Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64703

⸱

27 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1ACA CELL Biotech GmbH, 2Departamento Ciencias Biomédicas, Universidad Cardenal Herrera-CEU

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Streszczenie

Ludzkie komórki wątroby mogą tworzyć trójwymiarową (3D) strukturę zdolną do wzrostu w kulturze przez kilka tygodni, zachowując swoją funkcjonalną zdolność. Ze względu na ich naturę grupowania się w szalkach hodowlanych o niskiej lub zerowej przyczepności, tworzą agregaty wielu komórek wątroby, które nazywane są sferoidami ludzkiej wątroby. Tworzenie sferoid wątroby 3D opiera się na naturalnej tendencji komórek wątroby do agregacji przy braku podłoża adhezyjnego. Te struktury 3D mają lepsze reakcje fizjologiczne niż komórki, które są bliższe środowisku in vivo. Korzystanie z hodowli hepatocytów 3D ma wiele zalet w porównaniu z klasycznymi hodowlami dwuwymiarowymi (2D), w tym bardziej istotne biologicznie mikrośrodowisko, morfologię architektoniczną, która ponownie składa naturalne narządy, a także lepsze przewidywanie stanu chorobowego i reakcji in vivo na leki. Do generowania sferoid można wykorzystać różne źródła, takie jak pierwotna tkanka wątroby lub unieśmiertelnione linie komórkowe. Tkanka wątroby 3D może być również modyfikowana przy użyciu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do pozyskiwania hepatocytów. Uzyskaliśmy sferoidy ludzkiej wątroby przy użyciu pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzenia krwi (BD-PSC) generowanych z niemanipulowanej krwi obwodowej przez aktywację ludzkiego białka połączonego z błoną GPI i różnicowanych do ludzkich hepatocytów. Ludzkie komórki wątroby i sferoidy ludzkiej wątroby pochodzące z BD-PSC analizowano za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofenotypowania przy użyciu ludzkich markerów hepatocytów.

Wprowadzenie

W ostatnich latach trójwymiarowe (3D) systemy hodowli sferoidów stały się ważnym narzędziem do badania różnych obszarów badań nad rakiem, odkrywania leków i toksykologii. Takie hodowle cieszą się dużym zainteresowaniem, ponieważ wypełniają lukę między dwuwymiarowymi (2D) monowarstwami hodowli komórkowych a złożonymi narządami1.

W przypadku braku powierzchni adhezyjnej, w porównaniu do hodowli komórkowej 2D, tworzenie sferoid opiera się na naturalnym powinowactwie tych komórek do grupowania w formie 3D. Komórki te organizują się w grupy składające się z jednego lub więcej typów dojrzałych komórek. Wolne od ciał obcych komórki oddziałują ze sobą tak, jak w swoim pierwotnym mikrośrodowisku. Komórki w hodowli 3D są znacznie bliżej siebie i mają odpowiednią orientację względem siebie, z wyższą produkcją macierzy zewnątrzkomórkowej niż hodowle 2D i stanowią środowisko bliskie naturalnemu 2.

Modele zwierzęce są używane od dawna do badania ludzkiej biologii i chorób3. Pod tym względem istnieją wewnętrzne różnice między ludźmi a zwierzętami, co sprawia, że modele te nie do końca nadają się do badań ekstrapolacyjnych. Sferoidy i organoidy z hodowli 3D stanowią obiecujące narzędzie do badania tkankowej architektury, interakcji i przesłuchów między różnymi typami komórek, które występują in vivo i mogą przyczynić się do zmniejszenia lub nawet zastąpienia modeli zwierzęcych. Są one szczególnie interesujące dla badań nad patogenezą chorób wątroby, a także platform badań przesiewowych leków4.

3D hodowla sferoidalna ma szczególne znaczenie dla badań nad rakiem, ponieważ może wyeliminować nieciągłość między komórkami a ich środowiskiem, zmniejszając potrzebę trypsynizacji lub leczenia kolagenazą potrzebną do przygotowania monowarstw komórek nowotworowych do hodowli 2D. Sferoidy nowotworowe umożliwiają badanie, w jaki sposób normalne i złośliwe komórki odbierają i reagują na sygnały z otoczenia5 i są ważną częścią badań nad biologią nowotworów.

W porównaniu do monowarstwy, kultury 3D składające się z różnych typów komórek przypominają tkanki nowotworowe pod względem właściwości strukturalnych i funkcjonalnych, dlatego nadają się do badania przerzutów i inwazji komórek nowotworowych. Właśnie dlatego takie modele sferoidalne przyczyniają się do przyspieszenia badań nad rakiem6.

Sferoidy również pomagają rozwijać technologię tworzenia ludzkich organoidów, ponieważ biologia tkanek i organów jest bardzo trudna do zbadania, szczególnie u ludzi. Postęp w hodowli komórek macierzystych umożliwia rozwój kultur 3D, takich jak organoidy składające się z komórek macierzystych i komórek progenitorowych tkanek, a także różnych typów dojrzałych komórek (tkankowych) z narządu o pewnych cechach funkcjonalnych, takich jak prawdziwy narząd, który można wykorzystać do modelowania rozwoju narządów, chorób, ale można je również uznać za przydatne w medycynie regeneracyjnej7.

Podstawowe ludzkie hepatocyty są zwykle używane do badania in vitro biologii ludzkich hepatocytów, funkcji wątroby i toksyczności wywołanej przez leki. Hodowle ludzkich hepatocytów mają dwie główne wady, po pierwsze, ograniczoną dostępność tkanek pierwotnych, takich jak ludzkie hepatocyty, a po drugie, tendencję hepatocytów do szybkiego deróżnicowania w hodowli 2D, tracąc w ten sposób swoją specyficzną funkcję hepatocytów8. Hodowle wątroby 3D są lepsze pod tym względem i zostały ostatnio wykonane ze zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)9. Bioinżynieryjne sferoidy wątrobowe 3D są szczególnie interesujące dla badań nad rozwojem, toksycznością, genetycznymi i zakaźnymi chorobami wątroby, a także w odkrywaniu leków do leczenia chorób wątroby10. Wreszcie, mają one również potencjał do wykorzystania klinicznego, wiedząc, że ostra choroba wątroby ma śmiertelność prawie 80%, biosztuczne sferoidy wątroby i/lub wątroby mogą potencjalnie uratować tych pacjentów, zapewniając częściową czynność wątroby do czasu znalezienia odpowiedniego dawcy11.

Ustaliliśmy protokół generowania ludzkich sferoidów wątrobowych przy użyciu pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi (BD-PSC) do przygotowania różnej wielkości sferoid zawierających 4000 do 1 x 106 komórek i przeanalizowaliśmy je za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofluorescencji. Przetestowaliśmy również zdolność funkcji specyficznej dla hepatocytów, oceniając ekspresję enzymów cytochromu P450 3A4 (CYP3A4) i 2E1 (CYP2E1) należących do rodziny cytochromów P450, które odgrywają ważną rolę w metabolizmie komórkowym i lekowym w procesie detoksykacji12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano zgodę etyczną (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) na przeprowadzenie tych eksperymentów, a wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę przed pobraniem krwi, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie komórek jednojądrzastych (MNC) z ludzkiej krwi obwodowej (PB)

  1. Pobrać 30 ml krwi od zdrowych dawców z pomocą przeszkolonego personelu medycznego zgodnie ze standardowym protokołem.
  2. Wyizoluj PBMNC za pomocą pożywki o gradiencie gęstości zgodnie z protokołem opublikowanym przez Becker-Kojić et al.13. Wyizolować, pipetując, warstwę interfazową między osoczem a pożywką o gradiencie gęstości i użyć sterylnego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) do przemycia wyizolowanych komórek.
  3. Użyj komory liczącej i policz liczbę komórek przy użyciu standardowych metod.

2. Dedyferencjacja MNC po aktywacji za pomocą ludzkiej glikoproteiny zakotwiczonej w GPI

  1. Umieścić 6 x 106 komórek jednojądrzastych w PBS/1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w probówce polistyrenowej (15 ml) i inkubować ze specyficznym przeciwciałem przez 30 minut w temperaturze 37 °C zgodnie z Becker-Kojić i wsp.13.
  2. Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej i zastąpić PBS/BSA zmodyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  3. Hoduj komórki w probówkach polistyrenowych o pojemności 15 ml w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 8-10 dni, jak opisano w Becker-Kojić et al.13. W dniu 5 (D5) dodaj 1-2 ml pożywki Iscove uzupełnionej o 10% FBS do każdej probówki o pojemności 15 ml.

3. Sortowanie nowo wygenerowanych komórek odróżnicowanych

  1. Odwirować zawiesinę komórek hodowlanych w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 300 x g i odessać sterylną pipetą otrzymany supernatant zgodnie z Becker-Kojić et al.13.
  2. Zawiesić osad otrzymany przez odwirowanie w 90 μl zimnego buforu PBS (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA i 2 mM EDTA) i dodać 10 μl dodatnich kulek magnetycznych o rozmiarach nano CD45 i inkubować na lodzie przez 15 minut.
  3. Przemyć zawiesinę komórek 2 ml buforu PBS, odwirować ją przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodać 500 μl buforu PBS do komórek i dokładnie zawiesić.
  4. Odpipetować 500 μl wstępnie schłodzonego buforu PBS do kolumny, aby przepłukać i umieścić go w polu magnetycznym za pomocą podstawki magnetycznej.
  5. Przemyć komórki umieszczone na kolumnie dwukrotnie 500 μl buforu PBS i zebrać przepływowe komórki zawierające ujemne CD45 w pożywce Iscove'a uzupełnionej 10% FBS.
  6. Użyj komory zliczającej, aby określić liczbę przeprogramowanych komórek.

4. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do produkcji ludzkich hepatocytów

  1. Oddziel szkiełka nakrywkowe (14 mm) i inkubuj je w niejonowym detergencie przez 10 minut. Umyj szkiełka nakrywkowe w wodzie dejonizowanej, aż nie pozostaną pęcherzyki i inkubuj je w 1M HCl przez 30 minut (na podstawie Marchenko et al.14).
  2. Szkiełka nakrywkowe należy umyć wodą dejonizowaną co najmniej 3x i wysuszyć przez noc w temperaturze pokojowej. Wysuszone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w autoklawie w odpowiednim pojemniku.

5. Powlekanie płytek hodowli komórkowych biolamininą w celu 2D wątrobowego różnicowania BD-PSC

  1. Umieść autoklawizowane szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej pęsety w 4-dołkowych płytkach i włącz lampy UV na 30 minut, aby zapewnić sterylne warunki.
  2. Rozmrozić porcje biolamininy i dodać 120 μl 5 μg/ml biolamininy do każdego szklanego szkiełka nakrywkowego. Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć nadmiar biolamininy i dodać 200 μl pożywki do różnicowania hepatocytów, jak opisano poniżej.

6. Przygotowanie pożywki do różnicowania hepatocytów

  1. Przygotuj 500 ml pożywki zastępczej surowicy nokautującej hepatoblasty (KSR)/dimetylosulfotlenku (DMSO) składającej się z 76,4% nokautującego DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 0,1% β-merkaptoetanolu, 1% DMSO i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep).
  2. Przygotuj 500 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 1% L-glutaminy, 10 μM soli sodowej 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu (HCC) i 1% pióra/paciorkowca.
  3. Podwielokrotną pożywkę z podstawowego roztworu i dodać świeży czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) i onkostatynę M (OSM) w końcowych stężeniach 10 ng/ml i/lub 20 ng/ml dla każdej zmiany pożywki.
    UWAGA: Onkostatyna M jest cytokiną należącą do grupy cytokin interleukiny 6, ważną dla hematopoezy, a także dla rozwoju wątroby.

7. Hodowla komórek wątroby różnicowanych od BD-PSC

  1. Umieść 3 x 105 komórek BD-PSCS w każdym dołku 4-dołkowej płytki pokrytej biolamininą.
  2. Umieścić 4-dołkowe płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hodować komórki przez 5 dni w pożywce KSR/DMSO, która wspomaga różnicowanie endodermalne i zmieniać pożywkę co drugi dzień.
  3. Przejść na pożywkę do dojrzewania hepatocytów w 5 dniu i hodować komórki przez dodatkowe 7-10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 48 godzin.

8. 3D sferoidalne różnicowanie wątroby

  1. Policz komórki za pomocą komory liczącej.
  2. Odwirować zawiesinę komórek zderóżnicowaną BD w sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki odróżnicowane BD w pożywce KSR/DMSO w ilości 2 x 106 komórek/ml.
  3. Przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 μm, aby zapewnić zawiesinę pojedynczych komórek i usunąć wszelkie dodatkowe zanieczyszczenia.
  4. Policz komórki za pomocą komory liczącej i przygotuj wystarczającą objętość dla każdej gęstości wysiewu komórek, aby dozować wymaganą objętość na studzienkę. Przygotuj gradient z górnym wysiewem 1 x 106 komórek do niskiej gęstości wysiewu 4000 komórek.
  5. Dozować 100 μl pożywki KSR/DMSO do 96 płytek mocujących o bardzo niskim poziomie i dodać 100 μl rozcieńczonego wysiewu komórek.
  6. Umieścić niską płytkę mocującą w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i hodować je przez 5 dni.
  7. Zmień 50% podłoża od 3 do 4 dni po wysianiu, gdy sferoidy są wystarczająco zwarte.
  8. W 5 dniu zmień pożywkę na pożywkę do dojrzewania hepatocytów i hoduj komórki przez dodatkowe 7-10 dni w celu dalszego dojrzewania. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.

9. Analiza immunofluorescencyjna nowo wygenerowanych kultur komórek wątroby 2D

  1. Hodować komórki zgodnie z opisaną powyżej metodą różnicowania przez 4, 8, 15 i 24 dni i usunąć pożywkę.
  2. Inkubować komórki z podgrzanym utrwalaczem składającym się z 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 min. Wyrzuć utrwalacz i myj komórki 2x PBS przez 5 min każda. Natychmiast dodaj 0,1% roztwór trytonu X-100 i przepuszczaj komórki przez 5 minut. Umyj 2x PBS.
  3. Dodać roztwór blokujący z PBS i 5% BSA i umieścić na płycie kołyskowej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze rozcieńczonym 1% BSA/PBS w następujący sposób: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteina (AFP) 1:250, cytokeratyna 18 (CK18) 1:50, czynnik jądrowy hepatocytów 4 alfa (HNF4α) 1:1000 i transtyretyna (TTR) 1:50. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę.
  5. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć roztwór przeciwciała, myj komórki przez 5 minut i powtórz etap płukania 3 razy.
  6. Przygotować następujące przeciwciała drugorzędowe w buforze rozcieńczającym: królicze przeciwciała anty-kurze IgG (czerwień teksana) 1:1000, kozie anty-mysie IgG (488) 1:1000 i kozie anty-królicze (488) 1:500. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć komórki 3x PBS przez 5 minut każde i zamontować szkiełka nakrywkowe z mediami montażowymi zawierającymi DAPI do analizy mikroskopowej.

10. Żywe barwienie nowo powstałych sferoidów wątroby

  1. Ostrożnie wyrzuć pożywkę hodowlaną, nie dotykając sferoid, dodaj świeżo przygotowany PBS z 0,1% roztworem trytonu X-100 i inkubuj przez 5 minut, aby przepuszczalność komórek.
  2. Przemyć sferoidy pożywką powoli pipetując przez 5 minut, powtórzyć 2x.
  3. Inkubować sferoidy z pierwszorzędowymi przeciwciałami ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) i CYP3A4 (1:200) przygotowanymi w PBS z 1% BSA przez 1 godzinę w 5% inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę.
  4. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu przeciwciał i przemyj sferoidy pożywką 3x.
  5. Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe kozie anty-mysie IgG (Cy3), kozie anty-mysie IgG (488) i królicze przeciwciała anty-kurze IgG (czerwień teksana) w rozcieńczeniu 1:1000 i 1:500 dla koziego anty-królika (488) w PBS w 1% BSA. Użyć 50 μl rozcieńczenia przeciwciał na studzienkę i inkubować przez 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Ostrożnie przemyć 3x pożywką i pozostawić płytkę na 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed wykonaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

11. Badanie sferoid za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

  1. Włącz fluorescencyjne źródło światła 10 minut przed użyciem, włącz komputer i otwórz oprogramowanie do obrazowania.
  2. Użyj obiektywu z 4-krotnym powiększeniem, kliknij przycisk 4x na pasku narzędzi, aby wybrać odpowiednią podziałkę, a następnie umieść 96-dołkową płytkę na środkowej płycie sceny.
  3. Włącz źródło światła LED, użyj filtra jasnego pola i umieść płytkę w interesującej Cię studni za pomocą osi x-y stage pokrętło regulacji ostrości.
  4. Zmień na ścieżkę światła kamery, kliknij przycisk Na żywo w oprogramowaniu do obrazowania, aby zobrazować obraz na ekranie, i upewnij się, że sferoida jest wyśrodkowana za pomocą pokręteł osi x-y i ustaw ostrość za pomocą pokrętła zgrubnego/precyzyjnego ustawiania ostrości.
    UWAGA: Kształt sferoid pozostaje niezmienny po zastosowaniu barwienia na żywo.
  5. Wybierz metodę obserwacji w jasnym polu na pasku narzędzi, ustaw ekspozycję na automatyczną i kliknij przycisk Migawka na panelu sterowania aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie zapisz obraz jako plik .vsi używając odpowiedniej nazwy w interesującym Cię folderze.
  6. Umieść płytkę ekranującą światło otoczenia, aby wyłączyć światło LED, zmień na filtr wzbudzenia B, wybierz metodę obserwacji 488 na pasku narzędzi, otwórz migawkę, zrób zdjęcie, klikając przycisk Migawka, zamknij migawkę, a następnie zapisz file zgodnie z powyższym opisem.
  7. Powtórz to z filtrem do wzbudzenia G, stosując odpowiednią metodę obserwacji (czerwień teksańska lub CY3). Następnie powtórz całą procedurę dla każdego interesującego Cię dołka.
  8. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C i hodować ją w sposób opisany powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z sukcesem zróżnicowaliśmy ludzkie BD-PSC w komórki endodermy/progenitory wątroby oraz hepatocyty, stosując dwuetapowy protokół. Zmiany morfologiczne podczas procesu różnicowania wątrobowego przedstawiono na Rycynie 1. BD-PSC różnicują się w hepatocyty, przechodząc przez trzy różne stadia. Pierwszym etapem jest różnicowanie w komórki endodermalne L4, drugim różnicowanie w komórki progenitorowe wątroby (hepatoblasty) L8 wykazujące typową morfologię poligonalną, a trzecim dojrzewanie do hepato...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wątroba jest głównym organem w ludzkim ciele o wielu podstawowych funkcjach biologicznych, takich jak detoksykacja metabolitów. Z powodu ciężkiej niewydolności wątroby, takiej jak marskość wątroby i/lub wirusowe zapalenie wątroby, na całym świecie umiera prawie 2 miliony osób. Przeszczepy wątroby zajmują drugie miejsce wśród przeszczepów narządów litych na świecie, ale tylko około 10% obecnego zapotrzebowania jest zaspokajane22.

Pierwotne ludzkie hepatocyty (PHH) są czę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor korespondencyjny oświadcza, że jest posiadaczem patentu związanego z nowym ludzkim białkiem sprzężonym z GPI. Jest współzałożycielką i współpracowniczką ACA CELL Biotech GmbH. Pozostali autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy są szczególnie wdzięczni za pomoc techniczną udzieloną przez Oksanę i Johna Greenacre. Prace te były wspierane przez ACA CELL Biotech GmbH z Heidelbergu w Niemczech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało albuminoweSigma-AldrichSAB3500217wytwarzane w kurczaku
Albumina Frakcja VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Alpha-1 FetoproteinProteintech Germany GmbH14550-1-APkrólik poliklonalny IgG
Biolamina 111 LNBioLamina LN111-02ludzkie rekombinowane
mikrokulki CD45Miltenyi130-045-801nano-rozmiarowe kulki magnetyczne
Sitko do komórekpluriSelect43-10040-40
CellSens Oprogramowanie do obrazowaniaOlympus
Probówki wirówkowe 50 ml Greiner Bio-One210270
CEROplate 96 wellOLS OMNI Life Science2800-109-96
CKX53 Olympus
Dostępny w handlu detergentProcter & Gambleniejonowy detergent
Przeciwciało specyficzne dla CYP2E1Proteintech Germany GmbH19937-1-APkrólicze przeciwciało poliklonalne IgG
CYP3A4 Proteintech Germany GmbH67110-1-lgmysie przeciwciało monoklonalne IgG1
Cytokeratin 18DakoCytomationM7010mysie przeciwciało monoklonalne IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030BWycofane z produkcji. Dostępne pod: TMS-013-B
Szkiełka nakrywkowe szklane 14 mmR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-glutamina
Aldehyd glutarowy 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
Kozie przeciwciała anty-mysie IgG Cy3onlineABIN1673767poliklonalne
Kozie przeciwciała anty-mysie IgG DyLight 488Przeciwciała onlineABIN1889284poliklonalny
kozioł anty-królik IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021pożywka do dojrzewania hepatocytów
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324ludzkie rekombinowane
przeciwciało HNF4 i alfaSigma-AldrichZRB1457-25ULklon 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian (sól sodowa)BiomolCay18226-100
Zamiennik surowicy nokautującej - Multi Species GibcoFisher ScientificA3181501KSR
KnockOut DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012wycofany z produkcji. Dostępne pod numerem katalogowym 10-828-010
Bufor MACSMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303stojak magnetyczny
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
MerkaptoetanolThermo Fisher Scientific3135001050mM
kolumny MiniMACSMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishSigma-AldrichD6789Płytki 4-dołkowe
Oncostatin MThermo Fisher ScientificPHC5015ludzki rekombinowany
paraformaldehydSigma-Aldrich158127
PBS sterylneCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
Penicylina/StreptomycynaBiochrom GmbHA221310000 U/ml
PS 15ml probówki sterylneGreiner Bio-One188171
Królik anty-kurczak IgG Texas redPrzeciwciała onlineABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH+Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH+Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 człowiekCarl Roth GmbH+Co. KG0642.2
Przeciwciało transtyretynowe Sigma-AldrichSAB3500378produkowany z kurczaka
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

Bibliografia

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964(2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla hepatocytówpluripotencjalne komórki macierzyste pochodzenia krwiróżnicowanie wątrobowemedium do dojrzewania hepatocytówanaliza immunofluorescencyjnagenerowanie organoidówmarkery hepatocytówpłytki o niskim stopniu przylegania
Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.