Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64682

⸱

2 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans są powszechnie używane do badania biologii starzenia. Standardową praktyką w badaniach starzenia się C. elegans jest hodowla grup robaków na stałych pożywkach wzrostowych nicieni (NGM), co pozwala na efektywne gromadzenie danych na poziomie populacji dotyczących przeżycia i innych fenotypów fizjologicznych oraz okresowe pobieranie próbek subpopulacji w celu ilościowej oceny biomarkerów fluorescencyjnych. Ograniczeniem tego podejścia jest niemożność (1) śledzenia poszczególnych robaków w czasie w celu opracowania trajektorii wieku dla interesujących fenotypów oraz (2) monitorowania biomarkerów fluorescencyjnych bezpośrednio w kontekście środowiska hodowli. Alternatywne podejścia do hodowli wykorzystują kulturę płynną lub mikrofluidyczną do monitorowania poszczególnych zwierząt w czasie, w niektórych przypadkach z uwzględnieniem kwantyfikacji fluorescencji, z kompromisem polegającym na tym, że środowisko hodowli różni się kontekstowo od stałego NGM. WorMotel to wcześniej opisane mikrofabrykowane urządzenie wielodołkowe do hodowli izolowanych robaków na stałym NGM. Każdy robak jest utrzymywany w studni zawierającej stały NGM otoczony fosą wypełnioną siarczanem miedzi, środkiem odstraszającym kontakt z C. elegans, umożliwiającym wzdłużne monitorowanie poszczególnych zwierząt. Uważamy, że siarczan miedzi jest niewystarczający, aby zapobiec ucieczce robaków poddanych awersyjnym interwencjom powszechnym w badaniach nad starzeniem się, w tym ograniczeniom dietetycznym, bakteriom chorobotwórczym i czynnikom chemicznym wywołującym stres komórkowy. Urządzenia wielodołkowe są również formowane z polidimetylosiloksanu, który wytwarza artefakty o wysokim poziomie tła podczas obrazowania fluorescencyjnego. Protokół ten opisuje nowe podejście do hodowli izolowanych glist na stałym NGM przy użyciu dostępnych na rynku mikrotac polistyrenowych, pierwotnie zaprojektowanych do typowania ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), umożliwiając pomiar przeżycia, fenotypów fizjologicznych i fluorescencji przez całe życie. Bariera z kwasem palmitynowym zapobiega ucieczce robaków, nawet w przypadku awersyjnych warunków. Każda płytka może hodować do 96 zwierząt i łatwo dostosowuje się do różnych warunków, w tym ograniczeń dietetycznych, RNAi i dodatków chemicznych, a także jest kompatybilna z automatycznymi systemami zbierania danych dotyczących długości życia i aktywności.

Wprowadzenie

C. elegans są potężnym organizmem modelowym do badań w dziedzinie genetyki, biologii komórkowej i biologii molekularnej, ponieważ łatwo je hodować w laboratorium, mają krótki czas generacji i długość życia, mają wysoki stopień homologii białek ze ssakami i mają przezroczystą strukturę ciała, która pozwala na wizualizację in vivo fluorescencyjnych białek i barwników1. W wyniku długotrwałego stosowania C. elegans jako głównego systemu modelowego w wielu dziedzinach, w tym w biologii rozwoju i starzeniu się, ich wzrost i rozwój są dobrze poznane, ich genom został w pełni zsekwencjonowany i stworzono wiele potężnych narzędzi genetycznych, w tym biblioteki odżywiania RNAi obejmujące cały genom oraz tysiące zmutowanych i transgenicznych szczepów. Historycznie rzecz biorąc, C. elegans są hodowane jako populacje na stałych pożywkach wzrostowych nicieni agarowych (NGM), a fenotypy są oceniane ręcznie albo przez bezpośrednią obserwację, albo przez obrazowanie i dalszą analizę. Mikroskopia fluorescencyjna służy do uchwycenia różnych fenotypów molekularnych za pomocą barwników lub transgenicznie wyrażonych znaczników fluorescencyjnych u poszczególnych C. elegans. Obrazowanie fluorescencyjne zazwyczaj polega na unieruchomieniu lub sparaliżowaniu zwierzęcia na szkiełkach zawierających cienkie poduszki agarozowe, co jest inwazyjne i często śmiertelne. Wiąże się to również ze stosowaniem substancji chemicznych, takich jak lewamizol lub azydek sodu, które mogą potencjalnie zakłócać proces molekularny będący przedmiotem zainteresowania2,3. Łącznie podejścia te umożliwiają gromadzenie przekrojowych danych na poziomie populacji w szerokim zakresie fenotypów, ale nie pozwalają na śledzenie poszczególnych zwierząt w czasie.

W ostatnich latach pojawiło się kilka podejść do hodowli izolowanych C. elegans, co pozwala badaczom na uchwycenie dynamicznych zmian w fizjologicznych i molekularnych fenotypach zwierząt w czasie przy użyciu nowych technologii obrazowania. Jedną z kategorii podejścia do hodowli C. elegans są urządzenia mikroprzepływowe, w tym między innymi WormFarm4, chip5 oraz chip "behavior" firmy Chronis et al.6, między innymi7,8,9. Związane z nimi są metody hodowli oparte na płynach, które wykorzystują płytki wielodołkowe do charakteryzowania pojedynczych robaków lub małych populacji w czasie10,11. Mikrofluidyka i systemy mikropłytek zapewniają doskonałe pomiary ilościowe reakcji fenotypowych u C. elegans aż do pojedynczego zwierzęcia, ale środowisko hodowli stanowi kluczowe ograniczenie. Zdecydowana większość wcześniejszych badań nad C. elegans, szczególnie w dziedzinie starzenia, została zakończona na stałych podłożach na bazie agaru. Płynna kultura powoduje, że C. elegans pływa w sposób ciągły i reprezentuje odrębny kontekst środowiskowy, który może zmienić podstawową biologię. Na przykład zwierzęta hodowane w płynnych pożywkach mają drastycznie zmienioną zawartość tłuszczu i ekspresję genów - szczególnie w przypadku genów zaangażowanych w reakcję na stres - w porównaniu ze zwierzętami hodowanymi na stałym NGM12,13. Alternatywna kategoria metod obrazowania na pojedynczych zwierzętach obejmuje urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS), które izolują poszczególne zwierzęta na pożywkach stałych, starając się bardziej naśladować standardowe środowisko doświadczane przez robaki hodowane na stałym NGM w hodowli grupowej na płytkach Petriego. WorMotel to 240-dołkowe urządzenie PDMS przeznaczone do hodowli pojedynczych zwierząt na pożywkach stałych. Każda studzienka jest wypełniana zmodyfikowanym NGM przy użyciu niskotopliwej agarozy zamiast agaru i wysiewana pokarmem bakteryjnym, tworząc stałe środowisko podłoża podobne do najpopularniejszego systemu hodowli wykorzystującego płytki Petriego. Ściany studni są okrągłe, co pozwala na obrazowanie każdego zwierzęcia niezależnie od lokalizacji w studni (unikając wizualnego zaciemnienia spowodowanego przez zwierzę w pobliżu ściany w płycie wielostudziennej). Siarczan miedzi w wąskiej fosie otaczającej każdą studnię jest używany jako środek odstraszający do trzymania zwierząt w ich studniach14,15. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że siarczan miedzi jest nieskuteczny w zapobieganiu ucieczce robaków, gdy występują awersyjne warunki środowiskowe, w tym ograniczenia dietetyczne, bakterie chorobotwórcze lub substancje chemiczne wywołujące stres komórkowy (np. Parakwat).

Drugim systemem, który wykorzystuje stałe podłoże, jest Worm Corral, który wykorzystuje hydrożel do tworzenia małego, szczelnego środowiska dla każdego robaka na slajdzie, umożliwiając długoterminowe monitorowanie indywidualnie izolowanych zwierząt16. Kluczowym ograniczeniem jest to, że zwierzęta muszą być zamknięte w środowisku jako jaja, co wymaga użycia bezpłodnych zwierząt w celu zapobieżenia reprodukcji i ogranicza leczenie farmakologiczne do jednego zastosowania. Wielodawkowe próby leków można przeprowadzić w WorMotelu poprzez przeprowadzenie wielu rund ekspozycji przed przeniesieniem robaków do urządzenia lub poprzez miejscowe dodawanie dodatkowych leków do studzienek podczas eksperymentu; Jednak w tym drugim przypadku rzeczywista dawka narażenia po dodaniu dodatkowego leku do istniejącego odwiertu jest trudna do precyzyjnego określenia ilościowego i zależy od tego, jak szybko lek ulega degradacji. Zarówno WorMotel, jak i Worm Corral doskonale nadają się do obrazowania w jasnym lub ciemnym polu w celu uchwycenia informacji związanych z aktywnością i fizjologią zwierząt (np. wzrostem i rozwojem). Chociaż systemy te mogą być używane do monitorowania fluorescencji, z naszego doświadczenia wynika, że PDMS używany do tworzenia innych technologii obrazowania pojedynczych robaków jest podatny na tworzenie mikropęcherzyków, wychwytywanie cząstek stałych i inne drobne nieprawidłowości, które generują nieregularne artefakty fluorescencyjne, które zakłócają spójną wizualizację fluorescencji i kwantyfikację, szczególnie w zakresie emisji GFP, najpowszechniejszego fluoroforu stosowanego w badaniach nad C. elegans. Do tej pory obrazowanie fluorescencyjne na żywo poszczególnych zwierząt C. elegans w sposób podłużny opiera się głównie na urządzeniach mikroprzepływowych17.

Tutaj opisujemy nowatorską metodę hodowli poszczególnych C. elegans na stałych podłożach, która jest kompatybilna zarówno z interwencjami awersyjnymi, jak i bezpośrednim obrazowaniem fluorescencyjnym. Podejście to jest podobne w koncepcji do innych technologii obrazowania pojedynczego robaka, z wyjątkiem tego, że niestandardowo formowany chip PDMS został zastąpiony dostępnymi na rynku mikrotacami polistyrenowymi pierwotnie opracowanymi do testów mikrocytotoksyczności (powszechnie nazywanymi również tacami Terasaki)18. Te mikrotace zawierają studzienki, które można wypełnić stałymi pożywkami i zasiać pokarmem bakteryjnym, ściśle naśladując środowisko doświadczane przez zwierzęta przy użyciu standardowej metodologii hodowli ciał stałych NGM. Każda studnia jest otoczona awersyjną barierą z kwasu palmitynowego, a nie siarczanu miedzi. Kwas palmitynowy jest powszechnie stosowany w celu zapobiegania ucieczce robaków z pożywki stałej, przy użyciu standardowej hodowli grupowej na płytkach Petriego w eksperymentach, w których robaki są poddawane awersyjnemu środowisku, takiemu jak ograniczenia dietetyczne lub narażenie na stresor chemiczny. Mikrotacki wytwarzają również minimalne i spójne tło fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie fluorescencyjne zwierząt bezpośrednio w ich środowisku hodowlanym. Ten nowy system hodowli pojedynczych zwierząt na bazie agaru nie tylko pozwala na śledzenie poszczególnych zwierząt przez całe życie oraz monitorowanie wzrostu, rozwoju, aktywności i długości życia, ale jest również kompatybilny z bezpośrednią mikroskopią fluorescencyjną. Ponieważ robaki mogą być obrazowane bez paraliżu lub fiksacji, biomarkery fluorescencyjne in vivo można określić ilościowo w ujęciu wzdłużnym u poszczególnych zwierząt pozostających na pożywce hodowlanej, co pozwala na obserwację dynamicznych zmian w ciągu życia każdego zwierzęcia. Ten system hodowli jest również kompatybilny z automatyczną generacją systemów do śledzenia długości życia i innych wskaźników zdrowotnych14,19. Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli poszczególnych C. elegans w tym systemie opartym na mikrotacach, omawiamy potencjalne pułapki i rozwiązywanie problemów oraz omawiamy zalety i ograniczenia w stosunku do innych systemów, a w szczególności zaktualizowany i zoptymalizowany protokół WorMotel15.

Każde środowisko hodowli pojedynczych robaków składa się z mikrotacki zamontowanej wewnątrz standardowej tacki jednodołkowej za pomocą niestandardowego adaptera wydrukowanego w 3D (Rysunek 1A). Studnie są wypełnione niskotopliwymi pożywkami hodowlanymi nicieni agarozowych (lmNGM), obsiane skoncentrowanymi bakteriami jako źródłem pożywienia i otoczone powłoką z kwasu palmitynowego, aby zapobiec ucieczce robaków (Rysunek 1B). Przestrzeń między tacą mikro a ściankami płytki jednodołkowej jest wypełniona nasyconymi kryształkami wody, aby utrzymać wilgotność (Rysunek 1B). Na pokrywę tacki nakładana jest powłoka detergentowa, aby zapobiec kondensacji. Do każdej studzienki dodaje się pojedynczego robaka, a tacę z pojedynczą studzienką uszczelnia się Parafilmem, aby utrzymać wilgoć i umożliwić wymianę tlenu. Jeden doświadczony badacz może przygotować równolegle do sześciu mikrotac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przepisy

UWAGA: Przygotuj roztwory podstawowe przed rozpoczęciem przygotowywania płytek z mikrotacy.

  1. Roztwory podstawowe do niskotopliwych pożywek wzrostowych nicieni agarozowych (lmNGM)
    1. Przygotować 1 M K2HPO4 rozpuszczając 174,18 g K2HPO4 w 1 l sterylnej wody dejonizowanej w butelce o pojemności 1 l. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Przygotować 1 M KPi (pH 6,0) rozpuszczając 136,09 g KH2HPO4 w 1 l sterylnej wody dejonizowanej w butelce o pojemności 1 l. Miareczkować roztwór za pomocą 1 M K2HPO4 do uzyskania pH 6,0. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Przygotować 1 M CaCl2 rozpuszczając 73,5 g CaCl2 w 500 ml sterylnej wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej
    4. Przygotować 1 MMgSO4 rozpuszczając 123,25 gMgSO4 w 500 ml sterylnej wody dejonizowanej w butelce o pojemności 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Przygotuj 3 M NaCl dla lmNGM: W czystej butelce o pojemności 100 ml wymieszaj 100 ml ultraczystej wody i 18,20 g NaCl. Autoklaw w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 min.
    6. Przygotuj 5 mg/ml cholesterolu, łącząc 2,5 g cholesterolu, 275 ml 100% etanolu i 25 ml sterylnej wody dejonizowanej w bursztynowej butelce o pojemności 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Przygotować 50 mM fluorodeoksyurydyny (FUdR), rozpuszczając 0,1231 g FUdR w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór. Porcjować po 1 ml roztworu do 10 probówek do mikrowirówek i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    8. Przygotować 50 mg/ml karbenicyliny, rozpuszczając 500 mg karbenicyliny w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór. Porcjować po 1 ml roztworu do 10 probówek do mikrowirówek i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    9. Przygotować 1 mM ß-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG), rozpuszczając 2,38 g IPTG w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór. Porcjować po 1 ml roztworu do 10 probówek do mikrowirówek i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotować 100 mg/ml ampicyliny, rozpuszczając 1 g ampicyliny w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm, aby wysterylizować roztwór. Podamy po 1 ml roztworu ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml do 10 probówek do mikrowirówek i przechowujemy probówki w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotowanie pożywki hodowlanej nicieni (NGM) do ogólnego utrzymania C. elegans
    1. Aby przygotować 50 płytek, rozpuść 10 g agaru Bacto, 1,5 g NaCl i 1,25 g peptonu Bacto w 486 ml ultraczystej wody w kolbie o pojemności 1 litra. Wysterylizować pożywkę przez autoklawowanie w cyklu ciekłym w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez co najmniej 30 minut.
    2. Po autoklawie pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury 55 °C. Następnie do roztworu dodać 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 i 500 μl 5 mg/ml cholesterolu.
    3. Stosując sterylną technikę, wlać 10 ml pożywki przygotowanej w kroku 1.2.2 do każdej płytki o średnicy 60 mm (łącznie 50). Pozostaw płytki z podłożem na co najmniej 30 minut do zestalenia. Odpipetować 300 μl wyhodowanej przez noc kultury bakteryjnej na środek płytki i pozostawić płytkę na stole. Pozostaw kulturę do wyschnięcia i zgrubienia przez 1-2 dni. Przechowuj te płytki NGM z bakteriami w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie premiksu lmNGM
    1. W kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml wymieszaj 2 g niskotopliwej agarozy, 0,25 g peptonu, 1 ml 3 M NaCl i 99 ml ultraczystej wody. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 min.
    2. Porcjować 10 ml lmNGM do probówek i przykryć Parafilmem, aby zapobiec utracie płynu. Zakryj probówki i pozwól im ostygnąć i zestalać się.
  4. Przygotuj 85 mM NaCl do pokarmu bakteryjnego: W butelce o pojemności 100 ml połącz 515,61 mg NaCl i napełnij do 100 ml ultraczystą wodą. Autoklaw w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 min.
  5. Przygotować absorbujące wodę kryształy poliakrylamidu, rozpuszczając 1 g superchłonnego polimeru typu S w 150 ml ultraczystej wody w autoklawowalnej butelce do wyciskania. Odetnij końcówkę, aby zapewnić odpowiednią wielkość dozowania. Autoklaw w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut, przykryć folią aluminiową i wstrząsnąć, aby wymieszać kryształy.
  6. Przygotuj roztwór detergentu, łącząc 3 ml 100% Tween-20 z 7 ml ultraczystej wody w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml.
  7. Przygotuj 5 mg/ml cholesterolu, łącząc 2,5 g cholesterolu, 275 ml 100% EtOH i 25 ml ultraczystej wody w butelce o pojemności 500 ml.
  8. Przygotować roztwór roboczy kwasu palmitynowego
    1. Zmielić 500 mg stałego kwasu palmitynowego w moździerzu i tłuczku i połączyć z 15 ml Tween-20 w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml. Wymieszaj przez wirowanie, rozpuszczając jak najwięcej kryształów.
    2. Dodaj 17,5 ml 100% etanolu i rozmieszaj roztwór, aby rozpuścić jak najwięcej kwasu palmitynowego.
    3. Dodaj 17,5 ml ultraczystej wody i rygorystycznie wiruj. Delikatnie podgrzać roztwór w kąpieli perełkowej w temperaturze 80 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia kwasu palmitynowego. Podczas chłodzenia może wytrącać się trochę kwasu palmitynowego.
  9. Przygotuj bulion lizogeniczny (LB), mieszając 20 g proszku LB z 1 litrem wody dejonizowanej w zlewce o pojemności 1 l lub większej. Porcję 500 ml bulionu rozlać na dwie zlewki o pojemności 500 ml. Bulion sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 min. Przygotowany bulion przechowuj w temperaturze pokojowej.
  10. Przygotowanie talerzy agarowych bulionu lizogenicznego (LB)
    1. Wymieszaj 10 g proszku LB i 7,5 g agaru Bacto w 500 μl wody dejonizowanej w kolbie o pojemności 1 l. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym w temperaturze 121 °C, 15 psig, przez 30 minut.
    2. W razie potrzeby dodać opcjonalne antybiotyki (500 μl ze 100 μg/ml ampicyliny) po schłodzeniu autoklawizowanej pożywki do 55 °C. Stosując sterylną technikę, należy przygotować płytki agarowe LB, wlewając 20 ml pożywki do każdej płytki o średnicy 100 mm (łącznie 25). Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie populacji robaków zsynchronizowanych z wiekiem

  1. Przygotuj populację robaków zsynchronizowanych z wiekiem, które są gotowe do dodania do mikrotacki w stadium larwalnym 4 (L4). Alternatywnie można dodać robaki na dowolnym etapie życia (FUdR należy wykluczyć z pożywki mikrotacy, jeśli robaki są dodawane w stadium rozwoju wcześniejszym niż L4, aby zapobiec zahamowaniu rozwoju).
    UWAGA: Ten krok należy wykonać 2 dni przed dodaniem robaków do mikrotacy, jeśli docelowy etap życia na początku eksperymentu to L4. Czas synchronizacji można dostosować, aby umożliwić robakom osiągnięcie pożądanego etapu życia.
  2. Temperatura może mieć wpływ na żywotność. Aby uzyskać spójne wyniki, należy użyć standardowych płytek NGM (patrz sekcja 1), aby utrzymać C. elegans w temperaturze 20 °C i przenieść robaki na świeże płytki, jeśli zabraknie im pokarmu bakteryjnego.
  3. Na podstawie tabliczek z wieloma młodymi dorosłymi robakami użyj standardowego podejścia, aby wygenerować populację zsynchronizowaną z wiekiem, najczęściej bleaching20 lub czasowe składanie jaj21.
  4. Odizoluj jaja i dodaj je do płytki NGM nakrapianej przez bakterie. W przypadku stosowania C. elegans typu dzikiego, jaja wykluwają się i tworzą robaki, osiągając stadium larwalne L4 w ciągu 2 dni.

3. Przygotowanie kultury bakterii

  1. Dzień przed rozpoczęciem eksperymentu należy zaszczepić pożądane źródło pokarmu bakteryjnego. Przygotuj ~ 5 ml kultury bakteryjnej na płytkę.
    UWAGA: Smugę bakteryjną można przygotować z miesięcznym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C jako źródło pożywienia dla E. coli.
    1. Umieść bakterie dla pojedynczych kolonii na płytce agarowej LB z zamrożonego bulionu glicerynowego.
    2. Hoduj kulturę w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Zaszczepić płynny bulion LB pojedynczą kolonią na inokulację.
    4. Wstrząsać z prędkością ~250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.

4. Nakładanie powłoki kwasu palmitynowego na mikrotacę

UWAGA: Kwas palmitynowy służy jako bariera odstraszająca, zapobiegająca ucieczce zwierząt z poszczególnych studni. Powłokę nakłada się na całą dolną powierzchnię mikrotacy, z wyjątkiem wewnętrznych powierzchni studzienek. Nystatyna jest dodawana do kwasu palmitynowego w celu złagodzenia zanieczyszczenia grzybiczego. W razie potrzeby ten krok można wykonać 1 dzień przed rozpoczęciem eksperymentu.

  1. Ustaw kąpiel perełkową na 80 °C, aby dać czas na wstępne podgrzanie.
  2. Bezpośrednio przed użyciem należy podatkować 1 ml roztworu roboczego kwasu palmitynowego na mikrotacę do oddzielnego sterylnego pojemnika (zwykle stożkowej fiolki o pojemności 15 ml) i dodać 4 μl 10 000 jednostek/ml nystatyny na 1 ml roztworu kwasu palmitynowego przed podgrzaniem.
  3. Spryskaj wewnątrz i na zewnątrz tacki etanolem (70% lub więcej) do nasycenia i strząśnij nadmiar etanolu.
    UWAGA: Resztkowy etanol powinien odparować podczas obróbki sieciowaniem UV (krok 4.4).
  4. Użyj środka sieciującego UV do sterylizacji mikrotacki (poniższe instrukcje dotyczą środka sieciującego UV użytego w tym badaniu):
    1. Umieść mikrotackę i pokrywkę w sieciowniku UV osobno (tj. nie umieszczaj pokrywek na płytkach, ponieważ promieniowanie UV nie przenika przez plastik).
    2. Zamknij drzwi i włącz sieciownik UV.
    3. Naciśnij przycisk Czas, wprowadź wartość 20 min, a następnie naciśnij przycisk Start.
    4. Po 20 minutach odwróć talerz i pokrywkę i powtórz kroki 4.2.2-4.2.3.
    5. Nosząc rękawiczki, umieść pokrywki na mikrotacy, aby zapobiec zanieczyszczeniu po sterylizacji.
  5. Dokładnie wymieszaj roztwór roboczy kwasu palmitynowego, wirując i odwracając.
  6. Umieścić stożkową fiolkę o pojemności 15 ml z roztworem roboczym kwasu palmitynowego w kąpieli perełkowej i przed użyciem pozwolić, aby wszelkie widoczne kryształy całkowicie się rozpuściły.
  7. Umieść mikrotackę na półce otaczającej wannę z kulkami z założonymi pokrywkami na ~ 2 minuty, aby się rozgrzała.
  8. Zdejmij pokrywę tacki na mikro. Powoli dodaj 200 μl roztworu roboczego kwasu palmitynowego przez tylną ściankę (dłuższy bok) mikrotacy. Załóż pokrywki i pozostaw tackę na kąpieli perełkowej na 2-3 minuty, aby roztwór kwasu palmitynowego osiadł na dnie mikrotacy.
    UWAGA: Chociaż pełne dno mikrotacki nie zostanie całkowicie pokryte do kroku 4.10, roztwór powinien rozprowadzić się równomiernie na ponad połowie dolnej powierzchni. Jeśli roztwór kwasu palmitynowego nie rozprowadza się równomiernie, włącz silnik wirowy lub wibracyjny w pobliżu mikrotacy. Zapewni to niewielką ilość wibracji, które mogą pomóc w łatwiejszym rozprzestrzenianiu się roztworu kwasu palmitynowego. Utrzymuj pokrywki mikrotac na miejscu, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  9. Powtórz krok 4.8.
    UWAGA: Mniej więcej połowa lub więcej dna mikrotacki powinna być widocznie pokryta płynnym kwasem palmitynowym.
  10. Obróć mikrotackę o 180° i powtórz kroki 4.8 i 4.9 po drugiej stronie tacy.
    UWAGA: Dno tacki Terasaki zostanie pokryte cienką warstwą roztworu kwasu palmitynowego dopiero po dodaniu pełnej połączonej objętości z obu stron (kroki 4.9 i 4.10). Mniej lub bardziej mieszanina kwasu palmitynowego może być wymagana w zależności od przygotowania mieszaniny, temperatury i innych czynników. Ogólnie rzecz biorąc, od 400 do 800 μl mieszaniny kwasu palmitynowego wystarczy do pokrycia całego dna mikrotacy. Gdy tylko dno mikrotacki zostanie widocznie zakryte, nie należy dodawać dodatkowego kwasu palmitynowego, ponieważ może to zanieczyścić studzienki.
  11. Suszyć tackę w sterylnym pojemniku do suszenia lub okapie z przepływem laminarnym przez co najmniej 1 godzinę bez przykrycia. Alternatywnie, należy wykonać ten krok dzień przed załadowaniem płytek (sekcja 5), susząc mikrotackę z założoną pokrywką w temperaturze pokojowej przez co najmniej 16 godzin.

5. Ładowanie mikrotacki niskotopliwą pożywką do hodowli nicieni (lmNGM)

UWAGA: Ta metoda wykorzystuje standardowy NGM zmieszany z niskotopliwą agarozą zamiast zwykłego agaru. Agar może zacząć żelować w temperaturze 45 °C. Podczas pracy z małymi objętościami potrzebnymi do napełnienia dołków mikrotacy, NGM na bazie agaru często zatyka końcówkę pipety i/lub tworzy nierówne powierzchnie studzienki z powodu szybkiego żelowania. NGM wykorzystujący niskotopliwą agarozę zaczyna żelować w temperaturze ~28 °C, co pozwala na łatwe pipetowanie stopionych mediów i konsekwentne tworzenie płaskich powierzchni studzienek. Przygotuj lmNGM tego samego dnia, w którym robaki mają zostać umieszczone na mikrotacy. Jeśli przygotowujesz mikrotackę z lmNGM, wysiewasz bakterie i ładujesz C. elegans w ciągu tego samego dnia, upewnij się, że zwierzęta są w pożądanym wieku lub blisko niego przed rozpoczęciem tego zestawu kroków.

  1. Umieść miskę na pipety w kąpieli perełkowej o temperaturze 80 °C, aby się rozgrzała.
  2. Rozpuść jeden 10 ml premiksu lmNGM na przygotowywaną mikrotackę (krok 1.1) w kuchence mikrofalowej przez ~30-45 s.
    1. Umieść probówki z premiksem lmNGM w zlewce o pojemności 200 ml, bez przykrycia, aby się nie przewróciły.
    2. Po ~10-15 s lub gdy premiks lmNGM zaczyna bulgotać, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową, wlej premiks lmNGM do sterylnej zlewki o pojemności 200 ml i wznów podgrzewanie w kuchence mikrofalowej.
    3. W razie potrzeby wstrzymaj się, aby zapobiec wykipieniu, i mieszaj, aby wymieszać.
    4. Przestań podgrzewać w kuchence mikrofalowej, gdy cały lmNGM zamieni się w płyn bez kawałków.
      UWAGA: Pojedyncza porcja o pojemności 10 ml wystarcza do napełnienia łącznie 192 dołków (dwóch mikrotac).
  3. Przygotuj lmNGM, dodając następujące składniki w podanej kolejności do ciepłej niskotopliwej agarozy (objętości na 10 ml niskotopliwej agarozy): 250 μL 25 mM KPi (pH 6), 10 μL 1 M CaCl2, 10 μL 1 MMgSO4 i 10 μL 5 mg/ml cholesterolu
    1. Jeśli badacz planuje badać dorosłe zwierzęta w czasie i musi zapobiec rozmnażaniu, dodaj również 10 μl 50 mM FUdR.
    2. Jeśli przeprowadzasz eksperyment z karmieniem RNAi przy użyciu wspólnego szczepu HT115 RNAi E. coli i powiązanych plazmidów RNAi, dodaj również 5 μl karbenicyliny 50 mg / ml (w celu wybrania plazmidu RNAi) i 12 μl 1 mM IPTG (w celu wywołania ekspresji dwuniciowego RNA z plazmidu RNAi).
      UWAGA: Dodatkowe dodatki mogą być dołączone w zależności od selektywnych antybiotyków i innych chemikaliów potrzebnych dla pożądanego źródła żywności. Na tym etapie do lmNGM można również dodać leki lub chemiczne czynniki stresogenne. NGM i lmNGM zawierają to samo końcowe stężenie NaCl, ale różnią się sposobem dodawania NaCl do pożywki. W przypadku NGM cały NaCl jest dodawany podczas przygotowywania pożywki (krok 1.2). W przypadku lmNGM podczas przygotowywania pożywki dodaje się porcję NaCl (krok 5.3) i porcję z pokarmem bakteryjnym (sekcja 6). Powodem tej zmiany jest mała objętość nośnika w każdym dołku na mikrotacę. Dodanie 5 μl skoncentrowanych bakterii zawieszonych w LB do studzienki zawierającej 20 μl pożywki znacznie zmieni skład odżywczy pożywki (poprzez dodanie składników LB w porównywalnej objętości). Aby tego uniknąć, bakterie są zamiast tego ponownie zawieszane w roztworze NaCl w celu usunięcia składników LB, jednocześnie zapobiegając stresowi osmotycznemu bakterii. NaCl dodany do pożywki jest odpowiednio redukowany, aby uwzględnić sól dodaną do bakterii.
  4. Wlać lmNGM do podgrzanej miski na pipety.
  5. Umieść mikrotackę na blacie stołowym, a następnie odpipetuj 20 μl lmNGM do każdej mikrotacy. Podczas ponownego napełniania pipety należy zakryć tackę mikro, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
    UWAGA: Ten krok jest łatwiejszy w przypadku elektronicznej pipety powtarzalnej.

6. Zasiewanie mikrotac pokarmem bakteryjnym

UWAGA: 5 μL 10x zagęszczonego pokarmu z nocnej kultury zaszczepionej wystarcza do wyżywienia pojedynczego C. elegans przez cały okres jego życia.

  1. Przenieść bakterie z hodowli przez noc do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml.
  2. Wirować przy ~3,500 x g przez 20 min.
  3. Usunąć supernatant. Zawiesić hodowlę bakterii przy 10-krotnym stężeniu (1/10 objętości oryginalnej kultury) z roztworem NaCl o stężeniu 85 mM.
  4. Przed dodaniem bakterii do studzienek należy przeprowadzić oględziny na mikrotacy, aby upewnić się, że stały lmNGM jest całkowicie zawarty w każdym dołku. Jeśli którykolwiek lmNGM zwisa z boku studzienki, zeskrob nadmiar lmNGM za pomocą końcówki pipety. Ten nadmiar podłoża może spowodować, że żywność wpadnie do kwasu palmitynowego, jeśli nie zostanie usunięta.
  5. Ostrożnie odpipetować 5 μl 10x skoncentrowanej kultury bakteryjnej na powierzchnię lmNGM w każdym dołku. Staraj się nie dopuścić do tego, aby kultura bakterii przedostała się przez ścianę studni do kwasu palmitynowego, ponieważ przyciągnie to robaki do opuszczenia studni.
  6. Pozostaw mikrotacki do wyschnięcia w sterylnym pojemniku do suszenia lub okapie z przepływem laminarnym na ~35 minut. Sprawdzaj co ~5 minut i uważaj, aby nie wysuszyć zbyt mocno. Wyjmij, gdy kilka studzienek jest widocznie lekko mokrych, ponieważ studzienki będą dalej wysychać podczas dodawania nicieni.

7. Zamknięcie każdej mikrotacki w jednodołkowej płytce

UWAGA: W tej sekcji mikrotaca jest zamontowana wewnątrz standardowej płytki jednodołkowej za pomocą niestandardowej wkładki wydrukowanej w 3D i otoczona kryształami pochłaniającymi wodę. Płytka jednodołkowa jest następnie zamykana i uszczelniana za pomocą Parafilm. Umożliwia to wymianę tlenu, jednocześnie zapobiegając zanieczyszczeniu i utrzymując wystarczającą wilgotność, aby zapobiec wysychaniu lmNGM w trakcie wielotygodniowych eksperymentów (eksperymenty z długością życia robaków mogą trwać 6-8 tygodni, jeśli bada się mutacje wydłużające życie lub warunki środowiskowe). Podczas przygotowywania należy przykryć płytkę, gdy coś nie jest aktywnie dodawane, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze.

  1. Wysterylizuj płytkę jednodołkową oraz wydrukowany w 3D adapter i pokrywkę, zanurzając je w 10% roztworze wybielacza. Dokładnie spłucz sterylną wodą DI. Wytrzyj do sucha chusteczką zadaniową.
  2. Spryskaj płytkę jednodołkową i adapter wydrukowany w 3D oraz pokrywkę 70% lub większym roztworem etanolu i wytrzyj do czysta chusteczką zadaniową. Pozostaw resztki etanolu do wyschnięcia.
    UWAGA: Promieniowanie UV może być również stosowane po wybielaczu i etanolu o takich samych parametrach jak mikrotacka, jak opisano powyżej w kroku 4.4.
  3. Umieść sterylną wkładkę wydrukowaną w 3D w sterylnej płytce jednodołkowej.
  4. Wysterylizuj zewnętrzną część przygotowanej mikrotacy, spryskując ją 70% etanolem.
  5. Umieść mikrotackę w adapterze wydrukowanym w 3D w płytce jednodołkowej.
  6. Wyrzuć pokrywkę tacki na mikrotackę.
  7. Obficie dozuj kryształki wody na wierzch wkładki wydrukowanej w 3D między zewnętrzną ścianką mikrotacki a wewnętrzną ścianką płytki jednodołkowej.
  8. Natychmiast dodaj robaki (sekcja 8) lub zamknij mikrotackę do użycia następnego dnia. Zamknij pokrywę tacki i użyj jednego kawałka Parafilmu, aby owinąć wszystkie cztery strony, aby uszczelnić mikrotackę. Powtórz etap uszczelniania z Parafilm jeszcze dwa razy, w sumie trzy warstwy.
  9. Po zamknięciu mikrotacki należy pozostawić ją na stole w temperaturze pokojowej do 4 dni przed dodaniem robaków (punkt 8).

8. Dodawanie robaków do mikrotacki

UWAGA: Jeden robak może być ręcznie dodany do każdej studni, przenosząc zwierzęta z populacji robaków zsynchronizowanych wiekowo (sekcja 2) za pomocą platynowego kilofa. Przenoś zwierzęta tylko na pożądanym etapie życia. Jeśli proces przenoszenia trwa dłużej niż 1 godzinę, lmNGM w dołkach mikrotac może wyschnąć. Przenoszenie grup od 10 do 20 robaków na raz może przyspieszyć ten krok, ale wymaga trochę praktyki, aby konsekwentnie wypuszczać tylko jedno zwierzę na studzienkę.

  1. Dodaj jeden nicień do studzienki, gdy osiągną pożądany etap życia.
  2. Umieść pokrywkę z powrotem na mikrotacce podczas zbierania robaków z płytki źródłowej, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

9. Zakończenie przygotowania środowiska hodowlanego do długotrwałego użytkowania

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane, aby zapewnić, że media i robaki w mikrotace pozostaną nawodnione przez czas trwania eksperymentu.

  1. Dodaj ~40 μl roztworu detergentu do pokrywki płytki jednodołkowej i użyj chusteczki roboczej, aby równomiernie pokryć pokrywkę. Ta powłoka zapobiegnie kondensacji w miarę upływu czasu po uszczelnieniu płyty. Użyj dodatkowych chusteczek zadaniowych, aby rozprowadzić roztwór detergentu, aż widzenie przez pokrywkę nie zostanie zniekształcone (zwykle zajmuje to około dwóch chusteczek roboczych).
  2. Sprawdź kryształki wody, aby upewnić się, że są na poziomie górnej krawędzi mikrotacki i nie przelewają się. W razie potrzeby dodaj lub usuń kryształki wody na talerz.
  3. Stosując następujące podejście, owiń tacę Parafilm (w sumie trzy sztuki), aby upewnić się, że uszczelnienie Parafilm będzie trwało przez długi czas.
    1. Lekko rozciągnij pierwszy kawałek Parafilmu, aby pokryć dwie strony tacy.
    2. Lekko rozciągnij drugi kawałek Parafilmu i przykryj pozostałe boki tacy.
    3. Rozciągnij ostatni kawałek Parafilmu i całkowicie zawiń wszystkie cztery boki tacy, zakrywając pierwszy i drugi kawałek Parafilmu. Prawidłowo zamknięta mikrotaca może pozostać nawodniona przez ~2 miesiące.
      UWAGA: Monitoruj integralność Parafilmu co 1-2 tygodnie przez cały czas trwania eksperymentu i wymieniaj w razie potrzeby.
    4. Przetrzyj górną część tacki chusteczką zadaniową, zwilżoną 70% etanolem, aby usunąć wszelkie odciski palców.
  4. Oznacz płytkę jednodołkową za pomocą taśmy. Mikrotaca jest teraz gotowa do obrazowania i długoterminowego przechowywania w celu monitorowania robaków w czasie. Pomiędzy sesjami obrazowania utrzymuj tackę w temperaturze 20 °C. Mikrotacka może być wielokrotnie otwierana i ponownie zamykana w celu dozowania leku lub innych procedur, ale należy ją zminimalizować, aby zapobiec zanieczyszczeniu i utracie wilgoci.

10. Obrazowanie pojedynczych robaków w studzienkach mikrotac

UWAGA: Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego opisu, jak przygotować środowisko hodowli mikrotac. Po przygotowaniu i zasiedleniu robakami, środowiska hodowli pojedynczych robaków na mikrotacach mogą być wykorzystywane do wzdłużnego monitorowania wielu fenotypów przy użyciu technik ustalonych dla standardowych hodowli na płytkach Petriego. Poniższa sekcja zawiera podstawowe instrukcje dotyczące pomiaru niektórych popularnych fenotypów. Obrazowanie fluorescencyjne musi być wykonywane w mikroskopie pionowym. Załamanie światła przez tacę Terasaki jest zminimalizowane w ciemnym pomieszczeniu.

  1. Długość życia: Zmierz żywotność, delikatnie stukając w bok lub górę talerza lub świecąc jasnoniebieskim światłem na talerz i obserwując każde zwierzę. Zapunktuj zwierzę "martwe", jeśli nie poruszy się w ciągu kilku sekund. Powtarzaj to zadanie co 1-3 dni, aż wszystkie robaki umrą.
    UWAGA: Środowisko hodowli mikrotac jest kompatybilne z systemami, które automatyzują gromadzenie i analizę obrazów w celu oszacowania długości życia14,19.
  2. Mikroskopia standardowa: Wykonaj obrazowanie w jasnym polu (lub w ciemnym polu) na poszczególnych studzienkach lub na całej tacy za pomocą kamery lub skanera o wysokiej rozdzielczości. Te dane obrazowania mogą być używane dla różnych fenotypów, w tym wielkości zwierząt22,23,24, development25, activity14,19 i żywotność.
  3. Mikroskopia fluorescencyjna: Obrazowanie fluorescencyjne można wykonywać na pojedynczych studzienkach ręcznie lub za pomocą zmotoryzowanego systemu platformowego. Tace jednodołkowe są kompatybilne ze standardowymi adapterami płytek wielodołkowych. Stosunek sygnału do szumu jest zminimalizowany, jeśli urządzenie jest umieszczone w skrzynce o czarnych ściankach.
    UWAGA: Ponieważ robaki są obrazowane, pozostając swobodnie pełzającymi, ten system hodowli dobrze nadaje się do obrazowania o niskiej rozdzielczości w celu uchwycenia fluorescencji całego ciała i lokalizacji szorstkich tkanek fluoroforów. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu zazwyczaj wymaga unieruchomienia zwierząt, aby zapobiec ruchowi. Chociaż powinno być możliwe miejscowe zastosowanie środka paraliżującego (np. azydku sodu lub lewamizolu) do każdej studzienki i kontynuowanie obrazowania w wyższej rozdzielczości, wykluczyłoby to wielokrotne pomiary tego samego robaka w późniejszych punktach czasowych. System hodowli, zgodnie z opisem, również nie jest przeznaczony do odwrócenia, co uniemożliwia stosowanie systemów mikroskopu odwróconego.
    1. Jeśli jasne pole nie jest wykorzystywane do pomiaru długości życia, a rejestrowana jest tylko fluorescencja, należy zmierzyć długość życia ręcznie. Pozostawienie niebieskiego światła (używanego do wzbudzenia GFP) na robaku przez 5 sekund skłoni zwierzę do ruchu. Jeśli zwierzę nie poruszyło się w ciągu 5 sekund, należy je uznać za martwe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane tutaj środowisko hodowli pojedynczych nicieni w mikropłytkach może być wykorzystane do monitorowania różnych fenotypów, w tym długości życia i okresu zdrowia (health span), aktywności i ruchu, kształtu ciała i geometrii pełzania, a także ekspresji transgenicznych fluorescencyjnych biomarkerów w poszczególnych osobnikach w czasie. System hodowli w mikropłytkach jest zgodny z analizą długości życia przeprowadzaną zarówno poprzez ręczną ocenę, jak i zbieranie obrazów i późniejszą analizę obrazowania. Podobnie jak w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy nowatorski system hodowli, który dostosowuje mikrotace, pierwotnie opracowane do testów typowania tkanek ludzkiego antygenu leukocytów, aby umożliwić izolację i charakterystykę pojedynczych C. elegans w czasie w środowisku pożywki stałej, które jest kontekstowo podobne do NGM na bazie agaru, który jest standardem w badaniach nad C. elegans. System ten jest kompatybilny z różnymi interwencjami, w tym ograniczeniami dietetycznymi, leczeniem farmakami egzogennymi, wyzwaniem związany...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH R35GM133588 dla G.L.S., grant szkoleniowy NIHT32GM008659 dla L.E., United States National Academy of Medicine Catalyst Award dla G.L.S., oraz State of Arizona Technology and Research Initiative Fund zarządzany przez Arizona Board of Regents.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukowane w 3D wkładki terasakiFirma drukarska na zamówienieRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		Druk FDM, rozmiar dyszy 0,6 mm przy użyciu standardowych systemów PLA plus filament
AirClean AC624LF pionowym wyciągiem z przepływem laminarnymFisher Scientific36-100-4376
Pepton BactoThermo Scientific211677
CaCl2 Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Szczep typu dzikiego
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)OP50Standardowy pokarm laboratoryjny dla C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Nawilżające kryształy wody M2 Polymer TechnologiesTyp SSuper chłonny polimer typu S
Izopropyl ß-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Chusteczki do zadań
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Aparat monochromatyczny Leica K5 sCMOSLeica Microsystems11547112
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy Leica M205 FCALeica Microsystems10450826
Niskotopliwa agarozaResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClBioodczynniki FisherBP358-1
Nunc OmniTray Płytka jednodołkowaThermo Scientific264728
NystatynaSigmaN1538
Kwas palmitynowyAcros organics129700010
Ręczniki papieroweCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075Sieciownik UV
Tacki Terasaki (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Bibliografia

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla na po ywkach sta ychindywidualne ledzenie nicienipomiar d ugo ci yciabariera kwasu palmitynowegobiomarkery fluorescencyjneanaliza d ugo ci okresu zdrowiazautomatyzowane obrazowanie
Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.