Artykuł metodologiczny

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

DOI:

10.3791/64698

⸱

27 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1School of Infection & Immunity, University of Glasgow

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklasty (OC) to komórki resorpujące kości, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju szkieletu i przebudowie kości u dorosłych. Kilka zaburzeń kości jest spowodowanych zwiększonym różnicowaniem i aktywacją OC, więc hamowanie tej patobiologii jest kluczową zasadą terapeutyczną. Dwa kluczowe czynniki napędzające różnicowanie OC od prekursorów szpiku: czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). Od dawna wiadomo, że ludzkie krążące monocyty CD14 + różnicują się w OC in vitro. Jednak czas ekspozycji i stężenie RANKL wpływają na skuteczność różnicowania. Rzeczywiście, opisano protokoły generowania ludzkich OC in vitro, ale często skutkują one słabym i długotrwałym procesem różnicowania. W tym celu zapewniony jest solidny i ustandaryzowany protokół do generowania funkcjonalnie aktywnych, dojrzałych ludzkich OC w odpowiednim czasie. Monocyty CD14 + są wzbogacone z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i zaszczepione M-CSF w celu zwiększenia RANK. Późniejsza ekspozycja na RANKL generuje OC w sposób zależny od dawki i czasu. OC są identyfikowane i oznaczane ilościowo przez barwienie fosfatazą kwasoodporną winianu (TRAP) i analizę mikroskopową światła. Barwienie immunofluorescencyjne jąder i F-aktyny służy do identyfikacji funkcjonalnie aktywnych OC. Ponadto dojrzałe OC OSCAR+CD14− są dodatkowo wzbogacane poprzez sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i ilościowe określanie funkcjonalności OC za pomocą testów resorpcji minerałów (lub zębiny/kości) i tworzenia pierścieni aktynowych. Wreszcie, znany inhibitor OC, rotenon, jest stosowany w dojrzałych OC, co pokazuje, że produkcja adenozynotrifosforanu (ATP) jest niezbędna dla integralności pierścienia aktynowego i funkcji OC. Podsumowując, w niniejszej pracy ustanowiono solidny test do różnicowania dużej liczby OC, który w połączeniu z barwieniem pierścieni aktynowych i testem ATP stanowi użyteczny model in vitro do oceny funkcji OC i badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych związków terapeutycznych, które mogą modulować proces różnicowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklasty (OC) to wielojądrowe gigantyczne komórki linii krwiotwórczej z unikalną zdolnością do resorpcji kości. Są one odpowiedzialne za rozwój i ciągłą przebudowę skeletonu1,2. W kostnych fazach rozwoju OC i makrofagi rezydujące w tkankach pochodzą z erytro-szpikowych komórek progenitorowych i kolonizują niszę kostną i tkanki narządów. W warunkach fizjologicznych erytro-szpikowe komórki progenitorowe są niezbędne do prawidłowego rozwoju kości i wyrzynania się zębów, podczas gdy napływ krążących monocytów krwi do niszy kostnej zapewnia poporodowe utrzymanie OC, masy kostnej i jamy szpiku kostnego3. W warunkach patologicznych monocyty są rekrutowane do miejsc aktywnego stanu zapalnego i mogą przyczyniać się do patologicznego niszczenia kości4,5.

Pacjenci z kilkoma formami zapalenia stawów doświadczają zapalenia stawów, co prowadzi do postępującego niszczenia stawów spowodowanego przez OCs6. Na przykład w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS) nadmiernie aktywowane OC są odpowiedzialne za patologiczną erozję kości i niszczenie stawów7,8, a obecne leczenie często nie poprawia ani nie zatrzymuje uszkodzenia kości9,10,11. Zmiany w krążących monocytach, zarówno pod względem rozmieszczenia populacji, jak i sygnatur transkryptomicznych i epigenetycznych, odnotowano u pacjentów z RZS12,13,14. Ponadto doniesiono, że zmienione odpowiedzi monocytów na stymulację zapalną wpływają na osteoklastogenezę u pacjentów z RZS z aktywną chorobą15,16,17.

Różnicowanie OC to złożony, wieloetapowy proces polegający na zaangażowaniu komórek prekursorowych szpiku w prekursory OC. Podczas osteoklastogenezy OC stają się gigantyczne i wielojądrzaste poprzez fuzję komórka-komórka, niepełną cytokinezę i proces recyklingu jądrowego opisany jako rozszczepienie i fuzja18,19,20. Zdolność do różnicowania OC in vitro pozwoliła na znaczący postęp w zrozumieniu biologii kości21. OC odróżniają się od prekursorów po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). To ostatnie jest niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania OC in vitro i in vivo, nawet w warunkach zapalnych6,22,23. RANKL jest prezentowany przez osteoblasty i osteocyty, a także przez aktywowane limfocyty T i fibroblasty w zapalnym RZS synovium2,24,25. Podczas procesu różnicowania OC monocyty wystawione na działanie M-CSF zwiększają ekspresję receptora czynnika jądrowego kappa-B (RANK) na błonie komórkowej i pod wpływem późniejszej stymulacji RANKL różnicują się w oporne na winian fosfatazy kwasowej (TRAP)-dodatnie jednojądrzaste pre-OC, a następnie w wielojądrowe OCs15,26. OC wytwarzają kilka enzymów, z których najważniejszym jest TRAP, który umożliwia degradację fosfoprotein w obrębie bone27. Regulatorem i markerem różnicowania OC jest receptor związany z OC (OSCAR). Jest regulowany w górę wcześnie w komórkach prekursorowych, które zobowiązują się do linii OC28. Dojrzałe gigantyczne wielojądrowe OC mogą degradować (resorbować) macierz szkieletową, generując dużą strefę uszczelniającą, która jest wykonana z pierścienia aktynowego otaczającego pofałdowaną granicę21,29,30. Zdolność OC do resorpcji kości wymaga reorganizacji cytoszkieletu, a w konsekwencji polaryzacji i powstania pofałdowanej błony, która jest tak zwaną pofałdowaną granicą. Pofałdowana granica otoczona jest dużym okrągłym pasmem o strukturze bogatej w F-aktynę, który jest pierścieniem aktynowym lub strefą uszczelniającą. Integralność pierścienia aktynowego jest niezbędna, aby OC resorpowały kość zarówno in vitro, jak i in vivo, a wadliwe tworzenie pofałdowanych granic jest związane z ekspresją trifosfatazy adenozynowej (V-ATPazy) w dolnej wakuoli31,32,33. Co więcej, OC są komórkami bogatymi w mitochondria, a trifosforan adenozyny (ATP) wiąże się ze strukturami podobnymi do mitochondriów w OC zlokalizowanych na pofałdowanej granicy31,32,33. Rotenon działa jako silny inhibitor kompleksu mitochondrialnego I i wpływa na produkcję ATP. Wykazano również, że rotenon hamuje różnicowanie i funkcję OC34.

Ten protokół opisuje skuteczną i zoptymalizowaną metodę osteoklastogenezy in vitro z próbek ludzkiej krwi obwodowej. W ludzkiej krwi obwodowej monocyty CD14+ są głównym źródłem OCs15,35,36. W tym protokole kinetyka ekspozycji oraz stężenia M-CSF i RANKL zostały dostosowane w celu uzyskania optymalnej osteoklastogenezy. Komórki jednojądrzaste są najpierw oddzielane od erytrocytów i granulocytów obecnych we krwi pełnej za pomocą gradientu gęstości; następnie są wzbogacane o monocyty CD14 + za pomocą pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane monocyty CD14 + są następnie inkubowane przez noc z M-CSF. To przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Późniejsze dodanie RANKL indukuje osteoklastogenezę i wielojądrowość w sposób zależny od czasu. OC z aktywną resorpcją pokazują charakterystyczny rozkład pierścieni F-aktyny na krawędzi błony komórkowej30,32 i barwienie dla TRAP. Dojrzałe OC analizuje się poprzez ilościowe określenie komórek wielojądrowych TRAP+ (więcej niż trzy jądra). Zdolność funkcjonalną dojrzałych OC można ocenić na podstawie ich resorpcji, integralności pierścienia aktynowego i produkcji ATP. Co więcej, zróżnicowane OC CD14− OSCAR+ mogą być wzbogacane i wykorzystywane do oceny wpływu niektórych związków na funkcjonalność OC poprzez resorpcję minerałów (lub zębiny) i organizację F-aktyny. Dodatkowo w niniejszej pracy wykorzystano znany inhibitor OC, rotenon, jako przykład związku wpływającego na funkcjonalność OC. Zmniejszona aktywność resorpcyjna OC pod wpływem rotenonu wiąże się ze zmniejszoną produkcją ATP i fragmentacją pierścienia aktynowego. Podsumowując, protokół ten ustanawia solidny test, który może być wykorzystany jako metoda referencyjna do badania kilku biologicznych aspektów różnicowania i funkcji OC in vitro.

Ta metodologia może być użyta do oceny (1) potencjału krążących monocytów do różnicowania się w OC w zdrowiu i chorobach, a także (2) wpływu kandydatów terapeutycznych na różnicowanie i funkcję OC. Ten solidny protokół osteoklastogenezy umożliwia określenie skuteczności i mechanizmów terapii ukierunkowanych na kości zarówno w odniesieniu do różnicowania OC z komórek prekursorowych, jak i funkcji dojrzałych OC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płaszcze Buffy uzyskane ze Szkockiej Narodowej Służby Transfuzji Krwi (Edynburg) oraz stożki leukocytarne uzyskane z NHS Blood and Transplant (Newcastle) są dostarczane badaczom z Uniwersytetu w Glasgow w całkowicie anonimowej (nieidentyfikowalnej) formie od w pełni zgodnych dawców krwi NHS. Składniki krwi kożucha kożuchowego i stożka leukocytów są produkowane ze standardowego donacji krwi NHS podanej w centrum krwiodawstwa NHS w Szkocji lub Anglii. Dawca krwi wyraża świadomą zgodę w momencie oddawania krwi na nadwyżkę krwi, która nie jest wykorzystywana w standardowej praktyce klinicznej NHS, do wykorzystania w zatwierdzonych badaniach medycznych. Etyczna zgoda Komitetu ds. Etyki Badań NHS oraz podpisane formularze zgody dawcy na wykorzystanie tych krwiodawców są przechowywane przez służbę krwiodawstwa NHS. Zgodę na dostęp do krwi, na które wydano zgodę, i wykorzystanie jej w zatwierdzonych badaniach medycznych, uzyskano i uzyskano przy użyciu standardowego wewnętrznego procesu składania wniosków i przeglądu przez Krajową Służbę Transfuzji Krwi (Szkocja) oraz NHS Blood and Transport (Anglia). Nie była wymagana żadna dalsza zgoda NHS REC ani wewnętrzna komisja etyczna Uniwersytetu w Glasgow na wykorzystanie składników krwi w zatwierdzonych badaniach medycznych.

1. Uwagi ogólne przed rozpoczęciem

  1. Kontynuuj wszystkie prace z krwią ostrożnie. Należy wziąć pod uwagę potencjalne zagrożenia związane z różnymi czynnikami zakaźnymi, które mogą być obecne w próbkach.
  2. Wszystkie prace należy wykonywać ostrożnie w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, w rękawicach i fartuchach laboratoryjnych.
  3. Wykonaj utylizację bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
  4. Uzyskaj odpowiednią zgodę i zatwierdzenia etyczne przed pobraniem próbki zgodnie z przepisami władz lokalnych.
  5. Ogólnie rzecz biorąc, 1 ml świeżej krwi da 1 milion PBMC, a monocyty CD14 + stanowią około 10% -30% PBMC. Dla porównania, 10 ml stożka leukocytów może zawierać 5 x 10 8-15 x 108 PBMC. Aby uzyskać więcej informacji na temat izolacji PBMC, zapoznaj się z poprzednim protokołem37.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od krwi pełnej

  1. Pobrać wymaganą ilość świeżej krwi od zdrowych dawców do probówek do pobierania heparyny litowej.
    UWAGA: Można również stosować inne probówki z odpowiednimi antykoagulantami (np. probówki z heparyną sodową). W przypadku większej liczby komórek można użyć czopków leukocytów lub kożuchów.
  2. Aby wyizolować PBMCs, przenieś krew do nowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz ją sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) w stosunku 1:1 lub 1:3 odpowiednio dla świeżej krwi lub stożków leukocytów / kożuchów.
  3. Delikatnie wymieszaj komórki kilka razy przez odwrócenie.
  4. Przygotować probówki o pojemności 15 ml zawierające 3 ml pożywki o gradiencie gęstości. Powoli ułóż 8-10 ml rozcieńczonej krwi na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości i wiruj przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez hamulca.
    UWAGA: Ostrożnie nałóż krew na podłoże o gradiencie gęstości, aby zapobiec mieszaniu. Mieszanie może spowodować utratę PBMC.
  5. Ostrożnie wyrzuć górną warstwę (zawierającą osocze) za pomocą pipety Pasteura, zbierz znajdującą się pod spodem warstwę międzyfazową zawierającą PBMC (biała, pierścieniowa struktura) i przenieś tę warstwę do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Zawiesić komórki sterylnym 1x PBS do 50 ml i zmyć resztkową pożywkę gradientu gęstości przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z pełnym hamulcem.
  7. Aby usunąć resztki płytek krwi, powtórz proces z dodatkowym wolniejszym wirowaniem przy 200 x g przez 10 minut przy RT bez hamulca.
  8. Opcjonalnie: Aby usunąć przeniesienie czerwonych krwinek, rozcieńczyć bufor do lizy czerwonych krwinek (10x, tabela materiałów) w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej i nałożyć 3 ml rozcieńczonego buforu na osad. Wymieszaj i inkubuj przez 3 minuty. Przemyć osad w objętości do 50 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut przy RT z pełnym hamulcem.
  9. Ponownie zawiesić wyizolowane i oczyszczone PBMC w 20 ml 1x PBS i policzyć je za pomocą hemacytometru lub zgodnie z innymi standardowymi metodami.
    UWAGA: Metody rozcieńczania i zliczania komórek muszą być odpowiednio dostosowane w oparciu o gęstość komórek i zastosowane urządzenie zliczające.

3. Wzbogacanie monocytów CD14+ z PBMC

  1. Wyizoluj monocyty CD14 + z PBMC za pomocą zestawu selekcyjnego CD14 + dla człowieka zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów).
    UWAGA: Klasyczne monocyty CD14 + CD16− są głównym źródłem prekursorów OC 35; Można rozważyć alternatywne metody oczyszczania.
  2. Przenieś 1 x 107 PBMC do odpowiedniej polistyrenowej rurki okrągłodennej (tj. pasującej do magnesu zestawu selekcyjnego) i granuluj komórki o masie 300 x g przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do separacji komórek (PBS, 2% płodowa surowica bydlęca [FBS], 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]) do końcowego stężenia 1 x 10,8 komórek/ml i inkubować z 10 μl koktajlu przeciwciał na 100 μl pod pokrywką przez 10 min.
    UWAGA: Komórki są ponownie zawieszane w stężeniu 1 x 108 komórek/ml; Odpowiednio dostosuj głośność.
  4. Po inkubacji dodać 10 μl kulek nanocząstek magnetycznych na 100 μl i inkubować przez 3 minuty pod pokrywką.
    UWAGA: Dostosuj objętość koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych, aby uzyskać stężenie 10 μL/ml.
  5. Uzupełnij objętość do 2,5 ml buforem do separacji komórek, umieść probówkę w magnesie (bez pokrywki) i inkubuj przez 3 minuty. Wyrzuć ujemną populację komórek jednym ciągłym ruchem przez odwrócenie, gdy probówka jest nadal w magnesie.
    UWAGA: W przypadku używania >2 x 108 PBMC i większego magnesu, uzupełnij do 5 ml lub 10 ml buforem do separacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Wyjmij rurkę z magnesu i umyj wzbogacone monocyty CD14 + przyczepione do kulek magnetycznych poprzez ponowne zawieszenie ich w 2,5 ml buforu do separacji komórek. Inkubować przez 3 minuty wewnątrz magnesu jak poprzednio, odrzucić frakcję ujemną i powtórzyć jeszcze raz.
  7. Odwirować wszystkie zebrane komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml minimalnej pożywki niezbędnej alfa (α-MEM; Tabela materiałów) uzupełniony 1% L-glutaminą, 1% penicyliną/streptomycyną (kompletny α-MEM) i 10% FBS.
    UWAGA: Zaleca się kontrolę czystości po wzbogaceniu za pomocą cytometrii przepływowej i należy oczekiwać czystości ≥96%. Dodatkowe etapy prania (krok 3.6) mogą zwiększyć czystość.

4. Różnicowanie OC in vitro

  1. Policz wzbogacone monocyty CD14 + za pomocą hemacytometru.
  2. Osadzać komórki w ilości 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 1 x 106 komórek/ml w kompletnym α-MEM uzupełnionym 10% FBS.
  3. Aby rozróżnić OC, dodaj M-CSF w końcowym stężeniu 25 ng/ml do zawiesiny komórek.
    UWAGA: Na 1 ml zawiesiny komórkowej dodać 0,25 μl M-CSF ze stężeniem podstawowym 100 μg/ml.
  4. Wymieszać dokładnie pipetując w celu homogenizacji zawiesiny komórek i płytki 100 μl/basenik na płaskiej 96-dołkowej płytce do końcowej gęstości komórek 1 x 105 komórek/basenik.
  5. Dodaj 200 μl/studzienkę sterylnej wody destylowanej do studzienek wokół posianych komórek, aby zapobiec parowaniu podłoża i efektom krawędziowym w systemie hodowli.
  6. Inkubować komórki przez noc, przez około 18–20 godzin, w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Po całonocnej inkubacji ostrożnie usunąć połowę pożywki (50 μl/studzienkę) przez aspirację za pomocą pipety P200, unikając dotykania dna studzienki, i zastąpić świeżym, ciepłym, kompletnym α-MEM zawierającym 10% FBS, 25 ng/mL M-CSF i 50 ng/ml RANKL, aby uzyskać końcowe stężenie 25 ng/mL
    UWAGA: Na 1 ml pożywki dodać 0,25 μl M-CSF i 0,5 μl RANKL ze stężenia podstawowego 100 μg/ml.
  8. Zmieniaj pożywkę co 3 dni i różnicuj komórki w OC przez 7-14 dni (ryc. 1).
    UWAGA: Utrzymuj stałe stężenia M-CSF i RANKL w całej kulturze.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przepływ pracy różnicowania OC. Schematyczny przegląd izolacji monocytów CD14+ z PBMC i różnicowania do dojrzałych OC w obecności M-CSF i RANKL przez 7-14 dni. RT = temperatura pokojowa. Obraz utworzony za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Barwienie TRAP dla osteoklastów

  1. Ostrożnie usunąć pożywkę, utrwalić zróżnicowane przylegające OC za pomocą 100 μl/studzienkę uprzednio przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubować przez 1 minutę. Nie dotykaj dna studzienek, aby uniknąć zarysowania przylegających komórek.
    UWAGA: Roztwór utrwalający przygotowuje się w następujący sposób: 12,5 ml roztworu cytrynianu (zawartego w zestawie do barwienia TRAP), 32,5 ml acetonu i 5 ml 37% formaldehydu.
  2. Umyj studzienki trzykrotnie 300 μl sterylnej wody destylowanej. Po umyciu wysusz talerze.
  3. Przygotować roztwór barwiący zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela Materiałów); dodać 5 μl Fast Garnet i 5 μL azotynu sodu, aby uzyskać roztwór Fast Garnet; wymieszać przez inwersję i inkubować przez 3 minuty w temperaturze suchej masy. Przygotować 1 ml roztworu barwiącego, mieszając 900 μl sterylnej wody destylowanej, 10 μl naftolu, 40 μl roztworu octanu, 50 μl roztworu winianu i 10 μl roztworu Fast Garnet.
  4. Dodać 100 μl/basenik świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w ciemności przez 20 minut.
  5. Po inkubacji usunąć roztwór barwiący przez odwrócenie i umyć płytkę trzykrotnie 300 μl/studzienkę wody destylowanej.
  6. Usuń nadmiar wody, stukając talerzami o ręczniki papierowe. Pozostaw talerze otwarte i chronione przed światłem do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
    UWAGA: Suche talerze można przechowywać do 6 miesięcy. Czasami szczątkowe mogą sprzyjać rozwojowi pleśni, która jest widoczna pod mikroskopem; Można to usunąć w dowolnym momencie, myjąc dotknięte studnie wodą destylowaną i pozostawiając je ponownie do wyschnięcia na powietrzu.
  7. Wykonuj zdjęcia z powiększeniem 10x lub 20x za pomocą mikroskopu jasnego pola z opcją kafelków, aby uchwycić całą powierzchnię studni.
  8. Ręcznie policz OC zidentyfikowane jako fioletowe komórki barwione TRAP+ z więcej niż trzema jądrami za pomocą oprogramowania do analizy obrazu z wtyczką licznika komórek.
    UWAGA: Liczba OC TRAP+ na odwiert jest zależna od dawcy i może wahać się od ~200-1,600 OC/odwiert, przy średniej około 1,000 OC/odwiert. Ponadto, aby przeanalizować dane, liczby OC powinny być określone w trzech różnych dołkach (kontrpróbach technicznych), a średnia powinna być obliczona dla każdego stanu i dla każdej kontrpróby biologicznej.

6. Test resorpcji kości

  1. Świeżo wzbogacone monocyty CD14 + należy umieścić na 96-dołkowych płytkach do badania kości pokrytych fosforanem wapnia w ilości 1 x 105 komórek/dołek i różnicować OC przez 7-14 dni, jak wskazano w krokach 4.1-4.8, i zmieniać pożywkę co 3 dni.
    UWAGA: Zamiast płytek do testów kostnych można użyć plastrów zębiny/kości słoniowej lub kości bydlęcej. Jeśli tak, całkowity czas hodowli należy wydłużyć do 14-21 dni ze względu na bardziej złożone podłoże do resorpcji.
  2. W końcowym punkcie czasowym ostrożnie usuń pożywkę, unikając dotykania dna studzienki, i zlizuj komórki 10% roztworem podchlorynu sodu. Umyj studzienki trzykrotnie wodą destylowaną.
  3. Zeskanuj suche płytki za pomocą mikroskopu jasnego pola i przeanalizuj/określ ilościowo uzyskane obrazy wgłębień resorpcyjnych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

7. Barwienie fluorescencyjne pierścienia aktynowego

  1. Płytka 100 μl / basenik izolowanych monocytów CD14 + w 18-dołkowym szkiełku komorowym o gęstości komórek 1 x 105 komórek / basenik. Różnicuj OC w obecności M-CSF i RANKL, jak opisano wcześniej (kroki 4.1-4.8), w tym zmieniaj podłoże co 3 dni.
  2. W końcowym punkcie czasu delikatnie usuń pożywkę i umyj każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego PBS o pH 7,4. Nie pozwól, aby studzienki wyschły między którymkolwiek z etapów.
  3. Utrwalić próbkę w 100 μl/studzienkę 4% roztworu formaldehydu w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym wstrząsaniem.
    UWAGA: Metanol może zakłócać działanie aktyny podczas procesu utrwalania. Dlatego najlepiej jest unikać wszelkich utrwalaczy zawierających metanol. Preferowanym utrwalaczem jest formaldehyd wolny od metanolu. Wytrząsarka orbitalna użyta w tym kroku protokołu została ustawiona na ustawienie mocy 3 z 10.
  4. Przemyć dwukrotnie 200 μl/basenik PBS, przepuścić komórki 100 μl/basenik 0,1% roztworu Triton X-100 rozcieńczonego w PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym wstrząsaniem.
  5. Przemyć dwukrotnie 200 μl/studzienkę PBS. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie i zwiększyć sygnał, dodać 100 μl / studzienkę roztworu blokującego sporządzonego z 2% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym wstrząsaniem.
  6. Usunąć roztwór blokujący i dodać 100 μl / basenik fluorescencyjnie sprzężonego roztworu falloidyny rozcieńczonego w 2% roztworze BSA/PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem i chronić przed światłem.
    UWAGA: Dostosuj stężenie barwnika falloidyny zgodnie z zaleceniami producenta.
  7. Przemyć dwukrotnie 200 μl/studzienkę PBS, wybarwić jądra 100 μl/studzienkę roztworu PBS zawierającego 300 nM DAPI i inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej na orbitalnym wytrząsarce z delikatnym wstrząsaniem i chronić przed światłem.
    UWAGA: DAPI rozcieńcza się w wodzie destylowanej w celu uzyskania roztworu podstawowego DAPI o stężeniu 14,3 mM (5 mg/ml). Roztwór podstawowy rozcieńcza się następnie do końcowego stężenia 300 μM. Na koniec roztwór DAPI o stężeniu 300 μM rozcieńcza się ponownie w PBS do końcowego stężenia 300 nM.
  8. Po 10-15 minutach usuń roztwór DAPI i zastąp go 100 μL/studzienka PBS.
    UWAGA: W zależności od wybranych szkiełek komorowych, należy przechowywać z odpowiednią objętością PBS (100 μL/studzienkę w przypadku szkiełek 18-dołkowych) lub zamontować szkiełko z szkiełkami nakrywkowymi i odpowiednim medium montażowym. Szkiełka komorowe można przechowywać w lodówce do 1 tygodnia. W przypadku szkiełek z 18-dołkową komorą należy użyć 50-100 μl objętości barwienia i 200-300 μl do mycia. Odpowiednio przeskaluj w górę dla innych rozmiarów szkiełek komory. Aby uniknąć parowania, szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w przykrytym pojemniku w czasie inkubacji. Użycie wytrząsarki orbitalnej jest zalecane, ale nie jest to konieczne.
  9. Wizualizację barwienia za pomocą odpowiednich mikroskopów immunofluorescencyjnych lub konfokalnych i powiększeń od 4x do 40x.

8. Wzbogacanie dojrzałych OC i prekursorów OC za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej

  1. Ponownie zawiesić świeżo wzbogacone monocyty CD14 + w 1 x 106 komórek/ml i różnicować je w dojrzałe OC w obecności M-CSF i RANKL w taki sam sposób, jak opisano powyżej (kroki 4.1-4.8).
    UWAGA: Podczas skalowania w górę z płytki 96-dołkowej do większego rozmiaru płytki, postępuj zgodnie z tabelą 1; Objętości te są obliczane na podstawie roztworu 1 x 106 komórek/ml i zapewniają optymalną gęstość do fuzji komórka-komórka.
  2. W dniu 7 przemyj studzienki ciepłym PBS i dodaj 50 μl do 1 ml (objętość zależy od użytej płytki) akutazy. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 20 minut.
  3. Po inkubacji sprawdź płytki pod mikroskopem świetlnym, aby zobaczyć, czy komórki się odłączyły. Następnie odłącz komórki, stukając w płytki ze wszystkich stron i pipetując je w górę i w dół.
  4. Zawiesinę komórkową należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki ciepłym PBS (bez Ca2+, bez Mg2+) i połącz je z zawiesiną komórek. Powtórz kroki 8.2-8.3 raz lub dwa razy, aż większość komórek się odczepi.
    UWAGA: Accutaza, metoda zalecana przed barwieniem powierzchni do analizy cytometrii przepływowej, nie usuwa bardzo dużych OC. Wskaźnik odzysku wynosi ~50%-70%.
  5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS i policzyć komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 1 x 106 komórek/ml, usunąć 100 μl odpowiadające 1 x 105 komórek i przenieść te komórki do nowej probówki polipropylenowej. Dodać 200 μl buforu do sortowania komórek i odłożyć go na lód jako niebarwioną kontrolę.
  7. Pozostałe komórki zabarwić żywym/martwym barwnikiem rozcieńczonym w stosunku 1:750 przez 10 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
    UWAGA: Barwienie żywe/martwe należy wykonywać przy braku FBS, aby uniknąć silnego zabarwienia tła.
  8. Uzupełnić probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml zawierającą żywą/martwą zawiesinę barwionych komórek ciepłym buforem do sortowania komórek (1x PBS, bez Ca2+, bez Mg2+, 1% FBS i 5 mM EDTA) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek.
    UWAGA: Zaleca się wysokie stężenie EDTA i niskie stężenie FBS w buforze sortującym, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
  9. Usunąć objętość odpowiadającą 1 x 105 komórek i przenieść je do nowej polipropylenowej probówki do kontroli izotypu OSCAR. Przenieś wszystkie pozostałe komórki do innej polipropylenowej probówki w celu barwienia i sortowania komórek.
    UWAGA: Probówki polipropylenowe są używane do sortowania, ponieważ komórki są mniej podatne na przyleganie do tych probówek niż do rurek polistyrenowych.
  10. Wirować probówki o masie 400 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki, i wyrzucić nadmiar supernatantu przez inwersję.
  11. Zawiesić osad komórkowy w roztworze mieszaniny przeciwciał przygotowanym zgodnie z tabelą 2. Wybarwić probówkę kontrolną izotypu OSCAR przeciwciałem CD14 i kontrolą izotypu OSCAR w miejsce przeciwciała OSCAR.
  12. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem przez 30 minut.
  13. Po 30 minutach umyć komórki, dodając pięć objętości buforu do sortowania komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Ponownie zawiesić komórki w 300-1,000 μl buforu do sortowania zimnych komórek i pozyskać komórki za pomocą maszyny do sortowania cytometrii przepływowej wyposażonej w dyszę 100 μM.
    UWAGA: OC są bardzo lepkimi komórkami, dlatego ważne jest, aby przed sortowaniem przefiltrować je przez sterylną membranę 70 μm.
  15. Bramka OC i pre-OC jako CD14−OSCAR+. Ustawić bramkę OSCAR+ w oparciu o rurkę kontrolną izotypu OSCAR.
  16. Zebrać posortowane komórki w polipropylenowych probówkach zawierających kompletny α-MEM uzupełniony 20% FBS w temperaturze 8 °C.
  17. Po posortowaniu granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, policzyć komórki i ponownie zawiesić do dalszych zastosowań.
    UWAGA: Zazwyczaj, aby uzyskać ~1 x 105 posortowanych pre-OC/OC, zacznij od ~10 x 106 komórek posianych w dniu 0. Na niski wskaźnik odzysku ma wpływ utrata komórek podczas oddzielania za pomocą akutazy oraz przetwarzanie do barwienia i sortowania. Zaleca się przeprowadzenie całej procedury przy użyciu sterylnych i odczynników oraz pracę w sterylnych warunkach.

9. Test ATP dla aktywności mitochondriów

  1. Inkubować wzbogacone monocyty CD14 + w obecności M-CSF i RANKL na 96-dołkowej płytce w taki sam sposób, jak opisano wcześniej (kroki 4.1-4.8). Umieść cztery dodatkowe warunki w trzech egzemplarzach, aby użyć ich jako kontroli.
  2. Przeprowadź test ATP za pomocą zestawu do wykrywania luminescencji ATP zgodnie z instrukcją producenta. Krótko, aby przygotować roztwór ATP, dodać 10 ml roztworu buforowego substratu do liofilizowanego substratu i pozostawić do inkubacji w temperaturze RT przez 30 min.
    UWAGA: Do pomiaru wewnątrzkomórkowej produkcji ATP można zastosować różne metody. W tym artykule zastosowaliśmy detekcję produkcji ATP za pomocą luminescencji.
  3. Podczas inkubacji przygotować i dodać kontrole bezpośrednio do studzienek kontrolnych w następujący sposób: 2-deoksy-D-glukoza (2DG) w stężeniach 10 mM i 100 mM, oligomycyna w stężeniach 1 μM i 100 mM 2DG w połączeniu z oligomycyną 1 μM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: 2DG blokuje glikolizę, podczas gdy oligomycyna jest inhibitorem fosforylacji oksydacyjnej. Połączenie tych dwóch inhibitorów powoduje całkowitą utratę produkcji ATP poprzez glikolizę i fosforylację oksydacyjną, co oznacza, że służą one jako wewnętrzna kontrola testu ATP. W przypadku kontroli 10 mM i 100 mM 2DG dodać odpowiednio 0,5 μl i 5 μl roztworu podstawowego 2M 2DG na 100 μl dołka. Dla oligomycyny 1 μM rozcieńczyć roztwór podstawowy 5 mM w stosunku 1:100 w pożywce i dodać 2 μl/basenik do dedykowanych studzienek kontrolnych. Do ostatniej kontroli dodać 5 μl 2DG i 2 μl rozcieńczonego roztworu oligomycyny na studzienkę.
  4. Dodać 50 μl roztworu ATP do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję, i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 700 obr./min przez 5-10 minut, chroniąc przed światłem.
  5. Przenieść 100 μl supernatantu na 96-dołkową płytkę z białym dnem przeznaczoną do oznaczania ATP i odczytać płytkę za pomocą czytnika luminescencji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OC generacja z monocytów CD14+
Metoda ta miała na celu łatwe odróżnienie dużej liczby OC od monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej in vitro, zwykle w ciągu 1 tygodnia. Po pierwsze, monocyty CD14 + zostały wzbogacone z PBMC i zaszczepione M-CSF przez noc w celu zwiększenia RANK, jak wcześniej informowano15. Po zaszczepieniu monocytów, w celu określenia optymalnego stężenia RANKL dla różnicowania i dojrzewania OC, zastosowano stężenia RANKL 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/ml i 100 ng/ml wraz z 25 ng/mL M-CSF. Dodanie RANKL powodowało wzrost liczby dużych, wielojądrowych OC z dodatnim TRAP w sposób zależny od dawki, co oceniono za pomocą barwienia TRAP. Dojrzałe OC definiuje się jako komórki TRAP-dodatnie z wieloma jądrami (zwykle więcej niż trzema; Rysunek 2A,B i Rysunek uzupełniający 1). Ponadto zbadano kinetykę różnicowania OC od monocytów za pomocą barwienia TRAP i mikroskopii świetlnej w okresie hodowli trwającym od 2 do 14 dni. W tym przypadku wybrano różnicowanie OC przy użyciu pośredniego stężenia 50 ng/ml RANKL, aby ocenić, jak szybko OC różnicują się w hodowli. W tych warunkach hodowli wielojądrowe OC były widoczne od 5 dnia, a optymalne różnicowanie osiągnięto w 7 dniu (Ryc. 2C). Przedłużająca się inkubacja kultur powyżej 10 dni na tworzywach sztucznych skutkowała nienormalnie gigantycznymi połączonymi komórkami. W tym protokole dni 6-8 są zwykle używane jako optymalny punkt końcowy generowania OC. Pierścienie OC mogą być oznaczane ilościowo lub wykorzystywane do dalszych testów.

Ocena funkcjonalna zróżnicowanych OCs
Aby określić aktywność funkcjonalną generowanych OC, zbadaliśmy ich aktywność resorpcyjną poprzez różnicowanie OC na zmineralizowanej powierzchni. Ponieważ duże OC są generowane dopiero po 7-dniowym okresie hodowli i aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na resorpcję substratu mineralnego, kultury utrzymywano do 10 dnia. Powstawanie okrągłych otworów lub dołów resorpcyjnych zaobserwowano tylko na zmineralizowanych powierzchniach studni zawierających komórki, które zostały potraktowane zarówno M-CSF, jak i RANKL (Rysunek 3). Zatem procentowy udział rozpuszczonej zmineralizowanej powierzchni (dołów resorpcyjnych) pozwala na określenie zdolności resorpcyjnej OC. Dodatkowo, OC zróżnicowane zgodnie z tym protokołem do 7 dnia, zarówno na szkiełkach z plastikowej, jak i szklanej komory, wykazywały dobrze zorganizowaną strukturę pierścienia aktynowego, którą można było uwidocznić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (rysunek uzupełniający 2).

Wpływ inhibitora na dojrzałą funkcję OC
Wyżej wymienione warunki hodowli wykorzystano do określenia zdolności funkcjonalnej OC generowanych in vitro w obecności znanego inhibitora OC, rotenonu34. OC różnicowano przez 6-8 dni, a OC CD14−OSCAR+ i prekursory OC wzbogacono za pomocą cytometrii przepływowej (Ryc. 4). Wzbogacone komórki następnie posiewano w ilości 50 000 komórek / na studzience na pokrytej minerałami 96-dołkowej płytce w pożywce proosteoklastogennej (25 ng / mL M-CSF i RANKL) przez 3 dni. Leczenie rotenonem (Rysunek 5A,B) w zależności od dawki hamowało resorpcję zmineralizowanej powierzchni w porównaniu z nieleczoną studnią kontrolną, zgodnie z wcześniejszymi badaniami34. Dodatkowo funkcjonalność OC oceniano poprzez produkcję ATP i tworzenie pierścieni aktynowych. Zależne od rotenonu hamowanie resorpcji OC było związane z hamowaniem produkcji ATP (Rysunek 5C). Resorbujące OC to wysoce spolaryzowane komórki, które regulują swoją zdolność resorpcyjną poprzez promowanie organizacji cytoszkieletu. Sprzężona falloidyna Alexa fluor 647 została użyta do znakowania cytoszkieletu F-aktyny dojrzałych OC hodowanych w obecności lub bez rotenonu. Rotenon spowodował fragmentację pierścienia aktynowego pochodzącego z RANKL dojrzałych OC (Ryc. 5D).

figure-results-1
Rysunek 2: OC skutecznie odróżniają się od prekursorów monocytów CD14+. Monocyty CD14 + wzbogacono magnetycznie, posiano w 1 x 105 komórek / dołek na 96-dołkowych płytkach i inkubowano przez noc z 25 ng / mL M-CSF. (A) Monocyty zaszczepione M-CSF stymulowano rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng / ml, 25 ng / mL, 50 ng / ml i 100 ng / ml), utrwalonymi i wybarwionymi pod kątem TRAP w 7 dniu. Uzyskano obrazy i policzono komórki wielojądrowe TRAP+ (MNC). Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP pokazano na rysunku uzupełniającym 1. Słupki błędów pokazują średnią ± SD (n = 3). Dane zostały przeanalizowane za pomocą jednoczynnikowego testu ANOVA i wielokrotnych porównań Holma-Sidaka dla sparowanych danych; * P ≤ 0,05 i ** P ≤ 0,005. (B) Reprezentatywny obraz dołka barwionego metodą TRAP na 96-dołkowej płytce, pokazujący typową oczekiwaną ilość OC / studnię i ich morfologię poniżej 25 ng / ml RANK-L w porównaniu z makrofagami pochodzącymi z M-CSF w dniu 7. Paski skali: 1000 μm. (C) Reprezentatywne obrazy tworzenia OC poniżej 50 ng/ml RANKL oceniane za pomocą barwienia TRAP od 2 dnia do 14 dnia. OC są widoczne od 5 dnia. Gigantyczne, nienormalnie stopione OC są obecne po 10 dniach. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Resorpcyjne OC różniące się od monocytów CD14+. Komórki CD14 + wyizolowane z PBMC różnicowano przez 10 dni w OC w obecności 25 ng / mL M-CSF (M) i RANKL (R) na płytkach do oznaczania minerałów (test osteologiczny). (A) Obrazy reprezentatywnych zrekonstruowanych studni wykonane w 10-krotnym powiększeniu w celu analizy resorpcji w dniu 10 (podłoże mineralne w kolorze szarym; doły resorpcyjne w kolorze białym). Podziałka skali: 1000 μm. (B) Kwantyfikacja procentowej powierzchni resorbowanej. Dane dotyczące resorpcji analizowano za pomocą analizy par Wilcoxona. Słupki błędów pokazują średnią ± SD (n = 7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Wzbogacanie cytometrii przepływowej CD14−OSCAR+ OCs. Monocyty CD14 + wzbogacono z PBMC, a OC zróżnicowano zgodnie z wcześniejszym opisem. Przylegające kultury OC odłączono za pomocą akutazy i wybarwiono do cytometrii przepływowej. (A-C) OC w dniu 8 zostały posortowane na podstawie ekspresji CD14 i OSCAR. (A) Reprezentatywna strategia sortowania i bramkowania. Komórki bramkowano jako singlety, ujemne dla martwego barwienia, a podzbiory CD14+ OSCAR+ (czerwony) i CD14− OSCAR+ (niebieski) posortowano. (B) Reprezentatywne wykresy przedstawiające nakładające się na siebie barwienie OSCAR OC pochodzących z RANKL (cyjan) i kontrolnych makrofagów pochodzących z M-CSF (kolor pomarańczowy). Na czerwono zaznaczona jest kontrolą OC pochodzącą z RANKL zabarwioną izotypem OSCAR. (C) Posortowane populacje zostały posiane na plastiku i pozostawione do przylegania przez 2 godziny w pożywce pro-OC (25 ng / mL M-CSF i 50 ng / ml RANKL), a następnie wybarwiono i wizualizację metodą TRAP. Reprezentatywne obrazy pokazują brak komórek TRAP+ w podzbiorze CD14+ (czerwony) oraz mono- i wielojądrowe TRAP+ pre-OC i OC w podzbiorze CD14− (niebieski). Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Testy do oceny funkcji dojrzałych OC. Aby ocenić funkcję dojrzałych OC, komórki CD14 + wyizolowane z PBMC hodowano albo z samym M-CSF (M), albo w połączeniu z RANKL (R) przez 7 dni, OC wzbogacono za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie OC traktowano inhibitorem rotenonem przez 24 godziny. (A) Dojrzałe OC sortowano za pomocą cytometrii przepływowej (CD14−OSCAR+) i hodowano na powierzchni testu mineralnego w obecności lub bez rotenonu przez 3 dni, po czym komórki wybielono i zobrazowano z 10-krotną szybkością w celu odsłonięcia resorpcji (doły resorpcyjne w kolorze białym). (A) Reprezentatywne zrekonstruowane obrazy studni. Podziałka skali: 1000 μm. (B) Kwantyfikacja procentowej powierzchni resorbowanej. Dane w (B) analizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunna (n = 7); * P ≤ 0,05 i** P ≤ 0,01. Słupki błędu pokazują średnią ± SD. (C) Całkowita wewnątrzkomórkowa zawartość ATP w niezróżnicowanych i zróżnicowanych w dniu 7 dojrzałych OC różnicowanych za pomocą RANKL i traktowanych nośnikiem lub rotenonem (10 nM i 30 nM). W tym przypadku 2DG i oligomycyna zostały użyte jako kontrole pozytywne do testu i zostały dodane 30 minut przed lizą komórek i kwantyfikacją ATP. Słupki błędów pokazują średnią ± SD (n = 4). Dane zostały przeanalizowane za pomocą jednoczynnikowej ANOVA i testu wielokrotnego porównania Dunnetta dla sparowanych danych. ** P ≤ 0,01. (D) Reprezentatywny 20-krotny obraz dojrzałych OC wybarwionych pod kątem tworzenia pierścienia aktynowego (czerwony) i jąder (niebieski), pokazujący utratę pierścienia aktynowego wraz z inhibitorem. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Format płytyPłytka 96-dołkowaPłytka 48-dołkowaPłytka 24-dołkowaPłytka 12-dołkowaPłytka 6-dołkowa
głośność100 μL225–250 μl450–500 μL0,8–1 ml1,8–2 ml

Tabela 1: Objętość zawiesiny komórek dla różnych formatów płyt. Objętości są obliczane na podstawie roztworu 1 x 106 komórek/ml i zapewniają optymalną gęstość do fuzji komórka-komórka.

Fluorofor, klon Objętość (μL) na 106 komórek
Płyta CD14PE/Cyjanina7, HCD14 5 μL
OscarFITC, REA49410 μL
Bufor sortowania komórek 80 μL

Tabela 2: Roztwór mieszanki przeciwciał głównych.

Rysunek uzupełniający 1: Barwienie TRAP odpowiedzi na dawkę RANKL. Monocyty CD14 + wzbogacono magnetycznie, posiano w 1 x 105 komórek / dołku na 96-dołkowych płytkach i inkubowano przez noc z 25 ng / mL M-CSF, jak w Figura 2. Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP pokazują monocyty zaszczepione MCSF stymulowane rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng / ml, 25 ng / mL, 50 ng / ml i 100 ng / ml), utrwalone i wybarwione pod kątem TRAP w 7 dniu. Podziałka liniowa: 400 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Działające barwienie pierścieniowe w pełni zróżnicowanych OC. (A) 10-krotne powiększenie OC zróżnicowanych na plastiku TC i zabarwionych falloidyną AF647 (na czerwono). Podziałka skali: 400 μm. (B) 40-krotne powiększenie OC zróżnicowanych na szkiełkach szklanych komór i zabarwionych falloidyną AF488 (na żółto). Podziałka skali: 100 μm. Jądra są barwione DAPI, pokazane na niebiesko w (A) i na niebiesko w (B). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Wpływ różnych partii FBS na efektywność różnicowania OC. OC różnicowano od monocytów CD14+ w obecności 25 ng/mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL (MR) przez 7 dni. Studnie kontrolne miały tylko M-CSF (M). (A) Reprezentatywne 10-krotne powiększenia (podziałka skali: 400 μm) oraz (B) oznaczanie ilościowe OC barwionych metodą TRAP zróżnicowanych od jednego dawcy w dwóch różnych partiach FBS. Słupki błędów pokazują średnią ± SD trzech powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łatwa hodowla i izolacja dużej liczby funkcjonalnych OC in vitro są ważne dla lepszego zrozumienia biologii kości i chorób zależnych od OC. Klasycznie OC generowano w kokulturach z osteoblastami lub komórkami zrębu i komórkami krwiotwórczymi ze śledziony lub szpiku kostnego38,39. Znaczącym przełomem w zrozumieniu osteoklastogenezy była identyfikacja RANKL jako głównego regulatora powstawania, różnicowania i przeżycia OC40. Wczesne protokoły systemów hodowli zależnych od RANKL wykorzystywały PBMC do generowania OC 21,41,42. Jednak te mieszane kultury są długotrwałe i zawierają wiele czynników zakłócających, które ograniczają możliwość testowania bezpośredniego wpływu na różnicowanie i funkcję OC. Protokół ten opisuje skuteczny i wiarygodny model osteoklastogenezy in vitro z ludzkich obwodowych monocytów CD14 +, w którym optymalną osteoklastogenezę można uzyskać w ciągu 7 dni (ryc. 1 i ryc. 2), co jest znacznie szybsze w porównaniu z niektórymi innymi protokołami 43,44,45,46. Głównymi cechami wyróżniającymi ten protokół są: (1) zastosowanie oczyszczonych monocytów CD14 +, (2) przygotowanie monocytów M-CSF przed ekspozycją na RANKL, (3) długość hodowli (<7 dni) oraz (4) niezawodne wykrywanie hamowania tworzenia OC (barwienie TRAP) i funkcji (resorpcja, produkcja ATP, reorganizacja pierścienia aktynowego) za pomocą inhibitorów.

W trakcie optymalizacji metodyki zidentyfikowano kilka punktów krytycznych. Zaobserwowano, że różnicowanie OC in vitro jest w dużej mierze zależne od gęstości wysiewu monocytów CD14+. Tak więc w tym protokole komórki są wysiewane w dużej gęstości (1 x 105 komórek/dołek 96-dołkowej płytki, w 100 μl pożywki), ponieważ ważne jest, aby komórki mogły wchodzić ze sobą w interakcje i znajdować się w pobliżu, aby połączyć się i stać się dojrzałymi OC. Podobnie, wysiewanie komórek przy zbyt dużej gęstości ogranicza ich różnicowanie i wzrost ze względu na ograniczenia podłoża i brak wymaganej przestrzeni. Ponadto, aby osiągnąć maksymalny sukces w tym protokole, ważne jest, aby dokładnie przeprowadzić separację gradientu gęstości i upewnić się, że wzbogacona populacja komórek CD14 + jest tak czysta, jak to tylko możliwe. Na przykład nieodpowiednie etapy mycia skutkują brakiem usuwania płytek krwi, co w konsekwencji hamuje różnicowanie OC47,48. Podobnie, obecność niewielkiego zanieczyszczenia limfocytów T w izolowanych preparatach CD14 + stymulowanych samym M-CSF może powodować różnicowanie OC, potencjalnie poprzez wydzielanie RANKL przez limfocyty T49. Dlatego ważne jest, aby dołączyć kontrolę M-CSF do każdego eksperymentu. Rutynowa kontrola czystości, zwłaszcza w przypadku korzystania z nowego zestawu do izolacji, jest również zalecana w celu zapewnienia czystości próbki.

Optymalne wartości OC (zakres: ~200-1 600 OC/dołek) uzyskuje się przy użyciu pożywki α-MEM wzbogaconej o nukleozydy i L-glutaminę. Inne konwencjonalne podłoża hodowlane, w tym zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) i pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, wpływają na wydajność OC. Źródło FBS może również wpływać na osteoklastogenezę. Różne partie FBS mogą prowadzić do zmniejszenia osteoklastogenezy pochodzącej z RANK-L, a także do pojawienia się małej liczby komórek wielojądrowych TRAP + w kontrolach M-CSF (rysunek uzupełniający 3). Dlatego, aby osiągnąć spójne wyniki, zaleca się testowanie nowych partii FBS przed użyciem i kontynuowanie tej samej partii przez cały czas trwania eksperymentów, aby zminimalizować różnice w procesie różnicowania. Ponadto zmienność między dawcami, pod względem całkowitej liczby zróżnicowanych OC uzyskanych w końcowym punkcie czasowym, stanowi ograniczenie przy stosowaniu tego protokołu do porównywania, na przykład, zdrowych dawców z pacjentami. W takich przypadkach konieczne jest użycie dokładnie tych samych warunków i tej samej partii pożywki, FBS i innych odczynników.

Kolejnym niezbędnym krokiem dla optymalnego różnicowania i dojrzewania OC jest zaszczepienie monocytów M-CSF przed dodaniem RANKL. Ekspozycja komórek na M-CSF 18-24 godziny przed RANKL przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Dodanie RANKL w tym punkcie czasowym zapewnia optymalne różnicowanie OC w sposób zależny od dawki. Stopień zróżnicowania OC różni się w zależności od dawcy; jednak 25 ng / ml RANKL jest zwykle wystarczające do różnicowania dużej liczby OC u większości dawców. Dodatkowo, 25 ng/ml RANKL może być stosowany w testach do wstępnych badań przesiewowych związków, ponieważ ułatwia ocenę zarówno wzmacniającego, jak i hamującego działania badanych związków. Inne systemy hodowli wykorzystywały dłuższe czasy preinkubacji M-CSF przed dodaniem RANKL, ale skutkuje to dłuższym czasem hodowli osteoklastogenezy50. Ponadto pozostawienie przygotowanych monocytów do inkubacji przez noc pozwala im przyczepić się do płytki, choć nie w stanie w pełni przylegającym. Dlatego, gdy RANKL jest wprowadzany po raz pierwszy, pożywka musi być bardzo ostrożnie zmieniona w połowie, a nie całkowicie zmieniona, aby zapobiec oderwaniu i utracie przygotowanych monocytów. Pożywkę należy również odświeżać co 3-4 dni, aby uniknąć wyczerpania pożywki i zapobiec śmierci komórki. Ponadto, ze względu na małą objętość użytą w tym teście (100 μl/studzienkę na płytce 96-dołkowej), niezwykle ważne jest, aby wokół studzienek testowych znajdowała się rama z pustych studzienek, które są wypełnione roztworem wodnym (tj. sterylnym destylowanymH2Olub PBS). Zapobiega to parowaniu medium i efektom krawędziowym.

Wreszcie, w przypadku testów metabolicznych (np. Testów ATP), konieczne jest, aby komórki były żywotne, aby uniknąć ogromnego odchylenia standardowego między kontrpróbami (ryc. 5). Wysoka żywotność komórek jest również ważna dla sortowania komórek i dalszej hodowli posortowanych OC (ryc. 4). Ta metoda ma jednak kilka ograniczeń. W pełni dojrzałe OC są bardzo przylegające i trudne do oderwania od płytek. Większe OC są często niemożliwe do odłączenia, co może prowadzić do niższej wydajności ogniw. W związku z tym komórki należy policzyć po sortowaniu, a przed posiewem w wymaganym stężeniu. Ponadto w niniejszym protokole stosuje się metodę nieenzymatyczną (akutazę) do odłączania OC w celu zapobieżenia zmianom błony w dalszym barwieniu powierzchni do cytometrii przepływowej. Przetestowano również użycie skrobaków komórkowych (zarówno z miękkimi, jak i twardymi końcami), które doprowadziło do wysokiej śmierci komórek. Oddzielenie enzymatyczne przy użyciu 0,05% roztworów trypsyny/EDTA może być stosowane w celu uzyskania wyższej wydajności oderwanych OC, gdy integralność membrany nie jest wymagana w dalszych zastosowaniach. Dodatkowo, aby zapobiec zlepianiu się OC, zdecydowanie zaleca się stosowanie wysokiego stężenia EDTA we wszystkich po odłączeniu komórek, a także odpowiednie filtrowanie przed akwizycją cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że kultury OC to niejednorodna populacja komórek składająca się z dojrzałych OC, prekursorów OC i makrofagów. Makrofagi można łatwo odróżnić od OC, chociaż zarówno jednojądrzaste pre-OC, jak i wielojądrowe OC wyrażają OSCAR i nie można ich odróżnić za pomocą obecnej metody (ryc. 4). To ostatnie zagadnienie stanowi bowiem główne ograniczenie tej metody. Ponadto niska ekspresja OSCAR jest również obecna w kulturach M-CSF (Figura 4B) i może wskazywać na makrofagi, które są przygotowane do zaangażowania w linię OC. Ważne jest, aby ustawić bramkę dla komórek OSCAR+ w oparciu o sygnał barwienia FMO, jak pokazano na rysunku 4B.

Podsumowując, protokół ten opisuje zoptymalizowaną i solidną metodę wydajnej produkcji aktywnych i funkcjonalnie dojrzałych OC z krążących pierwotnych ludzkich monocytów. Mocną stroną tego protokołu jest jego zdolność do generowania OC w krótkim czasie i uzyskiwania dużej liczby zróżnicowanych OC. Metoda ta otwiera drogę do zbadania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw różnicowania i funkcji OC.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Flow Core Facility oraz Glasgow Imaging Facility (GIF) w ramach School of Infection and Immunity za ich wsparcie i pomoc w tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Slide 18-dołkowe szkiełka komoroweibidi81816
8-dołkowe szklane szkiełka komorowe Ibidi 80807 
96-dołkowa płytka TC Corning 3596 
96-dołkowy test kostno-ościowy Stripwell Plate   Corning 3989 
Roztwór octanuSigma Aldrich386-3z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Aceton Firma VWR 20066.330 
Zestaw fosfatazy kwasowej, leukocytów (TRAP) SIGMA-ALDRICH 387A-1KT 
Alexa Fluor 488 PhalloidinTheremo Fisher - Invitrogen A12379 AF488     
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher - InvitrogenA22287AF647
Alfa Aesar 2-Deoksy-D-glukoza Fisher Naukowy 11321867 2DG, 98% 
Minimum alfa niezbędne podłoże Gibco 22571-020 
ATPlite 1krok PerkinElmer 6016731 System oznaczania luminescencji ATP 
Sortownik komórek BD FACSAria IIIBD Biosciences
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Sigma-Aldrich A9418-100G 
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96-dołkowa, PS, F-bottom Greiner bio-one 655083 Płyty z białym dnem 
Roztwór cytrynianuSigma Aldrich91-5z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Corning 6ml probówki z polistyrenu okrągłodennegoFisher Scientific352054
Płytka wielodołkowa Corning do badania kości kościSigma-Aldrich 
Test kostny Corning Powierzchniowa płytka wielodołkowa 1 x 8 paskowaCorningCLS3989-2EA
DAPI Theremo Fisher  D3571 
Zestaw do pozytywnej selekcji człowieka EasySep CD14 Technologie STEMCELL Numer katalogowy: 17858 
Bufor do lizy czerwonych krwinek EasySep (10x)Technologie komórek macierzystych 20110
eBioscience utrwalany barwnik żywotności eFluor 780Theremo Fisher - Invitrogen 65-0865-14
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sigma-Aldrich E7889-100ML 
System automatycznego obrazowania EVOS FLThermo FisherA32678
Okrągłe probówki polipropylenowe Falcon z nakrętkąFisher Scientific10314791
Falcon probówki 15 mlCorning Numer katalogowy: 430790 
Probówki Falcon 50 mL Corning   430828 
Szybki granat GBC roztwór bazowySigma Aldrich387-2z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Surowica bydlęca płodu Gibco Numer katalogowy: 10500-064 FBS (Sieć Usługowa
Ficoll-Paque Plus cytiva 17144003 
Formaldehyd Sigma-Aldrich F-8775 
Ludzki ligand sRANK PEPROTECH 310-01-100UG Aktywator receptora czynnika jądrowego liganda kappa-B  (RANGL)
ImageJ Oprogramowanie do analizy obrazuImage Jwersja 2.9.0
L-glutamina Gibco 25030-024 
Probówki z heparyną litową (9 ml) ODKURZACZ 455084 
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów PEPROTECH 300-25-100UG   M-CSF
Napthol AS-BI roztwór kwasu fosforowegoSigma Aldrich387-1z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Komora zliczająca hemacytometr Neubauer CamlabSKU 1127885
Oligomycyna ze Streptomyces Diastatochromogenes Sigma-Aldrich Q4876-5MG 
Przeciwciało OSCAR, anty-ludzkie, Vio Bright FITC, REAfinitMiltenyi Biotec130-107-661 i 130-107-617Klon REA494
PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-ludzkie CD14Biolegend325618Klon HCD14 
Penicyna/streptomycyna SIGMA P0781 
Maszyna i oprogramowanie PHERAstarBMG LABTECH
Solanka buforowana fosforanami (DPBS, 1x) Gibco Numer katalogowy: 14190-094 
Przeciwciało kontrolne REA (S), ludzkie IgG1, Vio Bright FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-113-443
Podchloryn sodu, roztwór  Sigma-Aldrich Numer katalogowy: 425044-1L 
Roztwór azotynu soduSigma Aldrich91-4z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Roztwór winianuSigma Aldrich387-3z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 
Błękit trypanowy Sigma-Aldrich T8154-100ML 
CLS3989

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
  3. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  4. Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
  5. Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
  6. Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
  7. Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
  8. Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
  9. Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
  10. Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
  11. Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
  12. Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
  13. Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
  14. McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237(2021).
  15. Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
  16. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  17. Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282(2020).
  18. Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
  19. Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V. Osteoclast fusion and fission. Calcified Tissue International. 90 (6), 515-522 (2012).
  20. McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
  21. Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
  22. Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
  23. Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
  24. Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
  25. Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
  26. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  27. Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
  28. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780(2021).
  29. Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
  30. Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
  31. Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
  32. Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
  33. Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
  34. Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
  35. Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
  36. Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221(2020).
  37. Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776(2021).
  38. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
  39. Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
  40. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  41. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
  42. Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
  43. Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
  44. Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632(2018).
  45. Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152(2006).
  46. Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780(2018).
  47. Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
  48. Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
  49. D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82(2012).
  50. Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Osteoclast DifferentiationCD14 MonocytesHuman Peripheral BloodM CSF StimulationRANKL InductionTRAP StainingMineral Resorption AssayActin Ring FormationFlow Cytometry SortingImmunofluorescence Microscopy

Powiązane artykuły