazywać dwie lub więcej funkcji, w tym wydzielanie cytokin i degranulację, są charakteryzowane jako wielofunkcyjne limfocyty T (TPFs) po specyficznej stymulacji na poziomie pojedynczej komórki 8. Limfocyty T CD4 +, które wytwarzają jedną lub wiele cytokin, mogą mieć różne efekty i pamięć immunologiczną. Na przykład limfocyty T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ z większym prawdopodobieństwem wytworzą długoterminową skuteczną odpowiedź ochronną niż limfocyty T IL-2+ CD4+9, co może być używane jako ważny parametr w ocenie efektu szczepienia. Częstość występowania limfocytów T IL-2 + IFN-γ + CD4 + jest zwiększona u pacjentów z długotrwałym brakiem progresji zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS), podczas gdy limfocyty T CD4 + u pacjentów z progresją AIDS są bardziej skłonne do wytwarzania samego IFN-γ ze względu na promujący wpływ IL-2 na proliferację limfocytów T10. Ponadto wykazano, że podzbiór IL-2 + IFN-γ + TNF-α + przeżywa długotrwałe in vivo i synergistycznie promuje funkcję zabijania11. Chociaż limfocyty T CD8 + są bardziej skłonne do wykazywania aktywności cytotoksycznej, niektóre limfocyty T CD4 + są również wyposażone w aktywność cytotoksyczną jako pośrednio wykrywaną ekspresję powierzchniowych cząsteczek CD107a12. Ponadto niektóre podzbiory limfocytów T wyrażają chemokinę MIP-1α, która jest często wydzielana przez monocyty w celu udziału w rekrutacji neutrofili za pośrednictwem limfocytów T13. Podobnie, CD8+ TPFs może być również używany do scharakteryzowania wszechstronności powyższych markerów. Badania wykazały, że strategia prime-boost może skutecznie wywołać przedłużony okres działania ochronnego TPF13, co może zwiększyć ochronę wywołaną przez szczepienie. Główną cechą w badaniu układu odpornościowego jest zdolność limfocytów T pamięci do ułatwiania silniejszych, szybszych i skuteczniejszych odpowiedzi na wtórne wyzwania wirusowe niż naiwne limfocyty T. Limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) i limfocyty T pamięci centralnej (TCM) są ważnymi podzbiorami limfocytów T, które często różnicują się przez złożoną ekspresję CD27 / CD45RO lub CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ lub CCR7+ CD45RA-) ma tendencję do lokalizacji w wtórnych tkankach limfatycznych, podczas gdy TEM (CD27- CD45RO+ lub CCR7- CD45RA-) lokalizuje się w tkankach limfatycznych i obwodowych15,16. TEM zapewnia natychmiastową, ale nie trwałą obronę, podczas gdy TCM podtrzymuje odpowiedź poprzez proliferację w wtórnych narządach limfatycznych i generowanie nowych efektorów17. Tak więc, biorąc pod uwagę, że komórki pamięci mogą pośredniczyć w specyficznych i skutecznych reakcjach przypominania sobie wirusów, pojawiają się pytania o udział tego podzbioru polifunkcji.

Wraz z rozwojem technologii cytometrii przepływowej, powszechne stało się jednoczesne wykrywanie markerów więcej niż 10 klastrów, fenotypów i antygenów różnicujących, co jest korzystne dla obfitszego opisywania funkcjonalnych cech immunologicznych na poszczególnych limfocytach T, aby zmniejszyć błędną interpretację i trudności w zrozumieniu fenotypów limfocytów T. W badaniu tym wykorzystano stymulację ex vivo i cytometrię przepływową do analizy profili TPF w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) u dzieci zaszczepionych JEV. Stosując to podejście, poszerzona zostanie wiedza na temat krótko- i długoterminowej odporności limfocytów T specyficznej dla JEV, a nawet reaktywnej krzyżowo, indukowanej przez szczepienie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Etyczna aprobata dla niniejszego badania została uzyskana przez Komitet Etyki Szpitala Dziecięcego w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego (Numer zatwierdzenia: 2020-k-85). Ochotnicy zostali zrekrutowani z Pekińskiego Szpitala Dziecięcego Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Próbki krwi z żył obwodowych pobrano od pozornie zdrowych dzieci (2 lata), które wcześniej otrzymały szczepionkę podstawową i wzmocnioną żywym atenuowanym szczepionką JE SA14-14-2 przez okres krótszy niż pół roku (dzieci zaszczepione JE, n = 5) i dzieci nieszczepionych (6 miesięcy, n = 5). Zrezygnowano ze świadomej zgody ludzi, ponieważ w tym badaniu wykorzystano tylko pozostałe próbki, po przeprowadzeniu badań klinicznych. Aby chronić prywatność ochotników, wszystkie dane zostały w pełni zanonimizowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.

1. Izolacja PBMC z krwi żylnej obwodowej

  1. Pobrać próbki krwi z żył obwodowych (2 ml) od dzieci zaszczepionych i nieszczepionych JE w probówkach z antykoagulacjąEDTA-K 2 (patrz Tabela materiałów) za pomocą standardowej techniki nakłuwania żyły18.
  2. Dodać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) w celu rozcieńczenia krwi obwodowej.
    UWAGA: Proces jest przeprowadzany tak szybko, jak to możliwe, aby utrzymać maksymalną przeżywalność.
  3. Dodać 4 ml pożywki o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i powoli przenieść rozcieńczoną krew do górnej warstwy pożywki separującej.
    UWAGA: Nie mieszaj krwi z podłożem separacyjnym ani nie niszcz powierzchni kontaktowej utworzonej przez te dwie ciecze; W przeciwnym razie efekt separacji nie zostanie osiągnięty.
  4. Wirować przy 800 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Obserwuj znaczące warstwy po odwirowaniu.
  5. Przenieść PBMC (środkowa warstwa) do innej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przemyć PBMC 10 ml pożywki RPMI-1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, patrz Tabela materiałów).
  6. Wirować przy 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
  7. Ponownie zawiesić PBMC za pomocą 1 ml pożywki RPMI-1640 zawierającej 10% FBS i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika na bazie błękitu trypanowego (patrz Tabela materiałów).

2. Stymulacja PBMC przez inaktywowane cząstki JEV w celu wywołania ekspresji cytokin

  1. Ustaw dwie podgrupy grupy stymulacji JEV i grupy kontrolnej odpowiednio w próbkach szczepionych i nieszczepionych JE.
  2. Dostosuj liczbę PBMC do 2 × 106 komórek/ml za pomocą pożywki RPMI-1640 zawierającej 10% FBS i zasiaj PBMC na płytkach 24-dołkowych (2 × 106 komórek/1 ml pożywki na dołek); zaszczepić trzy dołki dla każdej grupy.
  3. Stymulować PBMC w grupie stymulacji JEV skoncentrowanymi inaktywowanymi cząstkami JEV5 (2 × 105 PFU) przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w obecności przeciwciał monoklonalnych CD28 (1 μg/ml, 1:1,000) i CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1,000) i monenzyny (1 μg/ml, 1:1,000). Do barwienia powierzchni użyj BV605-anty-CD107a (1 μg/ml, 1:1,000) (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: JEV został dezaktywowany przez promieniowanie UV, jak opisano wcześniej19.
  4. Stymulować PBMC z grupy kontrolnej bez skoncentrowanych cząstek wirusa przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w obecności przeciwciał monoklonalnych CD28 (1 μg/ml, 1:1,000) i CD49d (1 μg/ml, 1:1,000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1,000) i monenzyny (1 μg/ml, 1:1,000). Zabarwić powierzchnię za pomocą BV605-anty-CD107a (1 μg/ml, 1:1,000).

3. Barwienie wewnątrzkomórkowe ex vivo

  1. Zawiesinę komórek z każdej grupy zebrać do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS, dodać możliwy do utrwalenia barwnik żywotności (1 μl / ml, 1:1,000, patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Wirować przy 500 × g (w temperaturze pokojowej) przez 5 minut i usunąć supernatant.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS. Wirować przy 500 × g (w temperaturze pokojowej) przez 5 min. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić.
  4. Wykonaj barwienie markerem powierzchni komórki.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x PBS i dodać 2 μl każdego przeciwciała markerów powierzchniowych (BV650-anty-CD3, BUV395-anty-CD4, BV421-anty-CD8, BUV737-anty-CD27 i BV480-anty-CD45RO, współczynnik rozcieńczenia: 1:50, patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek w każdej probówce.
      UWAGA: Protokół barwienia przeciwciałami za pomocą kolorowej fluorescencji przedstawiono w tabeli 1.
    2. Inkubować probówki (etap 3.4.1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i chronić je przed światłem. Wirować przy 500 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      UWAGA: Przeciwciało BUV737-anty-CD27 i BV480-anty-CD45RO można zastąpić BUV737-anty-CCR7 i BV480-anty-CD45RA jako adnotację limfocytów T pamięci.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS. Wirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić.
  6. Wykonaj utrwalanie i pękanie membrany.
    1. Zawiesić komórki za pomocą 500 μl roztworu utrwalającego przerywającego błonę (patrz tabela materiałów) i utrwalić komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 500 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej 500 × g i ostrożnie usunąć supernatant.
  8. Wykonaj barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x PBS i dodać 2 μl każdego przeciwciała cytokinowego (FITC-anty-IFN-γ, PE-anty-TNF-α, BV785-anty-IL-2 i APC-anty-MIP-1α, współczynnik rozcieńczenia: 1:50, patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek w każdej probówce.
      UWAGA: Objętości i informacje na temat przeciwciał sprzężonych z fluoroforem przedstawiono w Tabeli 1.
    2. Inkubować probówki (etap 3.8.1) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować przy 500 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS. Wirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant. Dodaj 500 μl 1x PBS, aby ponownie zawiesić komórki.

4. Ustawienie cytometrii przepływowej

  1. Wyizolować samą próbkę PBMC zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 1 jako próbkę kontrolną. Podziel zawiesinę komórek na 12 równych części w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (100 μl/probówkę), jak podano poniżej.
    1. Przygotuj niebarwione, APC-Cy7-żywe/martwe barwione, BV650-anty-CD3 barwione pojedynczo, BUV395-anty-CD4 barwione pojedynczo, BV421-anty-CD8 barwione pojedynczo, BUV737-anty-CD27 barwione pojedynczo, BV480-anty-CD45RO, BV605-anty-CD107a, FITC-anty-IFN-γ barwione, PE-anty-TNF-α barwione pojedynczo, BV785-anty-IL-2 barwione pojedynczo i APC-anty-MIP-1α barwione pojedynczo.
  2. Dodaj markery powierzchni komórki i barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych zgodnie z opisem w kroku 3. Do każdej pojedynczej próbki barwienia należy dodać tylko jeden z fluoroforów z etapu barwienia. Dodaj 500 μl 1x PBS, aby ponownie zawiesić komórki i wirować z małą prędkością.
  3. Używając niebarwionej próbki, dostosuj rozproszenie do przodu (FSC), rozproszenie boczne (SSC) i różne napięcia barwnika fluorescencyjnego.
    UWAGA: Na potrzeby niniejszego badania ustawiono następujące napięcia. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-CY7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V i BV785: 725 V.
  4. Korzystając z pojedynczych próbek barwiących, dostosuj kompensację cytometrii przepływowej, aby wyeliminować sygnały zanieczyszczenia między różnymi fluoroforami.
    UWAGA: Parametry kompensacji przedstawiono w tabeli 2.

5. Strategia bramkowania i analiza danych

UWAGA: W niniejszym badaniu, dla tej analizy, komórki T pamięci centralnej (TCM komórek T CD8+ lub CD4+ jako CD27+ CD45RO+ lub CCR7+ CD45RA- oraz limfocyty T pamięci efektorowej (T EM) limfocytów T CD8+ lub CD4+ jako CD27- CD45RO+ lub CCR7- CD45RA- zostały zdefiniowane odpowiednio"xref">16.

  1. Narysuj bramkę wielokąta przez wykres punktowy obszaru FSC (FSC-A)/obszaru SSC (SSC-A), aby wybrać nienaruszoną populację limfocytów, wykluczając szczątki (Rysunek 1A).
  2. Narysuj prostokątną bramkę przez wykres punktowy FSC-A/FSC-WIDTH (FSC-W), aby zaznaczyć pojedyncze komórki (Rysunek 1B).
  3. Narysuj prostokątną bramkę przez wykres punktowy live/dead/SSC-A, aby wybrać żywe komórki (Rysunek 1C).
  4. Narysuj prostokątną bramkę przez wykres punktowy CD3 / SSC-A, aby zidentyfikować komórki T CD3 + ( Rysunek 1D).
  5. Narysuj poczwórną bramkę przez wykres punktowy CD4/CD8, aby zidentyfikować komórki T CD4 + lub CD8 + ( Rysunek 1E).
  6. Narysuj poczwórną bramkę przez wykres punktowy CD45RO / CD27, aby podzielić komórki T CD4 + lub CD8 + na TCM (CD27 + CD45RO +) i TEM (CD27- CD45RO +) ( Rysunek 1F-I).
  7. Narysuj bramki CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 i MIP-1α z TCM lub TEM limfocytów T CD8 + lub CD4 +, aby określić odpowiednio częstotliwość różnych wzorców odpowiedzi.
  8. Próbki należy ładować sekwencyjnie do cytometrii. Użyj bramki zatrzymującej20, aby uzyskać 1 × 106 limfocytów.
    UWAGA: Indywidualny użytkownik może zebrać więcej niż 1 × 106 komórek. Liczba ta stanowiła kompromis między czasem potrzebnym na zebranie wystarczającej liczby komórek, aby zapewnić miarodajne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia strategię bramkowania zastosowaną do wydzielenia frakcji TCM lub TEM limfocytów T CD8+ lub CD4+ w reprezentatywnej grupie dzieci zaszczepionych przeciwko JE po stymulacji JEV. Wykres kropkowy FSC-A/SSC-A służy do identyfikacji limfocytów, a wykres kropkowy FSC-A/FSC-W do identyfikacji pojedynczych komórek. Żywe komórki są wyznaczane na wykresie kropkowym live/dead/SSC-A. Wykres kropkowy CD3/SSC-A służy do identyfikacji limfoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten stanowi wykonalną metodę wykrywania opartą na cytometrii przepływowej profili TPF w PBMC dzieci zaszczepionych szczepionką JEV SA14-14-2. W badaniu tym jako materiał badawczy wykorzystano PBMC krwi żylnej zarówno dzieci szczepionych, jak i nieszczepionych. Dzięki stymulacji PBMC antygenem JEV, te amplifikowane TPFspecyficzne dla antygenu można scharakteryzować za pomocą wielobarwnego barwienia przeciwciałami cytometrii przepływowej. W porównaniu z konwencjonalną metodą testu immunoenzym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

R.W. był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82002130), Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (7222059). ZD.X. otrzymał wsparcie ze środków CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-ludzki CD28Biolegend302934Przeciwciało
anty-ludzkie CD49dBiolegend304339Przeciwciało
APC anty-ludzkie MIP-1 i alfa;BD551533Przeciwciało fluorescencyjne 
Automatyczny licznik komórekBIO RADTC20Liczba komórek
BD FACSymphony A5BDA5przepływ Cytometria
BUV395 anty-ludzki CD4BD563550Przeciwciało fluorescencyjne 
BUV737 anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne CCR7BD741786 
BUV737 anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne CD27BD612829 
BV421 anty-ludzkie CD8Biolegend344748Przeciwciało fluorescencyjne 
BV480 anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne CD45RABD566114 
BV480 anty-ludzkie CD45ROBD566143Przeciwciało fluorescencyjne 
BV605 anty-ludzki CD107aBiolegend328634Przeciwciało fluorescencyjne 
BV650 anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne CD3BD563999 
BV785 anty-ludzka IL-2Biolegend500348Przeciwciało fluorescencyjne 
Probówka wirówkowaBD FalconBD-3520971515 ml probówka wirówkowa
Cytofix/Cytoperm Zestaw roztworu do utrwalania/permeabilizacjiBD554714Utrwalanie i przenikanie komórek
Gradient gęstości MediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, pożywka do separacji ludzkich limfocytów
FITC anty-ludzka IFN-γBiolegend502506Przeciwciało fluorescencyjne 
Gibco Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000-044Płodowa surowica bydlęca
Gibco RPMI-1640 średniaPożywka do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific22400089
Szybkoobrotowa  wirówkaSigma  3K15Wirowanie komórek do probówki wirówkowej 15 ml
Szybkoobrotowe  WirówkaEppendorf5424RWirowanie komórek do probówki Eppendorf (EP) 1,5 ml Probówki
mikrowirówekAxygenMCT-150-C1,5 mL probówka do mikrowirówek
PE anty-ludzka TNF-αBiolegend502909Przeciwciało fluorescencyjne 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Inhibitor transportu białek (zawierający Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blokuje wewnątrzkomórkowe procesy transportu białek
Inhibitor transportu białek (zawierający Monenzynę)BD554724blokuje wewnątrzkomórkowe procesy transportu białek
Probówka okrągłodennaBD Falcon3522355 ml probówki
Zestaw do oznaczania żywotności komórek w kolorze trypanowymBeyotimeC0011Barwienie błękitem trypanowym
Zombie NIR Możliwy do naprawienia barwnik żywotnościBiolegend423106Barwienie martwych komórek
do

Bibliografia

  1. Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317(2022).
  2. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562(2022).
  3. Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
  4. Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476(2020).
  5. Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
  6. Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888(2022).
  7. Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329(2017).
  8. Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72(2021).
  9. Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275(2013).
  10. Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
  11. Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
  12. Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
  13. Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36(2021).
  14. Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
  15. Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
  16. Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212(2022).
  17. Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
  18. Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
  19. Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
  20. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  21. Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443(2020).
  22. Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126(2020).
  23. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416(2018).
  24. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
  25. Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odporno limfocyt w Twewn trzkom rkowe barwienie cytokinmononuklearne kom rki krwi obwodowejlimfocyty T CD4 dodatnielimfocyty T CD8 dodatniemarkery degranulacjipami immunologiczna
Wykrywanie wielofunkcyjnych limfocytów T u dzieci zaszczepionych szczepionką przeciwko japońskiemu zapaleniu mózgu za pomocą techniki cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.