Artykuł metodologiczny

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64701

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak podłużnie wizualizować ekspresję i lokalizację interesującego białka w określonych typach komórek mózgu zwierzęcia, po ekspozycji na bodźce egzogenne. W tym miejscu pokazano podawanie urazowego uszkodzenia mózgu w zamkniętej czaszce (TBI) i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego w celu późniejszego podłużnego obrazowania przyżyciowego u myszy. Myszom wstrzykuje się doczaszkowo wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wykazującym ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) pod specyficznym dla neuronów promotorem. Po 2 do 4 tygodniach myszy są poddawane powtarzającemu się TBI za pomocą urządzenia do obniżania masy ciała w miejscu wstrzyknięcia AAV. W ramach tej samej sesji chirurgicznej myszom wszczepia się metalowy słupek na głowę, a następnie szklane okno czaszki nad miejscem uderzenia TBI. Ekspresję i lokalizację komórkową EGFP bada się za pomocą mikroskopu dwufotonowego w tym samym obszarze mózgu narażonym na uraz w ciągu kilku miesięcy.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), które może wynikać z urazów sportowych, kolizji samochodowych i walk wojskowych, jest ogólnoświatowym problemem zdrowotnym. TBI może prowadzić do deficytów fizjologicznych, poznawczych i behawioralnych oraz niepełnosprawności lub śmiertelności na całe życie1,2. Nasilenie TBI można sklasyfikować jako łagodne, umiarkowane i ciężkie, przy czym zdecydowana większość to łagodne TBI (75%-90%)3. Coraz częściej uznaje się, że TBI, a zwłaszcza powtarzające się wystąpienia TBI, mogą sprzyjać zwyrodnieniu neuronów i służyć jako czynniki ryzyka kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), otępienia czołowo-skroniowego (FTD) i przewlekłej encefalopatii pourazowej (CTE)4,5,6. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw neurodegeneracji wywołanej TBI pozostają niejasne, a zatem stanowią aktywny obszar badań. Aby uzyskać wgląd w to, jak neurony reagują na TBI i regenerują się po TBI, opisano metodę monitorowania fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania, szczególnie w neuronach, za pomocą podłużnego obrazowania przyżyciowego u myszy po TBI.

W tym celu, to badanie pokazuje, jak połączyć procedurę chirurgiczną podawania TBI z zamkniętą czaszką, która jest podobna do tego, co zostało zgłoszone wcześniej7,8, wraz z procedurą chirurgiczną polegającą na wszczepieniu okna czaszkowego do dalszego obrazowania przyżyciowego, zgodnie z opisem Goldey et al9. Warto zauważyć, że nie jest możliwe wszczepienie najpierw okna czaszkowego, a następnie wykonanie TBI w tym samym obszarze, ponieważ wpływ spadku wagi, który wywołuje TBI, może uszkodzić okno i spowodować nieodwracalne szkody dla myszy. Dlatego protokół ten został opracowany tak, aby podać TBI, a następnie wszczepić okno czaszkowe bezpośrednio w miejscu uderzenia, a wszystko to w ramach tej samej sesji chirurgicznej. Zaletą połączenia zarówno TBI, jak i implantacji okna czaszkowego podczas jednej sesji chirurgicznej jest zmniejszenie liczby operacji poddawanych myszy. Co więcej, pozwala monitorować natychmiastową odpowiedź (tj. w skali godzin) na TBI, w przeciwieństwie do wszczepienia okienka podczas późniejszej sesji chirurgicznej (tj. początkowego obrazowania rozpoczynającego się w skali czasowej dni po TBI). Okno czaszkowe i platforma obrazowania przyżyciowego oferują również przewagę nad monitorowaniem białek neuronalnych za pomocą konwencjonalnych metod, takich jak barwienie immunologiczne utrwalonych tkanek. Na przykład do obrazowania przyżyciowego potrzeba mniej myszy, ponieważ ta sama mysz może być badana w wielu punktach czasowych, w przeciwieństwie do oddzielnych kohort myszy potrzebnych do dyskretnych punktów czasowych. Co więcej, te same neurony mogą być monitorowane w czasie, co pozwala śledzić określone zdarzenia biologiczne lub patologiczne w tej samej komórce.

Jako dowód koncepcji, tutaj pokazano specyficzną dla neuronów ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) pod promotorem synapsyny10. Podejście to można rozszerzyć na 1) różne typy komórek mózgowych poprzez wykorzystanie innych promotorów specyficznych dla typu komórki, takich jak promotor podstawowego białka mielinowego (MBP) dla oligodendrocytów i promotor kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) dla astrocytów11 , 2) różne białka docelowe będące przedmiotem zainteresowania poprzez fuzję ich genów z genem EGFP oraz 3) koekspresja wielu białek połączonych z różnymi fluoroforami. W tym przypadku EGFP jest pakowany i wyrażany poprzez dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe. TBI z zamkniętą czaszką podaje się za pomocą urządzenia do zmniejszania wagi, a następnie wszczepia się okno czaszki. Wizualizację neuronalnego EGFP uzyskuje się przez okno czaszkowe, przy użyciu mikroskopii dwufotonowej do wykrywania fluorescencji EGFP in vivo. Dzięki laserowi dwufotonowemu możliwe jest wniknięcie głębiej w tkankę korową przy minimalnym fotouszkodzeniu, co pozwala na wielokrotne obrazowanie podłużne tych samych obszarów korowych u pojedynczej myszy przez dni i do miesięcy12,13,14,15. Podsumowując, to podejście polegające na połączeniu operacji TBI z obrazowaniem przyżyciowym ma na celu pogłębienie wiedzy na temat zdarzeń molekularnych, które przyczyniają się do patologii choroby wywołanej przez TBI16,17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez Komitet Narodowej Rady ds. Badań Naukowych (USA). Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Massachusetts Chan (UMMS) (zezwolenie nr 202100057). W skrócie, jak pokazano na schemacie badania (Rysunek 1), zwierzę otrzymuje wstrzyknięcie wirusa, TBI, implantację okienka, a następnie obrazowanie przyżyciowe w sekwencji czasowej.

UWAGA: Warunki handlowe zostały usunięte. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnym używanym sprzętem.

1. Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie AAV za pomocą urządzenia stereotaktycznego

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. Użyj miana wirusa 1 x 1013 genomów wirusowych na mililitr (vg/ml). Syn1 odnosi się do synapsyny1, która jest specyficznym dla neuronów promotorem pozwalającym na ograniczoną ekspresję wirusa w neuronach. Wirus może być przygotowany we własnym zakresie lub zlecony na zewnątrz.
  2. Przygotowanie do operacji iniekcji stereotaktycznej w celu podania AAV
    1. Zwykłe nożyczki do autoklawu, suwmiarka chirurgiczna, chirurgiczne nożyczki sprężynowe, kleszcze chirurgiczne, kleszcze do komarów, gaza, aplikator z bawełnianą końcówką i szklana strzykawka mikrolitrowa.
    2. Zdezynfekuj obszar operacji za pomocą 75% etanolu. Rozwiń jednorazową sterylną serwetę chirurgiczną, aby zakryć obszar chirurgiczny na platformie stereotaktycznej.
      UWAGA: Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji iniekcji, należy użyć urządzenia grzewczego regulowanego sprzężeniem zwrotnym.
    3. Zważ i zapisz masę ciała myszy.
    4. Otwórz zawór butli tlenu i wyreguluj przepływ tlenu na 1,5 l/min. Otwórz aparat anestezjologiczny i ustaw wartość poziomu izofluranu na trzy.
      UWAGA: Na tym etapie gazem nośnym może być powietrze w pomieszczeniu lub 100% tlenu.
    5. Włóż mysz do komory indukcyjnej i pozostaw ją na 5 minut, aby uzyskać pełne znieczulenie.
    6. Gdy mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść głowę myszy w ramce stereotaktycznej.
    7. Umieść stożek nosowy rurki anestezjologicznej nad pyskiem myszy.
    8. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu, z gazem nośnym o natężeniu przepływu 1 l/min do końca operacji. Okresowo sprawdzaj częstotliwość oddechu i szczyp ogon lub palec u nogi co najmniej co 15 minut podczas operacji, aby ocenić odpowiednie znieczulenie. Dostosuj stężenie izofluranu w zależności od potrzeb, aby utrzymać pożądaną głębokość znieczulenia.
    9. Napełnij mikrolitrową strzykawkę (10 μl) roztworem wirusa. Następnie przymocuj strzykawkę do dopasowanej pompy mikroiniekcyjnej urządzenia stereotaktycznego.
  3. Chirurgia iniekcyjna
    1. Podawać buprenorfinę (1 mg/kg mc., podskórnie) za pomocą jednorazowej strzykawki insulinowej i nakładać smarującą maść okulistyczną na oczy myszy.
    2. Usuń włosy ze skóry głowy na czubku głowy, przycinając je zwykłymi nożyczkami 1.
    3. Oczyść skórę głowy gazą i aplikatorami z bawełnianą końcówką. Zdezynfekuj skórę za pomocą najpierw 75% etanolu, a następnie betadyny. Powtórz to trzy razy (tj. etanol, a następnie betadyna), pozostawiając ostateczną aplikację betadyny na skórze.
    4. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona). Wykonaj nacięcie ~1 cm za pomocą zwykłych nożyczek 2 wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić prawą czaszkę ciemieniową i usuń okostną za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
    5. Zaznacz dwa punkty na czaszce za pomocą markera na tych współrzędnych: punkt A: 2,5 mm za Bregmą i 1 mm w bok do linii środkowej nad prawą półkulą; punkt B: 2,5 mm za Bregmą i 2 mm bocznie do linii środkowej nad prawą półkulą.
    6. Ostrożnie wywierć dwa otwory w czaszce w zaznaczonych współrzędnych za pomocą elektrycznej wiertarki dentystycznej z drobnym wiertłem z węglika spiekanego EF4.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej.
    7. Wyreguluj ramę stereotaktyczną, aby wyrównać końcówkę igły strzykawki mikrolitrowej do otworu czaszki, który jest 1 mm boczny do linii środkowej.
    8. Opuścić igłę strzykawki, aby dotknąć powierzchni mózgu, a następnie ustawić to miejsce jako punkt zerowy (dla osi z). Opuść końcówkę igły do kory mózgowej na głębokość 0,5 mm i powoli wlej 1 μl roztworu wirusa z prędkością 200 nL/min.
    9. Odczekaj 5 minut po całkowitym wstrzyknięciu roztworu wirusa do tkanki mózgowej przed wycofaniem igły, aby zapobiec cofaniu się roztworu.
    10. Powoli wyjąć igłę ze strzykawki. Powtórzyć wstrzyknięcie w drugim miejscu. Zszyj nacięcie sterylnym, niewchłanialnym szwem chirurgicznym (rozmiar 6-0).
    11. Podawać cefazolinę [500 mg/kg (333 mg/mL, zwykle ~45 μL), domięśniowo] i meloksykam (5 mg/kg, podskórnie) po operacji, gdy zwierzę jest jeszcze znieczulone.
    12. Zwolnij mysz z ramki stereotaktycznej i przerwij znieczulenie. Umieść mysz w czystej klatce nad kocem grzewczym i monitoruj zwierzę, aż zacznie chodzić (około 15 minut). Następnie przenieś się do klatki domowej.
    13. Buprenorfinę (1 mg/kg mc. podskórnie) i meloksykam (5 mg/kg mc. podskórnie) należy podawać ponownie po 8 godzinach, 16 godzinach i 24 godzinach od pierwszego wstrzyknięcia buprenorfiny.
      UWAGA: Po 2-4 tygodniach od wstrzyknięcia wirusa mysz otrzymuje TBI i implantację okna czaszkowego w tym samym miejscu, co wstrzyknięcie AAV.

2. Podawanie powtarzalnej indukcji TBI

UWAGA: Parametry TBI są dostosowywane na podstawie poprzednich raportów7,8, w których uderzenie TBI zostało dostarczone raz. Protokół w tym miejscu stosuje ten sam parametr, z wyjątkiem zwiększenia całkowitej liczby wpływu do 10.

  1. Sprzęt TBI
    1. Użyj specjalnie skonstruowanego urządzenia przenośnego do podawania TBI z zamkniętą czaszką (Rysunek 2A) do głowy myszy po prawej stronie, jak pokazano w Rysunek 2B.
  2. Przygotowanie przed zabiegiem
    1. Sprzęt do chirurgii w autoklawie, w tym zwykłe nożyczki, suwmiarka chirurgiczna, chirurgiczne nożyczki sprężynowe, kleszcze chirurgiczne, kleszcze do komarów, kawałki słupka głowy, gaza i aplikatory z bawełnianą końcówką.
    2. Zważ i zapisz masę ciała myszy na 2 godziny przed zabiegiem. Aby zminimalizować obrzęk mózgu podczas implantacji okna czaszkowego, należy wstrzyknąć fosforan sodu deksametazonu w dawce 4,8 mg/kg [2 mg/mL, zwykle ~70 μl (należy wstrzyknąć w dwa miejsca)] do mięśnia czworogłowego uda za pomocą strzykawki insulinowej. Po wstrzyknięciu deksametazonu, ale przed rozpoczęciem operacji TBI, należy przygotować szklane okna zgodnie z zaleceniami w kroku 3.1 do późniejszego użycia.
    3. Zdezynfekuj scenę chirurgiczną i sprzęt TBI za pomocą 75% etanolu i rozszerz jednorazową sterylną serwetę chirurgiczną, aby pokryć etap operacji na platformie stereotaktycznej. Włącz urządzenie grzewcze i monitor temperatury, ustawiając temperaturę docelową na 37 °C.
    4. Otwórz zawór butli tlenu i wyreguluj przepływ tlenu na 1,5 l/min. Otwórz aparat anestezjologiczny i ustaw wartość poziomu izofluranu na trzy.
      UWAGA: 100% czysty tlen może pomóc zwierzęciu przetrwać uderzenia TBI.
    5. Włóż mysz do komory indukcyjnej i pozostaw ją na 5 minut, aby uzyskać pełne znieczulenie.
    6. Gdy mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść głowę myszy w ramce stereotaktycznej.
    7. Umieść stożek nosowy rurki anestezjologicznej nad pyskiem myszy.
    8. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu zmieszanego ze 100% czystym tlenem przy natężeniu przepływu 1 l/min do końca zabiegu. Okresowo sprawdzaj częstotliwość oddechu i szczyp ogon lub palec u nogi co najmniej co 15 minut podczas operacji, aby ocenić odpowiednie znieczulenie. Dostosuj stężenie izofluranu w zależności od potrzeb, aby utrzymać pożądaną głębokość znieczulenia.
  3. Operacja TBI
    1. Podawać buprenorfinę (1 mg/kg mc., podskórnie) za pomocą jednorazowych strzykawek insulinowych i nakładać maść okulistyczną na oczy myszy.
    2. Usuń włosy z czubka głowy, przycinając je nożyczkami 1, a następnie nakładając środek do depilacji na 1 min.
      UWAGA: Nie nakładaj środka do depilacji na skórę głowy dłużej niż 3 minuty, ponieważ działa drażniąco na skórę. Unikaj dostania się środka do depilacji na oczy myszy.
    3. Oczyść skórę głowy, nakładając gazę i aplikatory z bawełnianą końcówką. Następnie zdezynfekuj skórę, używając najpierw 75% etanolu, a następnie betadyny. Powtórz to trzy razy (tj. etanol, a następnie betadyna), pozostawiając ostateczną aplikację betadyny na skórze.
    4. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona). Zabezpiecz skórę kleszczami chirurgicznymi 3 i wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 12-15 mm, zaczynając około 3 mm z tyłu od oczu.
    5. Wytnij skórę nad lewą i prawą półkulą czaszki za pomocą nożyczek sprężynowych 2.
    6. Po odsłonięciu czaszki usuń okostną, delikatnie pocierając sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i spłukując sterylną solą fizjologiczną.
    7. Sprawdź wzrokowo stan czaszki, aby upewnić się, że jest nienaruszona, z wyjątkiem dwóch małych otworów, które zostały wykonane na potrzeby poprzedniej operacji wstrzyknięcia wirusa.
    8. Osusz obszar czaszki i zaznacz miejsce uderzenia TBI na następujących współrzędnych: 2,5 mm za Bregmą i 2 mm bocznie od szwu strzałkowego w prawo (Rysunek 2B).
    9. Szybko wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i połóż głowę na poduszce buforowej pod urządzeniem TBI.
    10. Dopasuj końcówkę impaktora do zaznaczonego miejsca uderzenia.
    11. Podnieś metalową kolumnę, ciągnąc nylonowy sznurek na uwięzi do 15 cm nad głową myszy, a następnie zwolnij go, pozwalając ciężarkowi swobodnie opaść na pręt przetwornika, który styka się z czubkiem czaszki w miejscu TBI. Nie dotykaj głowicy myszy podczas uderzania TBI.
    12. Przesuń mysz na koc grzewczy i połóż ją na plecach, monitorując stan oddychania.
    13. Gdy mysz ustawi się z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej, umieść ją w komorze indukcyjnej izofluranu na ~ 5 minut z 3% izofluranem zmieszanym ze 100% czystym tlenem przy natężeniu przepływu 1,5 l/min.
    14. Gdy mysz jest w pełni uspokojona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), powtórz kroki 2.3.9-2.3.14, aby uzyskać łącznie 10 uderzeń.
      UWAGA: W naszym badaniu stwierdzono, że dziesięć uderzeń TBI indukuje silny fenotyp o niskiej śmiertelności myszy (dane jeszcze nie opublikowane). Parametry mogą być dostosowywane w celu uzyskania różnej ciężkości uszkodzenia mózgu poprzez zwiększanie lub zmniejszanie liczby uderzeń i/lub wysokości, z której ciężar jest uwalniany. Wszystkie parametry podlegają zatwierdzeniu przez lokalny IACUC.
    15. Sprawdź czaszkę pod mikroskopem chirurgicznym i usuń mysz z badania, jeśli doszło do złamania czaszki.
    16. W przypadku operacji pozorowanej należy postępować zgodnie z tymi samymi procedurami, jak opisano powyżej, w tym umieszczaniem zwierzęcia pod impaktorem, ale bez wywoływania uderzeń TBI.
    17. Po tym, jak mysz ustawi się z pozycji leżącej na plecach do pozycji leżącej po 10. uderzeniu TBI, umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu na ~5 minut. Wykonaj kroki 2.2.6-2.2.8, aby umieścić głowę myszy na ramie stereotaktycznej w celu operacji implantacji okna czaszkowego opisanej poniżej.

3. Operacja wszczepienia implantu okienka czaszkowego

UWAGA: Poniższe kroki implantacji okna czaszkowego zostały zaczerpnięte z Goldey et al.9, a ich specyfikacje dotyczące głowicy i studni obrazowania zostały tutaj zastosowane.

  1. Przygotowanie okien
    UWAGA: Zakończ przygotowanie okna w kroku 2.2.2 przed rozpoczęciem operacji TBI. Okno składa się z dwóch okrągłych szkiełek nakrywkowych (jedno o średnicy 3 mm i jedno o średnicy 5 mm, jak wskazuje Rysunek 2C), które są połączone ze sobą przezroczystym klejem optycznym, jak opisano poniżej.
    1. Zdezynfekuj szklane szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 75% etanolu na 15 minut. Wyjmij szklane szkiełka nakrywkowe z etanolu i pozostaw je do wyschnięcia na sterylnej powierzchni (tj. pokrywce sterylnej płytki 24-dołkowej) przez ~10 minut.
    2. Napełnij strzykawkę insulinową przezroczystym klejem optycznym, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pod mikroskopem 1 (Tabela materiałów) przy powiększeniu 0,67x umieść małą kroplę (~1 μL) kleju optycznego na środku szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm. Następnie natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 3 mm na wierzchu i wyśrodkuj je z szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 5 mm.
    3. Delikatnie dociśnij za pomocą cienkich kleszczyków, aby równomiernie rozprowadzić klej. Wyrzuć szklane okienko, jeśli wokół 3 mm szkiełka nakrywkowego tworzy się pęcherzyk lub ściana.
    4. Aby utwardzić klej, umieść szkiełka nakrywkowe w pudełku UV na 150 s o mocy 20 x 100 μJ/cm2. Sprawdź, czy dwa szkiełka nakrywkowe są dobrze połączone, używając kleszczyków 4, aby delikatnie popchnąć bok szkiełka 3 mm. Jeśli szkiełko nakrywkowe się przesunie, umieść je z powrotem w pudełku UV na dodatkowe 60 sekund. Szklane okienko należy przechowywać w sterylnej 24-dołkowej płytce do późniejszego użycia.
  2. Szorstka powierzchnia czaszki.
    UWAGA: Od tego momentu wykonaj wszystkie kroki opisane w sekcji 3 pod mikroskopem chirurgicznym. Zacznij od 10x i dostosuj do żądanego powiększenia.
    1. Delikatnie i powoli wywierć powierzchnię czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG4 przy niskiej prędkości wirnika (tj. numer wyjściowy ustawiony na ~1-2), aby usunąć pozostałą okostną i stworzyć szorstką powierzchnię czaszki, tak aby cement dentystyczny bezpiecznie wiązał się z czaszką. Alternatywnie można tu również użyć skalpela zamiast wiertła.
    2. Użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać i usunąć pył kostny z powierzchni czaszki.
  3. Oddziel mięśnie.
    UWAGA: Separacja mięśni służy zwiększeniu powierzchni odsłoniętej kości czaszki, która będzie służyć jako punkt kontaktowy dla cementu dentystycznego, zapewniając w ten sposób integralność strukturalną implantu. Ten etap separacji mięśni zwykle odsłania ~3 mm skroniowej płytki czaszki.
    1. W odległości około 5 mm za okiem, gdzie znajduje się szew łączący czaszkę ciemieniową i skroniową, delikatnie włóż zamknięte cienkie końcówki (kleszcze #5/45), aby oddzielić mięśnie boczne od czaszki i delikatnie przesuwaj zamknięte końcówki w kierunku tylnym, aż do szwu Lambdoidalnego.
    2. Oddziel mięśnie boczne po stronie, po której nastąpi zagnieżdżenie okna czaszki.
      UWAGA: Uważaj, aby nie rozdzielać mięśni zbyt blisko oka, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy ocznej; W przeciwnym razie może wystąpić ciężkie i uporczywe krwawienie. Nie oddzielaj mięśni od kości potylicznej, ponieważ mysz potrzebuje tych mięśni do podniesienia głowy.
    3. Zmyj zanieczyszczenia z pola operacyjnego za pomocą soli fizjologicznej i osusz obszar gazą. Piankę żelową można nałożyć na miejsce operacji, aby zatrzymać krwawienie.
  4. Wszczep szpilkę.
    1. Użyj specjalnie wykonanego tytanowego słupka na głowę (Rysunek 2D), opisanego w poprzedniej publikacji9, aby bezpiecznie zamocować głowę myszy podczas wykonywania operacji kraniotomii i do późniejszego obrazowania dwufotonowego.
    2. Za pomocą markera i suwmiarki chirurgicznej obrysuj obwód kraniotomii na czystej i suchej czaszce po prawej stronie. Punkt środkowy śledzonego okręgu znajduje się 2,5 mm za Bregmą i 1,5 mm od szwu strzałkowego na prawej półkuli. Średnica narysowanego okręgu wynosi około 3,2-3,5 mm, jest nieco większa niż 3 mm szklane szkiełko nakrywkowe. Upewnij się, że krąg kraniotomii może zakryć miejsca wstrzyknięcia wirusa (dwa otwory wykonane podczas wstrzykiwania wirusa mogą służyć jako odniesienie) i miejsce TBI.
    3. Poluzuj nausznik i obróć głowę tak, aby płaszczyzna kraniotomii była idealnie pozioma, a następnie ponownie dokręć nausznik.
    4. Użyj drewnianego patyczka aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dodać dwie małe krople superglue do przedniej i tylnej krawędzi słupka.
    5. Umieść tytanowy słupek głowy nad środkiem kraniotomii i szybko wyreguluj go tak, aby spoczywał w tej samej płaszczyźnie, w której zostanie wszczepione okno czaszki. Zastosuj lekki nacisk, aż klej superglue wyschnie; Zwykle trwa to ~30 s.
    6. Przygotuj cement dentystyczny we wstępnie schłodzonym ceramicznym naczyniu do mieszania (pozostając co najmniej 10 minut w zamrażarce o temperaturze -20 °C): połącz 300 mg proszku cementowego, sześć kropli płynu szybkiego i jedną kroplę katalizatora, a następnie mieszaj mieszaninę, aż dokładnie się wymiesza (~15 razy).
      UWAGA: Cement musi być w postaci pasty. Jeśli jest zbyt rzadki, wymieszaj trochę więcej proszku cementowego. Jeśli jest zbyt gęsty, mieszaj z płynem szybkiej bazy po jednej kropli na raz, aż do uzyskania konsystencji pasty.
    7. Szybko nałóż dużą ilość mieszanki cementu dentystycznego na zewnętrzny obwód śledzonego obwodu i przykryj odsłoniętą powierzchnię kości. Nie należy jednak zakrywać miejsca kraniotomii. Odczekaj ~15 minut, aż cement dentystyczny wyschnie i stwardnieje, zanim przejdziesz dalej.
    8. Zwolnij pasek na ucho i przymocuj sztyft do metalowej ramy, aby upewnić się, że głowa jest stabilna do precyzyjnego wiercenia wzdłuż zaznaczonego obwodu kraniotomii. Jeśli w miejscu kraniotomii znajduje się cement, użyj wiertła z węglika spiekanego FG4, aby go wywiercić i usunąć.
  5. Kraniotomia
    1. Użyj suwmiarki chirurgicznej, aby sprawdzić średnicę zaznaczonego okręgu, zgodnie z definicją w kroku 3.4.2. W razie potrzeby wyreguluj, aby okienko czaszki ściśle przylegało do kraniotomii.
    2. Za pomocą elektrycznej wiertarki dentystycznej wytrawić i rozcieńczyć czaszkę wzdłuż zewnętrznej strony zaznaczonego okręgu, używając najpierw wiertła z węglika spiekanego FG4 (prędkość ustawiona na moc wyjściową ~9-10). W ten sposób powstaje "ścieżka", w której czaszka jest rozrzedzana.
      UWAGA: Aby zminimalizować obrażenia cieplne i uzyskać gładki tor, przesuwaj wiertło. Nie wiercić w tym samym miejscu dłużej niż 2 sekundy.
    3. Okresowo przerwij wiercenie i przepłucz cały obszar sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć nagrzewanie się wiertła i zmyć pył kostny.
    4. Kontynuuj rozrzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego FG1/4, jak opisano w kroku 3.5.2, aż czaszka stanie się cienka jak papier i przezroczysta.
      UWAGA: Używanie dwóch rąk do trzymania wiertła może ułatwić kontrolowanie wiertła i uniknięcie wkładania wiertła do mózgu.
    5. Zakończ przerzedzanie czaszki za pomocą wiertła z węglika spiekanego EF4. Kiedy dochodzi do pęknięcia między płatem kostnym a otaczającą go kością czaszki, czasami dochodzi do uwolnienia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), co wskazuje, że czaszka została całkowicie przewiercona.
    6. Kontynuuj przerzedzanie i wiercenie w pozostałej części czaszki wzdłuż toru. Unikaj wiercenia w miejscu, w którym widoczne unaczynienie przechodzi pod czaszką, aby zapobiec krwawieniu.
    7. Włóż cienką końcówkę kleszczy (kleszcze 1) ~ 0,5 mm przez pęknięte miejsce i delikatnie podnieś płat kostny do góry, nie wgniatając leżącego pod spodem mózgu.
    8. Po usunięciu płata kostnego przepłukać obszar kraniotomii solą fizjologiczną. Powierzchnia mózgu może być o 1-2 mm wyższa niż krawędź kraniotomii.
    9. Zaczynając od tego kroku, zawsze przykrywaj odsłonięty mózg solą fizjologiczną, aby chronić tkankę mózgową.
    10. Krwawienie może wystąpić podczas podnoszenia płata kostnego w oryginalnych miejscach wstrzyknięcia AAV z powodu adhezji tkanek i wzrostu naczyń krwionośnych po operacji iniekcji. Jeśli tak się stanie, delikatnie dociśnij miejsce suchym aplikatorem z bawełnianą końcówką przez ~2 minuty (lub dłużej w razie potrzeby). Do zatamowania krwawienia można użyć pianki żelowej. Nie używaj chemikaliów ani kleszczy grzewczych, aby zatrzymać krwawienie, ponieważ może to spowodować obrażenia.
    11. Użyj kleszczyków 1, aby delikatnie usunąć widoczną pajęczynówkę.
  6. Szklane okno implantu
    1. Użyj kleszczyków chirurgicznych 2, aby podnieść sterylne szklane okienko, szkiełkiem nakrywkowym o grubości 3 mm skierowanym w dół. Umieść i wyreguluj szklane okienko nad miejscem kraniotomii, aby upewnić się, że okienko może ściśle przylegać do krawędzi kraniotomii. Szkiełko nakrywkowe o grubości 5 mm znajduje się na górze.
    2. Przygotuj cement dentystyczny w następujący sposób: połącz 100 mg proszku cementowego, dwie krople płynu do szybkiej bazy i jedną kroplę katalizatora. Mieszaj mieszaninę, aż dokładnie się wymiesza (~15 razy). Odczekaj ~6 min, aż cement stanie się pastowaty i gęsty. Jeśli cement jest zbyt rzadki, może przedostać się do przestrzeni pod oknem w kroku 3.6.4 i zasłonić okno.
    3. Czekając, aż cement stanie się pastowaty i gęsty, przyłóż odpowiednią siłę nacisku do okna za pomocą manipulatora stereotaktycznego, aby sprawdzić, czy czaszka może bezpiecznie i szczelnie stykać się ze szklaną szybą. Upewnij się, że płyn cementowy z kroku 3.6.4 nie dotrze do przestrzeni pod szybą, a tym samym nie zasłoni okna.
    4. Użyj regulowanego, precyzyjnego pędzelka z aplikatorem, aby dodać niewielką ilość cementu wzdłuż krawędzi okna, aby uszczelnić szklane okno czaszką. Odczekaj ~10 min, aby cement całkowicie wyschł, a następnie delikatnie zwolnij i wyjmij manipulator nad oknem. Na tym etapie potrzeba ~4 godzin, aby zakończyć 10 uderzeń TBI i wszczepić sztyft i okno czaszki.
    5. Przyciąć cement dentystyczny za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem z węglika spiekanego FG4, jeśli nadmiar cementu pokrywa okno.
      UWAGA: Nadmiar cementu wokół okna może uniemożliwić zbliżenie się soczewek obiektywu dwufotonowego do powierzchni okna.
  7. Implantacja obrazowania well
    UWAGA: Studnia obrazowania (Rysunek 2D) to gumowy pierścień o średnicy zewnętrznej ~1,6 cm, który pasuje do górnej powierzchni słupka i utrzymuje wodę nad oknem czaszki do obrazowania dwufotonowego.
    1. Po zakończeniu implantacji okna należy wywiercić resztki cementu dentystycznego na górnej powierzchni słupka i oczyścić obszar za pomocą mokrej gazy chirurgicznej. Pozostaw obszar do wyschnięcia na ~3 minuty.
    2. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby zanurzyć niewielką ilość kleju superglue i wkleić go na górnej powierzchni słupka. Szybko umieść gumowy pierścień na sztyfcie. Wywieraj średni nacisk na gumowy pierścień przez ~2 minuty, aby zapewnić bliski kontakt z wtyczką. Używaj superglue oszczędnie, w przeciwnym razie może przylgnąć do szklanej szyby i zasłonić obrazowanie dwufotonowe.
  8. Podawanie leków przeciwbólowych i antybiotyków
    1. Bezpośrednio po implantacji dobrze obrazowej, ale przed odstawieniem izofluranu, należy podać cefazolinę [500 mg/kg (333 mg/mL, zwykle ~45 μL), domięśniowo] i meloksykam (5 mg/kg, podskórnie) za pomocą jednorazowych strzykawek insulinowych.
    2. Po podaniu leku przerwij znieczulenie, uwolnij mysz z ramki stereotaktycznej i wróć do domowej klatki, która znajduje się nad kocem grzewczym.
    3. Uważnie monitoruj mysz przez ~15 minut, aż zacznie chodzić.
      UWAGA: Myszy należy trzymać pojedynczo, ponieważ mogą one dobrze ugryźć gumę do obrazowania innych myszy. Umieść żel do jedzenia i wody blisko myszy w klatce, aby uzyskać dostęp ad libitum.
    4. Buprenorfinę (1 mg/kg mc., podskórnie) i meloksykam (5 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać ponownie co 8 godzin po podaniu poprzedniej dawki do 48 godzin po operacji implantacji okna czaszkowego.

4. Wewnątrzżyciowe obrazowanie dwufotonowe

  1. Użyj mikroskopu 2 (Tabela materiałów), wyposażonego w przestrajalny koherentny laser wielofotonowy i obiektyw o 20-krotnym powiększeniu (NA 1.0; zanurzenie w wodzie), do obrazowania przyżyciowego18. Filtr używany dla sygnału EGFP to "BP 500-550".
  2. Przygotuj mysz z oknem czaszkowym do obrazowania przyżyciowego.
    1. Począwszy od dnia operacji (oznaczonego jako dzień 0), należy przeprowadzić obrazowanie dwufotonowe w wyznaczonych punktach czasowych po TBI. Umieść mysz z okienkiem czaszkowym w komorze indukcyjnej znieczulenia i podawaj 3% izofluran zmieszany z gazem nośnym przy natężeniu przepływu 1,5 l/min przez 5 min.
      UWAGA: Gaz nośny może być powietrzem w pomieszczeniu lub 100% tlenem.
    2. Gdy mysz jest w pełni znieczulona (tj. powolne, ale stałe tempo oddychania przy około jednym cyklu na 2 s, w połączeniu z brakiem odruchu szczypania ogona), wyjmij mysz z komory indukcyjnej i szybko zaciśnij sztyft do wspornika. Niech tułów myszy leży na okrągłej plastikowej płytce (o średnicy 19 cm), która jest wyposażona w wspornik.
      UWAGA: Pod tułowiem myszy umieszczono podkładkę do ogrzewania dłoni, aby zapewnić wsparcie cieplne podczas obrazowania przyżyciowego.
    3. Nałóż smarującą maść okulistyczną na oczy myszy i umieść stożek nosowy rurki anestezjologicznej na pysku myszy. Utrzymuj znieczulenie, stosując 1,5% izofluranu z gazem nośnym o natężeniu przepływu 1 l/min.
    4. Okresowo sprawdzaj częstotliwość oddechu i szczyp ogon lub palec u nogi co najmniej co 15 minut podczas obrazowania, aby ocenić odpowiednie znieczulenie. Dostosuj stężenie izofluranu w zależności od potrzeb, aby utrzymać pożądaną głębokość znieczulenia.
    5. Ustaw głowicę myszy tak, aby okienko czaszki znajdowało się bezpośrednio pod soczewką obiektywu dwufotonowego. Dodaj trochę wody do obrazowania dobrze nad oknem czaszki. Opuść obiektyw tak, aby był zanurzony w wodzie.
  3. Obrazowanie przyżyciowe myszy z oknem wewnątrzczaszkowym
    1. Włącz lampę rtęciową lunety. Najpierw obserwuj mózg z epifluorescencją przez oko.
      UWAGA: Układ naczyniowy wydaje się. Wybierz obszar, w którym okno jest czyste. Wyłącz epifluorescencję, ustaw długość fali lasera na 860 nm dla sygnału EGFP i dostosuj ustawienie lasera do optymalnego (tj. jasnego, ale nie nasyconego) sygnału.
    2. Ustaw tryb skanowania na Ramka, a krok linii na 1. Ustaw liczbę uśredniania na 16, głębię bitową na 8 bitów, tryb na Linia, a metodę na Średnia.
    3. Użyj wzorca unaczynienia jako "mapy referencyjnej", aby zobrazować ten sam obszar mózgu do późniejszego obrazowania podłużnego. Wyobraź sobie poziom powierzchowny (warstwa I, mniej niż 100 μm od powierzchni opony mózgowej) dla trzech płaszczyzn, w których dominuje unaczynienie korowe w trybie z-stack, z odstępem międzypłaszczyznowym 10 μm, jak wskazano w Rysunek 3A.
    4. Wyobraź sobie sześć płaszczyzn na głębokim poziomie (warstwa IV i V, ~400 μm głębiej niż poziom powierzchowny), w trybie z-stack, jak pokazano w Rysunek 3A, z interwałem międzypłaszczyznowym 10 μm i prędkością skanowania 8.
    5. Po zakończeniu obrazowania (~20 min na mysz) przerwij znieczulenie, uwolnij mysz z ramek i umieść ją z powrotem w klatce domowej, która znajduje się nad kocem grzewczym. Monitoruj mysz kolejno, aż zacznie chodzić, co zwykle zajmuje ~7 minut.
    6. Wzdłużnie zobrazuj mysz w dniu 0, 1 tygodniu i 4 miesiącach po operacji TBI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako dowód koncepcji tego protokołu, cząsteczki wirusa wyrażające AAV-Syn1-EGFP zostały wstrzyknięte do kory mózgowej samców myszy TDP-43Q331K/Q331K (tło C57BL/6J)19 w wieku 3 miesięcy. Należy zauważyć, że można również wykorzystać zwierzęta C57BL / 6J typu dzikiego, jednak badanie to przeprowadzono na myszach TDP-43Q331K / Q331K, ponieważ laboratorium koncentruje się na badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Operację TBI przeprowadzono 4 tygodnie po wstrzyknięciu AAV....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wstrzyknięcie AAV, podanie TBI i słupek głowy z implantacją okna czaszkowego połączono w celu analizy obrazowania podłużnego neuronów znakowanych EGFP w korze mózgowej myszy (warstwy IV i V) w celu zaobserwowania wpływu TBI na neurony korowe. W badaniu tym zauważono, że wybrane tutaj miejsce TBI, powyżej hipokampa, zapewnia stosunkowo płaską i szeroką powierzchnię do implantacji okna czaszki. I odwrotnie, czaszka jest stosunkowo wąska z przodu w stosunku do tego miejsca, dlatego trudno jest zapewnić, że słu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Miguelowi Sena-Esteves z University of Massachusetts Chan Medical School za podarowanie wirusa AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, oraz Debrze Cameron z University of Massachusetts Chan Medical School za narysowanie szkicu czaszki myszy. Dziękujemy również obecnym i byłym członkom laboratoriów Bosco, Schafer i Henninger za ich sugestie i wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez Departament Obrony (W81XWH202071/PRARP) dla DAB, DS i NH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Regulowane precyzyjne szczotki aplikatoraParkellS379
BDBDNDC / HRI # 08290-3284-385/16 "x 31G
BetadinePurdueNDC67618-151-17w tym 7,5% jodu powidonu
BuprenorfinaPAR FarmaceutycznaNDC 42023-179-05
CefazolinHIKMA FarmaceutycznyNDC 0143-9924-90
Ceramiczne naczynie do mieszaniaParkellSKU: S387Do przygotowania cementu dentystycznego
Aplikatory z bawełnianą końcówkąZOROcatlog #: G9531702
KatalizatorParkellS371pełna nazwa: "C" Uniwersalny katalizator TBB
Cement dentystyczny w proszkuParkellS396Radionieprzepuszczalny L-proszek do C& B
Wiertło dentystyczneForedomH.MH-130
Kontroler wierteł dentystycznychForedomHP4-310
DeksametazonPhoenixNDC 57319-519-05
Frez z węglika spiekanego EF4Microcopy Lot # C150113Średnica głowicy / Lth / mm 1,0 / 4,2
EthonalFisher Scientific04355223EA75%
FG1/4 Wiertło z węglika spiekanegoMicrocopyLot # C150413Średnica głowicy / Lgth / mm 0,5 / 0,4
Frez z węglika spiekanego FG4MicrocopyLot # C150309Średnica głowicy / Lgth / mm 1,4 / 1,1
Słupek głównyNIEDOTYCZY NIE DOTYCZY
Aparatura grzewczaCWETC-1000 Myszwyposażona w instrument stereotaktyczny i używana podczas operacji
Koc grzewczyApteka CVSE12107dodatkowe urządzenie grzewcze i może być używane po operacji
IsofluranePivetalNDC 46066-755-03
Komora indukcyjna izofluranuVetequip89012-688komora indukcyjna do krótkiej
maszyny do ulatniania izofluranuVetequip911103
Uchwyt maszyny do latania izofluranuVetequip901801
Mikroskop chirurgiczny LeicaLeica10450243
Lubrykant maść okulistycznaPicetalNDC 46066-753-55
MarkerDelascoSMP-BK
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10
Pompa mikroiniekcyjna i jej sterownikWorld Precision Instrumentsmicro4 i UMP3
Strzykawka mikrolitrowaHamiltonHamilton 800141701 RN, 10 μ Miernik L do strzykawki i miernik 32 do igły, 2 cale, styl punktowy 3
Kleszcze do komarówCAROLINAPozycja #:625314Stal nierdzewna, zakrzywiona, 5 cali
Środek do depilacjiMcKesson CorporationN/ANair Hair Aloe & Balsam do depilacji lanoliną
Mikroskop 1NikonSMZ745Mikroskop Nikon do przygotowania okien czaszkowych
Mikroskop 2Mikroskop dwufotonowyZeissLSM 7 MP
Laser wielofotonowyKoherentnykameleon Ultra II, Model: MRU X1, laser VERDI 18Wdo mikroskopii dwufotonowej
Niewchłanialny szew chirurgicznyAparat Harvardacatlog# 59-68606-0, z okrągłą igłą
Klej optyczny Norland 81Norland ProductsNOA 81
No-Snag Uchwyt na igłęCAROLINAPozycja #: 567912
Szybka baza płynuParkellS398"B" Szybka baza do C & B Metabond
Nożyczki zwykłe 1Eurostateurostat es5-300
Nożyczki zwykłe 2World Precision Instrumentsnr 501759-G
Okrągłe szkło osłonowe 1Instrumenty WarnerCS-5R Cat# 64-0700do średnicy 5 mm
Okrągłe szkło osłonowe 2instrumenty WarnerCS-3R Cat# 64-0720o średnicy 3 mm
Pierścienie gumoweOrings-OnlinePozycja # OO-014-70-50O-ringi
SalineBioworldL19102411PR
Nożyczki sprężynowe 1World Precision InstrumentsNr 91500-09końcówka prosta
Nożyczki sprężynowe 2World Precision Instrumentsnr 91501-09końcówka zakrzywiona
Platforma stereotaktycznaKOPFModel 900LS
Super klejHenkelPozycja #: Światowa
Instrumenty precyzyjnenr 501200
Kleszcze chirurgiczne 1MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKICatlog # 0508-5 / 45-POstyl 5/45, zakrzywiony
Kleszcze chirurgiczne 2NAUKI O MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJcatlog # 0103-5-POstyl 5, prosty
Kleszcze chirurgiczne 3NAUKIO MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJcatlog# 72912
Kleszcze chirurgiczne 4NAUKI MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJCatlog# 0508-5/45-POstyl 5/45, zakrzywiony
Gaza chirurgicznaZOROcatlog #: G0593801
Lampa chirurgicznaLeicaLeica KL300 LED
UV boxSpectrolinkerXL-1000zwany również sieciownikiem UV
VaporguardVetequip931401
Klej tkankowy Vetbond3M Animal CareNumer części:014006
Strzykawka insulinowa Metabond na zamówienie suwmiarka chirurgiczna 1647358

Bibliografia

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646(2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060(2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601(2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia dwufotonowaekspresja EGFPwirus adeno zale nypromotor neuronalnypod u ne obrazowanie m zguchirurgia m zgu myszy

Powiązane artykuły