Method Article

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

DOI:

10.3791/64733

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splot naczyniówkowy (CP), wysoce unaczyniona struktura wystająca do komór mózgu, jest jedną z najbardziej niedostatecznie zbadanych tkanek w neurobiologii. Ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że ta niewielka struktura odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), niezwykle ważne jest, aby prawidłowo wypreparować CP z komór mózgowych w sposób, który umożliwia dalsze przetwarzanie, od analizy funkcjonalnej po strukturalną. W tym miejscu opisano izolację bocznej i czwartej komory mózgu myszy CP bez konieczności stosowania specjalistycznych narzędzi lub sprzętu. Ta technika izolacji zachowuje żywotność, funkcję i strukturę komórek w CP. Ze względu na wysokie unaczynienie, CP można uwidocznić unosząc się w jamach komorowych mózgu za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Jednak perfuzja przezsercowa wymagana do dalszej analizy może skomplikować identyfikację tkanki CP. W zależności od dalszych etapów przetwarzania (np. analiza RNA i białek) można to rozwiązać, wizualizując CP za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym. Po izolacji, CP może być przetwarzany przy użyciu kilku technik, w tym RNA, białka lub analizy pojedynczej komórki, aby uzyskać dalsze zrozumienie funkcji tej specjalnej struktury mózgu. W tym przypadku skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) na całym montażu CP jest używana do uzyskania ogólnego widoku struktury.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczelne bariery oddzielają centralny układ nerwowy (OUN) od peryferii, w tym barierę krew-mózg (BBB) i barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Bariery te chronią OUN przed zewnętrznymi uszkodzeniami i zapewniają zrównoważone i kontrolowane mikrośrodowisko1,2,3. Podczas gdy bariera krew-mózg była szeroko badana w czasie, bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy zlokalizowana w splocie naczyniówkowym (CP) zyskała coraz większe zainteresowanie badawcze dopiero w ciągu ostatniej dekady. Ta ostatnia bariera znajduje się w czterech komorach mózgu (Rysunek 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z prawem krajowym (belgijskie prawo 14/08/1986 i 22/12/2003, belgijski dekret królewski 06/04/2010) i europejskim (dyrektywy UE 2010/63/UE, 86/609/EWG). Wszystkie eksperymenty na myszach i zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Gandawie (zezwolenia o numerach LA1400091 i WE 2017-026).

1. Przygotowanie

  1. Środki znieczulające: Przygotuj znieczulenie końcowe. Na przykład można przygotować roztwór pentobarbitalu sodu (≥100 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół ułatwia skuteczną izolację CP od bocznych (Rysunek 2A-C) i czwartych (Figure 2D-F) komór mózgowych. Po wyizolowaniu całego mózgu, kleszcze są używane do strzałkowej półsekcji mózgu i identyfikacji CP unoszących się w bocznych komorach. CP z czwartej komory można wyizolować od móżdżkowej strony mózgu. Perfuzja z błękitem bromofenolowym może być wykorzystana do wizualizacji CP (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano metodę izolowania splotu naczyniówkowego (CP) z komory bocznej i czwartej komory mózgu myszy. Cała ta metoda montażu CP ułatwia dalszą analizę przy użyciu repertuaru technik, aby uzyskać pełny obraz morfologii CP, składu komórkowego, transkryptomu, proteomu i sekretomu. Takie analizy są kluczowe, aby lepiej zrozumieć tę niezwykłą strukturę wystającą z komór mózgu. Wiedza ta ma ogromne znaczenie badawcze, ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że CP odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Belgijską Fundację Badań nad Chorobą Alzheimera (SAO; numer projektu: 20200032), Fundację Badawczą Flandrii (FWO Vlaanderen; numery projektów: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) oraz Baillet Latour Fund. Dziękujemy VIB BioImaging Core za szkolenie, wsparcie i dostęp do parku instrumentów.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Igła 26G x 1/2Henke Sass Wolf4710004512
Aluminiowe mocowania próbekEM Sciences75220
Bufor kakodylowyEM Sciences11652
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowejSwann-Morton0210rozmiar: 0,45 mm x 12 mm
Zakładki z kleju węglowego -12 mmEM Sciences77825-12
Suszarka punktu krytycznego Bal-Tec CPD030
Belka poprzeczna 540System SEM Zeiss
KleszczeFine Science Tools GmbH 91197-00
Aldehyd glutarowyEM Sciences16220
HeparynaSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Cyfrowa pompa perystaltyczna 2-kanałowaMetrohm Belgia NVCPA-7800160
Tetratlenek osmu EM Sciences19170
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)LonzaBE17-516F
Platyna Kworum Q150T ESPBS bez Ca++ Mg++ i czerwieni fenolowej; sterylnie filtrowany
Pentobarbital soduKela NV514
Kosz na próbki Stal nierdzewnaEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Mikroskop stereoskopowyZeiss
Fine Science Tools GmbH Numer katalogowy: 91460-11
Nożyczki chirurgiczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Choroid PlexusMicrodissection TechniqueMouse Brain VentriclesScanning Electron MicroscopyWhole Mount SEMTranscardial PerfusionBromophenol Blue StainingChoroid Plexus IsolationMorphological AnalysisEpithelial Cells

Related Articles