Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64676

⸱

23 grudnia 2022

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Streszczenie

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest powszechny na całym świecie, odpowiada za 90% wszystkich przypadków raka przełyku każdego roku i jest najbardziej śmiertelnym ze wszystkich ludzkich raków płaskonabłonkowych. Pomimo niedawnych postępów w definiowaniu zmian molekularnych towarzyszących inicjacji i rozwojowi ESCC, rokowanie pacjentów pozostaje niekorzystne. Funkcjonalna adnotacja tych zmian molekularnych jest niezbędnym kolejnym krokiem i wymaga modeli, które zarówno rejestrują cechy molekularne ESCC, jak i mogą być łatwo i niedrogo manipulowane w celu adnotacji funkcjonalnej. Myszy leczone mimetycznym tlenkiem 4-nitrochinoliny (4NQO) dymu tytoniowego przewidywalnie tworzą ESCC i preneoplazję przełyku. Warto zauważyć, że zmiany 4NQO powstają również w jamie ustnej, najczęściej na języku, a także w przedżołądku, które mają wspólny warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy. Jednak myszami tymi nie można po prostu manipulować w celu testowania hipotez funkcjonalnych, ponieważ generowanie izogenicznych modeli myszy jest czasochłonne i zasobożerne. W tym celu pokonujemy to ograniczenie, generując trójwymiarowe (3D) organoidy pochodzące z pojedynczych komórek od myszy leczonych 4NQO, aby scharakteryzować mysie komórki ESCC lub komórki przednowotworowe ex vivo. Organoidy te wychwytują istotne cechy ESCC i preneoplazji przełyku, mogą być tanio i szybko wykorzystane do tworzenia modeli izogenicznych i mogą być wykorzystane do eksperymentów transplantacji syngenicznych. Pokazujemy, jak generować organoidy 3D z normalnej, przednowotworowej i SCC mysiej tkanki przełyku oraz utrzymywać i kriokonserwować te organoidy. Zastosowania tych wszechstronnych organoidów są szerokie i obejmują wykorzystanie genetycznie modyfikowanych myszy i dalszą charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej lub immunohistochemii, generowanie izogenicznych linii organoidowych przy użyciu technologii CRISPR oraz badania przesiewowe leków lub przeszczepy syngeniczne. Wierzymy, że powszechne zastosowanie technik zademonstrowanych w tym protokole przyspieszy postęp w tej dziedzinie w walce z poważnym obciążeniem ESCC.

Wprowadzenie

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest najbardziej śmiertelnym z ludzkich raków płaskonabłonkowych, ze względu na późną diagnozę, oporność na terapię i przerzuty¹^,². ESCC powstaje z warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, który wyściela powierzchnię światła przełyku. Nabłonek płaskonabłonkowy składa się z proliferacyjnych komórek podstawnych i zróżnicowanych komórek w warstwie komórek nadpodstawnych. W warunkach fizjologicznych komórki podstawne wyrażają markery, takie jak p63, Sox2 i cytokeratyna K5 i K14, podczas gdy komórki zróżnicowane wyrażają ekspresję K4, K13 i IVL. Same komórki podstawne są niejedn....