Artykuł metodologiczny

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64698

⸱

27 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1School of Infection & Immunity, University of Glasgow

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Streszczenie

Osteoklasty (OC) to komórki resorpujące kości, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju szkieletu i przebudowie kości u dorosłych. Kilka zaburzeń kości jest spowodowanych zwiększonym różnicowaniem i aktywacją OC, więc hamowanie tej patobiologii jest kluczową zasadą terapeutyczną. Dwa kluczowe czynniki napędzające różnicowanie OC od prekursorów szpiku: czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). Od dawna wiadomo, że ludzkie krążące monocyty CD14 + różnicują się w OC in vitro. Jednak czas ekspozycji i stężenie RANKL wpływają na skuteczność różnicowania. Rzeczywiście, opisano protokoły generowania ludzkich OC in vitro, ale często skutkują one słabym i długotrwałym procesem różnicowania. W tym celu zapewniony jest solidny i ustandaryzowany protokół do generowania funkcjonalnie aktywnych, dojrzałych ludzkich OC w odpowiednim czasie. Monocyty CD14 + są wzbogacone z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i zaszczepione M-CSF w celu zwiększenia RANK. Późniejsza ekspozycja na RANKL generuje OC w sposób zależny od dawki i czasu. OC są identyfikowane i oznaczane ilościowo przez barwienie fosfatazą kwasoodporną winianu (TRAP) i analizę mikroskopową światła. Barwienie immunofluorescencyjne jąder i F-aktyny służy do identyfikacji funkcjonalnie aktywnych OC. Ponadto dojrzałe OC OSCAR+CD14− są dodatkowo wzbogacane poprzez sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i ilościowe określanie funkcjonalności OC za pomocą testów resorpcji minerałów (lub zębiny/kości) i tworzenia pierścieni aktynowych. Wreszcie, znany inhibitor OC, rotenon, jest stosowany w dojrzałych OC, co pokazuje, że produkcja adenozynotrifosforanu (ATP) jest niezbędna dla integralności pierścienia aktynowego i funkcji OC. Podsumowując, w niniejszej pracy ustanowiono solidny test do różnicowania dużej liczby OC, który w połączeniu z barwieniem pierścieni aktynowych i testem ATP stanowi użyteczny model in vitro do oceny funkcji OC i badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych związków terapeutycznych, które mogą modulować proces różnicowania.

Wprowadzenie

Osteoklasty (OC) to wielojądrowe gigantyczne komórki linii krwiotwórczej z unikalną zdolnością do resorpcji kości. Są one odpowiedzialne za rozwój i ciągłą przebudowę skeletonu1,2. W kostnych fazach rozwoju OC i makrofagi rezydujące w tkankach pochodzą z erytro-szpikowych komórek progenitorowych i kolonizują niszę kostną i tkanki narządów. W warunkach fizjologicznych erytro-szpikowe komórki progenitorowe są niezbędne do prawidłowego rozwoju kości i wyrzynania się zębów, podczas gdy napływ krążących monocytów krwi do niszy kostnej zapewnia poporodowe utrzymanie OC, masy kostnej i jamy szpiku kostnego3. W warunkach patologicznych monocyty są rekrutowane do miejsc aktywnego stanu zapalnego i mogą przyczyniać się do patologicznego niszczenia kości4,5.

Pacjenci z kilkoma formami zapalenia stawów doświadczają zapalenia stawów, co prowadzi do postępującego niszczenia stawów spowodowanego przez OCs6. Na przykład w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS) nadmiernie aktywowane OC są odpowiedzialne za patologiczną erozję kości i niszczenie stawów7,8, a obecne leczenie często nie poprawia ani nie zatrzymuje uszkodzenia kości9,10,11. Zmiany w krążących monocytach, zarówno pod względem rozmieszczenia populacji, jak i sygnatur transkryptomicznych i epigenetycznych, odnotowano u pacjentów z RZS12,13,14. Ponadto doniesiono, że zmienione odpowiedzi monocytów na stymulację zapalną wpływają na osteoklastogenezę u pacjentów z RZS z aktywną chorobą15,16,17.

Różnicowanie OC to złożony, wieloetapowy proces polegający na zaangażowaniu komórek prekursorowych szpiku w prekursory OC. Podczas osteoklastogenezy OC stają się gigantyczne i wielojądrzaste poprzez fuzję komórka-komórka, niepełną cytokinezę i proces recyklingu jądrowego opisany jako rozszczepienie i fuzja18,19,20. Zdolność do różnicowania OC in vitro pozwoliła na znaczący postęp w zrozumieniu biologii kości21. OC odróżniają się od prekursorów po ekspozycji na czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywator receptora liganda czynnika jądrowego kappa-B (RANKL). To ostatnie jest niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania OC in vitro i in vivo, nawet w warunkach zapalnych6,22,23. RANKL jest prezentowany przez osteoblasty i osteocyty, a także przez aktywowane limfocyty T i fibroblasty w zapalnym RZS synovium2,24,25. Podczas procesu różnicowania OC monocyty wystawione na działanie M-CSF zwiększają ekspresję receptora czynnika jądrowego kappa-B (RANK) na błonie komórkowej i pod wpływem późniejszej stymulacji RANKL różnicują się w oporne na winian fosfatazy kwasowej (TRAP)-dodatnie jednojądrzaste pre-OC, a następnie w wielojądrowe OCs15,26. OC wytwarzają kilka enzymów, z których najważniejszym jest TRAP, który umożliwia degradację fosfoprotein w obrębie bone27. Regulatorem i markerem różnicowania OC jest receptor związany z OC (OSCAR). Jest regulowany w górę wcześnie w komórkach prekursorowych, które zobowiązują się do linii OC28. Dojrzałe gigantyczne wielojądrowe OC mogą degradować (resorbować) macierz szkieletową, generując dużą strefę uszczelniającą, która jest wykonana z pierścienia aktynowego otaczającego pofałdowaną granicę21,29,30. Zdolność OC do resorpcji kości wymaga reorganizacji cytoszkieletu, a w konsekwencji polaryzacji i powstania pofałdowanej błony, która jest tak zwaną pofałdowaną granicą. Pofałdowana granica otoczona jest dużym okrągłym pasmem o strukturze bogatej w F-aktynę, który jest pierścieniem aktynowym lub strefą uszczelniającą. Integralność pierścienia aktynowego jest niezbędna, aby OC resorpowały kość zarówno in vitro, jak i in vivo, a wadliwe tworzenie pofałdowanych granic jest związane z ekspresją trifosfatazy adenozynowej (V-ATPazy) w dolnej wakuoli31,32,33. Co więcej, OC są komórkami bogatymi w mitochondria, a trifosforan adenozyny (ATP) wiąże się ze strukturami podobnymi do mitochondriów w OC zlokalizowanych na pofałdowanej granicy31,32,33. Rotenon działa jako silny inhibitor kompleksu mitochondrialnego I i wpływa na produkcję ATP. Wykazano również, że rotenon hamuje różnicowanie i funkcję OC34.

Ten protokół opisuje skuteczną i zoptymalizowaną metodę osteoklastogenezy in vitro z próbek ludzkiej krwi obwodowej. W ludzkiej krwi obwodowej monocyty CD14+ są głównym źródłem OCs15,35,36. W tym protokole kinetyka ekspozycji oraz stężenia M-CSF i RANKL zostały dostosowane w celu uzyskania optymalnej osteoklastogenezy. Komórki jednojądrzaste są najpierw oddzielane od erytrocytów i granulocytów obecnych we krwi pełnej za pomocą gradientu gęstości; następnie są wzbogacane o monocyty CD14 + za pomocą pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane monocyty CD14 + są następnie inkubowane przez noc z M-CSF. To przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Późniejsze dodanie RANKL indukuje osteoklastogenezę i wielojądrowość w sposób zależny od czasu. OC z aktywną resorpcją pokazują charakterystyczny rozkład pierścieni F-aktyny na krawędzi błony komórkowej30,32 i barwienie dla TRAP. Dojrzałe OC analizuje się poprzez ilościowe określenie komórek wielojądrowych TRAP+ (więcej niż trzy jądra). Zdolność funkcjonalną dojrzałych OC można ocenić na podstawie ich resorpcji, integralności pierścienia aktynowego i produkcji ATP. Co więcej, zróżnicowane OC CD14− OSCAR+ mogą być wzbogacane i wykorzystywane do oceny wpływu niektórych związków na funkcjonalność OC poprzez resorpcję minerałów (lub zębiny) i organizację F-aktyny. Dodatkowo w niniejszej pracy wykorzystano znany inhibitor OC, rotenon, jako przykład związku wpływającego na funkcjonalność OC. Zmniejszona aktywność resorpcyjna OC pod wpływem rotenonu wiąże się ze zmniejszoną produkcją ATP i fragmentacją pierścienia aktynowego. Podsumowując, protokół ten ustanawia solidny test, który może być wykorzystany jako metoda referencyjna do badania kilku biologicznych aspektów różnicowania i funkcji OC in vitro.

Ta metodologia może być użyta do oceny (1) potencjału krążących monocytów do różnicowania się w OC w zdrowiu i chorobach, a także (2) wpływu kandydatów terapeutycznych na różnicowanie i funkcję OC. Ten solidny protokół osteoklastogenezy umożliwia określenie skuteczności i mechanizmów terapii ukierunkowanych na kości zarówno w odniesieniu do różnicowania OC z komórek prekursorowych, jak i funkcji dojrzałych OC.

Protokół

Warstwy leukocytarne pozyskane z Scottish National Blood Transfusion Service (Edynburg) oraz stożki leukocytarne pozyskane z NHS Blood and Transplant (Newcastle) są dostarczane badaczom z University of Glasgow w formie w pełni anonimowej (nieidentyfikowalnej), pochodzącej od dawców krwi NHS, którzy wyrazili pełną zgodę. Składniki krwi w postaci warstw leukocytarnych i stożków leukocytarnych są pozyskiwane ze standardowych donacji krwi NHS przeprowadzonych w centrach krwiodawstwa NHS w Szkocji lub Anglii. W momencie oddawania krwi dawca udziela świadomej zgody na wykorzystanie nadmiarowej krwi, która nie zostanie zużyta w standardowej praktyce klinicznej NHS, w zatwierdzonych badaniach medycznych. Zgoda etyczna z NHS Research Ethics Committee oraz podpisane formularze zgody dawców na wykorzystanie tych donacji krwi są przechowywane przez służbę donacji krwi NHS. Zgoda na dostęp do tych zatwierdzonych donacji krwi i ich wykorzystanie w zatwierdzonych badaniach medycznych została uzyskana w ramach standardowego wewnętrznego procesu aplikacyjnego i przeglądowego National Blood Transfusion Service (Szkocja) oraz NHS Blood and Transport (Anglia). Wykorzystanie składników krwi w zatwierdzonych badaniach medycznych nie wymagało dalszej zgody NHS REC ani zgody wewnętrznej komisji etycznej University of Glasgow.

1. Uwagi ogólne przed rozpoczęciem

  1. Wszelkie prace z krwią należy przeprowadzać z zachowaniem szczególnej ostrożności. Należy wziąć pod uwagę potencjalne zagrożenia związane z różnymi czynnikami zakaźnymi, które mogą znajdować się w próbkach.
  2. Wszystkie prace należy prowadzić ostrożnie w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego, w warunkach sterylnych, stosując rękawice i fartuchy laboratoryjne.
  3. Utylizację odpadów biologicznych należy przeprowadzić zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
  4. Przed pobraniem próbek należy uzyskać odpowiednią zgodę oraz zatwierdzenie komisji etycznej zgodnie z przepisami lokalnych organów nadzorczych.
  5. Zazwyczaj 1 mL świeżej krwi pozwala uzyskać 1 milion PBMC, a monocyty CD14+ stanowią około 10%-30% PBMC. Dla porównania, 10 mL osadu leukocytywnego może zawierać 5 x 108-15 x 108 PBMC. Szczegółowe informacje na temat izolacji PBMC znajdują się w poprzednim protokole37.

2. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej

  1. Pobrać wymaganą objętość świeżej krwi od zdrowych dawców do probówek z heparyną litową.
    UWAGA: Można stosować inne probówki z odpowiednimi antykoagulantami (np. z heparyną sodową). W celu uzyskania większej liczby komórek można wykorzystać koncentraty leukocytów lub warstwę buffy coat.
  2. W celu izolacji PBMC przenieść krew do nowej probówki 50 mL i rozcieńczyć ją sterylnym 1x roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w stosunku 1:1 dla świeżej krwi lub 1:3 dla koncentratów leukocytów/warstw buffy coat.
  3. Delikatnie wymieszać komórki kilkakrotnie poprzez odwracanie probówki.
  4. Przygotować probówki 15 mL zawierające 3 mL medium do gradientu gęstości. Powoli nanieść 8-10 mL rozcieńczonej krwi na powierzchnię medium do gradientu gęstości, a następnie wirować przy 400 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania.
    UWAGA: Krew należy nanosić ostrożnie na powierzchnię medium do gradientu gęstości, aby zapobiec mieszaniu. Mieszanie może doprowadzić do utraty PBMC.
  5. Ostrożnie usunąć górną warstwę (zawierającą osocze) za pomocą pipety Pasteura, zebrać znajdującą się poniżej warstwę interfazy zawierającą PBMC (biała struktura w kształcie pierścienia) i przenieść tę warstwę do nowej probówki 50 mL.
  6. Zzawiesić komórki w sterylnym 1x PBS do objętości 50 mL i wypłukać pozostałości medium do gradientu gęstości, wirowując przy 300 x g przez 10 min w RT z pełnym hamowaniem.
  7. Aby usunąć pozostałe płytki krwi, powtórzyć proces, wykonując dodatkowe wirowanie z mniejszą prędkością przy 200 x g przez 10 min w RT bez hamowania.
  8. Opcjonalnie: Aby usunąć pozostałości erytrocytów, rozcieńczyć bufor do lizy erytrocytów (10x, Tabela materiałów) w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej i nanieść 3 mL rozcieńczonego buforu na osad. Wymieszać i inkubować przez 3 min. Wypłukać osad w maksymalnie 50 mL 1x PBS i wirować przy 300 x g przez 10 min w RT z pełnym hamowaniem.
  9. Resuspendować wyizolowane i oczyszczone PBMC w 20 mL 1x PBS i policzyć je za pomocą hemacytometru lub stosując inne standardowe metody.
    UWAGA: Metody rozcieńczania i liczenia komórek muszą być odpowiednio dostosowane do gęstości komórek oraz użytego urządzenia pomiarowego.

3. Wzbogacanie monocytów CD14+ z PBMC

  1. Wyizolować monocyty CD14+ z PBMC przy użyciu zestawu do selekcji ludzkich komórek CD14+ zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów).
    UWAGA: Klasyczne monocyty CD14+CD16− są głównym źródłem prekursorów OC35; można rozważyć alternatywne metody oczyszczania.
  2. Przenieść 1 x 107 PBMC do odpowiedniej polistyrenowej probówki z zaokrąglonym dnem (tj. takiej, która pasuje do magnesu z zestawu selekcyjnego) i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
  3. Odlać nadosad, resuspender osad komórkowy w buforze do separacji komórek (PBS, 2% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]) do końcowego stężenia 1 x 108 komórek/mL i inkubować z 10 µL koktajlu przeciwciał na każde 100 µL przy zamkniętej pokrywce przez 10 min.
    UWAGA: Komórki są resuspenderowane w stężeniu 1 x 108 komórek/mL; należy odpowiednio dostosować objętości.
  4. Po inkubacji dodać 10 µL magnetycznych nanocząsteczek na każde 100 µL i inkubować przez 3 min przy zamkniętej pokrywce.
    UWAGA: Dostosować objętości koktajlu przeciwciał i kulek magnetycznych, aby uzyskać stężenie 10 µL/mL.
  5. Uzupełnić objętość do 2,5 mL buforem do separacji komórek, umieścić probówkę w magnesie (bez pokrywki) i inkubować przez 3 min. Usunąć negatywną populację komórek za pomocą jednego ciągłego ruchu odwrócenia, gdy probówka wciąż znajduje się w magnesie.
    UWAGA: W przypadku użycia >2 x 108 PBMC i większego magnesu, uzupełnić objętość do 5 mL lub 10 mL buforem do separacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Wyjąć probówkę z magnesu i przemyć wzbogacone monocyty CD14+ przyłączone do kulek magnetycznych, resuspenderując je w 2,5 mL buforu do separacji komórek. Inkubować przez 3 min w magnesie jak wcześniej, usunąć frakcję negatywną i powtórzyć czynność jeszcze raz.
  7. Odwirować wszystkie zebrane komórki przy 300 x g przez 5 min, odlać nadosad i resuspender komórki w 5 mL podłoża alpha minimum essential medium (α-MEM; Tabela materiałów) uzupełnionego o 1% L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny (pełne α-MEM) oraz 10% FBS.
    ​UWAGA: Zaleca się sprawdzenie czystości po wzbogaceniu za pomocą cytometrii przepływowej; oczekiwana czystość powinna wynosić ≥96%. Dodatkowe etapy przemywania (krok 3.6) mogą zwiększyć czystość.

4. Różnicowanie OC in vitro

  1. Policz wzbogacone monocyty CD14+ za pomocą hemacytometru.
  2. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min i resuspenduj w stężeniu 1 x 106 komórek/mL w pełnym medium α-MEM uzupełnionym o 10% FBS.
  3. Aby zróżnicować OCs, dodaj M-CSF do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 25 ng/mL.
    UWAGA: Na 1 mL zawiesiny komórkowej dodaj 0,25 µL M-CSF z roztworu stokowego o stężeniu 100 µg/mL.
  4. Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety, aby zhomogenizować zawiesinę komórkową, a następnie nanieś 100 µL/dołek na płaskodenną płytkę 96-dołkową, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 105 komórek/dołek.
  5. Dodaj 200 µL/dołek sterylnej wody destylowanej do dołków wokół naniesionych komórek, aby zapobiec odparowywaniu medium i efektowi brzegowemu w systemie hodowlanym.
  6. Inkubuj komórki przez noc, przez około 18-20 h, w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
  7. Po nocnej inkubacji ostrożnie usuń połowę medium (50 µL/dołek) poprzez aspirację za pomocą pipety P200, unikając dotykania dna dołka, i zastąp je świeżym, ogrzanym pełnym medium α-MEM zawierającym 10% FBS, 25 ng/mL M-CSF oraz 50 ng/mL RANKL dla uzyskania końcowego stężenia 25 ng/mL
    UWAGA: Na 1 mL medium dodaj 0,25 µL M-CSF i 0,5 µL RANKL z roztworu stokowego o stężeniu 100 µg/mL.
  8. Wymieniaj medium co 3 dni i różnicuj komórki w OCs przez 7-14 dni (Rysunek 1).
    ​UWAGA: Utrzymuj stałe stężenia M-CSF i RANKL przez cały okres hodowli.

Schemat izolacji monocytów: wirówka do krwi, izolacja CD14+, proces dojrzewania osteoklastów.
Rysunek 1: Schemat różnicowania OC. Schematyczny przegląd izolacji monocytów CD14+ z PBMC oraz ich różnicowania w dojrzałe OC w obecności M-CSF i RANKL przez 7-14 dni. RT = temperatura pokojowa. Obraz utworzony w BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

5. Barwienie TRAP dla osteoklastów

  1. Ostrożnie usunąć pożywkę, utrwalić zróżnicowane przylegające OCs za pomocą 100 µL/studnię wcześniej przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubować przez 1 min. Nie dotykać dna studni, aby uniknąć porysowania przylegających komórek.
    UWAGA: Roztwór utrwalający przygotowuje się w następujący sposób: 12,5 mL roztworu cytrynianu (zawartego w zestawie do barwienia TRAP), 32,5 mL acetonu oraz 5 mL 37% formaldehydu.
  2. Przemyć studnie trzykrotnie 300 µL sterylnej wody destylowanej. Po myciu delikatnie opukać płytki, aby usunąć nadmiar cieczy.
  3. Przygotować roztwór barwiący zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów); dodać 5 µL Fast Garnet i 5 µL azotynu sodu, aby przygotować roztwór Fast Garnet; wymieszać przez odwracanie i inkubować przez 3 min w RT. Przygotować 1 mL roztworu barwiącego, mieszając 900 µL sterylnej wody destylowanej, 10 µL naftolu, 40 µL roztworu octowego, 50 µL roztworu tatronianu oraz 10 µL roztworu Fast Garnet.
  4. Dodać 100 µL/studnię świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w ciemności przez 20 min.
  5. Po inkubacji usunąć roztwór barwiący przez odwracanie i przemyć płytkę trzykrotnie 300 µL/studnię wody destylowanej.
  6. Usunąć nadmiar wody, opukując płytki o ręczniki papierowe. Pozostawić płytki otwarte i chronione przed światłem do wyschnięcia przez noc.
    UWAGA: Wysuszone płytki można przechowywać do 6 miesięcy. Czasami pozostałości buforów mogą sprzyjać rozwojowi pleśni, widocznej pod mikroskopem; można ją usunąć w dowolnym momencie, przemywając zainfekowane studnie wodą destylowaną i ponownie pozostawiając je do wyschnięcia.
  7. Wykonać zdjęcia przy powiększeniu 10x lub 20x, używając mikroskopu w polu jasnym z funkcją mozaiki (tile), aby uchwycić całą powierzchnię studni.
  8. Ręcznie policzyć OCs zidentyfikowane jako komórki TRAP+ zabarwione na fioletowo i posiadające więcej niż trzy jądra, korzystając z oprogramowania do analizy obrazu z wtyczką do liczenia komórek.
    ​UWAGA: Liczba OCs TRAP+ na studnię zależy od donora i może wynosić od ~200 do 1 600 OCs/studnię, przy średniej około 1 000 OCs/studnię. Ponadto, aby przeanalizować dane, liczbę OCs należy wyznaczyć w trzech różnych studniach (powtórzenia techniczne), a następnie obliczyć średnią dla każdego stanu i dla każdego powtórzenia biologicznego.

6. Analiza resorpcji kości

  1. Wysiać świeżo wzbogacone monocyty CD14+ na 96-dołkowe płytki do testów osteogennych pokryte fosforanem wapnia w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/studzienkę, a następnie różnicować osteoklasty (OC) przez 7–14 dni, zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.8, wymieniając pożywkę co 3 dni.
    UWAGA: Zamiast płytek do testów osteologicznych można zastosować plasterki dentyny/kości słoniowej lub bydlą kość korową. W takim przypadku całkowity czas hodowli należy wydłużyć do 14–21 dni ze względu na bardziej złożony podłoże podlegające resorpcji.
  2. W końcowym punkcie czasowym należy ostrożnie usunąć medium, unikając dotykania dna studzienki, a następnie poddać komórki lizie, stosując 10% roztwór podchlorynu sodu. Studzienki należy przemyć trzykrotnie wodą destylowaną.
  3. Przeskanuj suche płytki za pomocą mikroskopu w polu jasnym, a następnie przeanalizuj i skwantyfikuj uzyskane obrazy jam resorpcyjnych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

7. Barwienie fluorescencyjne pierścienia aktynowego

  1. Wysiać 100 µL/studnię wyizolowanych monocytów CD14+ na szkiełko z komorami (18 studni) przy gęstości komórek 1 x 105 komórek/studnię. Różnicować osteoklasty (OCs) w obecności M-CSF i RANKL zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 4.1-4.8), w tym zmieniając pożywkę co 3 dni.
  2. W punkcie końcowym ostrożnie usunąć pożywkę i przemyć każdą studnię dwukrotnie 200 µL/studnię uprzednio ogrzanego PBS, pH 7.4. Nie dopuszczać do wyschnięcia studni pomiędzy poszczególnymi etapami.
  3. Utrwalić próbkę za pomocą 100 µL/studnię 4% roztworu formaldehydu w PBS i inkubować przez 10 min w RT na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym wstrząsaniu.
    UWAGA: Metanol może prowadzić do degradacji aktyny podczas procesu utrwalania. Dlatego najlepiej unikać utrwalaczy zawierających metanol. Preferowanym utrwalaczem jest formaldehyd bezmetanolowy. Wytrząsarka orbitalna użyta w tym kroku protokołu została ustawiona na moc 3 w skali od 1 do 10.
  4. Przemyć dwukrotnie 200 µL/studnię PBS, przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą 100 µL/studnię 0,1% roztworu Triton X-100 rozcieńczonego w PBS i inkubować przez 10 min w RT na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym wstrząsaniu.
  5. Przemyć dwukrotnie 200 µL/studnię PBS. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie i zwiększyć sygnał, dodać 100 µL/studnię roztworu blokującego przygotowanego z 2% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS. Inkubować przez 20 min w RT na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym wstrząsaniu.
  6. Usunąć roztwór blokujący i dodać 100 µL/studnię roztworu faloidyny sprzężonej z fluorophorem, rozcieńczonego w 2% roztworze BSA/PBS. Inkubować przez 20 min w RT na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym wstrząsaniu, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Stężenie barwnika faloidyny należy dostosować zgodnie z zaleceniami producenta.
  7. Przemyć dwukrotnie 200 µL/studnię PBS, zabarwić jądra komórkowe za pomocą 100 µL/studnię roztworu PBS zawierającego 300 nM DAPI i inkubować przez 10-15 min w RT na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym wstrząsaniu, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: DAPI rozcieńcza się w wodzie destylowanej, aby przygotować roztwór stokowy DAPI o stężeniu 14,3 mM (5 mg/mL). Roztwór stokowy jest następnie rozcieńczany do stężenia końcowego 300 µM. Na koniec roztwór 300 µM DAPI jest rozcieńczany ponownie w PBS do stężenia końcowego 300 nM.
  8. Po 10-15 min usunąć roztwór DAPI i zastąpić go 100 µL/studnię PBS.
    UWAGA: W zależności od wybranych szkiełek z komorami, przechowywać je z odpowiednią objętością PBS (100 µL/studnię dla szkiełek 18-komorowych) lub zamontować na szkiełku z użyciem lamellek i odpowiedniego medium montażowego. Szkiełka z komorami można przechowywać do 1 tygodnia w lodówce. Dla szkiełek 18-komorowych stosować objętość barwienia 50-100 µL oraz 200-300 µL do płukania. Dla innych rozmiarów szkiełek z komorami odpowiednio zwiększyć objętości. Aby zapobiec parowaniu, podczas inkubacji przechowywać lamelki w zamkniętym pojemniku. Zaleca się stosowanie wytrząsarki orbitalnej, choć nie jest ona niezbędna.
  9. Zwizualizować barwienie przy użyciu odpowiedniego mikroskopu immunofluorescencyjnego lub konfokalnego, stosując powiększenia od 4x do 40x.

8. Wzbogacanie dojrzałych osteoklastów i prekursorów osteoklastów poprzez sortowanie cytometryczne

  1. Resuspend świeżo wzbogacone monocyty CD14+ w stężeniu 1 x 106 komórek/mL i zróżnicuj je do dojrzałych OCs w obecności M-CSF i RANKL w taki sam sposób, jak opisano powyżej (kroki 4.1-4.8).
    UWAGA: Przy zwiększaniu skali z płytki 96-dołkowej na większą płytkę, należy postępować zgodnie z Tabelą 1; objętości te zostały obliczone dla roztworu o stężeniu 1 x 106 komórek/mL i zapewniają optymalną gęstość dla fuzji komórek.
  2. W 7. dniu przemyj dołki raz ciepłym PBS i dodaj od 50 µL do 1 mL (objętość zależna od rozmiaru użytej płytki) accutase. Inkubuj komórki w temperaturze 37 ˚C przy 5% CO2 przez 20 min.
  3. Po inkubacji sprawdź płytki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, czy komórki się odłączyły. Następnie odłącz komórki, opukując płytki ze wszystkich stron i pipetując zawiesinę w górę i w dół.
  4. Zbierz zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 mL. Przemyj dołki ciepłym PBS (bez Ca2+, bez Mg2+) i połącz z zawiesiną komórkową. Powtórz kroki 8.2-8.3 raz lub dwa razy, aż większość komórek zostanie odłączona.
    UWAGA: Accutase, rekomendowana metoda przed barwieniem powierzchniowym do analizy cytometrycznej, nie odłącza bardzo dużych OCs. Stopień odzysku wynosi ~50%-70%.
  5. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min, resuspenduj osad komórkowy w 1 mL PBS i policz komórki metodą wykluczania trypanowego.
  6. Resuspenduj komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/mL, pobierz 100 µL odpowiadające 1 x 105 komórkom i przenieś je do nowej probówki z polipropylenu. Dodaj 200 µL buforu do sortowania komórek i odstaw na lód jako kontrolę niebarwioną.
  7. Pozostałe komórki zabarw barwnikiem live/dead rozcieńczonym w stosunku 1:750 przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.
    UWAGA: Barwienie live/dead musi być przeprowadzane w obecności FBS, aby uniknąć wysokiego tła barwienia.
  8. Uzupełnij probówkę zbiorczą 15 mL zawierającą zabarwioną zawiesinę komórkową ciepłym buforem do sortowania komórek (1x PBS, bez Ca2+, bez Mg2+, 1% FBS i 5 mM EDTA) i odwiruj przy 300 x g przez 5 min, aby otrzymać osad komórkowy.
    UWAGA: W buforze do sortowania zaleca się stosowanie wysokiego stężenia EDTA i niskiego stężenia FBS, aby zapobiegać agregacji komórek.
  9. Pobierz objętość odpowiadającą 1 x 105 komórkom i przenieś je do nowej probówki z polipropylenu dla kontroli izotypowej OSCAR. Przenieś wszystkie pozostałe komórki do drugiej probówki z polipropylenu do barwienia i sortowania komórek.
    UWAGA: Do sortowania używa się probówek z polipropylenu, ponieważ komórki rzadziej przylegają do nich niż do probówek polistyrenowych.
  10. Wiruj probówki przy 400 x g przez 5 min, aby uzyskać osad komórkowy, i usuń nadmiar supernatantu poprzez odwrócenie probówki.
  11. Resuspenduj osad komórkowy w roztworze master mix przeciwciał przygotowanym zgodnie z Tabelą 2. Probówkę kontroli izotypowej OSCAR zabarw przeciwciałem CD14 i kontrolą izotypową OSCAR zamiast przeciwciała OSCAR.
  12. Inkubuj komórki w temperaturze 4 ˚C, chroniąc przed światłem przez 30 min.
  13. Po 30 min przemyj komórki, dodając pięciokrotność objętości buforu do sortowania komórek, i odwiruj przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C.
  14. Resuspenduj komórki w 300-1 000 µL zimnego buforu do sortowania komórek i przeprowadź sortowanie za pomocą sortera cytometrycznego wyposażonego w dyszę 100μM.
    UWAGA: OCs są komórkami o bardzo wysokiej lepkości, dlatego ważne jest ich przefiltrowanie przez sterylną membranę 70 µm przed sortowaniem.
  15. Wyznacz bramkę (gate) dla OCs i pre-OCs jako CD14−OSCAR+. Ustaw bramkę OSCAR+ na podstawie probówki kontroli izotypowej OSCAR.
  16. Zbierz posortowane komórki do probówek z polipropylenu zawierających kompletną pożywkę α-MEM z dodatkiem 20% FBS w temperaturze 8 ˚C.
  17. Po sortowaniu odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, policz komórki i resuspenduj do dalszych zastosowań.
    UWAGA: Zazwyczaj, aby uzyskać ~1 x 105 posortowanych pre-OCs/OCs, należy zacząć od ~10 x 106 komórek wysianych w dniu 0. Niski stopień odzysku wynika z utraty komórek podczas odłączania za pomocą accutase oraz podczas procesu barwienia i sortowania. Zaleca się przeprowadzanie całej procedury przy użyciu sterylnych buforów i odczynników oraz pracę w warunkach sterylnych.

9. Analiza ATP w celu oceny aktywności mitochondrialnej

  1. Inkubować wzbogaconą frakcję CD14+ monocyty w obecności M-CSF i RANKL na płytce 96-dołkowej w sposób opisany wcześniej (kroki 4.1-4.8). Należy przygotować cztery dodatkowe warunki w trzech powtórzeniach do wykorzystania jako kontrole.
  2. Przeprowadzić analizę ATP z użyciem zestawu do luminescencyjnego wykrywania ATP zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, aby przygotować roztwór ATP, do liofilizowanego substratu dodać 10 ml buforu substratowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Do pomiaru wewnątrzkomórkowej produkcji ATP można zastosować różne metody. W niniejszym protokole wykorzystaliśmy detekcję produkcji ATP metodą luminescencji.
  3. Podczas inkubacji przygotować i dodać kontrole bezpośrednio do odpowiednich dołków kontrolnych w następujący sposób: 2-deoksy-D-glukozę (2DG) w stężeniach 10 mM i 100 mM, oligomycynę w stężeniu 1 µM, oraz 100 mM 2DG w połączeniu z 1 µM oligomycyną. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    UWAGA: 2DG blokuje glikolizę, natomiast oligomycyna jest inhibitorem fosforylacji oksydacyjnej. Połączenie tych dwóch inhibitorów prowadzi do całkowitego zahamowania produkcji ATP. poprzez glikolizę i fosforylację oksydacyjną, co oznacza, że służą one jako kontrola wewnętrzna dla testu ATP. W przypadku kontroli 2DG w stężeniu 10 mM i 100 mM, dodać 0.5 µL i 5 µL roztworu zapasowego 2M 2DG na 100 µL odpowiednio do dołka hodowlanego. Dla 1 µM oligomycynę, rozcieńczając 5 mM roztwór zapasowy w stosunku 1:100 w pożywce, a następnie dodaj 2 µL/well do dedykowanych studzienek kontrolnych. Do ostatniej kontroli dodaj 5 µL 2-deoksy-D-glukozy (2DG) oraz 2 µL rozcieńczonego roztworu oligomycyny na dołek.
  4. Dodaj 50 µL roztworu ATP do każdej studzienki w celu zatrzymania reakcji, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 700 obr./min przez 5–10 min, chroniąc przed światłem.
  5. Transfer 100 µL nadpływu do białej płytki 96-dołkowej z białym dnem, przeznaczonej do analizy ATP, a następnie odczytać płytkę za pomocą luminometru.

Wyniki

Generowanie OC z monocytów CD14+
Celem tej metody było łatwe różnicowanie dużej liczby OC z ludzkich monocytów CD14+ krwi obwodowej in vitro, zazwyczaj w ciągu 1 tygodnia. Najpierw monocyty CD14+ zostały wzbogacone z PBMC i poddane primingu za pomocą M-CSF przez noc w celu upregulacji RANK, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami15. Po primingu monocytów, w celu określenia optymalnego stężenia RANKL dla różnicowania i dojrzewania OC, zastosowano stężenia RANKL wynoszące 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL oraz 100 ng/mL, wraz z 25 ng/mL M-CSF. Dodatek RANKL spowodował wzrost liczby dużych, TRAP-dodatnich, wielojądrowych OC w sposób zależny od dawki, co oceniono za pomocą barwienia TRAP. Dojrzałe OC definiuje się jako komórki TRAP-dodatnie z wieloma jądrami (zazwyczaj więcej niż trzy; Rycina 2A,B oraz Rycina uzupełniająca 1). Ponadto zbadano kinetykę różnicowania OC z monocytów za pomocą barwienia TRAP i mikroskopii świetlnej w okresie hodowli od 2 do 14 dni. W tym przypadku, aby ocenić szybkość różnicowania OC w hodowli, wybrano różnicowanie OC z użyciem pośredniego stężenia 50 ng/mL RANKL. W tych warunkach hodowli wielojądrowe OC były widoczne od 5. dnia, a optymalne różnicowanie osiągnięto w 7. dniu (Rycina 2C). Przedłużona inkubacja hodowli na tworzywach sztucznych powyżej 10 dni prowadziła do powstania nieprawidłowo wielkich komórek zlanej formy. W tym protokole dni 6-8 są zazwyczaj uznawane za optymalny punkt końcowy generowania OC. Komórki OC mogą być ilościowo oznaczane lub wykorzystywane w dalszych analizach.

Ocena funkcjonalna zróżnicowanych OC
Aby określić aktywność funkcjonalną wygenerowanych OC, przebadano ich aktywność resorpcyjną poprzez różnicowanie OC na zmineralizowanej powierzchni. Ponieważ duże OC powstają dopiero po 7-dniowym okresie hodowli, a aby zapewnić wystarczający czas na resorpcję podłoża mineralnego, hodowle utrzymywano do 10. dnia. Powstawanie okrągłych otworów, czyli lakunek resorpcyjnych, obserwowano wyłącznie na zmineralizowanych powierzchniach studzienek zawierających komórki traktowane zarówno M-CSF, jak i RANKL (Rysunek 3). W związku z tym procent rozpuszczonej zmineralizowanej powierzchni (lakun resorpcyjnych) pozwala na określenie zdolności resorpcyjnej OC. Dodatkowo, OC zróżnicowane zgodnie z tym protokołem do 7. dnia, zarówno na plastikowych, jak i szklanych szkiełkach przedmiotowych z komorami, wykazywały dobrze zorganizowaną strukturę pierścienia aktynowego, którą można było zwizualizować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (Rysunek dodatkowy 2).

Wpływ inhibitora na funkcję dojrzałych OC
Powyższe warunki hodowli wykorzystano do określenia zdolności funkcjonalnej in vitro generowane OC w obecności znanego inhibitora OC, rotenonu34Komórki OC różnicowano przez okres od 6 do 8 dni, a CD14−OSCAR+ Wzbogacono OC i prekursory OC poprzez cytometria przepływowa (Rycina 4). Wzbogacone komórki wysiano następnie w gęstości 50 000 komórek na studzienkę na mineralną płytkę 96-dołkową w pożywce proosteoklastogennej (25 ng/ml M-CSF i RANKL) na 3 dni. Traktowanie rotenonem (Rycina 5A,B) hamowało w sposób zależny od dawki resorpcję zmineralizowanej powierzchni w porównaniu z nieleczoną kontrolą, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami34Dodatkowo oceniono funkcjonalność OC poprzez Produkcja ATP i tworzenie pierścienia aktynowego. Zależne od rotenonu hamowanie resorpcji OC wiązało się z zahamowaniem produkcji ATP (Rycina 5C). Resorbujące osteoklasty (OC) są komórkami silnie spolaryzowanymi, które regulują swoją zdolność resorpcyjną poprzez promowanie organizacji cytoszkieletu. Do znakowania cytoszkieletu aktynowego (F-aktyny) dojrzałych OC hodowanych w obecności lub w nieobecności rotenonu użyto faloidyny sprzężonej z Alexa Fluor 647. Rotenon spowodował fragmentację pierścienia aktynowego indukowanego przez RANKL w dojrzałych OC (Rysunek 5D).

Równowaga statyczna, różnicowanie TRAP+; wykres i obrazy mikroskopowe pokazują efekty działania M-CSF/RANKL w czasie.
Rycina 2: Efektywne różnicowanie się OC z prekursorów monocytów CD14+. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone magnetycznie, wysiane w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/studzienkę na płytkach 96-dołkowych i inkubowane przez noc z 25 ng/mL M-CSF. (A) Monocyty przygotowane za pomocą M-CSF stymulowano rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL i 100 ng/mL), a następnie utrwalono i barwiono na TRAP w 7. dniu. Wykonano obrazowanie i policzono wielojądrowe komórki (MNCs) TRAP+. Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP przedstawiono na Rycini Uzupełniającej 1. Słupki błędu przedstawiają średnią ± SD (n = 3). Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu wielokrotnych porównań Holma-Sidaka dla danych sparowanych; * P ≤ 0,05 oraz ** P ≤ 0,005. (B) Reprezentatywny obraz zabarwionej na TRAP studzienki płytki 96-dołkowej, pokazujący typową oczekiwaną liczbę OC/studzienkę oraz ich morfologię przy 25 ng/mL RANK-L w porównaniu do makrofagów pochodzenia M-CSF w 7. dniu. Paski skali: 1000 µm. (C) Reprezentatywne obrazy tworzenia się OC przy 50 ng/mL RANKL oceniane via barwienie TRAP od 2. do 14. dnia. OC są widoczne od 5. dnia. Gigantyczne, nieprawidłowo połączone OC występują po 10 dniach. Paski skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat resorpcji kości; M-CSF sam w sobie vs M-CSF z RANKL, wykres porównawczy danych dotyczących % resorpcji.
Rycina 3Resorpcyjne osteoklasty zróżnicowane z komórek CD14++ monocyty. CD14+ komórki wyizolowane z PBMC różnicowano przez 10 dni do postaci OCs w obecności 25 ng/mL M-CSF (M) i RANKL (R) na płytkach do analizy mineralizacji (osteo-assay).A) Obrazy reprezentatywnych zrekonstruowanych studzienek wykonane przy 10-krotnym powiększeniu w celu analizy resorpcji w 10. dniu (podłoże mineralne w kolorze szarym; wgłębienia resorpcyjne w kolorze białym). Paski skali: 1000 µm. (B) Ilościowe określenie procentowej powierzchni resorpcji. Dane dotyczące resorpcji przeanalizowano za pomocą testu Wilcoxona dla prób zależnych. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD (n = 7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający sortowanie komórek; wykresy FSC, SSC; analiza CD14, OSCAR; żywotność komórek.
Rysunek 4: Wzbogacanie osteoklastów (OC) CD14−OSCAR+ za pomocą cytometrii przepływowej. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone z PBMC, a następnie zróżnicowano je na OC zgodnie z wcześniejszym opisem. Przyległe kultury OC ododerwano za pomocą accutase i wybarwiono do analizy cytometrii przepływowej. (A-C) OC w 8. dniu zostały posortowane na podstawie ekspresji CD14 i OSCAR. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania podczas sortowania. Wyłoniono singlety, komórki negatywne pod kątem barwienia martwych komórek, a następnie posortowano subpopulacje CD14+OSCAR+ (czerwona) i CD14−OSCAR+ (niebieska). (B) Reprezentatywne wykresy pokazujące nakładające się barwienie OSCAR dla OC pochodzących z RANKL (cyjan) oraz kontrolnych makrofagów pochodzących z M-CSF (pomarańczowy). Kolor czerwony oznacza kontrolę izotypową OSCAR dla OC pochodzących z RANKL. (C) Posortowane populacje wysiano na plastik i pozostawiono do adhezji przez 2 h w medium pro-OC (25 ng/mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL), a następnie przeprowadzono barwienie TRAP i wizualizację. Reprezentatywne obrazy pokazują brak komórek TRAP+ w subpopulacji CD14+ (czerwona) oraz jedno- i wielojądrzaste pre-OC i OC TRAP+ w subpopulacji CD14− (niebieska). Paski skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza resorpcji kości; Efekt rotenonu; Diagram, wykres, mikroskopia; Badanie aktywności osteoklastów.
Rysunek 5Testy oceniające funkcję dojrzałych osteoklastów. Aby ocenić funkcję dojrzałych osteoklastów (OC), CD14+ komórki wyizolowane z PBMC hodowano przez 7 dni albo z samym M-CSF (M), albo w połączeniu z RANKL (R), w celu wzbogacenia populacji OC poprzez cytometrią przepływową, a następnie OC traktowano inhibitorem rotenonem przez 24 h. (ADojrzałe osteoklasty (OC) zostały wyselekcjonowane poprzez cytometria przepływowa (CD14)−OSCAR+) i hodowano na mineralnej powierzchni testowej w obecności lub w nieobecności rotenonu przez 3 dni, po czym komórki poddano odbarwianiu i obrazowaniu przy powiększeniu 10x w celu uwidocznienia obszaru resorpcji (dołki resorpcyjne w kolorze białym). (A) Reprezentatywne zrekonstruowane obrazy studzienek. Paski skali: 1000 µm. (B) Ilościowe oznaczenie procentowej powierzchni resorpcji. Dane w (B) przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Dunna (n = 7); * P ≤ 0,05 oraz** P ≤ 0,01. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD. (C) Całkowita wewnątrzkomórkowa zawartość ATP w niedróżnicowanych oraz dojrzałych, zróżnicowanych w 7. dniu osteoklastach (OC), których różnicowanie indukowano RANKL i które poddano działaniu nośnika lub rotenonu (10 nM i 30 nM). W badaniu tym 2DG oraz oligomycynę zastosowano jako kontrole pozytywne; dodano je na 30 min przed lizą komórek i kwantyfikacją ATP. Słupki błędu przedstawiają średnią ± SD (n = 4). Dane przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) oraz testu porównań wielokrotnych Dunnetta dla danych sparowanych. ** P ≤ 0.01. (D) Reprezentacyjny obraz przy powiększeniu 20x dojrzałych osteoklastów barwionych w celu wykazania tworzenia pierścienia aktynowego (czerwony) i jąder komórkowych (niebieski), przedstawiający zanik pierścienia aktynowego pod wpływem inhibitora. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Format płytkipłytka 96-dołkowapłytka 48-dołkowapłytka 24-dołkowapłytka 12-dołkowapłytka 6-dołkowa
objętość100 µL225–250 µL450–500 µL0.8–1 mL1.8–2 mL

Tabela 1: Objętość zawiesiny komórkowej dla różnych formatów płytek. Objętości zostały obliczone na podstawie roztworu o stężeniu 1 x 106 komórek/mL i zapewniają optymalną gęstość dla fuzji komórka-komórka.

fluorofor, klon  Objętość (μL) na 106 komórki
CD14PE/Cyanine7, HCD14 5 μL
OSCARFITC, REA49410 μL 
Bufor do sortowania komórek 80 μL 

Tabela 2 : Roztwór master mix przeciwciał.

Rysunek uzupełniający 1: Barwienie TRAP w odpowiedzi na dawkę RANKL. Monocyty CD14+ zostały wzbogacone magnetycznie, wysiane w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/studzienkę w płytkach 96-dołkowych i inkubowane przez noc z 25 ng/mL M-CSF, zgodnie z Rysunkiem 2. Reprezentatywne obrazy barwienia TRAP przedstawiają monocyty przygotowane za pomocą MCSF i stymulowane rosnącymi stężeniami RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL i 100 ng/mL), utrwalone i zabarwione na TRAP w 7. dniu. Paski skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Barwienie pierścienia aktynowego w w pełni zróżnicowanych komórkach osteoklastów (OC). (A) Powiększenie 10x komórek OC zróżnicowanych na plastiku TC i zabarwionych falloidyną AF647 (kolor czerwony). Pasek skali: 400 µm. (B) Powiększenie 40x komórek OC zróżnicowanych na szkiełkach komorowych i zabarwionych falloidyną AF488 (kolor żółty). Pasek skali: 100 µm. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI, co przedstawiono w kolorze niebieskim w (A) oraz w kolorze cyjanowym w (B). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Wpływ różnych partii FBS na wydajność różnicowania OC. OC różnicowano z monocytów CD14+ w obecności 25 ng/mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL (MR) przez 7 dni. Do studni kontrolnych dodano wyłącznie M-CSF (M). (A) Reprezentatywne powiększenia 10x (paski skali: 400 µm) oraz (B) ilościowe oznaczenie OC barwionych TRAP, różnicowanych od jednego dawcy w dwóch różnych partiach FBS. Słupki błędów przedstawiają średnią ± SD z trzech powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Łatwa hodowla i izolacja dużej liczby funkcjonalnych OC in vitro są ważne dla lepszego zrozumienia biologii kości i chorób zależnych od OC. Klasycznie OC generowano w kokulturach z osteoblastami lub komórkami zrębu i komórkami krwiotwórczymi ze śledziony lub szpiku kostnego38,39. Znaczącym przełomem w zrozumieniu osteoklastogenezy była identyfikacja RANKL jako głównego regulatora powstawania, różnicowania i przeżycia OC40. Wczesne protokoły systemów hodowli zależnych od RANKL wykorzystywały PBMC do generowania OC 21,41,42. Jednak te mieszane kultury są długotrwałe i zawierają wiele czynników zakłócających, które ograniczają możliwość testowania bezpośredniego wpływu na różnicowanie i funkcję OC. Protokół ten opisuje skuteczny i wiarygodny model osteoklastogenezy in vitro z ludzkich obwodowych monocytów CD14 +, w którym optymalną osteoklastogenezę można uzyskać w ciągu 7 dni (ryc. 1 i ryc. 2), co jest znacznie szybsze w porównaniu z niektórymi innymi protokołami 43,44,45,46. Głównymi cechami wyróżniającymi ten protokół są: (1) zastosowanie oczyszczonych monocytów CD14 +, (2) przygotowanie monocytów M-CSF przed ekspozycją na RANKL, (3) długość hodowli (<7 dni) oraz (4) niezawodne wykrywanie hamowania tworzenia OC (barwienie TRAP) i funkcji (resorpcja, produkcja ATP, reorganizacja pierścienia aktynowego) za pomocą inhibitorów.

W trakcie optymalizacji metodyki zidentyfikowano kilka punktów krytycznych. Zaobserwowano, że różnicowanie OC in vitro jest w dużej mierze zależne od gęstości wysiewu monocytów CD14+. Tak więc w tym protokole komórki są wysiewane w dużej gęstości (1 x 105 komórek/dołek 96-dołkowej płytki, w 100 μl pożywki), ponieważ ważne jest, aby komórki mogły wchodzić ze sobą w interakcje i znajdować się w pobliżu, aby połączyć się i stać się dojrzałymi OC. Podobnie, wysiewanie komórek przy zbyt dużej gęstości ogranicza ich różnicowanie i wzrost ze względu na ograniczenia podłoża i brak wymaganej przestrzeni. Ponadto, aby osiągnąć maksymalny sukces w tym protokole, ważne jest, aby dokładnie przeprowadzić separację gradientu gęstości i upewnić się, że wzbogacona populacja komórek CD14 + jest tak czysta, jak to tylko możliwe. Na przykład nieodpowiednie etapy mycia skutkują brakiem usuwania płytek krwi, co w konsekwencji hamuje różnicowanie OC47,48. Podobnie, obecność niewielkiego zanieczyszczenia limfocytów T w izolowanych preparatach CD14 + stymulowanych samym M-CSF może powodować różnicowanie OC, potencjalnie poprzez wydzielanie RANKL przez limfocyty T49. Dlatego ważne jest, aby dołączyć kontrolę M-CSF do każdego eksperymentu. Rutynowa kontrola czystości, zwłaszcza w przypadku korzystania z nowego zestawu do izolacji, jest również zalecana w celu zapewnienia czystości próbki.

Optymalne wartości OC (zakres: ~200-1 600 OC/dołek) uzyskuje się przy użyciu pożywki α-MEM wzbogaconej o nukleozydy i L-glutaminę. Inne konwencjonalne podłoża hodowlane, w tym zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) i pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, wpływają na wydajność OC. Źródło FBS może również wpływać na osteoklastogenezę. Różne partie FBS mogą prowadzić do zmniejszenia osteoklastogenezy pochodzącej z RANK-L, a także do pojawienia się małej liczby komórek wielojądrowych TRAP + w kontrolach M-CSF (rysunek uzupełniający 3). Dlatego, aby osiągnąć spójne wyniki, zaleca się testowanie nowych partii FBS przed użyciem i kontynuowanie tej samej partii przez cały czas trwania eksperymentów, aby zminimalizować różnice w procesie różnicowania. Ponadto zmienność między dawcami, pod względem całkowitej liczby zróżnicowanych OC uzyskanych w końcowym punkcie czasowym, stanowi ograniczenie przy stosowaniu tego protokołu do porównywania, na przykład, zdrowych dawców z pacjentami. W takich przypadkach konieczne jest użycie dokładnie tych samych warunków i tej samej partii pożywki, FBS i innych odczynników.

Kolejnym niezbędnym krokiem dla optymalnego różnicowania i dojrzewania OC jest zaszczepienie monocytów M-CSF przed dodaniem RANKL. Ekspozycja komórek na M-CSF 18-24 godziny przed RANKL przygotowuje monocyty do zwiększenia ekspresji RANK15,26. Dodanie RANKL w tym punkcie czasowym zapewnia optymalne różnicowanie OC w sposób zależny od dawki. Stopień zróżnicowania OC różni się w zależności od dawcy; jednak 25 ng / ml RANKL jest zwykle wystarczające do różnicowania dużej liczby OC u większości dawców. Dodatkowo, 25 ng/ml RANKL może być stosowany w testach do wstępnych badań przesiewowych związków, ponieważ ułatwia ocenę zarówno wzmacniającego, jak i hamującego działania badanych związków. Inne systemy hodowli wykorzystywały dłuższe czasy preinkubacji M-CSF przed dodaniem RANKL, ale skutkuje to dłuższym czasem hodowli osteoklastogenezy50. Ponadto pozostawienie przygotowanych monocytów do inkubacji przez noc pozwala im przyczepić się do płytki, choć nie w stanie w pełni przylegającym. Dlatego, gdy RANKL jest wprowadzany po raz pierwszy, pożywka musi być bardzo ostrożnie zmieniona w połowie, a nie całkowicie zmieniona, aby zapobiec oderwaniu i utracie przygotowanych monocytów. Pożywkę należy również odświeżać co 3-4 dni, aby uniknąć wyczerpania pożywki i zapobiec śmierci komórki. Ponadto, ze względu na małą objętość użytą w tym teście (100 μl/studzienkę na płytce 96-dołkowej), niezwykle ważne jest, aby wokół studzienek testowych znajdowała się rama z pustych studzienek, które są wypełnione roztworem wodnym (tj. sterylnym destylowanymH2Olub PBS). Zapobiega to parowaniu medium i efektom krawędziowym.

Wreszcie, w przypadku testów metabolicznych (np. Testów ATP), konieczne jest, aby komórki były żywotne, aby uniknąć ogromnego odchylenia standardowego między kontrpróbami (ryc. 5). Wysoka żywotność komórek jest również ważna dla sortowania komórek i dalszej hodowli posortowanych OC (ryc. 4). Ta metoda ma jednak kilka ograniczeń. W pełni dojrzałe OC są bardzo przylegające i trudne do oderwania od płytek. Większe OC są często niemożliwe do odłączenia, co może prowadzić do niższej wydajności ogniw. W związku z tym komórki należy policzyć po sortowaniu, a przed posiewem w wymaganym stężeniu. Ponadto w niniejszym protokole stosuje się metodę nieenzymatyczną (akutazę) do odłączania OC w celu zapobieżenia zmianom błony w dalszym barwieniu powierzchni do cytometrii przepływowej. Przetestowano również użycie skrobaków komórkowych (zarówno z miękkimi, jak i twardymi końcami), które doprowadziło do wysokiej śmierci komórek. Oddzielenie enzymatyczne przy użyciu 0,05% roztworów trypsyny/EDTA może być stosowane w celu uzyskania wyższej wydajności oderwanych OC, gdy integralność membrany nie jest wymagana w dalszych zastosowaniach. Dodatkowo, aby zapobiec zlepianiu się OC, zdecydowanie zaleca się stosowanie wysokiego stężenia EDTA we wszystkich po odłączeniu komórek, a także odpowiednie filtrowanie przed akwizycją cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że kultury OC to niejednorodna populacja komórek składająca się z dojrzałych OC, prekursorów OC i makrofagów. Makrofagi można łatwo odróżnić od OC, chociaż zarówno jednojądrzaste pre-OC, jak i wielojądrowe OC wyrażają OSCAR i nie można ich odróżnić za pomocą obecnej metody (ryc. 4). To ostatnie zagadnienie stanowi bowiem główne ograniczenie tej metody. Ponadto niska ekspresja OSCAR jest również obecna w kulturach M-CSF (Figura 4B) i może wskazywać na makrofagi, które są przygotowane do zaangażowania w linię OC. Ważne jest, aby ustawić bramkę dla komórek OSCAR+ w oparciu o sygnał barwienia FMO, jak pokazano na rysunku 4B.

Podsumowując, protokół ten opisuje zoptymalizowaną i solidną metodę wydajnej produkcji aktywnych i funkcjonalnie dojrzałych OC z krążących pierwotnych ludzkich monocytów. Mocną stroną tego protokołu jest jego zdolność do generowania OC w krótkim czasie i uzyskiwania dużej liczby zróżnicowanych OC. Metoda ta otwiera drogę do zbadania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw różnicowania i funkcji OC.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Flow Core Facility oraz Glasgow Imaging Facility (GIF) w ramach School of Infection and Immunity za ich wsparcie i pomoc w tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Slide 18-dołkowe szkiełka komoroweibidi81816
8-dołkowe szklane szkiełka komorowe Ibidi 80807 
96-dołkowa płytka TC Corning 3596 
96-dołkowy test kostno-ościowy Stripwell Plate   Corning 3989 
Roztwór octanuSigma Aldrich386-3z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Aceton Firma VWR 20066.330 
Zestaw fosfatazy kwasowej, leukocytów (TRAP) SIGMA-ALDRICH 387A-1KT 
Alexa Fluor 488 PhalloidinTheremo Fisher - Invitrogen A12379 AF488     
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher - InvitrogenA22287AF647
Alfa Aesar 2-Deoksy-D-glukoza Fisher Naukowy 11321867 2DG, 98% 
Minimum alfa niezbędne podłoże Gibco 22571-020 
ATPlite 1krok PerkinElmer 6016731 System oznaczania luminescencji ATP 
Sortownik komórek BD FACSAria IIIBD Biosciences
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Sigma-Aldrich A9418-100G 
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96-dołkowa, PS, F-bottom Greiner bio-one 655083 Płyty z białym dnem 
Roztwór cytrynianuSigma Aldrich91-5z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Corning 6ml probówki z polistyrenu okrągłodennegoFisher Scientific352054
Płytka wielodołkowa Corning do badania kości kościSigma-Aldrich 
Test kostny Corning Powierzchniowa płytka wielodołkowa 1 x 8 paskowaCorningCLS3989-2EA
DAPI Theremo Fisher  D3571 
Zestaw do pozytywnej selekcji człowieka EasySep CD14 Technologie STEMCELL Numer katalogowy: 17858 
Bufor do lizy czerwonych krwinek EasySep (10x)Technologie komórek macierzystych 20110
eBioscience utrwalany barwnik żywotności eFluor 780Theremo Fisher - Invitrogen 65-0865-14
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sigma-Aldrich E7889-100ML 
System automatycznego obrazowania EVOS FLThermo FisherA32678
Okrągłe probówki polipropylenowe Falcon z nakrętkąFisher Scientific10314791
Falcon probówki 15 mlCorning Numer katalogowy: 430790 
Probówki Falcon 50 mL Corning   430828 
Szybki granat GBC roztwór bazowySigma Aldrich387-2z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Surowica bydlęca płodu Gibco Numer katalogowy: 10500-064 FBS (Sieć Usługowa
Ficoll-Paque Plus cytiva 17144003 
Formaldehyd Sigma-Aldrich F-8775 
Ludzki ligand sRANK PEPROTECH 310-01-100UG Aktywator receptora czynnika jądrowego liganda kappa-B  (RANGL)
ImageJ Oprogramowanie do analizy obrazuImage Jwersja 2.9.0
L-glutamina Gibco 25030-024 
Probówki z heparyną litową (9 ml) ODKURZACZ 455084 
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów PEPROTECH 300-25-100UG   M-CSF
Napthol AS-BI roztwór kwasu fosforowegoSigma Aldrich387-1z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Komora zliczająca hemacytometr Neubauer CamlabSKU 1127885
Oligomycyna ze Streptomyces Diastatochromogenes Sigma-Aldrich Q4876-5MG 
Przeciwciało OSCAR, anty-ludzkie, Vio Bright FITC, REAfinitMiltenyi Biotec130-107-661 i 130-107-617Klon REA494
PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-ludzkie CD14Biolegend325618Klon HCD14 
Penicyna/streptomycyna SIGMA P0781 
Maszyna i oprogramowanie PHERAstarBMG LABTECH
Solanka buforowana fosforanami (DPBS, 1x) Gibco Numer katalogowy: 14190-094 
Przeciwciało kontrolne REA (S), ludzkie IgG1, Vio Bright FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-113-443
Podchloryn sodu, roztwór  Sigma-Aldrich Numer katalogowy: 425044-1L 
Roztwór azotynu soduSigma Aldrich91-4z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Roztwór winianuSigma Aldrich387-3z zestawu Nr kat. 387A-1KT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 
Błękit trypanowy Sigma-Aldrich T8154-100ML 
CLS3989

Bibliografia

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
  3. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  4. Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
  5. Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
  6. Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
  7. Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
  8. Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
  9. Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
  10. Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
  11. Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
  12. Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
  13. Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
  14. McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237(2021).
  15. Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
  16. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  17. Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282(2020).
  18. Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
  19. Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V. Osteoclast fusion and fission. Calcified Tissue International. 90 (6), 515-522 (2012).
  20. McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
  21. Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
  22. Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
  23. Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
  24. Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
  25. Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
  26. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  27. Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
  28. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780(2021).
  29. Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
  30. Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
  31. Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
  32. Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
  33. Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
  34. Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
  35. Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
  36. Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221(2020).
  37. Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776(2021).
  38. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
  39. Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
  40. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  41. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
  42. Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
  43. Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
  44. Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632(2018).
  45. Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152(2006).
  46. Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780(2018).
  47. Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
  48. Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
  49. D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82(2012).
  50. Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie osteoklastówstymulacja M-CSFindukcja RANKLbarwienie TRAPtest resorpcji mineralnejtworzenie pierścienia aktynowegosortowanie cytometrycznemikroskopia immunofluorescencyjna
Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.