Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64676

⸱

23 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Streszczenie

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest powszechny na całym świecie, odpowiada za 90% wszystkich przypadków raka przełyku każdego roku i jest najbardziej śmiertelnym ze wszystkich ludzkich raków płaskonabłonkowych. Pomimo niedawnych postępów w definiowaniu zmian molekularnych towarzyszących inicjacji i rozwojowi ESCC, rokowanie pacjentów pozostaje niekorzystne. Funkcjonalna adnotacja tych zmian molekularnych jest niezbędnym kolejnym krokiem i wymaga modeli, które zarówno rejestrują cechy molekularne ESCC, jak i mogą być łatwo i niedrogo manipulowane w celu adnotacji funkcjonalnej. Myszy leczone mimetycznym tlenkiem 4-nitrochinoliny (4NQO) dymu tytoniowego przewidywalnie tworzą ESCC i preneoplazję przełyku. Warto zauważyć, że zmiany 4NQO powstają również w jamie ustnej, najczęściej na języku, a także w przedżołądku, które mają wspólny warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy. Jednak myszami tymi nie można po prostu manipulować w celu testowania hipotez funkcjonalnych, ponieważ generowanie izogenicznych modeli myszy jest czasochłonne i zasobożerne. W tym celu pokonujemy to ograniczenie, generując trójwymiarowe (3D) organoidy pochodzące z pojedynczych komórek od myszy leczonych 4NQO, aby scharakteryzować mysie komórki ESCC lub komórki przednowotworowe ex vivo. Organoidy te wychwytują istotne cechy ESCC i preneoplazji przełyku, mogą być tanio i szybko wykorzystane do tworzenia modeli izogenicznych i mogą być wykorzystane do eksperymentów transplantacji syngenicznych. Pokazujemy, jak generować organoidy 3D z normalnej, przednowotworowej i SCC mysiej tkanki przełyku oraz utrzymywać i kriokonserwować te organoidy. Zastosowania tych wszechstronnych organoidów są szerokie i obejmują wykorzystanie genetycznie modyfikowanych myszy i dalszą charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej lub immunohistochemii, generowanie izogenicznych linii organoidowych przy użyciu technologii CRISPR oraz badania przesiewowe leków lub przeszczepy syngeniczne. Wierzymy, że powszechne zastosowanie technik zademonstrowanych w tym protokole przyspieszy postęp w tej dziedzinie w walce z poważnym obciążeniem ESCC.

Wprowadzenie

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest najbardziej śmiertelnym z ludzkich raków płaskonabłonkowych, ze względu na późną diagnozę, oporność na terapię i przerzuty1,2. ESCC powstaje z warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, który wyściela powierzchnię światła przełyku. Nabłonek płaskonabłonkowy składa się z proliferacyjnych komórek podstawnych i zróżnicowanych komórek w warstwie komórek nadpodstawnych. W warunkach fizjologicznych komórki podstawne wyrażają markery, takie jak p63, Sox2 i cytokeratyna K5 i K14, podczas gdy komórki zróżnicowane wyrażają ekspresję K4, K13 i IVL. Same komórki podstawne są niejednorodne i zawierają domniemane komórki macierzyste zdefiniowane przez markery, takie jak K153 i CD734. W homeostazie komórki podstawne ulegają postmitotycznemu różnicowaniu końcowemu w warstwie komórek nadpodstawnych, podczas gdy zróżnicowane komórki migrują i złuszczają się do światła, aby zakończyć odnowę nabłonka. Przypominając komórki, z których pochodzą, ESCC wykazuje różnicowanie komórek płaskonabłonkowych w różnym stopniu. ESCC często towarzyszą wieloogniskowe histologiczne zmiany prekursorowe, znane jako neoplazja śródnabłonkowa (IEN) lub dysplazja, obejmująca atypowe komórki podstawne. Oprócz zmian nabłonkowych, ESCC wykazuje przebudowę tkanek w obrębie przedziału podnabłonkowego, gdzie następuje aktywacja fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i rekrutacja komórek immunologicznych/zapalnych w celu wspierania mikrośrodowiska sprzyjającego nowotworowi.

Patogeneza ESCC obejmuje zmiany genetyczne i narażenie na środowiskowe czynniki ryzyka. Kluczowe zmiany genetyczne obejmują inaktywację genów supresorowych TP53 i CDKN2A (p16INK4A) oraz aktywację onkogenów CCND1 (cyklina D1) i EGFR, które prowadzą do upośledzenia funkcji punktu kontrolnego cyklu komórkowego, nieprawidłowej proliferacji i przeżycia w stresie genotoksycznym związanym z narażeniem na środowiskowe czynniki rakotwórcze. Rzeczywiście, zmiany genetyczne ściśle oddziałują na behawioralne i środowiskowe czynniki ryzyka, najczęściej palenie tytoniu i spożywanie alkoholu. Dym tytoniowy zawiera substancje rakotwórcze dla ludzi, takie jak aldehyd octowy, który jest również głównym metabolitem alkoholu. Aldehyd octowy indukuje addukty DNA i wiązania krzyżowe między niciami DNA, prowadząc do uszkodzenia DNA i akumulacji mutacji DNA oraz niestabilności chromosomalnej. Biorąc pod uwagę nadmierne bodźce mitogenne i nieprawidłową proliferację w wyniku aktywacji onkogenu, złośliwa transformacja komórek nabłonka przełyku jest ułatwiona przez mechanizmy radzenia sobie ze stresem genotoksycznym, w tym aktywację przeciwutleniaczy, autofagię i przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Co ciekawe, te funkcje cytoprotekcyjne są często aktywowane w rakowych komórkach macierzystych ESCC (CSC), które charakteryzują się wysoką ekspresją CD44 (CD44H) i mają zdolność inicjacji nowotworu, inwazji, przerzutów i oporności na terapię5,6,7.

ESCC został zamodelowany w hodowli komórkowej i na modelach gryzoni8,9. W ciągu ostatnich trzech dekad opracowano solidne, genetycznie modyfikowane mysie modele ESCC. Należą do nich myszy transgeniczne CCND1 i EGFR10,11 oraz myszy z nokautem p53 i p120Ctn12,13. Jednak pojedyncze zmiany genetyczne zazwyczaj nie powodują szybkiego początku ESCC. Wyzwanie to zostało przezwyciężone dzięki zastosowaniu czynników rakotwórczych przełyku, które dobrze podsumowują zmiany genetyczne człowieka w ESCC14. Na przykład tlenek 4-nitrochinolino-1 (4NQO) przyspiesza rozwój ESCC u transgenicznych myszy CCND115. W ostatnich latach domniemane komórki macierzyste nabłonka przełyku, komórki progenitorowe i ich odpowiednie losy były badane w modelach myszy śledzących linię komórkową3,4. Co więcej, te myszy śledzące linię komórkową zostały wykorzystane do zbadania komórek pochodzenia ESCC i tego, w jaki sposób takie komórki powodują powstawanie CSC CD44H za pomocą konwencjonalnej histologii i charakterystyki molekularnej opartej na omice7.

Jednym z pojawiających się obszarów związanych z tymi modelami myszy jest nowatorskie zastosowanie technik hodowli komórkowych do analizy żywych komórek ESCC i komórek prekursorowych w trójwymiarowym (3D) systemie organoidowym, w którym architektura oryginalnych tkanek jest rekapitulowana ex vivo7,8,9. Te organoidy 3D są szybko hodowane z zawiesiny jednokomórkowej wyizolowanej z tkanek myszy, w tym guzów pierwotnych i przerzutowych (np. Uszkodzenia węzłów chłonnych, płuc i wątroby). Komórki są zanurzone w ekstrakcie z błony podstawnej (BME) i karmione dobrze zdefiniowaną, wolną od surowicy pożywką do hodowli komórek. Organoidy 3D rosną w ciągu 7-10 dni, a powstałe kuliste struktury są podatne na subhodowlę, kriopkonserwację i testy do analizy różnych właściwości i funkcji komórkowych, w tym markerów CSC, EMT, autofagii, proliferacji, różnicowania i apoptotycznej śmierci komórki.

Te metody mogą być szeroko stosowane do kultur organoidowych 3D utworzonych z dowolnej warstwowej tkanki nabłonka płaskonabłonkowego, takiej jak błona śluzowa głowy i szyi (jama ustna, język, gardło i krtań), a nawet przedni żołądek. Błona śluzowa głowy i szyi przylega do przełyku, a obie tkanki mają podobną organizację, funkcję i podatność na choroby. Zarówno rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC), jak i ESCC mają wspólne zmiany genetyczne i środowiskowe czynniki ryzyka związane ze stylem życia, takie jak narażenie na palenie tytoniu i alkohol. Podkreślając to podobieństwo, myszy leczone mimetykiem dymu tytoniowego 4NQO łatwo rozwijają zarówno HNSCC, jak i ESCC. Biorąc pod uwagę łatwość, z jaką opisane poniżej protokoły można zastosować do modelowania HNSCC, dołączamy szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia kultur organoidów 3D z tych zmian.

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły generowania mysich organoidów 3D przełyku (MEO) reprezentujących normalne, przednowotworowe i ESCC zmiany rozwojowe u myszy leczonych 4NQO. Można wykorzystać różne szczepy myszy, w tym popularne szczepy laboratoryjne, takie jak C57BL/6 i identyfikowalne linie komórkowe oraz inne genetycznie modyfikowane pochodne. Kładziemy nacisk na kluczowe etapy, w tym izolację normalnego lub chorego mysiego nabłonka przełyku, przygotowanie zawiesin jednokomórkowych, hodowlę i monitorowanie rosnących organoidów 3D, subkulturę, krioprezerwację i przetwarzanie do kolejnych analiz, w tym morfologii i innych zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na myszach zostały zaplanowane i przeprowadzone zgodnie z przepisami oraz w ramach protokołu dotyczącego zwierząt nr AABB1502, który został sprawdzony i zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Columbia. Myszy były utrzymywane w odpowiednim ośrodku opieki nad zwierzętami, zapewniającym humanitarne traktowanie myszy, właściwą opiekę weterynaryjną oraz szkolenia z zakresu bezpieczeństwa laboratoryjnego dla personelu laboratorium.

1. Traktowanie myszy związkiem 4NQO w celu indukcji zmian IEN i ESCC w przełyku (czas trwania: do 28 tygodni)

UWAGA: W celu wytworzenia MEO reprezentujących nowotworowe zmiany przełyku, myszy są poddawane chemicznej kancerogenezie indukowanej 4NQO, zgodnie z wcześniejszym opisem Tang i wsp.14. Normalne/nienowotworowe MEO są pozyskiwane od myszy niepoddanych leczeniu.

  1. Myszy
    1. Kwaterować od czterech do pięciu myszy w klatce i aklimatyzować je w pomieszczeniu dla zwierząt przez co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo przedwczesnego zakończenia pełnego 28-tygodniowego eksperymentu z powodu zaburzeń związanych z wiekiem, należy rozpocząć badanie na myszach w wieku od 8 do 16 tygodni.
      UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano myszy C57BL/6 o masie około 20-30 g. W przypadku krótszych eksperymentów można użyć starszych myszy. Dopuszczalne jest użycie myszy samców lub samic. Myszy kontrolne (bez leczenia, patrz sekcja 1.3.1) muszą być dopasowane pod względem wieku i płci.
  2. Przygotowanie wody pitnej zawierającej 4NQO
    1. Przygotować roztwór zapasowy 4NQO o stężeniu 1 mg/mL w etylenopropylenglikolu (Tabela materiałów). Rozpuścić 100 mg 4NQO w 100 mL 99,9% etylenopropylenglikolu w zlewce szklanej o pojemności 500 mL przykrytej folią uszczelniającą. Mieszać dokładnie w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą mieszadła magnetycznego przy 800 rpm przez 30 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 900 mL autoklawowanej wody dejonizowanej do 100 mL roztworu zapasowego 4NQO 1 mg/mL i wymieszać przez odwracanie w plastikowym cylindrze miarowym o pojemności 2 L przykrytym folią uszczelniającą. Objętość 1 L 4NQO o stężeniu 100 µg/mL w 10% etylenopropylenglikolu wystarczy dla dwóch klatek z myszami wyposażonych w butelki do picia o pojemności 500 mL.
      OSTRZEŻENIE: Należy pamiętać, że 4NQO jest syntetycznym kancerogenem chemicznym, który może powodować nowotwory. Należy z nim pracować w rękawicach nitrylowych i fartuchu laboratoryjnym z długimi rękawami oraz w zamkniętym obuwiu. Należy zapewnić odpowiednią ochronę oczu, twarzy i nakrycie głowy. Odpady zawierające 4NQO należy umieszczać w oznakowanych pojemnikach zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi gospodarki odpadami niebezpiecznymi opracowanymi przez służby BHP.
  3. Leczenie 4NQO i monitorowanie
    1. Zamocować butelkę do picia i podawać 4NQO w wodzie pitnej ad libitum myszom przez 16 tygodni. Jako kontrolę nośnika (bez leczenia) stosować 10% (w/v) propylenglikol.
      UWAGA: Do indukcji IEN można zastosować krótsze okresy leczenia 4NQO.
    2. Uzupełniać wodę raz w tygodniu.
    3. Ważć każdą mysz co tydzień, umieszczając ją w plastikowym pojemniku na wadze laboratoryjnej.
    4. Po zakończeniu 16-tygodniowego okresu leczenia 4NQO, rozpocząć podawanie myszom zwykłej wody pitnej podczas okresu obserwacji po 4NQO, trwającego do 12 tygodni (Rycina 1).
    5. Monitorować myszy codziennie pod kątem oznak stresu (np. upośledzona mobilność, zgarbiona postawa, wycofane zachowanie), dysfagii i odwodnienia. Dodatkowo oceniać co tydzień zmiany masy ciała lub spożycie pokarmu i płynów. Jeśli masa ciała spadnie o więcej niż 10% w stosunku do masy początkowej, podawać myszom płynny suplement diety.
      UWAGA: Utrata masy ciała oporna na płynne suplementy diety może wskazywać na ESCC; myszy, które stracą więcej niż 20% masy ciała, należy poddać eutanazji. Co ważne, MEO można pozyskać z myszy poddanych przedwczesnej eutanazji. Należy zauważyć, że myszy C57BL/6 bez modyfikacji genetycznych zazwyczaj nie wykazują oznak chorobowych ani widocznych zmian ESCC aż do końca okresu obserwacji po 4NQO.
  4. Przygotowanie zwierząt
    1. Poddać myszy eutanazji w komorze z CO2 wypełnionej CO2 z przepływem zastępującym 30%-70% objętości komory na minutę. Śmierć potwierdzić poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.
    2. Przytwierdzić kończyny i nos myszy w pozycji grzbietnej do platformy sekcyjnej za pomocą igieł 21 G.
    3. Zdezynfekować powierzchnię brzuszną myszy 70% etanolem.
  5. Sekcja (czas trwania: 0,5 h)
    1. Otworzyć skórę, chwytając futro i skórę w okolicy środkowej brzucha, aby upewnić się, że są oddzielone od znajdujących się poniżej trzewi. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha od dolnej części brzucha do podbródka w kierunku kraniokaudalnym.
    2. Rozpocznąc od nacięcia w linii środkowej, za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać cięcia radialne rozchodzące się w stronę kończyn po obu stronach ciała myszy. Odchylić płaty skóry.
    3. Aby odsłonić tchawicę szyjną, użyć nożyczek sekcyjnych do rozdzielenia gruczołów ślinowych w linii środkowej. Tchawica znajduje się głęboko w gruczołach.
    4. Aby odsłonić tchawicę klatki piersiowej, usunąć mostek.
      1. Delikatnie chwycić i unieść otrzewną pęsetą i za pomocą nożyczek rozciąć otrzewną w kierunku kraniokaudalnym oraz bocznie wzdłuż klatki piersiowej.
      2. Delikatnie odsunąć wątrobę od powierzchni kaudalnej przepony i za pomocą nożyczek wykonać małe nacięcie w przeponie w miejscu wcięcia mostka, konkretnie na powierzchni grzbietowej wyrostka mieczykowatego. Uwalnia to płuco i serce z opłucnej trzewnej.
      3. Oddzielić klatkę piersiową od zawartości klatki piersiowej. Wprowadzić nożyczki do nacięcia w przeponie i przeprowadzić sekcję w kierunku kranialnym do obręczy barkowej. Podczas tej sekcji należy ściśle trzymać się powierzchni grzbietowej mostka, aby uniknąć uszkodzenia organów poniżej. Należy upewnić się, że płaszczyzna sekcji znajduje się przed tchawicą.
      4. Przeciąć żebra po obu stronach mostka za pomocą nożyczek i usunąć mostek. Upewnić się, że zawartość klatki piersiowej jest odsłonięta.
    5. Odsłonić przełyk brzuszny. Delikatnie unieść żołądek w kierunku przednim, trzymając antrum pęsetą. Odseparować śledzionę, trzustkę i krezkę od żołądka i przełyku za pomocą nożyczek.
    6. Odsłonić przełyk klatki piersiowej (Rycina 2).
      1. Delikatnie unieść tchawicę bezpośrednio za chrzęstną tarczą krtani i odseparować przełyk od strony grzbietowej tchawicy za pomocą nożyczek irydowych.
      2. Przeciąć tchawicę na wysokości chrzęstnej tarczy krtani nożyczkami irydowymi.
      3. Oddzielić tchawicę od pozostałej części przełyku poprzez ostrożną sekcję w kierunku kaudalnym.
      4. Usunąć płuco, serce i grasicę en masse wraz z tchawicą. Należy uważać, aby nie uszkodzić przełyku podczas sekcji i przecinania aorty oraz żyły głównej.
    7. Przeciąć żołądek w okolicy odźwiernika za pomocą nożyczek.
    8. Oddzielić przełyk od kręgów, trzymając antrum pęsetą i prowadząc sekcję w kierunku kranialnym.
    9. Przeciąć przełyk na wysokości chrzęstnej tarczy krtani i pobrać przełyk oraz żołądek en masse (Rycina 3).
    10. Oddzielić żołądek od przełyku, przecinając przełyk w miejscu wpustu (Rycina 4, panel górny, czerwona linia).
    11. Usunąć wszelką powięź z zewnętrznej powierzchni przełyku. Aby zachować próbkę do badania histologicznego (opcjonalnie), usunąć połowę przełyku i rozdzielić go wzdłużno nożyczkami. Pozostały nienaruszony przełyk umieścić w zimnym PBS na lodzie.
    12. Otworzyć żołądek wzdłuż większej krzywizny i wystarczająco przemyć PBS. Oddzielić żołądek przedni i przemyć zimnym PBS. Umieścić żołądek przedni w zimnym PBS na lodzie.
    13. Aby pobrać język, usunąć igłę 21 G z nosa i wyciągnąć język pęsetą. Odciąć język tak, aby był jak najdłuższy. Umieścić język w zimnym PBS na lodzie.

2. Ustanowienie hodowli mysich organoidów przełyku (MEO)

UWAGA: Niniejszy protokół można również wykorzystać do ustanowienia hodowli organoidów języka mysiego poprzez dodanie etapu, w którym tkanka językowa jest rozdrabniana przed trypsynizacją. Patrz uwaga w kroku 2.2.3.

  1. Przygotowanie odczynników
    UWAGA: Listę odczynników można znaleźć w Tabela materiałówPrzygotować i przechowywać roztwory zapasowe zgodnie z instrukcjami producenta, chyba że wskazano inaczej.
    1. Należy upewnić się, że jednorazowe alikwoty macierzy błony podstawnej (BME) wykorzystywane w niniejszym protokole są przechowywane w temperaturze −20 °C do dnia użycia, a następnie rozmrażane na lodzie lub w temperaturze 2-8 °Cor przechowywane w lodzie przez cały czas, gdy nie są używane.
    2. Rozpuścić 250 mg inhibitora trypsyny z soi (STI) w 1000 ml PBS (stężenie roztworu stokowego 250 mg/ml), a następnie poddać sterylizacji przez filtrowanie (0.22 µm) go. Rozdzielić w ilościach 50 ml do probówek stożkowych i przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować pożywkę do organoidów mysich (MOM): do pożywki advanced DMEM/F12 dodać 1 mM N-acetyl-L-cysteinę (NAC), 2% pożywki kondycjonowanej R-Spondin i Noggin (RN CM), 1x suplement N-2, 1x suplement B-27, 10 mM HEPES, 1x roztwór antybiotyk-antymykotyk, 1x suplement GlutaMAX oraz 100 ng/mL mysiego czynnika wzrostu naskórka (mEGF). Pożywkę MOM przygotowywać w ilościach 500 mL, podzielić na aliquoty po 50 mL i przechowywać w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia. Dodać 0.5 µg/mL amfoterycyna B i 10 µM Y-27632 bezpośrednio przed użyciem.
    4. Podgrzej do odpowiedniej temperatury MOM, trypsynę 0,25% oraz inhibitor trypsyny sojowej (STI). 37 °C w łaźni wodnej lub piaskowej przed użyciem.
  2. Izolacja keratynocytów z wypreparowanej tkanki mysiej (przewidywany czas: 2 h)
    1. Przenieś tkankę przełyku do 500 µL dyspazy w PBS (łącznie 2,5–5 jednostek), a następnie inkubować w termomikserze przez 10 min w temperaturze 37 °C oraz 800 obr./min.
    2. Przenieś tkankę do naczynia hodowlanego i ostrożnie oddziel warstwę mięśniową od nabłonka za pomocą pęsety (Rysunek 4).
      UWAGA: Ten etap może zostać wykonany przez doświadczonego badacza przed inkubacją z dispazą.
    3. Przenieś nabłonek do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 500 µL trypsyny 0,25% i inkubować w termomikserze przez 10 min w temperaturze 37 °C oraz 800 obr./min.
      UWAGA: Jeśli materiałem wyjściowym jest tkanka języka, należy posiekać ją sterylnym skalpelem na mniejsze kawałki o wielkości około 1–2 mm2 rozmiaru, przed dodaniem trypsyny.
    4. Krótko wiruj przez 5–10 s przy 2000 x g g aby odwirować tkankę do postaci pelletu. Przygotować probówkę stożkową o pojemności 50 ml z 100 µm sitko do komórek. Przenieść zawiesinę tkankową/komórkową przez sitko za pomocą końcówki o szerokim otworze, wykonując ruchy okrężne.
    5. Należy dodać 3 mL STI przez sitko, wykonując ruchy okrężne w celu przemycia.
    6. Przesunąć komórki przez sitko, pocierając je podstawą tłoka strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.
    7. Przemyć sitko 3 ml PBS 3–5 razy, szorując je podstawą strzykawki pomiędzy poszczególnymi płukaniami.
    8. Wiruj probówkę z prędkością 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C aby odwirować komórki do postaci osadu.
    9. Usunąć nadsącz, pozostawiając w probówce 1 ml roztworu.
    10. Resuspenduj osad w pozostałym 1 ml i przenieś zawiesinę komórkową przez 70 µm przez sitko komórkowe do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    11. Wirować probówkę przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C w celu odwirowania komórek do postaci osadu.
    12. Resuspender osad w 100 µL MOM; dostosować objętość w razie potrzeby. Wykonać automatyczne liczenie komórek metodą wykluczania błękitu trypanu.
  3. Wysiew początkowej zawiesiny komórkowej (uwzględnienie czasu: <1 h)
    1. Podgrzej wcześniej 24-dołkową płytkę do hodowli komórek w 37 °C inkubator
    2. Wysiać 5 000 żywych komórek w 75% (v/v) BME/MOM z 50 µL całkowita objętość na dołek. Należy zmaksymalizować liczbę wysianych dołków i przygotować w BME wystarczającą liczbę komórek na jeden dodatkowy dołek, zgodnie z poniższymi obliczeniami przykładowymi.
      UWAGA: Nadmiar komórek należy kriotekstować w medium do krio konserwacji (10% DMSO w FBS) przy maksymalnym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Przechowywać krioprobówki w pojemniku do mrożenia przez noc w temperaturze −80 °CPrzenieść je do fazy gazowej ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.
    3. W probówce do mikrocentryfugi należy najpierw przygotować odpowiednie rozcieńczenie komórek w MOM, a następnie, bezpośrednio przed wysianiem, dodać BME, używając końcówki o szerokim otworze.
    4. Używając 200 µL końcówka o szerokim otworze, powoli dodać 50 µL kroplę na środek dołka, unikając kontaktu końcówki z dnem lub ściankami dołka (Rycina 5). Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej siły podczas wypychania cieczy z końcówki, w przeciwnym razie kopułka spłaszczy się.
    5. Pozostawić BME do zastygnięcia na 30 min w 37 °C, 5% CO22, inkubator z 95% wilgotnością względną (RH).
    6. Ostrożnie dodać 500 µL pożywki MOM na dołek, uzupełnionej o 0.5 µg/mL amfoterycyna B i 10 µM Y-27632.
      UWAGA: Do wszystkich pożywek MOM należy dodawać amfoterycynę przez cały okres początkowej hodowli pierwotnej. Y-27632 należy dodawać wyłącznie w dniu pasażowania (dzień 0) przy każdym pasażu.
    7. Wymień MOM w dniach 3-4, a następnie co 2-3 dni aż do momentu pasażowania.
    8. W dniach 7–10 należy wykonać obrazowanie organoidów i zmierzyć szybkość tworzenia organoidów (OFR), dzieląc liczbę powstałych organoidów przez liczbę komórek wysianych początkowo.
      Przykładowe obliczenia:
      figure-protocol-1
  4. Pasażowanie i kriokonserwacja mysich organoidów przełyku (MEOs) (uwzględnienie czasu: <1,5 h)
    1. Rozmrozić i przechowywać BME w lodzie. Podgrzać MOM, 0,05% trypsynę oraz STI do 37 °C w łaźni wodnej lub paciorkowej przed użyciem. Podgrzej wstępnie płytkę hodowlaną z 24 dołkami w 37 °C inkubator
    2. Za pomocą końcówki do mikropipety o szerokim otworze należy zebrać organoidy znajdujące się w kopule BME wraz z nadsączem. Następnie należy rozbić BME poprzez wielokrotne pipetowanie (zasysanie i wydmuchiwanie cieczy).
      UWAGA: Przenieś zawartość dołków zawierających identyczne próbki do jednej probówki do mikrocentryfugi.
    3. Krótko wiruj przez 10–15 s przy 2000 x g g w celu odwirowania organoidów w pellet. Usunąć i odrzucić nadsącz.
    4. Ostrożnie rozbij osad i resuspenduj go w 500 µL 0,05% trypsyny.
    5. Inkubować probówkę(i) w termomikserze w temperaturze 37 °C oraz 800 obr./min przez 10 min.
    6. Inaktywować trypsynę za pomocą 600 µL infekcji przenoszonych drogą płciową (STI).
    7. Wiruj probówkę z prędkością 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C w celu odwirowania komórek do osadu.
    8. Usunąć i odrzucić nadsącz. Resuspender osad komórkowy w 100 µL z MOM. Wykonać automatyczne zliczenie komórek metodą wykluczania błękitu trypanu.
      UWAGA: Objętość można dostosować w razie potrzeby.
    9. Wysiać od 2000 do 5000 żywych komórek w 75% (v/v) roztworze BME/MOM z 50 µL całkowita objętość na dołek. Należy zmaksymalizować liczbę wysianych dołków i przygotować w BME wystarczającą liczbę komórek na jeden dodatkowy dołek, zgodnie z obliczeniami poglądowymi wspomnianymi wcześniej.
      UWAGA: Nadmiar komórek należy krio konserwować w medium do krio konserwacji (10% DMSO w FBS) przy maksymalnym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Przechowywać krio probówki w pojemniku do zamrażania przez noc w temperaturze −80 °CPrzenieść je do fazy gazowej ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    10. W probówce do mikrocentryfugi należy najpierw przygotować odpowiednie rozcieńczenie komórek w medium MOM, a następnie, bezpośrednio przed wysianiem, dodać BME za pomocą końcówki o szerokim otworze (wide bore tip).
    11. Korzystając z 200 µL końcówka o szerokim wylocie, powoli dodać 50 µL kroplę na środek dołka, unikając kontaktu końcówki z dnem lub ściankami dołka. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej siły podczas wypychania cieczy z końcówki, w przeciwnym razie kopułka ulegnie spłaszczeniu.
    12. Inkubować płytkę przez 30 min w 37 °C, 5% CO22,inkubator z wilgotnością względną 95%.
    13. Ostrożnie dodać 500 µL pożywki MOM na dołek, uzupełnionej o 10 µM Y-27632.
      UWAGA: Y-27632 należy dodawać wyłącznie w dniu pasażowania (dzień 0). Dodawanie go podczas wymiany pożywki nie jest konieczne. Dodawanie amfoterycyny B nie jest już wymagane.
    14. Wymień MOM w dniach 3–4, a następnie co 2–3 dni aż do momentu pasażowania.
    15. W dniach 7–10 należy wykonać obrazowanie organoidów i zmierzyć OFR.
  5. Rozmrażanie i regeneracja mysich organoidów przełyku (MEO) (uwzględnienie czasu: <1 h)
    1. Rozmrozić i przechowywać BME w lodzie. Podgrzać wstępnie płytkę hodowlaną z 24 dołkami w 37 °C inkubator
    2. Przygotować 10 ml zimnego lub w temperaturze pokojowej buforu MOM lub PBS w 15 ml probówce stożkowej.
    3. Rozmrozić krioprobówkę w 37 °C kąpiel wodną lub kąpiel w kuleczkach przez około 30 s do 1 min lub do momentu, aż pozostanie mała grudka lodu.
    4. Za pomocą uprzednio zwilżonego końcówki pipety powoli przenoś zawiesinę komórkową do probówki zawierającej MOM lub PBS, dodając ją kroplami.
    5. Wiruj probówkę z prędkością 300 x g i 4 °C przez 5 min w celu osadzenia komórek.
    6. Usunąć i odrzucić nadsącz. Resuspender osad komórkowy w 100 µL MOM; dostosować objętość w razie potrzeby. Wykonać zautomatyzowane liczenie komórek metodą wykluczania błękitu trypanu.
    7. Wysiać od 5 000 do 10 000 żywych komórek w 75% (v/v) BME/MOM z 50 µL całkowita objętość na dołek. Należy zmaksymalizować liczbę wysianych dołków oraz przygotować w BME wystarczającą liczbę komórek na jeden dodatkowy dołek, zgodnie z wcześniej wspomnianymi obliczeniami przykładowymi.
    8. Kontynuuj pozostałe kroki protokołu pasażowania i kriotokonserwacji mysich organoidów przełyku (MEO) (patrz krok 2.4.11).

3. Przygotowanie organoidów do zatopienia w parafinie (czas trwania: <1 h [plus 1,5 h na przygotowanie odczynników])

  1. Za pomocą końcówki do mikropipety o szerokim otworze zebrać zawartość trzech dołków na każdą probówkę do mikrowirówki. Zebrać organoidy wraz z kopułą BME oraz naddatkiem. Rozbić BME poprzez pipetowanie w górę i w dół.
  2. Krótko wirować przez 10-15 s przy 2,000 x g, aby uzyskać osad z organoidów. Usunąć i odrzucić naddatek.
  3. Delikatnie rozbić osad i zawiesić go ponownie w 300 µL 4% paraformaldehydu (PFA).
  4. Fiksować organoidy przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Krótko wirować przez 10-15 s przy 2,000 x g, aby uzyskać osad z organoidów. Usunąć i odrzucić jak największą ilość PFA.
  6. Delikatnie rozbić osad i zawiesić go ponownie w 500 µL PBS.
    UWAGA: Ufiksowane organoidy można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed przejściem do następnego kroku.
  7. Przygotować 50 mL roztworu stokowego żelu agarowego (2% agaru oraz 2,5% żelatyny).
    UWAGA: Roztwór stokowy żelu agarowego należy przygotować z wyprzedzeniem ze względu na czas inkubacji, a następnie poddać cyklowi autoklawowania.
    1. Zawiesić 1 g Bacto-agaru i 1,25 g żelatyny w 50 mL wody w 150 mL autoklawowalnym zlewce szklanej.
    2. Zamieszać zawiesinę i pozostawić na 30-60 min w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Autoklawować przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    4. Lekko schłodzić i rozdzielić w aliquoty po 5 mL do 15 mL probówek stożkowych.
    5. Przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Przygotować powierzchnię do zatapiania, odwracając statyw do probówek do mikrowirówki i pokrywając jego powierzchnię arkuszem folii uszczelniającej. Opisać odpowiednim identyfikatorem (ID) organoidów.
  9. Wirować probówkę przy 300 x g przez 5 min, aby uzyskać osad z organoidów. Usunąć i odrzucić naddatek.
  10. W międzyczasie upłynnić żel agarowy, umieszczając 15 mL probówkę stożkową z żelem agarowym w 150 mL zlewce szklanej zawierającej 100 mL wody i podgrzewając w kuchence mikrofalowej na najwyższej mocy przez 1-2 min lub do momentu, gdy woda zacznie wrzeć, a żel agarowy przejdzie w stan ciekły.
    OSTROŻNIE: Przed włożeniem do kuchenki mikrofalowej poluzować zakrętkę probówki stożkowej z żelem agarowym.
  11. Częściowo zanurzyć probówkę do mikrowirówki zawierającą osad organoidów w ciepłej wodzie, uważając, aby woda nie dostała się do wnętrza probówki.
  12. Ostrożnie przykryć osad organoidów, dodając 50 µL agaru po ściance probówki.
  13. Bez naruszania osadu (nie zawieszać ponownie, zachować strukturę osadu), przenieść osad w kropli żelu agarowego na folię uszczelniającą na powierzchni do zatapiania.
  14. Powtórzyć krok 3.12 i 3.13 z dodatkowymi 50 µL ciekłego żelu agarowego, aby zebrać pozostały osad organoidów, i ostrożnie dodać go do tej samej kropli żelu.
  15. Inkubować kroplę zawierającą osad organoidów przez 45 min w temperaturze 4 °C.
  16. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieść kroplę zawierającą osad organoidów do opisanej kasety patomorfologicznej.
  17. Przechowywać kasetę w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  18. Przeprowadzić zatapianie w parafinie poprzez rutynowe przetwarzanie histologiczne w celu przygotowania bloków parafinowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten protokół opisuje proces generowania mysich organoidów przełyku (MEO) z normalnej tkanki przełyku lub tkanki nowotworowej ESCC od myszy leczonych 4NQO, zgodnie ze specyficznym schematem leczenia składającym się z 16 tygodni 4NQO podawanego w wodzie pitnej, po którym następuje okres obserwacji od 10 tygodni do 12 tygodni (Rysunek 1). Myszy są następnie poddawane eutanazji w celu wycięcia języka lub tkanki przełyku (Rysunek 2 i Rysunek 3). Opisujemy metodę izo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W opisanych tutaj protokołach istnieje kilka kluczowych etapów i kwestii związanych z generowaniem i analizą prywatnego inwestora. Aby zapewnić odtwarzalność i rygor w eksperymentach w ramach prywatnego inwestora, ważne są zarówno kontrpróby biologiczne, jak i techniczne. W przypadku kontrprób biologicznych na ogół wystarczają dwie do trzech niezależnych myszy z ESCC na warunki doświadczalne. Jednak odpowiednia liczba kontrprób biologicznych może się różnić w zależności od parametrów, które mają być badane w poszczególny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Wspólnemu Zasobowi (Cytometria Przepływowa, Patologia Molekularna oraz Mikroskopia Konfokalna i Specjalistyczna) w Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia za wsparcie techniczne. Dziękujemy doktorom Alanowi Diehlowi, Adamowi J. Bassowi i Kwok-Kin Wongowi (NCI P01 Mechanizmy Karcynogenezy Przełyku) oraz członkom laboratoriów Rustgi i Nakagawa za pomocne dyskusje. Badanie to było wspierane przez następujące granty NIH: P01CA098101 (H.N. i A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. i H.N.) oraz P30CA013696 (A.K.R.). H.N. i C.L. są laureatami nagrody Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. jest laureatem nagrody Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. jest laureatem nagrody The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) oraz nagrody American Association for Cancer Research Award. J.G. jest laureatem nagrody Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego (AGA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25-300-120
0,25% trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25-200-114
0,4% Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
1 ml strzykawka tuberkulinowa bez igłyBD309659
1,5 ml probówka do mikrowirówekThermo Fisher Scientific05-408-129
100 &mikro; m Sitko do komórekThermo Fisher Scientific22363549
15 mL rurki stożkoweThermo Fisher Scientific14-959-53A
200 µ Końcówki do mikropipet L o szerokim otworzeThermo Fisher Scientific212361A
21 G igłyBD305167
24-dołkowa płytkaThermo Fisher Scientific12-556-006
4-tlenek nitrochinolino-1 (4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50 ml rurki stożkoweThermo Fisher Scientific12-565-270
6 dołków talerzThermo Fisher Scientific12556004
70 µ m sitko komórkoweThermo Fisher Scientific22363548
99,9% glikol etylenowo-propylenowySK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
Amfoterycyna BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018Stężenie magazynowe 250 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 0,5 &mikro; g/ml
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyThermo Fisher Scientific15240062Stężenie zapasowe 100x, stężenie końcowe 1x
suplement B-27Thermo Fisher Scientific17504044Stężenie zapasowe 50x, stężenie końcowe 1x
Inkubator Bactoagar BD214010
CO2 inkubator, np. Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406lub równoważny
Countess II FL Automatyczny licznik komórek ThermoFisher ScientificAMQAX1000lub równoważny
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Dimetylosulfotlenek (DMSO)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning354235Stężenie podstawowe 50 U/ml, stężenie końcowe 2,5– Nożyczki preparacyjne 5 U/ml
VWR25870-002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190250Stężenie zapasów 1x
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30071.03
KleszczeVWR82027-386
Pojemnik do zamrażaniaCorning432002lub odpowiednik
ŻelatynaThermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Stężenie wyjściowe 100x, stężenie końcowe 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Stężenie materiału 1 M, stężenie końcowe 10 mM
Płyta grzejna/mieszadłoCorningPC-420Dlub równoważne
Lab Kąpiel z kulkami pancernymi (lub kąpiel wodna)VWR89409-222lub równoważny
Waga laboratoryjnaOhaus71142841lub równoważna
Ekstrakt z błony podstawnej Matrigel (BME)Corning354234
Mikrowirówka MinispinEppendorf22620100lub równoważny
Stojak na probówki do mikrowirówekSouthern Labware0061
Suplement N-2Thermo Fisher Scientific17502048Stężenie magazynowe 100x, stężenie końcowe 1x
N-acetylocysteina (NAC)Sigma-AldrichA9165Stężenie wyjściowe 0,5 M, stężenie końcowe 1
mM Folia Parafilm MThermo Fisher ScientificS37440
Paraformaldehyd (PFA)MiliporeSigma158127-500G
Kaseta patologicznaThermo Fisher Scientific22-272416
Mikroskop z kontrastem fazowymNikonlub równoważny
Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (mEGF)Peprotech315-09-1mgStężenie standardowe 500 ng / &mikro; L, stężenie końcowe 100 ng / ml
RN kondycjonowane komórkowo podłoże eksprymujące R-Spondin1 i Noggin (RN CM)N/AN/ADostępne za pośrednictwem rdzenia organoidów i hodowli komórkowych na żądanie, stężenie końcowe 2%
Wirówka Sorval ST 16RThermo Fisher Scientific75004380lub równoważny
inhibitor trypsyny sojowej (STI)MilliporeSigmaT9128Stężenie zapasowe 250 i mikro; g/ml
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMlub odpowiednik
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Stężenie zapasowe 10 mM, stężenie końcowe 10 i mikro; M

Bibliografia

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
  4. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  5. Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
  6. Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
  7. Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).
  8. Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
  9. Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
  10. Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
  11. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  12. Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
  13. Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
  14. Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
  15. Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
  16. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  17. Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224(2013).
  18. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  19. Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
  20. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
  21. Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
  22. Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  23. Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).
  24. Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).
  25. Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy 3Dhodowla organoidówmikrośrodowisko guzaedycja CRISPRprzesiewy wysokoprzepustowetkanka przełyka mysiegozatapianie w parafiniedysocjacja komórektworzenie organoidów
Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.