Tutaj opisujemy prostą metodę wszczepienia myszom komercyjnego ciągłego monitora glikemii przeznaczonego dla pacjentów i dostarczamy skrypty do analizy wyników.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Proste, ciągłe monitorowanie glikemii u swobodnie poruszających się myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Myszy są powszechnym organizmem modelowym używanym do badania chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca. Poziom glukozy jest zwykle mierzony przez krwawienie z ogona, które wymaga obchodzenia się z myszami, powoduje stres i nie dostarcza danych na temat swobodnie zachowujących się myszy podczas ciemnego cyklu. Najnowocześniejszy ciągły pomiar glikemii u myszy wymaga wprowadzenia sondy do łuku aorty myszy, a także specjalistycznego systemu telemetrycznego. Ta trudna i kosztowna metoda nie została przyjęta przez większość laboratoriów. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół polegający na wykorzystaniu dostępnych na rynku ciągłych monitorów glikemii używanych przez miliony pacjentów do ciągłego pomiaru glukozy u myszy w ramach badań podstawowych. Sonda wykrywająca poziom glukozy jest wprowadzana do przestrzeni podskórnej z tyłu myszy przez małe nacięcie na skórze i jest mocno utrzymywana na miejscu za pomocą kilku szwów. Urządzenie jest przyszywane do skóry myszy, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu. Urządzenie może mierzyć poziom glukozy przez okres do 2 tygodni i przesyła dane do pobliskiego odbiornika bez konieczności zajmowania się myszami. Dostępne są skrypty do podstawowej analizy danych zarejestrowanych poziomów glukozy. Ta metoda, od chirurgii po analizę obliczeniową, jest opłacalna i potencjalnie bardzo przydatna w badaniach metabolicznych.
Wprowadzenie
Cukrzyca (DM) jest wyniszczającą chorobą charakteryzującą się wysokim poziomem glukozy we krwi. Cukrzyca typu 1 może być wynikiem ataku autoimmunologicznego na komórki beta trzustki produkujące insulinę. Z drugiej strony cukrzyca typu 2 i cukrzyca ciążowa charakteryzują się niezdolnością komórek beta do wydzielania wystarczającej ilości insuliny w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy1. Mysz jest powszechnym organizmem modelowym używanym do badania DM, ponieważ ma podobną fizjologię, a jej normalny poziom glukozy jest zbliżony do ludzkiego. Co więcej, określone szczepy myszy mogą rozwinąć cukrzycę z powodu mutacji w kluczowych szlakach sygnałowych lub po ekspozycji na określone diety, co umożliwia modelowanie choroby2,3,4.
Poziom glukozy we krwi jest zwykle mierzony u myszy za pomocą glukometrów przeznaczonych dla pacjentów, poprzez pobranie małej kropli krwi (1-2 μL) z czubka ogona myszy. Ta metoda powoduje stres i wymaga posługiwania się myszką, co wpływa na poziom glukozy i uniemożliwia pomiar poziomu glukozy we krwi u swobodnie zachowujących się myszy lub gdy badacz nie jest w pobliżu5. Krwawienie u myszy może powodować stres u pobliskich myszy, szczególnie u myszy z tej samej klatki, których glikemia nie została jeszcze zmierzona, wpływając w ten sposób na wyniki. Myszy reagują różnie w zależności od przewodnika, a osoba mierząca poziom glukozy może wpływać na poziom glukozy u myszy. Pułapki te wymagają starannego projektowania eksperymentów i leżą u podstaw pewnych niespójności między eksperymentami.
Możliwe jest zmierzenie glukozy u swobodnie poruszających się myszy bez krwawienia poprzez wszczepienie czujników glukozy do łuku aorty myszy za pomocą najnowocześniejszej telemetrii6. Uzyskane pomiary są bardzo dobre i mogą być utrzymywane przez długi czas, ale wszczepienie tych czujników jest trudne, a system telemetryczny jest drogi, co prowadzi do umiarkowanego przyjęcia tej metodologii i braku jej przyjęcia w niewyspecjalizowanych laboratoriach. Podskórne lub inne czujniki glukozy, które są dostosowane do wymiarów myszy i ich fizjologii, zostały opracowane w ostatnich latach, ale ponownie wymagają one wysoko wykwalifikowanych ekspertów i w niektórych przypadkach są kosztowne6,7,8,9,10.
Komercyjne ciągłe monitory glikemii (CGM), które zostały pierwotnie opracowane do monitorowania poziomu glukozy u pacjentów z DM, oferują inną opcję pomiaru glukozy u swobodnie poruszających się myszy, z niższymi kosztami i wymaganiami technicznymi niż wszczepione sondy. Takie sondy były używane w badaniach podstawowych przez kilka laboratoriów5,11,12,13,14,15 w tym nasi koledzy, którzy korzystali z tego protokołu16. Urządzenia te zazwyczaj zawierają czujnik, urządzenie montażowe, odbiornik i aplikację. Czujnik posiada kaniulę prowadzącą glukosensor enzymatyczny, taśmę klejącą, źródło energii, pamięć krótkotrwałą oraz moduł komunikacji bezprzewodowej, który przechowuje i wysyła dane do odbiornika. Odbiornik może pokazywać aktualny poziom glukozy i wysyłać dane na serwer; Ten odbiornik może być telefonem komórkowym. Aplikacja dostarcza pacjentowi i zespołowi opieki medycznej danych na temat glikemii pacjenta. U pacjentów czujnik można łatwo zamocować za pomocą urządzenia montażowego. Kaniulę wprowadza się podskórnie poprzez dociśnięcie urządzenia montażowego do skóry, a czujnik pozostaje na miejscu za pomocą taśmy klejącej.
To jest szczegółowy protokół adaptacji komercyjnego urządzenia CGM do pomiaru poziomu glukozy u myszy. Ten protokół opisuje, jak chirurgicznie włożyć czujnik glukozy i przymocować go do myszy. Dostępne są skrypty do podstawowej analizy danych i wizualizacji danych. Podano potencjalne pułapki, rozwiązywanie problemów i przykłady standardowych wyników. Poniższy protokół jest specyficzny dla określonego CGM, ale można go łatwo dostosować do innych typów komercyjnych CGM, gdy staną się dostępne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Hebrajskiego.
UWAGA: Wszystkie narzędzia muszą być wysterylizowane, a manipulacje z kaniulą należy przeprowadzać z zachowaniem techniki sterylnej. Poniższy protokół został zoptymalizowany dla konkretnego systemu CGM. Protokół ten można dostosować do innych systemów CGM.
1. Podanie leków przeciwbólowych przed zabiegiem
- Podaj 5% dekstrozę i 0,45% sól fizjologiczną wraz z meloksykamem w dawce 5 mg/kg masy ciała podskórnie.
2. Podanie znieczulenia
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej, szczelnie zamykając pokrywę. Ustaw indukcję znieczulenia w komorze na 3% isofluranu przy przepływie 500 mL/min.
- Gdy mysz przestanie reagować, wyjmij ją z komory i załóż maskę nosową. Potwierdź poziom znieczulenia, wykonując ucisk między palcami. W przypadku myszy o masie 30 g ustaw stężenie na 1%-1,5% isofluranu i przepływ na 100 mL/min.
- Nałóż maść okulistyczną do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Przygotowanie sensora
- Zamocuj czujnik w urządzeniu montażowym tak, aby odsłonić stronę z taśmą i kaniulą (Rysunek 1A). Zachowaj ostrożność, ponieważ igła jest włożona do kaniuli i pozostaje odsłonięta.
- Wykonaj dwa szwy pointyżowe 5-0 na taśmie po obu stronach kaniuli (Rysunek 1A).
4. Usuwanie owłosienia i dezynfekcja
- Wygolić obszar o wielkości około 4 cm x 4 cm w linii środkowej na grzbiecie myszy.
- Nałożyć krem do depilacji na wygolony obszar, aby zapewnić całkowite usunięcie włosów.
- Przetrzeć skórę i zdezynfekować ją za pomocą roztworu antyseptycznego zawierającego 2% glukonianu chlorheksydyny i 70% alkoholu izopropylowego.
5. Przygotowanie skóry grzbietowej
- Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj nacięcie o długości 2 mm w centrum ogolonego obszaru nad kręgosłupem (Rysunek 1B).
- Krótko wprowadź małą pęsetę z tępą krawędzią pod skórę, aby utworzyć niewielką kieszonkę podskórną, co umożliwi łatwe wprowadzenie kaniuli do kieszonki podskórnej (Rysunek 1B).
- Przeciągnij szew z kroku 3.2 przez skórę po obu stronach nacięcia (Rysunek 1C).
6. Wprowadzenie czujnika
- Całkowicie wyjmij czujnik z urządzenia montażowego (kaniula zostaje wysunięta z igły) i przytrzymaj go pęsetą, aby zapobiec sklejaniu się otaczającej go taśmy.
- Ostrożnie wprowadź kaniulę do podskórnej kieszeni.
- Pociągnij za szwy po obu stronach, a następnie zaciśnij i zawiąż je, aby stabilnie przymocować czujnik, co zapobiegnie wysunięciu się kaniuli z podskórnej kieszeni po tym, jak taśma przylepna z czasem straci swoje właściwości.
7. Mocowanie i szycie sensora
- Mocno przymocuj czujnik do pleców, zawiązując wewnętrzne szwy i używając taśmy przylepnej otaczającej czujnik.
- Wykonaj osiem przerywanych szwów wokół czujnika, mocując krawędź taśmy czujnika do skóry (Rysunek 1D).
8. Aktywacja czytnika
- Po wprowadzeniu sensora należy aktywować czytnik poprzez jego włączenie, naciśnięcie opcji Start New Sensor oraz przesunięcie sensora zgodnie z instrukcjami producenta.
- Pierwszy pomiar można wykonać dopiero kilka minut po zainstalowaniu systemu CGM. W przypadku tego systemu CGM pierwszy pomiar można przeprowadzić po 60 min.
9. Odczyt wyników
- Umieść czytnik blisko myszy (nie ma potrzeby dotykania jej). Wszystkie dane zapisane w czujniku zostaną przesłane do czytnika.
UWAGA: Różne urządzenia CGM mogą różnić się okresem możliwości zapisu danych historycznych. W przypadku tego systemu CGM pomiędzy dwoma odczytami można zapisać dane z maksymalnie 8 h.
10. Usuwanie czujnika
- Zanieś znieczulenie myszy (patrz sekcja 2).
- Przetnij ostrymi nożyczkami szwy łączące czujnik z grzbietem myszy.
- Usuń i przetnij szwy w miejscu nacięcia, delikatnie wyjmując czujnik.
- W razie potrzeby użyj pojedynczego szwu, aby zamknąć nacięcie na grzbiecie myszy.
11. Analiza danych
- Pobieranie danych: Pobierz dane zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta CGM.
UWAGA: Każdy system CGM ma inny format, który może być lub nie być łatwo dostępny dla użytkownika. Jest to istotny czynnik przy wyborze systemu CGM. - W celu przeprowadzenia analizy za pomocą dostarczonego oprogramowania sformatuj dane zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku readme w serwisie Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Rysunek 1: Mocowanie czujnika do myszy. (A) Dwie nici chirurgiczne oznaczone czerwonymi strzałkami są przeciągane przez taśmę czujnika po obu stronach kaniuli na dolnej stronie czujnika CGM, oznaczonej białą strzałką. (B) Ostrymi nożyczkami wykonuje się niewielkie nacięcie o długości 2 mm w centrum ogolonego obszaru wzdłuż kręgosłupa. Mały pęseta z tępym końcem jest krótko wprowadzana pod skórę w celu utworzenia niewielkiej kieszeni podskórnej, aby umożliwić podskórne wprowadzenie kaniuli. (C) Te same nici z punktu A są przeciągane podskórnie po każdej stronie nacięcia. Czerwone strzałki wskazują nici przymocowane do czujnika jak w punkcie A, niebieskie strzałki wskazują miejsce przejścia nici przez skórę na grzbiecie myszy, a czarna strzałka pokazuje nacięcie. (D) Po wprowadzeniu kaniuli wewnętrzne nici są zaciśnięte i zawiązane blisko nacięcia w celu zabezpieczenia CGM. Następnie czujnik zostaje przyszyty do skóry. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wynik chirurgiczny
Przedstawiono wyniki dla ośmiu myszy HSD:ICR (w wieku 8 tygodni) karmionych dietą wysokotłuszczową i wysokosacharozową (HFHS) przez 18 tygodni oraz pięciu szczupłych myszy HSD:ICR (w wieku 12 tygodni). Wykorzystane przez nas urządzenie przechowuje dane przez maksymalnie 8 h. Dostęp do lokalnego pomieszczenia dla zwierząt był ograniczony do godzin 07:00-19:00, co uniemożliwiało gromadzenie danych w późnych godzinach wieczornych, kiedy myszy są aktywne. W związku z tym, na 7 dni prze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten oferuje prostą, niedrogą metodę monitorowania poziomu glukozy u myszy, która nie wymaga trudnej mikrochirurgii i nie obejmuje krwawienia ani obchodzenia się z myszami. Metoda jest łatwa do wdrożenia w każdej placówce i nie powoduje śmiertelności, bólu ani nadmiernego dyskomfortu u myszy. Najważniejszym krokiem w protokole jest wprowadzenie kaniuli czujnika glukozy pod skórę myszy. Dodanie kilku szwów pozwala kaniuli pozostać na miejscu przez dłuższy czas. Czujniki są małe i mogą zostać zablokowane lub zgubio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Dvirowi Mintzowi DVM oraz personelowi weterynaryjnemu i hodowlanemu w obiekcie dla zwierząt, a także członkom naszej grupy, za owocne dyskusje. Badanie to było wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Nauki 1541/21 przyznany D.B.Z. D.B.Z. jest wydziałem Zuckerman STEM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2% Glukonian chlorheksydyny i 70% Alkohol izopropylowy | 3M | ID | |
| 5% dekstroza i 0,45% chlorek sodu do wstrzykiwań, uchwyt na igły USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo | FST | 12061-02 | |
| Nożyczki Extra Fine Bonn | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 czytnik | Abbott | ART27543 | |
| Czujnik FreeStyle Libre | |||
| FreeStyle Libre | ART36787 | ||
| Gaziki | Sion | medyczne PC912017 | |
| Graefe Szczypce | FST | 11052-10 | |
| Krem do depilacji | Veet | 3116523 | |
| Dieta wysokotłuszczowa i bogata w sacharozę | Envigo Teklad diety | TD.08811 | |
| Izofluran, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloksykam 5 mg/ml | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| Zestaw maszynki do strzyżenia MiniARCO | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Szew polipropylenowy 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Maść okulistyczna | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite System anestezjologiczny o niskim przepływie | Kent Scientific | SOMNO |
Bibliografia
- Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
- Rees, D. A., Alcolado, J. C. Animal models of diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 22 (4), 359-370 (2005).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351(2016).
- Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705(2021).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
- Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450(2021).
- Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
- Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
- Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
- Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
- Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241(2020).
- Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073(2010).
- Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538(2013).
- Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
- Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296(2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
