Method Article

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/64745

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja proteaz cysteinowych, znanych jako kaspazy, pozostaje ważnym procesem w wielu formach śmierci komórki. Kaspazy są kluczowymi inicjatorami i egzekutorami apoptozy, najlepiej zbadanej formy programowanej śmierci komórki. Apoptoza zachodzi podczas procesów rozwojowych i jest niezbędnym zdarzeniem w homeostazie tkanek. Piroptoza to inna forma śmierci komórki, która wykorzystuje kaspazy i jest krytycznym procesem aktywacji układu odpornościowego poprzez aktywację inflamasomu, co powoduje uwolnienie członków rodziny interleukiny-1 (IL-1). Aby ocenić aktywność kaspazy, można ocenić docelowe substraty. Jednak czułość może stanowić problem podczas badania pojedynczych komórek lub aktywności na niskim poziomie. Pokazujemy, w jaki sposób substrat fluorogenny może być używany z testem populacyjnym lub testem jednokomórkowym za pomocą cytometrii przepływowej. Przy odpowiedniej kontroli można wykorzystać różne sekwencje aminokwasów do określenia, które kaspazy są aktywne. Korzystając z tych testów, zidentyfikowano jednoczesną utratę inhibitorów białek apoptozy po stymulacji czynnikiem martwicy nowotworu (TNF), co przede wszystkim indukuje apoptozę w makrofagach, a nie inne formy śmierci komórki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaspazy biorą udział w kilku formach programowanej śmierci komórki. Apoptoza jest najlepiej zbadaną formą programowanej śmierci komórki i jest związana z aktywnością kaspazy1. Wszystkie kaspazy posiadają dużą i małą podjednostkę katalityczną. Kaspaza-1, kaspaza-4, kaspaza-5, kaspaza-9 i kaspaza-11 posiadają domenę aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD), a kaspaza-8 i kaspaza-10 zawierają domeny efektorowe śmierci (DED)2,3,4,5 (Tabela 1). Apoptoza może być zainicjowana przez dwie główne ścieżki: szlak zewnętrzny i szlak wewnętrzny. Zewnętrzny szlak apoptozy jest wyzwalany przez receptory śmierci, które są częścią nadrodziny czynnika martwicy nowotworu (TNFSF). Receptory śmierci posiadają domeny DD, ułatwiające aktywność kaspazy-86. Wewnętrzny szlak apoptotyczny obejmuje aktywację kaspazy-9 po utworzeniu apoptosomu, co wymaga uwolnienia cytochromu c i Apaf-17. Aktywacja kaspazy inicjującej, kaspazy-8 lub kaspazy-9, prowadzi do rozszczepienia, a następnie aktywacji kaspaz egzekucyjnych, którymi są kaspaza-3, kaspaza-6 i kaspaza-7. Zidentyfikowanie, że kaspazy kata są aktywne, wskazuje, że komórki przechodzą apoptozę, a ta aktywacja jest uważana za ważny czynnik w określaniu trybu śmierci komórki.

Aktywacja kaspazy jest również krytycznym momentem dla regulacji stanu zapalnego i indukcji alternatywnych form programowanej śmierci komórki. Na przykład aktywacja kaspazy-1 prowadzi do dojrzewania cytokin prozapalnych z rodziny interleukiny-18. Uwalnianie i aktywacja cytokin z tej rodziny, w szczególności IL-1β i IL-18, wynika z rozszczepienia gasderminy D i tworzenia się porów na błonie komórkowej9,10. Niewystarczająca naprawa błony porów gasderminy D może prowadzić do rodzaju śmierci komórki znanej jako pyroptoza11. Co więcej, aktywność kaspazy-8 powoduje zahamowanie niezależnej od kaspazy śmierci komórki, znanej jako nekroptoza12. Kinaza białkowa seryny/treoniny 1 oddziałująca z receptorem (RIPK1) jest jednym z krytycznych czynników nekroptozy i napędzania stanu zapalnego regulowanego przez NF-kB. Modele wykazały, że RIPK1 jest rozszczepiany przez kaspazę-8, co powoduje ograniczenie sygnalizacji NF-kB, apoptozę i nekroptozę13,14. Dlatego identyfikacja aktywności różnych kaspaz może pomóc w zrozumieniu wynikającego z tego stanu zapalnego i modalności śmierci komórki.

Niezależnie od funkcji kaspaz w regulowaniu modalności śmierci komórki, aktywność kaspazy może również regulować inne rodziny cytokin, takie jak interferon (IFN), w odpowiedzi na infekcję15,16. Ponadto kaspazy są zaangażowane w funkcje niezwiązane ze śmiercią komórki, w tym decyzje o losie komórki, naprawę i regenerację tkanek, nowotworzenie poprzez naprawę DNA i funkcję synaps neuronalnych. Uważa się, że aktywność kaspaz w tych nieśmiertelnych rolach jest ograniczona przez lokalizację komórkową i ilość kaspaz. W związku z tym ilościowe określenie poziomu aktywności kaspazy może dobrze określić, czy komórka przechodzi śmierć komórkową, czy też kaspaza odgrywa rolę w funkcji niezwiązanej ze śmiercią komórki4,17,18.

Aktywność kaspazy może być oceniana wieloma metodami. Western blot dla rozszczepionych kaspaz i ich substratów został użyty jako wskaźnik aktywności, ale te testy są w najlepszym razie jakościowe. Aby określić, czy aktywność kaspazy jest związana ze śmiercią komórki, idealny jest pomiar ilościowy. Ponieważ kaspazy rozszczepiają substraty w miejscu rozpoznania składającym się z czterech aminokwasów, opracowano metody kolorymetryczne, luminescencyjne lub fluorometryczne. Wydaje się jednak, że kaspazy mają plastyczność w rozpoznawaniu substratów19,20. Sekwencja rozpoznawania nie jest związana z domenami białkowymi (Tabela 1). Sekwencja tetrapeptydowa DEVD może być jednak używana do wykrywania aktywności kaspazy-3 i kaspazy-720,21.

Mimetyki Smac to związki ukierunkowane na inhibitory białek apoptozy (IAP). Zastosowanie mimetyki Smac w podzbiorze komórek nowotworowych powoduje, że komórki stają się wrażliwe na śmierć komórkową wywołaną przez TNF22. W pierwotnych makrofagach mimetyki Smac powodują śmierć komórek bez egzogennego dodatku TNF23,24. Utrata cIAP1 przez degradację wywołaną mimetykiem Smac powoduje produkcję TNF. Jeśli zostanie wykryta aktywność kaspazy, oznacza to, że komórki nie umarły w wyniku nekroptozy, ale w sposób apoptozyczny. W tej metodzie wykrywanie rozszczepionego substratu DEVD służy do identyfikacji aktywności kaspazy-3/kaspazy-7. Dalsze eksperymenty mające na celu potwierdzenie apoptotycznej śmierci komórek zostały opublikowane wcześniej24.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi komitetu etyki zwierząt Uniwersytetu w Zurychu (#ZH149/19). Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57Bl/6J w wieku 8-16 tygodni, hodowane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF). Nienaruszone kości mogą być przechowywane na lodzie w sterylnym buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) z 2% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Szpik kostny pobrano z kości udowej i piszczelowej myszy 25 w dniu różnicowania. Obie metody oceny aktywności kaspazy mogą być stosowane do innych typów komórek, w tym zarówno pierwotnych, jak i transformowanych.

1. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM)

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze z przepływem laminarnym do hodowli tkanek i stosuj sterylne techniki aseptyki.

  1. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą o sile 21 g.
  2. Dodaj 5 ml HBSS + 2% FBS do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy weź wyciętą kość udową i włóż igłę do otworu kości udowej. Trzymając kość udową w HBSS + 2% FBS, wypłucz szpik kostny, aż kość stanie się biała. W ten sam sposób przepłucz kość piszczelową. Kontynuuj przepłukiwanie roztworu, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  4. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Postukaj w rurkę, aby delikatnie zawiesić granulkę. Dodać 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (patrz tabela materiałów) i delikatnie wymieszać pipetą P1,000. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  6. Dodać 10 ml HBSS + 2% FBS i odwirować przy 200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki hodowlanej makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).
    UWAGA: Pożywka hodowlana BMDM składa się z DMEM o niskiej zawartości glukozy z dodatkiem 10% FBS, 20 ng/ml M-CSF, penicyliny (50 U/ml) i streptomycyny (50 μg/ml) (patrz tabela materiałów). Alternatywnie można zastąpić M-CSF 20% pożywką kondycjonowaną L929.
  8. Dodać 15 ml pożywki BMDM do dwóch 15-centymetrowych szalek Petriego. Dodać 5 ml roztworu jednokomórkowego do każdej płytki.
    UWAGA: Nie należy używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych. Płytki poddane działaniu kultur tkankowych ograniczają różnicowanie.
  9. Umieść naczynia w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 6 dni.
    UWAGA: BMDM można zbierać po 5-7 dniach. Dłuższe czasy inkubacji w celu różnicowania prowadzą do zwiększonej ekspresji białek antyapoptotycznych26.

2. Zbieranie, siew i obróbka komórek

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze z przepływem laminarnym do hodowli tkanek i stosuj sterylne techniki aseptyki. W pełni zróżnicowane makrofagi przylegają do płytki, co pozwala na łatwą separację, podczas gdy pływające komórki można wyrzucić. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) może być stosowana z lub bez Ca2+ i Mg2+.

  1. Po 6 dniach inkubacji usunąć pływające komórki i pożywkę z płytki za pomocą aspiratora.
  2. Dodaj 5 ml PBS do każdej płytki o średnicy 15 cm. Wyjąć PBS z płytki za pomocą aspiratora.
  3. Dodaj 2 ml trypsyny (patrz Tabela Materiałów) do każdej płytki. Inkubować płytkę do momentu, gdy delikatne stukanie w płytkę spowoduje usunięcie komórek. Weź 5 ml pożywki hodowlanej BMDM i zbierz komórki z płytki.
    1. Przełóż na drugą 15 cm płytkę i zbierz komórki z talerza. Usunąć zawiesinę komórek z płytki do probówki o pojemności 50 ml. Weź dodatkowe 5 ml pożywki hodowlanej BMDM i umyj obie płytki, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. Umieścić zawiesinę komórek w tej samej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i policzyć za pomocą hemytometru, stosując rozcieńczenie 1:1 z błękitem trypanowym.
    UWAGA: Automatyczne liczniki komórek mogą być również używane po skalibrowaniu pod kątem wielkości makrofagów.
  5. Wysiewaj makrofagi o gęstości 1 x 106 komórek/ml. BMDM wysiane w 6-dołkowej płytce w ilości 2 x 106 komórek/basenik dostarczają około 2 mg/ml białka całkowitego. Pozwól komórkom przylegać do płytki przez co najmniej 6 godzin przed zabiegiem.
    UWAGA: W przypadku innych typów ogniw należy określić optymalne stężenie.
  6. Potraktuj makrofagi mimetykiem Smac (związek A, patrz tabela materiałów)22 przy 250 nM i 500 nM przez 16 h.
    UWAGA: Uwzględnij kontrolę pozytywną w celu wywołania apoptozy i rozszczepienia kaspazy-3, aby upewnić się, że test działa. Częstymi induktorami apoptozy są staurosporyna i etopozyd. Aby wiele linii komórkowych uległo apoptozie, wystarczy 0,1-10 μM na 16 godzin stymulacji.

3. Przygotowanie lizatów komórkowych z leczonych komórek

UWAGA: Ten krok musi być wykonany na lodzie, a odczynniki i materiały muszą być wstępnie schłodzone.

  1. Przenieść płytki zawierające leczone komórki na lód. Zebrać pożywkę z hodowli komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę i umieścić probówkę na lodzie. Pozwala to na zebranie komórek, które oderwały się od płytki.
  2. Dodaj 1 ml zimnego PBS do płytki do hodowli komórkowej w celu przemycia komórek i odessania całego PBS. Dodaj 100 μl trypsyny do komórek (jeśli pracujesz z naczyniem 6-dołkowym). Poczekaj, aż trypsyna podniesie komórki z płytki i zbierz je do probówki o pojemności 1,5 ml. Użyj 1 ml zimnego PBS, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
    UWAGA: W przypadku pracy z komórkami zawiesinowymi delikatnie przenieś pożywkę i komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu do lizy DISC (150 mM chlorek sodu, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glicerol, 20 mM Tris, pH 7,5, patrz tabela materiałów).
  4. Próbki należy inkubować na lodzie przez 20 minut.
  5. Odwirować lizaty przy ~12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać granulki nierozpuszczalnej frakcji.
  6. Przenieść 25 μl lizatu na białą, płaskodenną 96-dołkową płytkę do oznaczania aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 (etap 5).
    UWAGA: Nie naruszaj pelletu. Jest to nierozpuszczalna frakcja lizatu komórkowego.
  7. Przenieść 10 μl pozostałego lizatu na przezroczystą płaskodenną 96-dołkową płytkę do oznaczania kwasem bicinchoninowym (BCA) (etap 4). Zostanie to wykorzystane do normalizacji próbek.
  8. Trzymaj obie płytki na lodzie do dalszej obróbki.
    UWAGA: Na tym etapie płytki można uszczelnić samoprzylepną pokrywą i przechowywać w temperaturze -20 °C przez około 4 tygodnie.

4. Kwantyfikacja białka za pomocą testu BCA

UWAGA: Inne odczynniki lub testy mogą być użyte do ilościowego określenia ilości białka w każdej próbce. W teście populacyjnym próbki można porównać, normalizując ilość białka użytego w teście.

  1. Przygotować wzorcowe stężenia białka od 0 μg/ml do 2 000 μg/ml (0 μg/ml, 25 μg/ml, 125 μg/mL, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/mL, 100 μg/ml, 1,500 μg/mL, 2,000 μg/ml) z albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Przygotować ślepe próby tylko z buforem do lizy.
  2. Dodać po 10 μl każdego wzorca do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki, o których mowa w kroku 3.7.
  3. Zmieszać odczynnik BCA 1 z odczynnikiem BCA 2 w stosunku 50:1 (patrz tabela materiałów). Dodać 200 μl zmieszanego odczynnika BCA do każdej próbki i wzorca.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Zmierzyć absorbancję przy 562 nm na przyrządzie fluorometrycznym i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej.

5. Populacyjny test aktywności kaspazy-3/kaspazy-7

UWAGA: Nie pozwól, aby lizaty komórkowe w płytce leżały na lodzie dłużej niż 3 godziny. Jeśli aktywność kaspazy jest obecna, wzrasta ona z czasem, mimo że próbka znajduje się na lodzie. Jeśli próbki zostały zamrożone, rozmrozić je na lodzie i przystąpić do działania natychmiast po rozmrożeniu lizatów.

  1. Uruchom przyrząd fluorometryczny (patrz Tabela Materiałów) i rozgrzej maszynę do 37 °C. Przygotuj skrypt zgodnie z opisem:
    1. Wykonuj indywidualne odczyty co minutę przez 40 minut w celu określenia kinetyki reakcji.
    2. Ustaw wzbudzenie na 360 nm, a emisję na 465 nm. Wystarczy dziesięć błysków na studzienkę.
  2. Przygotować kontrolę pozytywną rekombinowanej kaspazy-3 (patrz tabela materiałów). Zmieszać 1 j. rekombinowanego enzymu kaspazy-3 w 50 μl buforu do lizy (probówka 1). Dodać 25 μl buforu do lizy do dodatkowych trzech probówek. Przenieść 25 μl z probówki 1 do probówki 2. Wymieszać pipetując.
    1. Powtórz dla rurki 3 i rurki 4. Probówka 5 będzie zawierała tylko 50 μl buforu do lizy. Dodać 25 μl każdego wzorca do białej, płaskodennej 96-dołkowej płytki do oznaczania aktywności kaspazy-3, o której mowa w kroku 3.6.
  3. Przygotować główną mieszaninę reakcyjną do oznaczania aktywności kaspazy na lodzie. W jednej reakcji wymieszaj 50 μl 2x buforu rozszczepienia kaspazy (0,2 M HEPES pH 7,5; 20% sacharozy lub PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL 1 mM DEVD-AMC (substrat tetrapeptydu kaspazy-3), 2 μL 500 mM DTT i 18 μl wody dejonizowanej (patrz Tabela materiałów).
  4. Dodać 75 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej próbki i wzorca, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100 μl.
  5. Natychmiast zmierz fluorescencję za pomocą przyrządu fluorometrycznego ustawionego w kroku 5.1.
  6. Dla każdego pomiaru fluorescencyjnego należy odjąć odczyt fluorescencji dla ślepej próby (tylko bufor do lizy) od fluorescencji próbki. Znormalizuj odczyt, dzieląc go przez stężenie białka w próbce (obliczone w kroku 4.5)27:
    figure-protocol-1
  7. Oblicz szybkość aktywności kaspazy, określając nachylenie znormalizowanej fluorescencji na osi y i czas na osi x.

6. Test jednokomórkowy (analiza cytometrii przepływowej) dla aktywności kaspazy-3/kaspazy-7

  1. Wysiewać komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.
  2. Zbierz komórki do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml. W przypadku pracy z komórkami przylegającymi należy zebrać pożywkę do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml zimnego PBS do płytki do hodowli komórkowej i zebrać PBS do probówki o pojemności 5 ml. Dodaj trypsynę do komórek (100 μl, jeśli pracujesz z naczyniami 6-dołkowymi). Poczekaj, aż trypsyna oderwie komórki od płytki i zbierz je do probówki o pojemności 5 ml. Użyj 1 ml zimnego PBS, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
    UWAGA: W przypadku pracy z komórkami zawiesinowymi delikatnie przenieś pożywkę i komórki do probówki o pojemności 5 ml.
  3. Odwirować próbki o stężeniu 300 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego.
  4. Przygotuj mieszankę barwiącą. Optymalne stężenie barwienia to 1 x 106-2 x 106 komórek w 50 μL. Rozcieńczyć substrat fluorogenny zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów, cytometria przepływowa). Pobrać 1 μl podłoża podstawowego i rozcieńczyć w 150 μl PBS. Dodać 50 μl na próbkę.
  5. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, chroniąc je przed światłem, mieszając co 15 minut.
  6. Za pomocą cytometru przepływowego użytego w tym badaniu należy użyć czerwonego lasera o długości fali 640 nm, a następnie o długości fali 675/25 nm. Najpierw uruchom niebarwioną próbkę kontrolną i uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń z żądanej populacji. Wyklucz zanieczyszczenia za pomocą bramki (P1) na wykresie punktowym FSC-A i SSC-A.
    1. Użyj histogramu przedstawiającego zdarzenia w bramce P1 i detekcji substratu kaspazy (oś y), aby określić medianę intensywności fluorescencji (MFI).
      UWAGA: Opisany w tej metodzie substrat kaspazy wymaga wzbudzenia przy długości fali 590 nm i emisji przy długości fali 628 nm.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne makrofagi myszy były różnicowane przez 6 dni. Po 6 dniach komórki zostały zebrane, policzone i wysiane. Zastosowano następujące zabiegi: brak leczenia i mimetyk Smac (związek A)22 przy 250 nM i 500 nM przez 16 godzin (Rysunek 1). Eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, aby umożliwić ocenę aktywacji kaspazy-3/kaspazy-7 za pomocą testu populacyjnego lub analizy pojedynczej komórki przy użyciu cytometrii przepływowej.

Stężenie białka w lizatach komórkowych zostało określone ilościowo za pomocą testu BCA (Tabela uzupełniająca 1). Jest to konieczne, aby zapewnić, że ilość białka użytego w teście aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 jest taka sama we wszystkich próbkach. W tym teście populacyjnym dane można przedstawić na dwa sposoby. Pierwszym z nich jest pokazanie kinetyki poprzez wykreślenie skorygowanej fluorescencji (oś y) w funkcji czasu (oś x) (Rysunek 2A). Alternatywnie nachylenie można obliczyć, aby bezpośrednio porównać próbki (Rysunek 2B). Wzrost nachylenia po leczeniu mimetycznym Smac 500 nM nie był znaczący w oparciu o zwykłą jednokierunkową ANOVA z wieloma porównaniami (test wielokrotnych porównań Dunnetta28).

Do analizy aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 za pomocą cytometrii przepływowej, pobrano komórki i supernatant. Jako kontrolę ujemną zastosowano niebarwione komórki lub fluorescencję minus jeden, a także komórki nieleczone. Histogram komórek zebranych za pomocą cytometrii przepływowej wykazał zmianę fluorescencji dla komórek traktowanych mimetykami Smac w porównaniu z komórkami nieleczonymi (Figura 2C). Dane mogą być przedstawione jako mediana intensywności fluorescencji (Rysunek 2D) lub jako zmiana krotności w stosunku do nieleczonych komórek (Rysunek 2E).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy badania. (A) Kości udowe i piszczelowe zostały wycięte od myszy C57Bl/6. Kości przepłukano i różnicowano w 20 ng/mL M-CSF przez 6 dni. (B) W 6 dniu makrofagi zostały zebrane i ponownie wysiane w celu leczenia. Jeden zestaw komórek pobrano pod kątem lizatów i oceniono pod kątem aktywności fluorogenicznej, podczas gdy drugi zestaw zebrano, inkubowano z substratem fluorogennym i oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test kinetyczny aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 i rozszczepienia substratu za pomocą cytometrii przepływowej. (A,B) Reprezentatywne dane testu kinetycznego dla aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 (C-E) i rozszczepienia substratu za pomocą cytometrii przepływowej. Makrofagi traktowano dwoma stężeniami mimetyku Smac (związek A; 250 nM i 500 nM) przez 16 godzin. (A) Wykrywanie rozszczepionego substratu DEVD AFC w czasie. Dane znormalizowano do stężenia białka w próbce. (B) Szybkość rozszczepienia (nachylenia) DEVD AFC dla każdej próbki została znormalizowana do nieleczonego nachylenia i przedstawiona jako zmiana fałdu nad nieleczonymi komórkami. (C) Histogramy cytometrii przepływowej komórek inkubowanych z substratem kaspazy-3. (D,E) Porównanie MIF i zmiana krotności MIF w porównaniu z próbą niepoddawaną działaniu substancji. Każdy punkt danych reprezentuje niezależną próbkę; podawana jest średnia ± błąd standardowy średniej; *p < 0,05 przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA i wielu testów porównawczych (test wielokrotnych porównań Dunnetta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:
Kaspazagatunek Sekwencja substratówDomeny białkowe
Kaspaza-1hs, mm(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-2hs, mmDEXD (Sieć Demokratyczna)CARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-4Hs(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-5Hs(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-9hs, mm(I/V/L)E(H/T)DCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-11Mm(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-12MmATAD (Sieć PrzeciwpowodziCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-8hs, mm(I/V/L)E(H/T)DDED, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-10Hs(I/V/L)E(H/T)DDED, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-3hs, mmDEXD (Sieć Demokratyczna)duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-6hs, mm(I/V/L)E(H/T)Dduża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-7hs, mmDEXD (Sieć Demokratyczna)duża domena, mała domena katalityczna
kaspaza-14HS, mm(W/L)EHDduża domena, mała domena katalityczna
kartadomena aktywacji i rekrutacji kaspazy
Deddomena efektora śmierci
Hshomo sapien
Mmmus musculus

Tabela 1: Specyficzność substratu i domeny białkowe kaspaz. Tabela została zaadaptowana z McStay et al.20; Shalini et al.3; oraz van Opdenbosch i Lamkanfi4.

Tabela uzupełniająca 1: Analiza kinetyczna DEVD. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie substrat fluorogenny jest używany w teście populacyjnym lub analizie pojedynczej komórki w celu pomiaru aktywności kaspazy-3 / kaspazy-7. Obie metody mierzą aktywność kaspazy w sposób ilościowy w oparciu o rozszczepienie substratu. Jedną z zalet jest możliwość wykorzystania tych metod do wielu próbek. Dzięki tym metodom aktywność kaspazy-3 / kaspazy-7 jest wykrywana w pierwotnych makrofagach traktowanych mimetykami Smac.

Krytycznym aspektem populacyjnego testu fluorometrycznego jest czas od lizy do odczytu fluorescencji. Próbki muszą być przechowywane na lodzie przez cały czas trwania procedury, w szczególności przed "odczytaniem" testu. Zapobiega to przedwczesnemu rozszczepianiu i fluorescencji podłoża. Korzystając z testu populacyjnego, może być wymagana mniejsza optymalizacja. Ilość białka użytego w teście jest znormalizowana, co pozwala na bezpośrednie porównanie próbek. Jednym zastrzeżeniem jest to, że w późnym stadium apoptotycznej śmierci komórki całkowita ilość białka jest zmniejszona; W związku z tym wykrycie aktywności kaspazy może nie być możliwe. Aby obejść ten problem, zaleca się stosowanie różnych kinetyki lub różnych dawek leczniczych. Ponadto do dokładnej oceny szybkości aktywności kaspazy można użyć innego oprogramowania oprócz oprogramowania opisanego w tej metodzie.

W przypadku testu cytometrii przepływowej wymagana jest wystarczająca liczba zdarzeń lub komórek, aby pewnie zabramować populacje. Ponadto może być wymagana większa optymalizacja w teście opartym na przepływie, aby osiągnąć optymalny stosunek substratu do liczby komórek. Jednak w przypadku cytometrii przepływowej metoda ta nadaje się do pomiaru dodatkowych parametrów, takich jak markery powierzchni komórki do identyfikacji typu komórki.

Zarówno metody populacyjne, jak i jednokomórkowe mogą być stosowane do innych kaspaz. Należy jednak pamiętać, że sekwencja rozpoznawania jest mniej dyskryminowana w przypadku innych kaspaz. W związku z tym należy stosować inne metody aktywności kaspazy. Obejmuje to hamowanie aktywności kaspazy, CRISPR lub knock-down określonych kaspaz oraz western blot w celu wykrycia rozszczepienia znanych substratów.

Jedną z alternatywnych metod wykrywania aktywności kaspazy jest obrazowanie poklatkowe. Ten sam przepuszczalny substrat kaspazy może być używany wraz z innymi markerami żywotności, takimi jak aneksyna V, w celu uzyskania informacji na temat kinetyki śmierci komórki. Obrazowanie pozwoliłoby również oddzielić aktywność kaspazy od przeżycia komórki, co pozwoliłoby na wykrycie subletalnych ilości aktywności kaspazy w populacji komórek. Nieśmiertelne funkcje kaspazy-3 / kaspazy-7 są związane z regulacją przeciwwirusową we wrodzonych komórkach odpornościowych29, w szczególności z aktywacją IFN typu I poprzez uwalnianie mitochondrialnego DNA15,16. W związku z tym te testy do pomiaru aktywności kaspazy mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji różnych sposobów śmierci komórki i mogą być przydatne w ocenie funkcji niezwiązanych ze śmiercią komórki.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.W.W. jest wspierany przez grant Clöetta Medical Research Fellow, S.R. jest wspierany przez CanDoc UZH Forschungskredit, a J.T. jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 ml probówki do mikrofugeSarstedt72.706.400
15 cm płytki PetriegoSarstedt82.1184.500
Wytrząsarka do inkubatora 37 stopniWytrząsarka IKA KS 4000i97014-816dystrybuowana przez VWR
6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowychSarstedt83.392
96-dołkowe płaskie dno, biały polistyren, niesterylnySigmaCLS3600
96-dołkowa płaska płytkaSarstedt82.1581
Ac-DEVD-AFCEnzo Life SciencesALX-260-032-M005Podłoże kaspazy-3
BD FortessaBDzadziała dowolny cytometr przepływowy z odpowiednim detektorem wzbudzenia i emisji
b-glicerolfosforanSigmaG9422-10G
kaspaza-3 rekombinant Enzo Life SciencesALX-201-059-U025
CHAPSSigma1.11662
DMEM, niska glukoza, pirogronianThermoscientific31885023
DMSOSigmaD8418-250ML
EDTASigma03685-1KG
EGTASigma324626-25GM
EtopozydMedChem ExpressHY-13629
FBSThermoscientific26140
Probówki do cytometrii przepływowejFalcon352008
FlowjoFlowjoWymagana jest licencja, ale wystarczy dowolny program, który może analizować pliki .fcs
GlycerolSigmaG5516-500ML
HEPESSigmaH4034
Zestaw do oznaczania kaspazy Magic Red-3/7; cytometria przepływowa lub obrazowanieImmunochemistry Technologies935
M-CSFebioscience14-8983-80obecnie spółka zależna Thermoscientific
M-PlexTecankażdy czytnik fluorometryczny będzie współpracował z odpowiednimi detektorami wzbudzenia i emisji
NaClRoth3957.1
PBS pH 7.4Thermoscientific10010023
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)Thermoscientific10378016
Zestaw do oznaczania białek BCA PierceThermoFisher Scientific23225oznaczania stężenia białka
inhibitory proteazyBiomolP9070.100
Mimetyk Smac, Związek ATetralogicsznany również jako 12911; struktura pokazana na dodatkowych rysunkach Vince'a et al., Komórka 2007
Fluorek soduSigmaS7920-100G
orthovanadat soduSigmaS6508-10G
pirofosforan soduSigmaP8010-500G
StaurosporineMedChem ExpressHY-15141
sacharozaSigma1.07687
Tris BaseSigmaT1503-1KG
Triton X100SigmaT8787-50ML
TrypLEThermoscientificA1285901W protokole jest wymieniony jako Trypsyna
Test do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
  2. Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. Caspases: Killer proteases. Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).
  3. Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
  4. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  5. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  6. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  7. Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
  8. Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
  9. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  10. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  11. Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
  12. Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
  13. Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
  14. Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
  15. White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
  16. Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
  17. Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E. Caspase-dependent non-apoptotic processes in development. Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).
  18. Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
  19. Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
  20. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
  21. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  22. Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
  23. McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
  24. Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
  25. Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631(2015).
  26. Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
  27. Caspase activity assay buffer. Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).
  28. Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
  29. Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caspase ActivityFluorometric AssayFlow CytometryApoptosis DetectionCell Death AssayCaspase 3 7 ActivityBone Marrow MacrophagesFluorogenic SubstrateProtein QuantificationLive Cell Microscopy

Related Articles