Artykuł metodologiczny

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

DOI:

10.3791/64736

⸱

16 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 2Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3Université de Lyon, 4Centre Léon Bérard, 5Department of Experimental and Clinical Biomedical Sciences Mario Serio, Università degli Studi di Firenze

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nisza rdzeniowa to złożony ekosystem, który jest niezbędny do utrzymania homeostazy komórek rezydentnych. Rzeczywiście, szpik kostny, który obejmuje złożoną macierz zewnątrzkomórkową i różne typy komórek, takie jak mezenchymalne komórki macierzyste, osteoblasty i komórki śródbłonka, jest głęboko zaangażowany w regulację hematopoetycznych komórek macierzystych poprzez bezpośrednie interakcje komórka-komórka, a także produkcję cytokin. Aby dokładnie naśladować tę strukturę in vivo i przeprowadzić eksperymenty odzwierciedlające reakcje ludzkiego szpiku kostnego, stworzono kilka modeli 3D opartych na biomateriałach, opierając się głównie na pierwotnych komórkach zrębu. W tym miejscu opisano protokół mający na celu uzyskanie minimalnego i ustandaryzowanego systemu, który jest łatwy w konfiguracji i zapewnia cechy struktury podobnej do szpiku kostnego, która łączy różne populacje komórek, w tym komórki śródbłonka, i odzwierciedla niejednorodność tkanki szpiku kostnego in vivo. Ta trójwymiarowa struktura przypominająca szpik kostny - złożona przy użyciu cząstek na bazie fosforanu wapnia i ludzkich linii komórkowych, reprezentatywnych dla mikrośrodowiska szpiku kostnego - umożliwia monitorowanie szerokiej gamy procesów biologicznych poprzez łączenie lub zastępowanie różnych pierwotnych populacji komórek w systemie. Końcowe struktury 3D mogą być następnie zebrane do analizy obrazu po utrwaleniu, zatopieniu w parafinie i barwieniu histologicznym/immunohistochemicznym w celu lokalizacji komórek w systemie lub zdysocjowane w celu zebrania każdego składnika komórkowego w celu scharakteryzowania molekularnego lub funkcjonalnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szpik kostny (BM) znajduje się zarówno w centralnych jamach kości osiowych i długich, jak i w płaskich kościach beleczkowych, i zawiera wiele różnych składników komórkowych i niekomórkowych. Na poziomie strukturalnym składa się z wysp tkanki krwiotwórczej (zwanych również "hematonami")1,2 oraz komórek tłuszczowych otoczonych zatokami naczyniowymi przeplatanymi w obrębie kości beleczkowej3. W kościach długich i płaskich dopływ krwi do kości i szpiku kostnego jest połączony siecią naczyń wewnątrzkostnych 4. Ukryty w tej solidnej sieci ochronnej, BM zawiera bardzo niedojrzałe komórki zanurzone w gąbczastym zrębie i stanowi miejsce różnicowania rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs)5. Rzeczywiście, oprócz odnawiania tkanek kostnych poprzez produkcję osteoblastów, jedną z głównych znanych funkcji BM jest rozwój hematopoezy6.

Tkanka krwiotwórcza BM obejmuje różne typy komórek, a mianowicie HSC, prekursory i bardziej zróżnicowane komórki krwi, takie jak limfocyty, neutrofile, erytrocyty, granulocyty, monocyty i trombocyty7. Komórki krwiotwórcze nie są losowo rozmieszczone w przestrzeni BM, ale wykazują szczególną organizację w niszach krwiotwórczych, które obejmują wiele typów komórek różnego pochodzenia (osteoblasty, osteoklasty, MSC, adipocyty, śródbłonek sinusoidalny i komórki zrębu okołonaczyniowego, komórki odpornościowe, komórki nerwowe i odrębne dojrzałe komórki krwiotwórcze), tworząc złożoną strukturę zapewniającą normalną hematopoezę8. Biologiczne funkcje niszy krwiotwórczej obejmują regulację przeżycia HSC, adhezję, spoczynek, naprowadzanie i różnicowanie poprzez różne mechanizmy (interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, produkcja rozpuszczalnych czynników, niedotlenienie) w odpowiedzi na wiele stresów fizjologicznych lub niefizjologicznych3,6. Chociaż te nisze krwiotwórcze były początkowo postrzegane jako jednorodne jednostki, postęp technologiczny, taki jak analizy pojedynczych komórek i obrazowania, stopniowo ujawnił ich złożoność, dynamikę i właściwości adaptacyjne9,10,11.

Kluczowa potrzeba zastąpienia i ograniczenia wykorzystania zwierząt do rozszyfrowywania ludzkich procesów fizjologicznych i patologicznych prowadzi do nowych możliwości i wyzwań11,12. Wśród nowo opisanych narzędzi in vitro zaproponowano modele trójwymiarowe (3D), które naśladują ludzkiego BM in vivo lepiej niż klasyczne hodowle dwuwymiarowe (2D)13,14,15,16,17. Modelowanie 3D wydaje się więc być obiecującym podejściem do obserwacji interakcji komórka-komórka i komórka-macierz, bliższym tym zachodzącym in vivo. Korzystając z różnych tych modeli, niektóre zespoły wykazały przetrwanie i rozprzestrzenianie się HSCs18,19. Dostępnych jest kilka modeli 3D, z których najczęstszym podejściem jest wykorzystanie biomateriałów 3D na bazie rusztowań, takich jak hydrożele, koloidy lub kolageny, związanych z MSCs, wykorzystując ich zdolności różnicowania linii osteoblastycznej20,21,22. Niemniej jednak nie osiągnięto globalnej zgody na spełnienie wszystkich wymagań dotyczących badań na komórkach ludzkich w sposób przyjazny dla użytkownika i ustandaryzowany23, zwłaszcza, że te obecne systemy 3D opierają się głównie na pierwotnych komórkach zrębu, a zatem cierpią z powodu ograniczonego dostępu do pierwotnych próbek, dostępności tkanek i niejednorodności.

Dodatkowo, kompartment komórek śródbłonka powinien zostać wprowadzony, ponieważ te komórki stanowią główny składnik interakcji komórka-komórka i są zaangażowane w los komórek macierzystych i rozwój choroby BM, zarówno w białaczce24, jak i przerzutach25. Wcześniej informowaliśmy, że dodanie elementów patologicznych do standaryzowanego modelu 3D ludzkiego szpiku kostnego podsumowuje cechy obserwowane w próbkach pobranych od pacjentów, takie jak zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)26. Aby lepiej zrozumieć dynamikę i interakcje między ludzkim mikrośrodowiskiem BM a komórkami rezydentnymi, udostępniamy szczegółowy protokół dla przyjaznego dla użytkownika i ustandaryzowanego systemu, który pozwala zbudować minimalną, dobrze zorganizowaną strukturę podobną do BM. System ten składa się z trzech typów komórek ludzkiego szpiku kostnego - komórek śródbłonka i komórek zrębu, które reprezentują mikrośrodowisko, oraz HSC. Dzięki zastosowaniu określonych koralików jako rusztowania i ośrodka różnicowania osteoblastycznego, uzyskana struktura 3D będzie naśladować ludzką niszę rdzeniową, umożliwiając przydatne badanie ludzkiego szpiku kostnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Aby przygotować strukturę szkieletu podobną do szpiku kostnego, protokół ten opiera się na łączeniu koralików z komórkami śródbłonka HMEC-1 i komórek zrębu HS27A z dwufazowymi kulkami fosforanu wapnia (BCP). Koraliki BCP posłużą jako rusztowanie umożliwiające, za pomocą określonego medium, kształtowanie konstrukcji 3D.

1. Przygotowanie koralików i sterylizacja

  1. Odważyć 35-40 mg kulek BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 μm) dla każdej wkładki (małej, cylindrycznej, plastikowej płytki z membraną poliwęglanową na dole) w probówce o pojemności 1,5 ml (patrz tabela materiałów). Po zważeniu kulek wywiercić mały otwór czystą igłą w górnej części probówki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć otwarcia pokrywki podczas cyklu autoklawu (121 °C przez 60 min) i umieścić probówki w pozycji pionowej w zamkniętym sterylnym pudełku
    2. .

2. 3D włóż preparat pod sterylny kaptur

  1. Umieść sterylne wkładki do hodowli komórek poliwęglanowych w dołkach 6-dołkowej płytki. Wlej sterylne kulki BCP z probówki o pojemności 1,5 ml do wkładu. Dokładnie umyj kulki, wlewając 350 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do wkładki, a następnie dodaj 4,5 ml 1x PBS do studzienki. Wyjmij i wyrzuć PBS za pomocą próżni lub pipety o pojemności 5 ml, umieszczając końcówkę w rogu studzienki. Powtórz krok prania dwukrotnie.
  2. Po umyciu koralików użyj 1x PBS uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aby zablokować system. Ostrożnie dodać 350 μl roztworu blokującego do wkładki i 4,5 ml do studzienki i umieścić całą płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
    UWAGA: Kroki 2.1 i 2.2 pomagają zminimalizować uwalnianie jonów z kulek BCP przed wysiewem komórek.

3. Zbieranie danych z linii komórkowych i utrzymanie 3D

UWAGA: Po tym etapie inkubacji, dodawane są komórki mikrośrodowiskowe, które tworzą szkielet struktury 3D. System ten opiera się na wykorzystaniu HMEC-1, ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego unieśmiertelnionych dużym antygenem T z SV40 i HS27A, ludzkich komórek zrębu szpiku kostnego unieśmiertelnionych wirusem brodawczaka ludzkiego, ze względu na ich zdolność do tworzenia solidnej struktury podobnej do BM i ich kompatybilność z włączeniem komórek śródbłonka.

  1. Przed dodaniem komórek do systemu należy przygotować następujące podłoża inkubacyjne:
    1. Na 50 ml kompletnego podłoża do różnicowania kości (ODM) wymieszaj 45 ml zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco + 5 ml FBS + 0,5 ml penicyliny-streptomycyny + 8 × 10-4 mg/l deksametazonu + 2,16 g/l beta-glicerofosforanu + 44 mg/l kwasu askorbinowego.
    2. Na 50 ml kompletnej pożywki HMEC-1 wymieszaj 45 ml MCDB 131 + 5 ml FBS + 0,5 ml penicyliny-streptomycyny + 1% substytutu glutaminy + 1 mg/L hydrokortyzonu + 10 μg/l EGF.
  2. Usuń rozwiązanie blokujące z systemu. Wymieszać 1 × 106 komórek HMEC-1 (reprezentujących przedział naczyniowy) i 2 × 106 komórek HS27A (reprezentujących przedział komórek mezenchymalnych zrębu) w probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 1,575 × g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dodać 175 μl pożywki HMEC-1 (pożywki specyficznej dla wzrostu komórek HMEC-1) ze 175 μl pożywki ODM (pożywki specyficznej dla osteoróżnicowania HS27A).
  3. Wlać 350 μl tej zawiesiny zawierającej łącznie 3 × 106 komórek do każdej wkładki. Następnie wlej 4,5 ml połączonej pożywki (2,25 ml pożywki HMEC-1 + 2,25 ml ODM) bez komórek do dołków płytki. Delikatnie odessać i dozować mieszaninę kilka razy za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, aby homogenizować komórki i kulki BCP we wkładce. Przełóż całą mieszankę, aby osiadła na dnie wkładki.
    UWAGA: Preparat mieszany z jedną martwą objętością jest zalecany, jeśli hodowanych jest kilka wkładek. Na przykład, jeśli hodowane są cztery wkładki, zawsze przygotuj objętość wymaganą dla pięciu wkładek.
  4. Po homogenizacji komórek śródbłonka i mezenchymów wewnątrz wkładki, należy przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 tygodnie. Zmieniaj pożywkę wewnątrz wkładu i studzienki 2 razy w tygodniu, ostrożnie wyjmując pożywkę z wkładu za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml i umieszczając końcówkę na wewnętrznej ściance wkładki, aby uniknąć naruszenia rogu wkładki.
    UWAGA: Pobrany supernatant może być przechowywany w temperaturze -80 °C na dowolnym etapie w celu późniejszej oceny ilościowej białka.

4. Dodawanie interesujących komórek do systemu

UWAGA: Po 3 tygodniach hodowli HMEC-1 i HS27A, osteodyferencjacja komórek HS27A umożliwiła usztywnienie systemu. Na tym etapie dodaj interesujące nas komórki hematologiczne (liczba dodanych komórek może wahać się od 1 × 104 do 1 ×10 6) we wstawce. Dodane komórki były komórkami TF1 transfekowanymi onkogenem BCR-ABL i pierwotnymi monojądrowymi komórkami CD34 + pochodzącymi od pacjentów z ostrą białaczką szpikową lub zdrowych dawców.

  1. Na tym etapie należy zmienić skład pożywki, ponieważ związek ODM jest toksyczny dla komórek hematologicznych i nie ma potrzeby dalszego dodawania go po zakończeniu usztywnienia systemu. Na przykład, aby wspomóc utrzymanie układu krwiotwórczego, zastąp pożywkę ODM kompletnym RPMI dla linii komórek krwiotwórczych (RPMI uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny) lub IMDM dla pierwotnych komórek krwiotwórczych. Przygotuj partię 50% kompletnego podłoża HMEC-1 i 50% kompletnego podłoża RPMI/IMDM do zmian podłoża 3D (dwukrotnie) raz w tygodniu.
  2. Zawiesić interesujące nas komórki hematologiczne w tej pożywce złożonej i dodać ją do wkładki. Jeśli wymagany jest protokół leczenia farmakologicznego, odczekaj 24 godziny po dodaniu interesujących komórek przed leczeniem, dając im czas na przyleganie do struktury przypominającej kość.
  3. Dostosuj okres hodowli komórek 3D do wymagań. Odświeżaj pożywkę (50% kompletna pożywka HMEC-1 + 50% kompletna pożywka RPMI) dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: W trakcie hodowli komórek 3D niektóre przylegające komórki mogą przeciekać na zewnątrz wkładki na dno studzienek, zwiększając zużycie pożywki. Sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma dyspersji komórek poza wkładką i w razie potrzeby umieść wkładkę na nowej 6-dołkowej płytce pod sterylnym kapturem.

5. 3D wyniki eksperymentów podobnych do szpiku kostnego

UWAGA: Po hodowli 3D można osiągnąć kilka wyników zgodnie z celami eksperymentu.

  1. Analiza białka
    UWAGA: W trakcie eksperymentu 3D można zebrać białka wydzielane przez komórki obecne w strukturze podobnej do szpiku kostnego do dalszych analiz.
    1. W przypadku zmiany pożywki hodowlanej 2 razy w tygodniu, należy przechowywać pobrany supernatant z wnętrza wkładki w temperaturze -80 °C w celu oceny produkcji białek będących przedmiotem zainteresowania w systemie.
  2. Oddzielanie komórek od struktury 3D (pod sterylnym kapturem, jeśli komórki muszą być posortowane)
    UWAGA: Komórki hodowane w systemie 3D podobnym do szpiku kostnego mogą być pobierane, sortowane i dalej analizowane.
    1. Pod koniec eksperymentu, w probówce o pojemności 15 ml, zmieszaj 4,5 ml RPMI z 0,5 ml FBS uzupełnionym 0,4 mg/ml kolagenazy i podgrzej roztwór w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Umieść wkładkę do góry nogami (biała strona z membraną na górze) na sterylnej pokrywie płytki 6-dołkowej, aby prawidłowo wyciąć membranę. Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć membranę z boków, uzyskując w ten sposób biały, stały krążek. Umieścić krążek w ciepłej probówce o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 5.2.1.
    3. Umieścić probówkę w aktywnym kole w inkubatorze o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut, aby umożliwić trawienie (w kontakcie z kolagenazą). Zastosuj ten sam czas inkubacji dla wszystkich membran, aby uniknąć przekrzywionej analizy.
    4. Po 10 minutach odwirować probówkę o pojemności 15 ml przez 5 minut w temperaturze 1,575 × g w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml ciepłego 1x PBS. UWAGA: Na tym etapie, ponieważ membrana poliwęglanowa zazwyczaj unosi się we frakcji supernatantu, można ją wyrzucić za pomocą sterylnej końcówki do pipety. Jeśli membrana jest nadal zawarta w granulce, pozostaw ją i usuń na końcu następnego kroku.
    5. Zawiesić granulkę w 300 μl ciepłej trypsyny, wirować probówkę przez 10 s i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę.
    6. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 1 ml ciepłego, czystego FBS. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml mechanicznie odessać i dozować pożywkę, aby całkowicie oddzielić krążek.
      UWAGA: Etap aspiracji/dozowania musi być bardzo szybki, w przeciwnym razie kulki osadzą się wewnątrz końcówki.
    7. Odwirowywać probówkę przez 5 minut przy stężeniu 1,575 × g. Zawiesić osad w 3 ml 1x PBS uzupełnionego 10% FBS.
    8. Pozostaw kulki do osadu na 5 sekund przed zebraniem supernatantu i przefiltrowaniem go przez sitko o wielkości 35 μm umieszczone na probówce zbiorczej. Odwirować pobrany filtrat przez 5 minut przy stężeniu 1,575 × g. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby ocenić żywotność i przystąp do analiz cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Liczba żywotnych komórek pobranych po inkubacji błękitu trypanowego wynosi ~1-2 × 105 komórek na strawioną wkładkę.
  3. Znakowanie pobranych komórek metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Komórki pobrane ze struktury podobnej do szpiku kostnego 3D można znakować i dalej analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj mieszanki przeciwciał, aby wykryć różne przedziały po dysocjacji 3D. W tym przypadku zastosowano CD45 (barwi interesujące komórki hematologiczne), CD31 (barwi przedział naczyniowy) i CD73 (barwi przedział osteoblastyczny) w stężeniu 1 μL w 50 μL PBS + 2% FBS. Przez cały czas trwania procesu wszystkie przygotowane komórki i przeciwciała należy przechowywać na lodzie (4 °C) z dala od światła.
    1. Zawiesić osady w mieszaninie przeciwciał i inkubować przez 30-40 minut na lodzie z dala od światła.
    2. Dodać 1 ml PBS + 2% FBS, aby przepłukać komórki i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1,575 × g.
    3. Odzyskany osad zawiesić w 200 μL 1x PBS + 10% FBS uzupełnionego 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI, rozcieńczony 1:2,000).
    4. Analizować probówki w cytometrze przy użyciu następujących parametrów: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Użyj wykresu wykresu FSC-H w porównaniu z FSC-W, aby przebramować populację singletów. We frakcji singletowej użyj wykresu DAPI-A w porównaniu z FSC-A, aby określić populację żywotnych komórek (DAPI-ujemne). W przypadku wcześniej bramkowanej populacji DAPI należy użyć wykresu APC-A i FSC-A, aby określić populację CD45-dodatnią.
  4. Utrwalenie struktury 3D przypominającej szpik kostny
    UWAGA: Utrwalanie struktury podobnej do BM 3D jest zwykle wykonywane w celu immunohistochemii lub immunofluorescencji w celu wizualizacji komórek in situ i dalszego specyficznego barwienia.
    1. Aby naprawić strukturę podobną do BM, przenieś wkładkę (krok 4.3) ze starej płytki na nową 6-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS. Następnie delikatnie zastąp podłoże wewnątrz wkładu 1x PBS.
      UWAGA: Nie spłukiwać uformowanej struktury PBS; ciśnienie cieczy może uszkodzić strukturę 3D.
    2. Po umyciu wkładu umieść go w nowej 6-dołkowej płytce i napełnij zarówno studzienkę, jak i wkładkę świeżo otwartym paraformaldehydem (PFA) 4% (rozcieńczonym 16% w 1x PBS).
    3. Pozwól, aby proces utrwalania postępował przez 4 godziny w temperaturze pokojowej z dala od światła.
    4. Pod koniec procesu utrwalania umyć wkładkę raz 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    5. Przeciąć membranę na spodzie wkładki zgodnie z opisem w kroku 5.2.2, aby pobrać twardy dysk.
    6. Inkubować dysk 4x przez 48 godzin w EDTA (0,5 M, pH 8) w celu odwapnienia struktury.
    7. Osadź strukturę w parafinie i pokrój na kawałki o grubości 4 μm.
    8. Za pomocą automatycznego immunostainera inkubuj skrawki z przeciwciałami anty-CD45, anty-CD73 i Ki67. Wizualizację barwienia za pomocą anty-króliczej lub -mysiej peroksydazy chrzanu (HRP) i z 3,3'-diaminobenzydyną jako substratem chromogennym i przeciwbarwieniem za pomocą hematoksyliny Gilla.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, możliwe jest podsumowanie minimalnego, in vitro, 3D, ludzkiego mikrośrodowiska podobnego do BM, z którego można pobrać żywe komórki z trzech różnych przedziałów komórkowych (Rysunek 1). Rzeczywiście, po pożądanej ekspozycji, struktury podobne do BM 3D można zdysocjować, a MSC, komórki śródbłonka i komórki krwiotwórcze można ocenić/scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2A). Dotychczasowe wyniki sugerują, że możliwe jest utrzymanie komórek hematologicznych przez co najmniej 6 tygodni w modelu 3D, przed odzyskaniem żywotnych komórek (Rysunek 2B). Konieczne są jednak przyszłe badania, aby oszacować granicę tego modelu 3D. Ponadto, w razie potrzeby, możliwe jest zastąpienie linii komórkowej HS27A pierwotnym MSC prawidłowego szpiku kostnego (NBM) lub ostrą białaczką szpikową (AML) MSC w tym modelu 3D podobnym do BM (Rysunek 2C) lub zastąpienie linii komórek krwiotwórczych pierwotnymi HSC (Rysunek 2D). Co więcej, analizując interakcje między przedziałami komórkowymi lub lokalizację określonych markerów będących przedmiotem zainteresowania, struktury podobne do BM 3D można utrwalić i dalej przetwarzać za pomocą zatapiania parafiny i immunochemii. Na przykład analizę zawartości CD45 (hematologicznej) lub CD73 (MSC) przeprowadzono przy użyciu tych modeli 3D (Rysunek 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat początkowy konfiguracji ludzkiego systemu 3D podobnego do BM. Po 3 tygodniach kohodowli można pobrać stałą tkankę podobną do BM lub zasiać ją komórkami krwiotwórczymi (jak w przykładzie) lub innymi typami komórek. W razie potrzeby, po zejściu komórek, można dodać leczenie i wprowadzić zmiany pożywki dwa razy w tygodniu. Pod koniec eksperymentu struktury podobne do BM mogą być albo utrwalone i dalej przetwarzane do badań lokalizacyjnych, albo zdysocjowane w celu oceny zawartości komórek. Skróty: BCP = dwufazowy fosforan wapnia; BM = szpik kostny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Odzyskiwanie żywotnych komórek z różnych przedziałów po hodowli w modelu 3D podobnym do BM. (A) Typowy wzór odzyskiwania komórek z jednej zdysocjowanej struktury podobnej do BM z 9,84% żywotnych komórek (DAPI-). Reprezentatywne poletka komórek krwiotwórczych (66,6% CD45+), MSC/osteoblastów (88,6% komórek CD73+ w populacji CD45-) i komórek śródbłonka (22,1% komórek CD31+ w populacji CD45-) odzyskanych po dysocjacji 3D. (B) System 3D umożliwia utrzymanie żywotnych komórek krwiotwórczych (CD45+) do 6 tygodni po hodowli. (C) Systemy 3D wykonane z pierwotnych MSC z NBM lub AML wraz z HMEC-1 (w tym przykładzie pokolorowane Kusabira-Orange) mogą utrzymywać HSC (3,88% komórek CD45 + DAPI) in situ (D). Skróty: BM = szpik kostny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; MSC = mezenchymalna komórka macierzysta; NBM = normalny szpik kostny; AML = ostra białaczka szpikowa; HSC = hematopoetyczne komórki macierzyste; FSC = rozproszenie do przodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wizualizacja interakcji komórkowych i proliferacji w modelu 3D podobnym do BM. Systemy pobrano po 3 tygodniach kohodowli 3D z HS27A i HMEC-1 oraz dodaniu komórek krwiotwórczych po 1 tygodniu. Typowe barwienie immunohistochemiczne (wizualizowane na brązowo) przez IHC zostało uwidocznione przy użyciu peroksydazy chrzanu anty-króliczego lub myszy i uwidocznione za pomocą 3,3′-diaminobenzydyny jako substratu chromogennego i wybarwione przeciwwagowo hematoksyliną Gilla i wykazuje obecność komórek krwiotwórczych z CD45 (lewy panel), komórek zrębu z CD73 (panel środkowy) lub proliferacji wszystkich komórek z KI67 (prawy panel). Podziałka = 50 μm. Skróty: BM = szpik kostny; IHC = immunohistochemia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z obecnych wyzwań, przed którymi stoją badania nad fizjologicznymi i związanymi z nimi problemami patologicznymi człowieka, jest brak modeli dokładnie naśladujących złożone funkcje ludzkich narządów. W przypadku ludzkich modeli BM 3D, wiele modeli wykorzystuje hydrożele i częściowo odtwarza BM, ilustrując moc warunków hodowli 3D w porównaniu z klasycznymi kulturami 2D w zapewnianiu, na przykład, lepszego różnicowania osteoblastycznego27,28. Niemniej jednak, pomimo dobrej odtwarzalności i łatwości obsługi, systemy te nie naśladują ludzkiej struktury i architektury BM 3D, co może znacząco wpłynąć na dalsze analizy. Postęp technologiczny umożliwił naukowcom lepsze odtworzenie rodzimego środowiska niszy osteoblastycznej człowieka przy użyciu systemu bioreaktorów opartego na perfuzji w celu utrzymania niektórych właściwości HSC29. Rozwój urządzeń mikroprzepływowych doprowadził do nowych podejść do odtworzenia istotnej struktury podobnej do szpiku kostnego, ale do tej pory osiągnięto tylko ograniczone cechy szpiku kostnego, a zatem ich zastosowania były ograniczone 30,31,32,33.

Postępy w naukach o materiałach przyczyniły się do opracowania szerokiej gamy naturalnych lub syntetycznych biomateriałów, które można wykorzystać do opracowania odpowiednich systemów hodowli kości 3D. Jednak takie systemy są czasami trudne do opracowania w standardowych laboratoriach biologicznych, które nie posiadają własnych umiejętności w zakresie biofizyki. Co więcej, w większości przypadków systemy te osiągają ograniczoną zdolność do naśladowania struktury 3D ludzkiej kości, w tym mikrośrodowiska BM, i wykorzystują duże ilości cytokin i czynników wzrostu, tworząc sztucznie wzbogaconą pożywkę hodowlaną34.

Wybór indukcji różnicowania osteoblastów, a nie różnicowania adipocytarnego, opierał się na fakcie, że preosteoblasty i osteoblasty zostały opisane jako część niszy śródkostnej35. W ten sposób zidentyfikowano komórki osteoblastyczne jako pożądane składniki zarówno kości, jak i szpiku kostnego. Wśród składników komórkowych szpiku kostnego dużą część mikrośrodowiska zajmują komórki śródbłonka i zrębu. Ponadto te dwa typy komórek wytwarzają strukturalne niekomórkowe składniki macierzy zewnątrzkomórkowej i cytokiny biorące udział w regulacji homeostazy i różnicowania, wymagane tutaj w celu wytworzenia zwapniałej struktury. W związku z tym uzasadnia to użycie komórek śródbłonka i zrębu oraz wybór linii komórkowych, aby umożliwić łatwy dostęp i zwiększyć odtwarzalność między laboratoriami. Ponieważ hodowla linii HMEC-1 jest bardziej stabilna w czasie, ta linia komórkowa została zachowana do opracowania systemu 3D. W przypadku komórek zrębu porównaliśmy w hodowli 2D zdolność różnicowania osteoblastów linii komórek zrębu pochodzących z prawidłowego szpiku kostnego: HS5 i HS27A. Odkryliśmy, że linia HS5 nie różnicowała się tak bardzo, jak linia HS27A w systemie 3D wygenerowanym za pomocą którejkolwiek z linii komórkowych. W związku z tym próby zastąpienia ogniw HS27A przez linię HS5 doprowadziły do wytworzenia mniej sztywnej konstrukcji, co sugeruje, że HS27A są bardziej odpowiednie.

Zarówno linie komórkowe HS27A, jak i HMEC-1 hodowano w różnych kombinacjach pożywek, w których uzyskuje się najlepszą sztywną strukturę i ułożenie HMEC-1 wzdłuż struktur osteoblastów, tak że produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej nadaje strukturę podstawową względną sztywność. Analiza zaawansowania różnicowania w D14 wykazała, że różnicowanie było bardziej zaawansowane w D21 (pomiar BSP, markera późnej osteoblasty), ze stosunkiem 1:2 dla HMEC-1:HS27A i z lepszymi wynikami, gdy wprowadzono 2 × 106 HS27A. Komórki śródbłonka odgrywają również ważną rolę w regulacji homeostazy i różnicowania (między innymi poprzez dostarczanie cytokin). Fakt, że ogniwa HMEC-1 są utrzymywane w tym systemie wskazuje, że mogą one przynajmniej spełniać tę rolę, a to przyczynia się do legitymizacji naszego modelu. W przypadku linii śródbłonka HMEC-1 ważne było, aby wprowadzić ją na tyle wcześnie, aby można ją było prawidłowo zintegrować ze strukturą i z nadzieją, że komórki te mogą tworzyć wyrównania, a nawet rurki w strukturze. Testy kohodowli HS27A i HMEC-1 przeprowadzono poprzez wprowadzenie tych ostatnich na różnych etapach: D0, D7, D14; Nie zaobserwowano żadnej znaczącej różnicy ani w różnicowaniu komórek zrębu, ani w utrzymaniu lub umiejscowieniu komórek śródbłonka. W ten sposób komórki te zostały wprowadzone na początku procesu. Komórki krwiotwórcze zostały wprowadzone w czasie, gdy różnicowanie osteoblastyczne byłoby wystarczająco zaawansowane, aby sprzyjać interakcjom komórka-komórka. Wybór ten był również uwarunkowany faktem, że to różnicowanie osteoblastyczne jest uwarunkowane użyciem pożywki, która według naszych badań nie wspiera w pełni utrzymania komórek krwiotwórczych. Komórki hematologiczne mogą być liniami komórkowymi lub pierwotnymi komórkami hematopoetycznymi BM CD45.

Na podstawie tego modelu 3D możemy wyobrazić sobie zastąpienie każdego typu komórek komórkami pierwotnymi, normalnymi lub patologicznymi, a nawet dodanie innych typów komórek w celu zwiększenia właściwości biomimetycznych, takich jak komórki odpornościowe, adipocyty lub fibroblasty26. W rzeczywistości linia komórkowa HS27A została zastąpiona pierwotnymi MSC BM o niskim pasażowaniu. Podobnie hematologiczne linie komórkowe zastąpiono pierwotnymi komórkami hematopoetycznymi BM. Jednak zastąpienie komórek HMEC-1 pierwotnymi komórkami śródbłonka nie zostało jeszcze przetestowane. Obecnie model ten można jeszcze udoskonalić pod względem reprezentacji naczyń krwionośnych, ponieważ mimo że komórki śródbłonka są obecne i prawidłowo oddziałują z innymi komórkami z mikrośrodowiska (np. komórkami krwiotwórczymi), nie tworzą one naczyń strukturalnych, co wyklucza perfuzję przepływową w celu naśladowania funkcjonalnych naczyń krwionośnych. Ogólnie rzecz biorąc, może to stopniowo zwiększać złożoność i reprezentatywność obecnego minimalnego modelu 3D. Dodanie innych typów komórek może ułatwić badania nad innymi kwestiami, takimi jak znaczenie miejscowego zapalenia BM lub oporności na immunoterapię.

Jednak ten system 3D potrzebuje 3 tygodni, zanim będzie można dodać komórki będące przedmiotem zainteresowania, komórki hematologiczne lub komórki raka nabłonka, jeśli oceniany jest proces przerzutowania. Należy utrzymać sterylne warunki, ponieważ wymiana pożywki dwa razy w tygodniu może czasami prowadzić do zanieczyszczenia pożywki. Ponadto, ponieważ niektóre komórki mogą migrować przez pory wkładu i zacząć rozpraszać się w studni, co prowadzi do zwiększonego zużycia pożywki, zaleca się regularne monitorowanie.

Opisaliśmy tutaj rusztowanie 3D umożliwiające różnicowanie osteoblastyczne i opracowaliśmy odpowiednie, in vitro, 3D, ludzkie mikrośrodowisko podobne do BM. System ten umożliwia analizę in situ i ostateczne pobieranie żywych komórek. System ten zapewnia nowe i wysoce elastyczne narzędzie, powtarzalne i przyjazne dla użytkownika, z szerokim zakresem zastosowań do badania interakcji i mechanizmów w mikrośrodowisku BM człowieka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy P. Battiston-Montagne i A. Jambon z platformy cytometrycznej CRCL oraz N. Gadot i C. Leneve z Platformy Patologii Badawczej, Wydziału Badań Translacyjnych i Innowacji, Centrum Léon Bérard. Autorzy są wdzięczni firmie B. Manship za wydanie angielskie. Praca ta została sfinansowana przez Inserm i FI-LMC dla V. M. S., a S. L. K. A. i L. B. były wspierane przez grant Société Française d'Hématologie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3,3-diaminobenzydyna (DAB) System płynnych substratówMERCK SIGMAD7304Barwienie IHC
5 ml PipetaSARSTEDT861253001Średnia zmiana
Anti Mouse HRPThermofisher62-6520IHC Barwienie wtórne
Anti Rabbit HRPThermofisher31460Barwienie wtórne IHC
Kwas askorbinowy 250 μ MMERCK SIGMAA92902ODM medium
BCPCaP Biomaterials
LLC-US		Koraliki 3D
Beta glicerofosforan 10 mMMERCK SIGMAG9422ODM medium
CD31-BV711BD7440783D śródbłonek Oznaczanie populacji komórek
CD34-APCBD5558243D niedojrzałe hematologiczne Oznaczanie populacji komórek
CD38-PE-Cy5BD5554613D progenitor hematologiczny Znakowanie populacji komórek
CD45Miltenyibiotec130-110-637IHC barwienie komórek hematologicznych
CD45-APCBD555485Hematologiczne 3D Znakowanie populacji komórek
CD45-BV500BD560777Hematologiczne 3D Znakowanie populacji komórek
CD73Miltenyibiotec130-120-066IHC barwienie przedziału zrębu
CD73-BV605BD563199 3DEtykietowanie populacji komórek osteoblastycznych 3D
Sitko do urządzeń FACS z probówką 5 mlFALCON352235Sitko i rurka służące do zbierania komórek i usuwania kulek
KolagenazaMERCK SIGMAC2674-1GDysocjacja enzymatyczna 3D
Cytometria rurka filtracyjnaThermofisher10585801Filtracja odzyskanych komórek 3D
Rurka cytometrycznaThermofisher10100151Etykietowanie odzyskanych komórek w 3D 
DAPI (Roztwór 12)Chemometec910-30123D odzyskane żywe komórki Znakowanie
deksametazonuThermofisherA13449ODM podłoże
DMEM, wysoka glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian 500 mlThermofisher31966021podłoże ODM
EGFMERCK SIGMAE9644-0,2MG HMED-1 średni
Eppendorf Probówka 1,5 mlSARSTEDT72696Do autoklawu perełkowego i supernatantu retieve
Falcon 15 mLFALCON352096Do dysocjacji 3D
FBSDUTSCHERS1900-500Aby uzupełnić pożywkę hodowlaną i zatrzymać działanie trypsyny
GlutamaxThermofisherA1286001substytut glutaminy dla HMED-1 Pożywka
Hematoksylina Solution, Gill Nr 1MERCK SIGMAGHS132-1LBarwienie IHC
HMEC-1ATCCCRL-3243Populacja komórek śródbłonka 3D 
HS27AATCCCRL-2496Populacja komórek osteoblastycznych 3D 
HydrokortyzonMERCK SIGMAH0135-1MGHMED-1 podłoże
Wkładka: Wkładki do hodowli komórek z poliwęglanu Nunc w płytkach wielodołkowychTHERMO SCIENTIFIC NUNCDo pobierania komórek i tworzenia struktury 3D przypominającej kość
KI-67 IHCThermofisherMA5-14520IHC barwienie komórek proliferacyjnych
MCDB 131 Podłoże, bez glutaminyThermofisher10372019HMED-1 średnia
mikropipeta (1 000 &mikro; L)Eppendorf  4924000088Zmiana podłoża
PBS D 1xThermofisher14190169Cells/ Wkładka do płukania
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermofisher15140122Do uzupełnienia pożywki hodowlanej 
PFA (Formaldehyd 16%)EUROMEDEXEM-15710Utrwalanie 3D (rozcieńczenie PBS 1X)
RMPI 1640 podłoże, suplement glutamaxThermofisher61870044Cuture
Podłoże Skalpel  FISHER SCIENTIFIC 11768353Cięcie membranowe 3D
Płytka sześciodołkowaFALCON353046kultura 3D
ROZTWÓR TRYPSYNY-EDTA (1x)Thermofisher25300096dysocjacja enzymatyczna 3D
140627

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
  2. Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
  3. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  4. Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
  5. Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
  6. Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
  7. Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
  8. Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462(2022).
  9. Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
  10. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  11. Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
  12. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
  13. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030(2020).
  14. Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
  15. Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
  16. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  17. Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
  18. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  19. Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
  20. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  21. Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77(2018).
  22. Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
  23. Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
  24. Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444(2018).
  25. Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
  26. Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
  27. Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002(2016).
  28. Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
  29. Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
  30. Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
  31. de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
  32. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  33. Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796(2021).
  34. Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683(2021).
  35. Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model szpiku kostnegotr jwymiarowa hodowla kom rekmezenchymalne kom rki macierzystekom rki r db onkakrwiotw rcze kom rki macierzystemacierz zewn trzkom rkowacytometria przep ywowalokalizacja kom rekbarwienie immunohistochemicznemikro rodowisko guza

Powiązane artykuły