Method Article

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

DOI:

10.3791/64733

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splot naczyniówkowy (CP), wysoce unaczyniona struktura wystająca do komór mózgu, jest jedną z najbardziej niedostatecznie zbadanych tkanek w neurobiologii. Ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że ta niewielka struktura odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), niezwykle ważne jest, aby prawidłowo wypreparować CP z komór mózgowych w sposób, który umożliwia dalsze przetwarzanie, od analizy funkcjonalnej po strukturalną. W tym miejscu opisano izolację bocznej i czwartej komory mózgu myszy CP bez konieczności stosowania specjalistycznych narzędzi lub sprzętu. Ta technika izolacji zachowuje żywotność, funkcję i strukturę komórek w CP. Ze względu na wysokie unaczynienie, CP można uwidocznić unosząc się w jamach komorowych mózgu za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Jednak perfuzja przezsercowa wymagana do dalszej analizy może skomplikować identyfikację tkanki CP. W zależności od dalszych etapów przetwarzania (np. analiza RNA i białek) można to rozwiązać, wizualizując CP za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym. Po izolacji, CP może być przetwarzany przy użyciu kilku technik, w tym RNA, białka lub analizy pojedynczej komórki, aby uzyskać dalsze zrozumienie funkcji tej specjalnej struktury mózgu. W tym przypadku skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) na całym montażu CP jest używana do uzyskania ogólnego widoku struktury.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczelne bariery oddzielają centralny układ nerwowy (OUN) od peryferii, w tym barierę krew-mózg (BBB) i barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Bariery te chronią OUN przed zewnętrznymi uszkodzeniami i zapewniają zrównoważone i kontrolowane mikrośrodowisko1,2,3. Podczas gdy bariera krew-mózg była szeroko badana w czasie, bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy zlokalizowana w splocie naczyniówkowym (CP) zyskała coraz większe zainteresowanie badawcze dopiero w ciągu ostatniej dekady. Ta ostatnia bariera znajduje się w czterech komorach mózgu (Rysunek 1A, B) i charakteryzuje się pojedynczą warstwą komórek nabłonka splotu naczyniówkowego (CPE) otaczających centralny zrąb, nieszczelne naczynia włosowate, fibroblasty oraz populację komórek limfoidalnych i szpikowych (Rysunek 1C)4,5,6. Komórki CPE są mocno połączone ścisłymi połączeniami, zapobiegając w ten sposób wyciekowi z leżących pod spodem naczyń włosowatych krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego i mózgu. Dodatkowo, transport przez komórki CPE jest regulowany przez szereg wewnętrznych i zewnętrznych systemów transportowych, które zarządzają napływem korzystnych związków (np. składników odżywczych i hormonów) z krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego oraz wypływem szkodliwych cząsteczek (np. odpadów metabolicznych, nadmiaru neuroprzekaźników) w przeciwnym kierunku1,6. Aby móc pełnić swoją aktywną funkcję transportową, komórki CPE zawierają liczne mitochondria w swojej cytoplazmie7. Co więcej, CP jest głównym źródłem płynu mózgowo-rdzeniowego i działa jako strażnik mózgu poprzez obecność rezydentnych komórek zapalnych1. Ze względu na swoje unikalne położenie między krwią a mózgiem, CP jest również doskonale przygotowany do prowadzenia nadzoru immunologicznego8.

Schemat anatomii splotu i komór naczyniówki; przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego i struktura komórkowa.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd lokalizacji i składu splotu naczyniówkowego (CP). (A,B) Tkanka CP znajduje się w dwóch bocznych, trzeciej i czwartej komorze (A) ludzkiego i (B) mysiego mózgu. (C) Tkanka CP składa się z pojedynczej warstwy ściśle połączonych prostopadłościennych komórek nabłonka CP (CPE) otaczających fenestrowane naczynia włosowate, luźną tkankę łączną oraz komórki limfoidalne i szpikowe, i tworzy barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (zaadaptowaną i zmodyfikowaną z reference23). Figura utworzona za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W ciągu ostatniej dekady, coraz więcej dowodów, w tym kilka raportów naszej grupy badawczej, ujawniło, że CP odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Wiadomo na przykład, że starzejąca się bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy wykazuje zmiany morfologiczne m.in. w jądrach, mikrokosmkach i błonie podstawnej1,19. Dodatkowo, w kontekście choroby Alzheimera, ogólna integralność bariery jest zagrożona, a wszystkie te zmiany związane z wiekiem wydają się być jeszcze bardziej wyraźne1,8,20. Oprócz zmian morfologicznych, transkryptom, proteom i sekretom CP są zmieniane podczas choroby12,21,22,23. W związku z tym zaawansowana wiedza na temat CP jest niezbędna, aby lepiej zrozumieć jej rolę w chorobach neurologicznych i potencjalnie opracować nowe strategie terapeutyczne.

Skuteczna metoda dokładnej mikrodysekcji CP z komór mózgowych jest pierwszym nieocenionym krokiem umożliwiającym prawidłowe zbadanie tej maleńkiej struktury mózgu. Ze względu na jego wysoce unaczynioną naturę (Ryc. 2B), CP unoszący się w jamach komorowych mózgu można zidentyfikować za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Jednak perfuzja przezsercowa jest często wymagana do dalszej analizy, co komplikuje prawidłową identyfikację i izolację tkanki CP (Figura 2C). Jeśli pozwalają na to dalsze etapy przetwarzania (np. w przypadku analizy RNA i białek), CP można uwidocznić za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym (Figura 2A). Kilka publikacji opisuje już izolację CP od rat24 i mouse pup brains25. Tutaj opisano technikę izolacji mikrodysekcji w celu odizolowania CP od dorosłych myszy. Co ważne, ta technika izolacji zachowuje żywotność, funkcję i strukturę komórek w CP. Izolacja CP unoszącego się w czwartej i bocznej komorze jest opisana tutaj. Krótko mówiąc, myszy są znieczulane nieuleczalnie i, jeśli to konieczne, perfundowane przezsercowo. Należy jednak zauważyć, że perfuzja może uszkodzić strukturę komórek w CP. W związku z tym, jeśli próbka ma być analizowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), skaningowej mikroskopii elektronowej z blokiem szeregowym (SBF-SEM) lub skupionej wiązki jonów SEM (FIB-SEM), nie należy wykonywać perfuzji. Następnie izoluje się cały mózg, a kleszcze są używane do strzałkowej hemisekcji mózgu. Stąd można zidentyfikować i wypreparować CP unoszące się w komorach bocznych, podczas gdy CP z czwartej komory można wyizolować od móżdżkowej strony mózgu.

Wpływ perfuzji na komory mózgu myszy; błękit bromofenolowy, bez perfuzji, PBS/heparyna; diagram.
Rysunek 2: Wizualizacja (A-C) czwartej i (D-F) bocznej komory koroidowej splotu naczyniówkowego (CP) po (A,D) perfuzji błękitu bromofenolowego, (B,E) braku perfuzji i (C,F) perfuzji z PBS/heparyną. Obrazy wykonywane są mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 8x-32x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gdy CP zostanie prawidłowo wypreparowany z komór mózgu, można zastosować cały repertuar technik, aby uzyskać dalsze zrozumienie funkcji tej struktury. Na przykład cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki mogą być wykonane w celu ilościowego określenia i analizy fenotypowej naciekających komórek zapalnych w określonych warunkach chorobowych26,27. Oprócz składu komórkowego, skład molekularny CP może być analizowany w celu oceny obecności cytokin i chemokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), immunoblot lub poprzez jednoczesną analizę wielu cytokin przy użyciu tablicy kulek cytokin28. Ponadto można przeprowadzić analizy transkryptomu, naczyń krwionośnych, histologii komórek odpornościowych i sekretomu na mikrowypreparowanych eksplantatach CP29. W tym przypadku skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) na całym montażu CP jest używana do uzyskania ogólnego widoku struktury CP. SEM wykorzystuje wiązkę skupionych elektronów do skanowania powierzchni i tworzenia obrazu topografii i składu powierzchni. Ponieważ długość fali elektronów jest znacznie mniejsza niż światła, rozdzielczość SEM mieści się w zakresie nanometrów i jest lepsza niż w mikroskopie świetlnym. W związku z tym badania morfologiczne na poziomie subkomórkowym można przeprowadzić za pomocą SEM. Krótko mówiąc, wypreparowany CP jest natychmiast przenoszony do utrwalacza zawierającego aldehyd glutarowy w celu utrwalenia przez noc, a następnie osmikacji i barwienia octanem uranylu. Próbki są następnie poddawane barwieniu asparaginianem ołowiu, odwadniane i ostatecznie osadzane w celu obrazowania.

Tak więc, ten protokół ułatwia efektywną izolację CP od komór mózgu myszy, które mogą być dalej analizowane przy użyciu różnych technik w celu zbadania jego struktury i funkcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z prawem krajowym (belgijskie prawo 14/08/1986 i 22/12/2003, belgijski dekret królewski 06/04/2010) i europejskim (dyrektywy UE 2010/63/UE, 86/609/EWG). Wszystkie eksperymenty na myszach i zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Gandawie (zezwolenia o numerach LA1400091 i WE 2017-026).

1. Przygotowanie

  1. Środki znieczulające: Przygotuj znieczulenie końcowe. Na przykład można przygotować roztwór pentobarbitalu sodu (≥100 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  2. Roztwór perfuzyjny przezsercowy: Przygotować 10 ml (na mysz) roztworu PBS/heparyny (zawierającego 0,2% heparyny) uzupełnionego 0,5% błękitu bromofenolowego.
    UWAGA: Jeśli pozwalają na to dalsze etapy przetwarzania (np. w przypadku analizy RNA i białek), splot naczyniówkowy (CP) można uwidocznić za pomocą perfuzji przezsercowej z błękitem bromofenolowym. Jeśli błękit bromofenolowy nie jest kompatybilny z dalszymi etapami przetwarzania (np. do obrazowania), należy użyć PBS/heparyny do perfuzji.
  3. Przygotuj rozwiązania wymagane do analizy SEM.
    1. Przygotować 0,1 M bufor Na-kakodylanu (pH 7,4). Przygotować roztwór 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylowym. Przygotować 20 ml tego roztworu na próbkę.
    2. Przygotować 2% tetratlenek osmu w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (5 ml na próbkę).
    3. Przygotuj 50%, 70%, 85% i 100% roztwory EtOH. Przygotować 5 ml każdego roztworu EtOH na próbkę.

2. Mikrodysekcja splotu naczyniówkowego z komory bocznej i czwartej

UWAGA: W tym badaniu użyto żeńskich, 9-tygodniowych myszy C57BL/6. Jednak opisana technika izolacji jest niezależna od szczepu, płci i wieku dorosłej myszy.

  1. Odizoluj mózg myszy.
    1. Dootrzewnowo wstrzyknąć śmiertelną dawkę krótko działającego barbituranu (>100 mg/kg, przygotowanego w kroku 1.1) za pomocą igły 26G w celu ostatecznego znieczulenia myszy. Sprawdź odruch stopy myszy, ściskając jej tylną łapę kleszczami.
    2. Gdy nie ma odruchu stopy, umieść nieuleczalnie znieczulone zwierzę w pozycji odleżynowej grzbietowej i unieruchamiaj mysz, przypinając kończyny do talerza.
      UWAGA: Jeśli perfuzja przezsercowa myszy nie jest potrzebna, w zależności od dalszej metody analizy (np. do obrazowania SEM), przejdź do kroku 2.1.7. Jeśli jednak perfuzja jest potrzebna do usunięcia komórek krwi lub innych składników krwi, CP można uwidocznić jako niebieską strukturę unoszącą się w komorach mózgu poprzez perfuzję z błękitem bromofenolowym.
    3. Zdezynfekuj klatkę piersiową, rozpylając 70% etanolu. Umieść sterylną serwetę wokół obszaru operacyjnego. Wykonaj nacięcie o długości ~4 cm tuż pod przeponą za pomocą ostrza chirurgicznego ze stali węglowej (patrz Tabela Materiałów).
    4. Otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych. Całkowicie rozetnij membranę.
    5. Oddziel klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i bijące serce.
    6. Perfuzję przezsercową myszy należy podać 10 ml roztworu perfuzyjnego z szybkością 4,5 ml / min, używając pompy perfuzyjnej (patrz Tabela materiałów). Perfuzja potrwa ~2 min. Wprowadzić igłę 26G do lewej komory, aby przepompować roztwór do obwodu ogólnoustrojowego. Ponadto wykonaj cięcie nożyczkami chirurgicznymi w prawym przedsionku, aby krew mogła wydostać się z krążenia.
      UWAGA: Pompa perfuzyjna jest lepsza niż ręczne podawanie płynu, ponieważ dostarcza płyny z precyzyjnie zaprogramowaną szybkością i zapewnia, że siły ścinające spowodowane perfuzją nie są zbyt duże. Nadmierne siły ścinające zagrozi żywotności i strukturze komórek w CP. Ponadto zalecana tutaj szybkość przepływu perfuzyjnego jest optymalna do perfuzji dorosłych myszy od 7 tygodnia życia. Jeśli używane są młodsze myszy, należy zastosować mniejsze natężenie przepływu. Ważne jest również, aby usunąć krew, która wydostaje się z prawego przedsionka, aby zachować czyste miejsce operacji.
    7. Odetnij głowę myszy.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby odciąć głowę jak najniżej do ramienia, aby zachować strukturę mózgu. Jeśli cięcie jest zbyt wysokie, móżdżek może zostać uszkodzony.
    8. Po ścięciu głowy należy rozciąć skórę głowy, wykonując nacięcie od strony między uszami do górnej części oczu. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę. Następnie rozetnij czaszkę, podążając za szwami łuskowymi, w kierunku części nosowej.
      UWAGA: Ważne jest, aby delikatnie usunąć czaszkę, aby zachować integralność mózgu.
    9. Umieść mózg na lodowatej szalce Petriego i dodaj 1 ml lodowatej płytki 1x PBS na tkankę mózgową.
      UWAGA: Powlekanie naczynia nie jest potrzebne.
  2. Odizoluj CP unoszący się w czwartej komorze.
    1. Delikatnie odetnij móżdżek od mózgu skalpelem. Mózg jest największą częścią mózgu, podczas gdy móżdżek jest znacznie mniejszą częścią z tyłu mózgu. W razie potrzeby usuń pozostałe części tkanki pnia mózgu z móżdżku.
    2. Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry. Upewnij się, że jama czwartej komory jest teraz widoczna w środku sekcji, a CP unosi się w miejscu grzbietowym. W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. W ten sposób punkt kontrolny będzie bardziej widoczny i łatwiej do niego dotrzeć.
    3. Delikatnie oderwij CP od ściany komory za pomocą maleńkich ostrych kleszczyków.
      UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie dotykać i wyjmować CP tylko wtedy, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką. Otwarcie komór zgodnie z opisem w kroku 2.2.2 ułatwi wykonanie kroku 2.2.3.
  3. Odizoluj CP wystający z komory bocznej.
    1. Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby strzałkowo przeciąć mózg na dwie półkule.
    2. Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry. Aby odsłonić komorę boczną, delikatnie odciągnij korę od wzgórza.
    3. Cofnij hipokamp do środkowej linii cięcia. Komora boczna jest teraz widoczna, a CP leży na dnie komory. W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. W ten sposób punkt kontrolny będzie bardziej widoczny i łatwiej do niego dotrzeć.
    4. Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby delikatnie wyrwać CP ze ściany komory.
      UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie dotykać i wyjmować CP tylko wtedy, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką. Otwarcie komór zgodnie z opisem w kroku 2.3.4 ułatwi wykonanie kroku 2.3.5. Na tym etapie należy zachować niezbędną ostrożność, aby w jak największym stopniu zachować strukturę CP. Najłatwiej jest zacząć ciągnąć CP w kierunku rostralnym do ogonowego.

3. Analiza morfologiczna tkanki CP za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

UWAGA: Toksyczne roztwory są używane w następujących etapach przetwarzania. Zaleca się przygotowanie próbki w dygestorium.

  1. Wykonaj przygotowanie próbki do SEM zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przenieść świeżo wyizolowany CP do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego zawierającego 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze Na-kakodylanu (pH 7,4). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ponieważ tkanka CP jest bardzo delikatna i cienka, tkankę należy umieścić w małych koszyczkach na próbki (patrz Tabela materiałów), aby przenieść ją między. W ten sposób struktura tkanki zostanie lepiej zachowana. Utrwalacz na bazie kakodylatu jest stosowany zamiast utrwalacza na bazie PBS, ponieważ silny bufor kakodylowy może przeciwdziałać niskiemu pH aldehydu glutarowego w utrwalaczu EM.
    2. Przemyć próbkę 3x przez 5 minut każdy, 3-5 ml 0,1 M buforu Na-kakodylanu (pH 7,4).
    3. Po utrwaleniu próbek w 3-5 ml 2% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze Na-kakodylanu przez 30 minut. Próbki należy przemywać 3 razy przez 5 minut każda 3-5 ml ultraczystej wody.
    4. Odwodnić próbki w serii lodowatych roztworów o rosnących stężeniach EtOH (50%, 70%, 85%, 100%) przez 15 minut na roztwór EtOH. Użyj osuszacza do punktu krytycznego, aby prawidłowo wysuszyć próbkę punktowo.
      UWAGA Przejście z fazy ciekłej na gazową wpływa na napięcie powierzchniowe, powodując uszkodzenie struktury powierzchni. Etap suszenia w punkcie krytycznym pozwala na zachowanie struktury powierzchni.
    5. Ostrożnie umieść sample na uchwycie próbki dostarczonym z naklejką węglową (patrz Tabela materiałów).
    6. Próbki należy pokryć cienką warstwą (2-5 nm) platyny. W tym celu należy zamontować źródło platyny w układzie próżniowym między dwoma wysokoprądowymi zaciskami elektrycznymi i podgrzać platynę do temperatury parowania. Drobny strumień platyny osadza się na próbce.
      UWAGA: Bardziej szczegółowy protokół dla tego kroku znajduje się w reference30. Oprócz platyny można również użyć złota lub złota/palladu.
  2. Wizualizacja próbek CP za pomocą SEM (patrz tabela materiałów). Procedura wizualizacji tkanki CP za pomocą SEM jest podobna do procedury innych typów tkanek i zależy od zastosowanego oprogramowania i instrumentów. Protokół SEM krok po kroku wraz z towarzyszącym filmem wideo jest dostępny w reference31 lub reference30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół ułatwia skuteczną izolację CP od bocznych (Rysunek 2A-C) i czwartych (Figure 2D-F) komór mózgowych. Po wyizolowaniu całego mózgu, kleszcze są używane do strzałkowej półsekcji mózgu i identyfikacji CP unoszących się w bocznych komorach. CP z czwartej komory można wyizolować od móżdżkowej strony mózgu. Perfuzja z błękitem bromofenolowym może być wykorzystana do wizualizacji CP (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano metodę izolowania splotu naczyniówkowego (CP) z komory bocznej i czwartej komory mózgu myszy. Cała ta metoda montażu CP ułatwia dalszą analizę przy użyciu repertuaru technik, aby uzyskać pełny obraz morfologii CP, składu komórkowego, transkryptomu, proteomu i sekretomu. Takie analizy są kluczowe, aby lepiej zrozumieć tę niezwykłą strukturę wystającą z komór mózgu. Wiedza ta ma ogromne znaczenie badawcze, ponieważ staje się coraz bardziej oczywiste, że CP odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Belgijską Fundację Badań nad Chorobą Alzheimera (SAO; numer projektu: 20200032), Fundację Badawczą Flandrii (FWO Vlaanderen; numery projektów: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) oraz Baillet Latour Fund. Dziękujemy VIB BioImaging Core za szkolenie, wsparcie i dostęp do parku instrumentów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Igła 26G x 1/2Henke Sass Wolf4710004512
Aluminiowe mocowania próbekEM Sciences75220
Bufor kakodylowyEM Sciences11652
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowejSwann-Morton0210rozmiar: 0,45 mm x 12 mm
Zakładki z kleju węglowego -12 mmEM Sciences77825-12
Suszarka punktu krytycznego Bal-Tec CPD030
Belka poprzeczna 540System SEM Zeiss
KleszczeFine Science Tools GmbH 91197-00
Aldehyd glutarowyEM Sciences16220
HeparynaSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Cyfrowa pompa perystaltyczna 2-kanałowaMetrohm Belgia NVCPA-7800160
Tetratlenek osmu EM Sciences19170
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)LonzaBE17-516F
Platyna Kworum Q150T ESPBS bez Ca++ Mg++ i czerwieni fenolowej; sterylnie filtrowany
Pentobarbital soduKela NV514
Kosz na próbki Stal nierdzewnaEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Mikroskop stereoskopowyZeiss
Fine Science Tools GmbH Numer katalogowy: 91460-11
Nożyczki chirurgiczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
  3. Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  6. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
  7. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  8. Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430(2020).
  9. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
  10. Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
  11. Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
  12. Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135(2009).
  13. Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
  14. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  15. Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
  16. Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
  17. Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
  18. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
  19. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
  20. Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
  21. Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
  22. Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
  23. Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143(2021).
  24. Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285(2012).
  25. Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991(2015).
  26. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  27. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  28. Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482(2021).
  29. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  30. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480(2019).
  31. JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).
  32. Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Choroid PlexusMicrodissection TechniqueMouse Brain VentriclesScanning Electron MicroscopyWhole Mount SEMTranscardial PerfusionBromophenol Blue StainingChoroid Plexus IsolationMorphological AnalysisEpithelial Cells

Related Articles