Artykuł metodologiczny

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

DOI:

10.3791/64734

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miliony ludzi na całym świecie borykają się z problemami dotyczącymi płodności. Zmniejszona płodność, a nawet niepłodność, może wynikać z wielu różnych przyczyn, w tym z zaburzeń genetycznych, z których najczęściej występują nieprawidłowości chromosomalne. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest dobrze znaną i często stosowaną metodą wykrywania aberracji chromosomowych u ludzi. FISH jest stosowany głównie do analizy nieprawidłowości chromosomalnych w plemnikach samców z numerycznymi lub strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Co więcej, technika ta jest również często stosowana u kobiet w celu wykrycia aberracji chromosomowych X, o których wiadomo, że powodują dysgenezję jajników. Nadal jednak brakuje informacji na temat zawartości chromosomu X w komórkach jajnika pochodzących od kobiet z aberracjami chromosomowymi X w limfocytach i/lub komórkach policzkowych.

Celem tego badania jest postęp w podstawowych badaniach dotyczących aberracji chromosomu X u kobiet, poprzez przedstawienie dwóch metod opartych na FISH do identyfikacji zawartości chromosomu X w komórkach jajnika. Po pierwsze, opisano metodę oznaczania zawartości chromosomu X w izolowanych komórkach jajnika (oocytach, komórkach ziarnistych i komórkach zrębu) w nieprzeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomowymi X. Druga metoda ma na celu ocenę wpływu aberracji chromosomowych na folikulogenezę poprzez określenie zawartości chromosomu X w komórkach jajnika nowo powstałych pęcherzyków wtórnych i antralnych w tkance jajnikowej od samic z aberracjami chromosomu X po długotrwałym przeszczepieniu myszom z obniżoną odpornością. Obie metody mogą być pomocne w przyszłych badaniach mających na celu uzyskanie wglądu w potencjał reprodukcyjny samic z aberracjami chromosomu X.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepłodność to problem zdrowotny męskiego lub żeńskiego układu rozrodczego, dotykający około 186 milionów osób w wieku rozrodczym na całym świecie1. U co najmniej 35% niepłodnych par niepłodność jest spowodowana zaburzeniem żeńskiego układu rozrodczego2. Istnieje wiele czynników, które mogą powodować niepłodność kobiet, takich jak czynniki genetyczne, nieprawidłowości dróg rodnych, zaburzenia endokrynologiczne, choroby zapalne i leczenie jatrogenne3.

Nieprawidłowości genetyczne występują u około 10% niepłodnych kobiet4,5. Spośród wszystkich nieprawidłowości genetycznych, aberracje chromosomu X są najczęstszą przyczyną dysgenezji jajników2. Kilka badań wykazało, że aberracje chromosomowe X u kobiet z zespołem Turnera (TS) lub zespołem potrójnego chromosomu X są związane z przedwczesną niewydolnością jajników z powodu przyspieszonej utraty komórek rozrodczych lub upośledzonej oogenezy6,7,8.

Aberracje chromosomu X można podzielić na: 1) aberracje numeryczne, w których liczba chromosomów X jest inna, ale chromosomy X są nienaruszone; oraz 2) aberracje strukturalne, w których chromosom X zyskał lub utracił materiał genetyczny3,9. Aberracje numeryczne chromosomu X występują częściej niż nieprawidłowości strukturalne i często są spowodowane spontanicznymi błędami podczas podziału komórki3,9. Kiedy taki błąd występuje podczas mejozy, może prowadzić do aneuploidalnych gamet, a ostatecznie do potomstwa z aberracjami chromosomowymi we wszystkich komórkach. Gdy w komórkach somatycznych powstają defekty chromosomowe w wyniku błędów zachodzących podczas mitozy we wczesnych stadiach ontogenezy, może to prowadzić do mozaicyzmu. U tych osób obecne są zarówno komórki z normalną zawartością chromosomu X, jak i komórki z aberracjami chromosomowymi X.

W latach osiemdziesiątych XX wieku opracowano technikę cytogenetyczną zwaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) do wizualizacji i lokalizacji określonych sekwencji kwasów nukleinowych na chromosomach metafazowych i międzyfazowych10,11. Technika ta wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie sondy DNA do wiązania się z określoną sekwencją w chromosomie, którą można następnie uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Obecnie FISH jest powszechnie stosowany jako kliniczne narzędzie diagnostyczne i jest uważany za złoty standard w wykrywaniu aberracji chromosomowych10. W dziedzinie medycyny reprodukcyjnej analiza FISH na nasieniu została wykorzystana do uzyskania wglądu w zawartość chromosomu X w plemnikach u mężczyzn z numerycznymi lub strukturalnymi aberracjami chromosomowymi w komórkach somatycznych12,13,14. Badania te wykazały, że mężczyźni z aberracjami chromosomowymi byli bardziej narażeni na większą częstość występowania plemników aneuploidalnych w ich nasieniu w porównaniu z samcami z prawidłowymi kariotypami12,13,14.

W przeciwieństwie do plemników, bardzo mało wiadomo o zawartości chromosomu X w komórkach jajnika (w tym oocytach, komórkach ziarnistych/osłonki i komórkach zrębu) u osób z aberracją chromosomalną, a także o możliwych konsekwencjach aneuploidii tych komórek dla ich potencjału reprodukcyjnego. Ważnym powodem skąpych informacji na temat kariotypu komórek jajnika w porównaniu z plemnikami jest fakt, że kobiety muszą poddać się inwazyjnemu zabiegowi, takiemu jak nakłucie pęcherzyka lub operacja w celu uzyskania komórek jajowych lub tkanki kory jajnikowej. Gamety żeńskie są zatem trudne do pozyskania do celów badawczych.

Obecnie w Holandii przeprowadzane jest obserwacyjne badanie interwencyjne mające na celu zbadanie skuteczności kriokonserwacji tkanki jajnikowej u młodych kobiet z TS15. Jeden fragment tkanki kory jajnikowej pacjentki był dostępny w celu zidentyfikowania zawartości chromosomu X w komórkach jajnika16,17. W ramach badania opracowano nowatorską metodę opartą na FISH zdysocjowanej tkance kory jajnikowej w celu określenia, czy aberracje chromosomowe występują w komórkach jajnika u kobiet z aberracją chromosomową w niejajnikowych komórkach somatycznych, takich jak limfocyty lub komórki policzkowe. Ponadto określono również wpływ aneuploidii w komórkach jajnika na folikulogenezę. W tym celu zmodyfikowano ustalony protokół FISH, który umożliwia analizę histologicznych odcinków tkanki kory jajnika po sztucznie wywołanej folikulogenezie podczas długotrwałej ksenotransplantacji u myszy z obniżoną odpornością. W niniejszej pracy przedstawiono dwie metody oparte na FISH do określenia zawartości chromosomu X w komórkach jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika u kobiet z aberracjami chromosomowymi X, w celu poprawy podstaw nauki na ten temat.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania TurnerFertility został zatwierdzony przez Centralny Komitet ds. Badań z udziałem ludzi (NL57738.000.16). W tym badaniu uzyskano tkankę kory jajnikowej u 93 kobiet z TS. Materiały, które wymagają środków ostrożności, są wymienione w tabeli 1.

Tabela 1: Środki ostrożności.

materiałHazard
kwas octowyPoważne oparzenia skóry i podrażnienia układu oddechowego
KolagenazaDziała drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
DAPI (interfejs DAPI)Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
DNaza IDziała drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
etanolWysoce łatwopalny
FormaldehydDziała toksycznie po inhalacji, spożyciu i kontakcie ze skórą
Formamid
(w sondach fluorescencyjnych)		Może zaszkodzić nienarodzonemu dziecku
Liberase (Liberaza)Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
metanolWysoce łatwopalny, toksyczny przez drogi oddechowe, spożycie i kontakt ze skórą
Nonidet P40Działa drażniąco na skórę lub oczy
pepsynaDziała drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
Proteinaza KTrudności w oddychaniu po inhalacji
ksylenWysoce łatwopalny, toksyczny po inhalacji i kontakcie ze skórą. Unikać kontaktu z oczami.

Tabela 1: Materiały wymagające środków bezpieczeństwa.

1. RYBA na izolowanych pojedynczych komórkach kory jajnika

  1. Dysocjacja tkanki kory jajnika w celu uzyskania pojedynczych komórek
    1. Pokrój kriokonserwowaną/rozmrożoną tkankę kory jajnika na małe kawałki o wymiarach około 1 mm x 1 mm x 1 mm za pomocą skalpela.
    2. Enzymatycznie trawić fragmenty tkanek w 4 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża L15 zawierającego 0,1 mg/ml mieszaniny enzymów dysocjacji tkanek, 10 μg/ml DNazy I i 1 mg/ml kolagenazy I z C. histolyticum przez maksymalnie 75 minut w temperaturze 37 °C. Pipetować mieszankę mineralizacyjną w górę i w dół co 15 minut.
    3. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 4 ml zimnego L15 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przemyć zdysocjowaną tkankę raz 8 ml zimnej pożywki L15 przez odwirowanie przy 500 x g i ponownie zawiesić w 500 μl pożywki L15 bez wirowania, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
    4. Przenieś zawiesinę komórkową zawierającą głównie pojedyncze komórki zrębu i małe pęcherzyki (oocyty otoczone pojedynczą warstwą komórek ziarnistych) na plastikową szalkę Petriego i zbadaj zawiesinę komórek pod mikroskopem stereoskopowym (100-krotne powiększenie).
    5. Pobrać małe pęcherzyki (<50 μm) ręcznie za pomocą plastikowej pipety o długości 75 μm i przenieść pęcherzyki do kropelki pożywki L15 uzupełnionej 10% FBS w temperaturze 4 °C, aby zapobiec agregacji pęcherzyków. Pobieranie mieszków włosowych należy wykonywać maksymalnie przez 30 minut. Aby poprawić rozprzestrzenianie się komórek pęcherzykowych przed analizą FISH, należy przenieść oczyszczone pęcherzyki do roztworu 0,06% trypsyny, 1 mg/ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1 mg/ml glukozy i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Komórki zrębu jajnika należy pobrać z zawiesiny komórek kory mózgowej za pomocą plastikowej pipety o długości 75 μm, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć zanieczyszczenia małymi pęcherzykami.
  2. Analiza FISH poszczególnych komórek jajnika
    1. Przenieść leczone pęcherzyki jajnikowe (zalecane n = 5-20) z trypsyną/EDTA/glukozą lub komórkami zrębu (n > 1 000) do kropelek po 5 μl 0,15 mM KCl/15 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na szkiełku i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Wysuszyć i wstępnie utrwalić szkiełka w 300 μl 0,05 mM KCl/7,5% kwasu octowego/22,5% metanolu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Przykryj szkiełka metanolem/kwasem octowym (3:1) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby sfinalizować utrwalanie.
    3. Przygotować 20x wzorcowy cytrynian sodu (SSC), dodając 876 g chlorku sodu i 441 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego w 5 l wody destylowanej. Następnie dodaj 100 ml 20x SSC do 900 ml wody zdemineralizowanej (demi), aby uzyskać 2x SSC. Przemyć próbkę w 2x SSC w temperaturze 73 °C, przykryć ją 100 μl 2% proteinazy K i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka przez 10 minut w temperaturze 37 °C w stacji hybrydyzacji.
    4. Usunąć szkiełko nakrywkowe i myć szkiełka przez 5 minut w DPBS w temperaturze pokojowej. Utrwalać próbkę przez 5 minut za pomocą 1% formaldehydu w temperaturze pokojowej. Na tym etapie materiał nie jest jeszcze w pełni przymocowany do szkiełek i dlatego nie powinien być umieszczany na platformie wytrząsającej.
    5. Myj szkiełka przez 5 minut w DPBS w temperaturze pokojowej, a następnie odwadniaj kolejno 70%, 80%, 90% i 100% etanolu przez 2 minuty każde. Wysuszyć odwodnioną próbkę na powietrzu i zhybrydyzować ją za pomocą sond znakowanych fluorescencyjnie.
    6. Wybierz sondę specyficzną dla centromeru dla chromosomu X i inną sondę centromerową specyficzną dla chromosomu jako kontrolę, aby określić zawartość chromosomu X w komórkach jajnika. W tym przypadku stosuje się sondy specyficzne dla centromeru dla chromosomu X (X [DXZ1]) bezpośrednio znakowanego fluorochromem SpectrumGreen i chromosomu 18 (18 [D18Z1]) bezpośrednio znakowanego fluorochromem SpectrumOrange.
    7. Dodać 1 μl X, 1 μl 18 i 18 μl buforu hybrydyzacyjnego do próbki i uszczelnić szkiełkiem nakrywkowym, które jest przyklejone do szkiełek, aby zapobiec parowaniu sondy podczas hybrydyzacji. Przenieść szkiełka do stacji hybrydyzacji w celu denaturacji w temperaturze 73 °C przez 3 minuty, a następnie hybrydyzacji podczas całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C.
    8. Usuń szkiełko nakrywkowe i pozostały klej z szkiełka po hybrydyzacji. Myć szkiełka w 0,4x SSC/0,3% Tween-20 w temperaturze 72 °C przez 2 minuty, a następnie inkubować przez 1 minutę w 2x SSC/0,1% Tween-20 w RT.
    9. Odwodnić szkiełka przez kolejne 2-minutowe inkubacje w 70%, 80%, 90% i 100% etanolu i wysuszyć na powietrzu w ciemności. Przykryj szkiełka podłożem montażowym zawierającym 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  3. Obrazowania
    1. Zbadaj sygnał(y) dla chromosomu X za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego połączonego z oprogramowaniem do przetwarzania obrazu.
      1. Najpierw wybierz fluorochrom DAPI.
        1. Uzyskaj obraz, wybierając opcję Nowa komórka > Live > Capture przy powiększeniu 630x. Pojawi się nowe okno z progiem. Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.
        2. Pojawi się nowe okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (12), promienia (3) i głębi (1). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone.
      2. Po drugie, wybierz fluorochrome SpectrumOrange i kliknij Przechwyć.
        1. Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.
        2. Pojawi się okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (-11), promienia (2.7) i głębi (0.6). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone.
      3. Na koniec wybierz fluorochrome SpectrumGreen i kliknij Przechwyć.
        1. Ustaw niebieski pasek progu na 0, aby zminimalizować tło, a czerwony pasek na maksimum (255), aby sygnały były jaśniejsze. Kliknij Akceptuj.
        2. Pojawi się okno z ulepszeniem z sugestią ciemniejszego/jaśniejszego (0), promienia (3) i głębi (0). Użyj sugerowanych wartości lub dostosuj je, jeśli nie są zadowolone. Zapisz obraz w nowo utworzonym pliku.
          UWAGA: Komórki somatyczne oceniano tylko wtedy, gdy widoczne były dwa sygnały kontrolnego chromosomu 18. W większości oocytów można było wykryć tylko jeden sygnał dla każdego chromosomu.
    2. Po analizie należy przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C, aby zapobiec utracie sygnałów.

2. RYBA na skrawkach parafiny przeszczepionej tkanki kory jajnika

UWAGA: Jeden fragment kriokonserwowanej/rozmrożonej tkanki kory jajnika 18 samic z TS był ksenografowany myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) przez 5 miesięcy. Procedura ksenoprzeszczepu została opisana wcześniej i została przeprowadzona na Université Catholique de Louvain (Bruksela, Belgia) zgodnie z lokalnymi wytycznymi Komitetu ds. Badań nad Zwierzętami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (odniesienie 2014/UCL/MD/007)18,19.

  1. Selekcja wycinków ksenoprzeszczepowanej tkanki kory jajnika zawierającej pęcherzyki jajnikowe
    1. Utrwalić ksenoprzeszczepioną tkankę kory jajnika w 4% formaldehydzie i zanurzyć tkankę w parafinie. Przytnij bloki skalpelem, aby usunąć nadmiar parafiny i przytnij blok parafiny do grubości 4 μm na mikrotomie rotacyjnym
      2. .
    2. Wybierz co siódmy odcinek wstęgi parafinowej do barwienia hematoksyną i eozyną (HE), aby określić, które odcinki zawierają mieszki włosowe. Umieścić wycinek w łaźni wodnej o temperaturze 40-45 °C i zamontować na szkiełkach mikroskopu immunohistochemicznego.
  2. Deparafinizacja i barwienie HE
    1. Umieść szkiełka na kuchence na 10 minut w temperaturze 60 °C, a następnie zanurz je w 100% ksylenie na 5 minut. Nie ma potrzeby umieszczania zjeżdżalni bezpośrednio na kuchence. Uwodnić sekcje przez 15 s w 100% etanolu, a następnie 2 x 15 s w 96% etanolu. Opłucz szkiełka w wodzie z kranu przez 2 minuty.
    2. Szkiełka należy barwić w hematoksylinie przez 10 minut, a następnie krótko spłukać szkiełka w wodzie z kranu. Na krótko zanurzyć szkiełka w roztworze wodorowęglanu (100 g siarczanu magnezu i 10 g wodorowęglanu sodu w 5 l wody destylowanej). Opłucz szkiełka w wodzie z kranu przez 5 minut.
    3. Przeciwbarwić szkiełka eozyną przez 4 minuty i trzykrotnie odwodnić szkiełka 100% etanolem, a następnie ksylenem. Nakryj szkiełko nakrywkowe plamy HE na szkiełkach i oceń skrawki HE pod mikroskopem świetlnym, aby wybrać skrawki z pęcherzykami (100-krotne powiększenie).
  3. Obróbka wstępna i hybrydyzacja skrawków parafiny dla DNA FISH
    1. Wybierz nowe sekcje, które leżały przed lub po sekcji, która zawierała mieszki włosowe ze wstęgi parafiny. Zamontuj jedną sekcję na szklanym szkiełku. Suszyć skrawki parafiny przez co najmniej 45 minut na piecu w temperaturze 56 °C. Nie ma potrzeby umieszczania zjeżdżalni bezpośrednio na kuchence.
    2. Odparafinować skrawki w ksylenie przez 10 min. Zanurzyć szkiełka w 99,5% etanolu i płukać je przez 5 min w wodzie z kranu. Preparaty należy wstępnie potraktować roztworem do pobierania celu (niskie pH) przez 10 minut w temperaturze 96 °C. Po wystudzeniu szkiełka opłukać w wodzie destylowanej.
    3. Traktować szkiełka przez 5 minut 0,01 M kwasem solnym, a następnie wytrawiać pepsyną (200 U/ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie płukać szkiełka w 0,01 M kwasie solnym, a następnie w PBS.
    4. Utrwal szkiełka w 1% formaldehydzie/PBS przez 5 minut. Krótko przepłucz szkiełka w PBS, a następnie ponownie w demi wodzie. Odwodnić szkiełka w 99,5% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    5. Wybierz sondę specyficzną dla centromeru dla chromosomu X i inną sondę centromerową specyficzną dla chromosomu jako kontrolę, aby określić zawartość chromosomu X w komórkach ziarnistych. W tym przypadku chromosom 18 jest używany jako kontrola.
    6. Na wstępnie obrobione szkiełka nanieść 5 μl sondy 18 (D18Z1) bezpośrednio znakowanej fluorochromem SpectrumGreen i sondy X (DXZ1) bezpośrednio znakowanej fluorochromem SpectrumRed. Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij obszar klejem fotograficznym. Umieścić szkiełka w hybrydyzatorze w celu denaturacji w temperaturze 80 °C przez 10 minut i hybrydyzacji przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Następnego dnia płukać szkiełka przez 5 minut w 2x SSC w temperaturze 42 °C, a następnie 2 minuty i 1 minutę płukać w 0,3% Nonidet P40 w temperaturze 73 °C. Odświeżyć 2x SSC i ponownie płukać szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przykryj kuwetę tak, aby sekcje były trzymane w ciemności.
    8. Krótko opłukać szkiełka w wodzie destylowanej. Odwodnić szkiełka w 99,5% etanolu i pozostawić do ponownego wyschnięcia na powietrzu. Na koniec zamontuj prowadnice za pomocą roztworu zawierającego DAPI i medium montażowe.
  4. Obrazowania
    1. Przeanalizuj wyniki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 630x. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu na komputerze. Wybierz FISH jako profil.
    2. Sprawdź, czy emisja DAPI jest ustawiona na 431 nm, a wzbudzenie na 359 nm, emisja Texas red na 613 nm i wzbudzenie na 595 nm, a emisja FITC na 519 nm i wzbudzenie na 495 nm.
    3. Uzyskaj obraz, wybierając opcję Live > Capture Single Image (Na żywo) Capture Single Image (Przechwyć pojedynczy obraz). Zoptymalizuj jakość obrazu, dostosowując ekspozycję i wzmocnienie, przesuwając suwak Ekspozycja i suwak Wzmocnienie w menu Obraz po lewej stronie (np. ekspozycja: 212 ms i wzmocnienie: 7,9). Wymagana ekspozycja i wzmocnienie mogą się różnić w zależności od obrazu; Obserwuj zmiany podczas tego procesu, aby uzyskać zoptymalizowany obraz. Zapisz obraz w nowo utworzonym pliku.
    4. Po analizie należy przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C, aby zapobiec utracie sygnałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH na izolowanych komórkach jajnika przed szczepieniem
Do zilustrowania wyników przy użyciu tego protokołu wykorzystano kriokonserwowaną tkankę kory jajnikowej od kobiet z 45,X/46,XX (pacjentka A) lub 45,X/46,XX/47,XXX (pacjentka B) TS. U pacjenta A 50% limfocytów miało kariotyp 45,X, a 50% miało 46,XX. U pacjenta B 38% limfocytów miało 45,X, 28% 46,XX, a 34% 47,XXX. Sondy specyficzne dla centromeru dla chromosomu X (zielony) i chromosomu 18 jako kontroli (czerwony) zastosowano do określenia zawart...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza FISH jest dobrze znaną techniką wykrywania aberracji chromosomowych X w limfocytach lub komórkach policzkowych zarówno mężczyzn, jak i samic10. W kilku badaniach opisano FISH na gametach samców z aberracjami chromosomowymi X, ale nadal brakuje szczegółowych informacji uzyskanych przez FISH na komórkach jajnika od samic z aberracjami chromosomu X14. W artykule przedstawiono nowatorskie metody oparte na FISH w celu określenia, czy aneuploidia jest obecna w komórkach j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef i Milanowi Intezarowi za ich ekspertyzę i pomoc techniczną. Źródła finansowania: Merck Serono (A16-1395), Goodlife i Ferring.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyBiosolve BV0001070602BS
Wirówka 1200Hettich Universal4140
Kolagenaza ISigma131470
Szkiełko nakrywkoweVWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase IRoche10104159001
Dulbecco' s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
EtanolEMSURE1009832500
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Technologia Life10100147
Mikroskop fluorescencyjny do sekcji DM4 BLeica Microsystems 
Mikroskop fluorescencyjny A1Zeiss AXIO
Sondy fluorescencyjne znakowane fluorescencyjnie do komórek zdysocjowanychAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Sondy znakowane fluorescencyjnie do wycinków tkanekAbbott DiagnosticsX (DXZ1 05J08-023
18 (D18Z1)  05J10-028
FormaldehydSigma252549
GlueMerck108337
Glue (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
HematoxylinSigma1159380025
Bufor hybrydyzacyjnyAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Stacja hybrydyzacji DakoS2451
Kwas solnyMerck1003171000
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów pojedyncze komórki kory jajnika (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów na przekrojach paraffinekowych Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Preparaty mikroskopowe immunohitochemiczneDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
Mikroskop świetlnyZeiss West Germany
Siarczan magnezuMerckA335586
MetanolHoneywell14262-1L
Podłoże montażoweVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ParafinaPoth Hile2712.20.10
PepsynaSigmaP7000-25G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco11530546
Plastic pipetaCooperSurgical7-72-4075/1
Chlorek potasu Merck1049361000
Proteinaza KQiagen19131
Mikrotom rotacyjny HM 355SSkalpel termoizolacyjny
Dahlhausen11.000.00.515
Szkiełko do RYB na komórkach zdysocjowanychThermo scientificJ1810AM1JZ
Wodorowęglan soduSigma55761-500G
Standardowy cytrynian sodu (SSC)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomikroskop IX 70Olympus
Roztwór do odzyskiwania celu    DakoGV80511-2
TrypsinSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XyleneBOOM 760518191000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FISH AnalysisOvarian Cortex TissueChromosomal AbnormalitiesFolliculogenesisGranulosa CellsEnzymatic DigestionFluorescence Microscopy

Powiązane artykuły