Artykuł metodologiczny

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64745

⸱

24 marca 2023

 ,  , 
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Streszczenie

Aktywacja proteaz cysteinowych, znanych jako kaspazy, pozostaje ważnym procesem w wielu formach śmierci komórki. Kaspazy są kluczowymi inicjatorami i egzekutorami apoptozy, najlepiej zbadanej formy programowanej śmierci komórki. Apoptoza zachodzi podczas procesów rozwojowych i jest niezbędnym zdarzeniem w homeostazie tkanek. Piroptoza to inna forma śmierci komórki, która wykorzystuje kaspazy i jest krytycznym procesem aktywacji układu odpornościowego poprzez aktywację inflamasomu, co powoduje uwolnienie członków rodziny interleukiny-1 (IL-1). Aby ocenić aktywność kaspazy, można ocenić docelowe substraty. Jednak czułość może stanowić problem podczas badania pojedynczych komórek lub aktywności na niskim poziomie. Pokazujemy, w jaki sposób substrat fluorogenny może być używany z testem populacyjnym lub testem jednokomórkowym za pomocą cytometrii przepływowej. Przy odpowiedniej kontroli można wykorzystać różne sekwencje aminokwasów do określenia, które kaspazy są aktywne. Korzystając z tych testów, zidentyfikowano jednoczesną utratę inhibitorów białek apoptozy po stymulacji czynnikiem martwicy nowotworu (TNF), co przede wszystkim indukuje apoptozę w makrofagach, a nie inne formy śmierci komórki.

Wprowadzenie

Kaspazy biorą udział w kilku formach programowanej śmierci komórki. Apoptoza jest najlepiej zbadaną formą programowanej śmierci komórki i jest związana z aktywnością kaspazy1. Wszystkie kaspazy posiadają dużą i małą podjednostkę katalityczną. Kaspaza-1, kaspaza-4, kaspaza-5, kaspaza-9 i kaspaza-11 posiadają domenę aktywacji i rekrutacji kaspazy (CARD), a kaspaza-8 i kaspaza-10 zawierają domeny efektorowe śmierci (DED)2,3,4,5 (Tabela 1). Apoptoza może być zainicjowana przez dwie główne ścieżki: szlak zewnętrzny i szlak wewnętrzny. Zewnętrzny szlak apoptozy jest wyzwalany przez receptory śmierci, które są częścią nadrodziny czynnika martwicy nowotworu (TNFSF). Receptory śmierci posiadają domeny DD, ułatwiające aktywność kaspazy-86. Wewnętrzny szlak apoptotyczny obejmuje aktywację kaspazy-9 po utworzeniu apoptosomu, co wymaga uwolnienia cytochromu c i Apaf-17. Aktywacja kaspazy inicjującej, kaspazy-8 lub kaspazy-9, prowadzi do rozszczepienia, a następnie aktywacji kaspaz egzekucyjnych, którymi są kaspaza-3, kaspaza-6 i kaspaza-7. Zidentyfikowanie, że kaspazy kata są aktywne, wskazuje, że komórki przechodzą apoptozę, a ta aktywacja jest uważana za ważny czynnik w określaniu trybu śmierci komórki.

Aktywacja kaspazy jest również krytycznym momentem dla regulacji stanu zapalnego i indukcji alternatywnych form programowanej śmierci komórki. Na przykład aktywacja kaspazy-1 prowadzi do dojrzewania cytokin prozapalnych z rodziny interleukiny-18. Uwalnianie i aktywacja cytokin z tej rodziny, w szczególności IL-1β i IL-18, wynika z rozszczepienia gasderminy D i tworzenia się porów na błonie komórkowej9,10. Niewystarczająca naprawa błony porów gasderminy D może prowadzić do rodzaju śmierci komórki znanej jako pyroptoza11. Co więcej, aktywność kaspazy-8 powoduje zahamowanie niezależnej od kaspazy śmierci komórki, znanej jako nekroptoza12. Kinaza białkowa seryny/treoniny 1 oddziałująca z receptorem (RIPK1) jest jednym z krytycznych czynników nekroptozy i napędzania stanu zapalnego regulowanego przez NF-kB. Modele wykazały, że RIPK1 jest rozszczepiany przez kaspazę-8, co powoduje ograniczenie sygnalizacji NF-kB, apoptozę i nekroptozę13,14. Dlatego identyfikacja aktywności różnych kaspaz może pomóc w zrozumieniu wynikającego z tego stanu zapalnego i modalności śmierci komórki.

Niezależnie od funkcji kaspaz w regulowaniu modalności śmierci komórki, aktywność kaspazy może również regulować inne rodziny cytokin, takie jak interferon (IFN), w odpowiedzi na infekcję15,16. Ponadto kaspazy są zaangażowane w funkcje niezwiązane ze śmiercią komórki, w tym decyzje o losie komórki, naprawę i regenerację tkanek, nowotworzenie poprzez naprawę DNA i funkcję synaps neuronalnych. Uważa się, że aktywność kaspaz w tych nieśmiertelnych rolach jest ograniczona przez lokalizację komórkową i ilość kaspaz. W związku z tym ilościowe określenie poziomu aktywności kaspazy może dobrze określić, czy komórka przechodzi śmierć komórkową, czy też kaspaza odgrywa rolę w funkcji niezwiązanej ze śmiercią komórki4,17,18.

Aktywność kaspazy może być oceniana wieloma metodami. Western blot dla rozszczepionych kaspaz i ich substratów został użyty jako wskaźnik aktywności, ale te testy są w najlepszym razie jakościowe. Aby określić, czy aktywność kaspazy jest związana ze śmiercią komórki, idealny jest pomiar ilościowy. Ponieważ kaspazy rozszczepiają substraty w miejscu rozpoznania składającym się z czterech aminokwasów, opracowano metody kolorymetryczne, luminescencyjne lub fluorometryczne. Wydaje się jednak, że kaspazy mają plastyczność w rozpoznawaniu substratów19,20. Sekwencja rozpoznawania nie jest związana z domenami białkowymi (Tabela 1). Sekwencja tetrapeptydowa DEVD może być jednak używana do wykrywania aktywności kaspazy-3 i kaspazy-720,21.

Mimetyki Smac to związki ukierunkowane na inhibitory białek apoptozy (IAP). Zastosowanie mimetyki Smac w podzbiorze komórek nowotworowych powoduje, że komórki stają się wrażliwe na śmierć komórkową wywołaną przez TNF22. W pierwotnych makrofagach mimetyki Smac powodują śmierć komórek bez egzogennego dodatku TNF23,24. Utrata cIAP1 przez degradację wywołaną mimetykiem Smac powoduje produkcję TNF. Jeśli zostanie wykryta aktywność kaspazy, oznacza to, że komórki nie umarły w wyniku nekroptozy, ale w sposób apoptozyczny. W tej metodzie wykrywanie rozszczepionego substratu DEVD służy do identyfikacji aktywności kaspazy-3/kaspazy-7. Dalsze eksperymenty mające na celu potwierdzenie apoptotycznej śmierci komórek zostały opublikowane wcześniej24.

Protokół

Niniejsza analiza została przeprowadzona za zgodą i zgodnie z wytycznymi komisji etyki badań na zwierzętach Uniwersytetu w Zurychu (#ZH149/19). W badaniu wykorzystano samce myszy C57Bl/6J w wieku od 8 do 16 tygodni, hodowane i utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF). Nieuszkodzone kości można przechowywać w lodzie w sterylnym roztworze soli Hanksa (HBSS) z dodatkiem 2% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Szpik kostny pobrano z kości udowej i piszczeli myszy25 w dniu rozpoczęcia różnicowania. Obie metody oceny aktywności kaspaz mogą być stosowane w przypadku innych typów komórek, w tym zarówno pierwotnych, jak i transformowanych.

1. Różnicowanie makrofagów pochodzących z szpiku kostnego (BMDMs)

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w laminarnym komorze z przepływem powietrza do hodowli tkanek, stosując sterylne techniki aseptyczne.

  1. Przygotować strzykawkę 1 mL z igłą 21 G.
  2. Do probówki 15 mL dodać 5 mL HBSS + 2% FBS.
  3. Używając sterylnej pęsety, pobrać wycięty kość udową i wprowadzić igłę do otworu kości. Trzymając kość w HBSS + 2% FBS, przepłukać szpik kostny, aż kość stanie się biała. W ten sam sposób przepłukać kość piszczelową. Kontynuować przepłukiwanie roztworem, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
  4. Odwirować zawiesinę pojedynczych komórek przy 200 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Usunąć nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego. Opukać probówkę, aby delikatnie resuspendować osad. Dodać 1 mL buforu do lizy erytrocytów (patrz Tabela materiałów) i delikatnie wymieszać pipetą P1,000. Inkubować w RT przez 1 min.
  6. Dodać 10 mL HBSS + 2% FBS i odwirować przy 200 x g przez 4 min w RT.
  7. Usunąć nadsącz i resuspendować w 10 mL pożywki hodowlanej dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).
    UWAGA: Pożywka hodowlana BMDM składa się z DMEM z niską zawartością glukozy z dodatkiem 10% FBS, 20 ng/ml M-CSF, penicyliny (50 U/mL) i streptomycyny (50 μg/mL) (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie, M-CSF można zastąpić 20% pożywką kondycjonowaną linią L929.
  8. Do dwóch szalek Petriego o średnicy 15 cm dodać po 15 mL pożywki hodowlanej BMDM. Do każdej szalki dodać 5 mL roztworu pojedynczych komórek.
    UWAGA: Nie należy używać płytek traktowanych do hodowli tkanek. Płytki traktowane do hodowli tkanek ograniczają różnicowanie.
  9. Umieścić szalki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, na 6 dni.
    ​UWAGA: BMDM można zebrać po 5–7 dniach. Dłuższy czas inkubacji w celu różnicowania prowadzi do zwiększonej ekspresji białek antyapoptotycznych26.

2. Zbieranie, wysiewanie i traktowanie komórek

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w laminarnym hucie do hodowli tkanek, stosując sterylne techniki aseptyczne. W pełni zróżnicowane makrofagi przylegają do płytki, co umożliwia ich łatwe oddzielenie, natomiast komórki pływające można usunąć. Do użycia można zastosować roztwór soli w soli fosforanowej (PBS) z dodatkiem lub bez dodatku Ca2+ i Mg2+.

  1. Po 6 dniach inkubacji usunąć z płytki pływające komórki oraz medium za pomocą aspiratora.
  2. Do każdej płytki o średnicy 15 cm dodaj 5 ml PBS. Usuń PBS z płytki za pomocą aspiratora.
  3. Dodać 2 ml trypsyny (patrz Tabela materiałów) do każdej płytki. Inkubować płytkę do momentu, gdy delikatne stuknięcie w płytkę spowoduje odczepienie się komórek. Odmierzyć 5 ml pożywki do hodowli BMDM i zebrać komórki z płytki.
    1. Przenieś zawartość na drugą płytkę 15 cm i zbierz komórki z płytki. Przenieś zawiesinę komórkową z płytki do probówki 50 ml. Pobierz dodatkowe 5 ml pożywki do hodowli BMDM i przemyj obie płytki, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. Umieść zawiesinę komórkową w tej samej probówce 50 ml.
  4. Pobrać 10 μL zawiesiny komórkowej, a następnie przeprowadzić zliczenie za pomocą hemacytometru w rozcieńczeniu 1:1 z błęknitem trypanu.
    UWAGA: Można również stosować automatyczne liczniki komórek, pod warunkiem ich skalibrowania pod kątem wielkości makrofagów.
  5. Wysiać makrofagi z gęstością 1 x 106 komórek/ml. BMDM wysiane w zagęszczeniu 2 x 106 liczba komórek/dołek w płytce 6-dołkowej zapewnia około 2 mg/ml całkowitego białka. Przed rozpoczęciem inkubacji z preparatem należy pozwolić komórkom przywrzeć do płytki przez co najmniej 6 h.
    UWAGA: W przypadku innych typów komórek należy wyznaczyć optymalne stężenie.
  6. poddać makrofagi działaniu mimetyku Smac (Związek A, zobacz Tabela materiałów)22 w stężeniu 250 nM i 500 nM przez 16 h.
    UWAGA: Należy uwzględnić kontrolę pozytywną w celu indukcji apoptozy i rozszczepienia kaspazy-3, aby upewnić się, że test działa prawidłowo. Powszechnie stosowane induktory apoptozy to staurosporyna i etoposyd. Aby w wielu liniach komórkowych doszło do apoptozy, 0,1-10 μM stymulacja przez 16 h jest wystarczająca.

3. Przygotowywanie lizatów komórkowych z komórek poddanych działaniu czynników

UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić w lodzie, a odczynniki i materiały muszą być schłodzone.

  1. Przenieś płytki zawierające potraktowane komórki na lód. Zbierz medium z hodowli komórkowej do probówki 1,5 mL, odwiruj przy 300 x g przez 5 min w 4 °C, odessij medium i umieść probówkę na lodzie. Pozwala to na zebranie komórek, które oddzieliły się od płytki.
  2. Dodaj 1 mL zimnego PBS do płytki z hodowlą komórkową w celu opłukania komórek, a następnie odessij cały PBS. Dodaj 100 μL trypsyny do komórek (w przypadku pracy z płytką 6-dołkową). Pozostaw trypsynę, aby odkleiła komórki od płytki, a następnie zbierz je do probówki 1,5 mL. Użyj 1 mL zimnego PBS, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
    UWAGA: W przypadku pracy z komórkami w zawiesinie, ostrożnie przenieś medium i komórki do probówki 1,5 mL.
  3. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min w 4 °C. Usuń supernatant i resuspenduj w 100 μL buforu lizującego DISC (150 mM chlorku sodu, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glicerolu, 20 mM Tris, pH 7,5, patrz Tabela materiałów).
  4. Inkubuj próbki na lodzie przez 20 min.
  5. Odwiruj lizaty przy ~12,000 x g przez 10 min w 4 °C, aby odwirować frakcję nierozpuszczalną.
  6. Przenieś 25 μL lizatu do białej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem do testu aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 (krok 5).
    UWAGA: Nie naruszaj osadu. Jest to nierozpuszczalna frakcja lizatu komórkowego.
  7. Przenieś 10 μL pozostałego lizatu do przezroczystej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem do testu kwasu bicinchoniminowego (BCA) (krok 4). Posłuży to do normalizacji próbek.
  8. Przechowuj obie płytki na lodzie do czasu dalszej obróbki.
    ​UWAGA: Na tym etapie płytki można szczelnie zamknąć pokrywą adhezyjną i przechowywać w temperaturze −20 °C przez około 4 tygodnie.

4. Ilościowe oznaczanie białka metodą BCA

UWAGA: Do ilościowego oznaczenia białka w każdej próbce można użyć innych odczynników lub testów. W analizie populacyjnej próbki można porównywać poprzez normalizację ilości białka wykorzystanego w badaniu.

  1. Przygotować standardowe stężenia białka w zakresie od 0 μg/mL do 2 000 μg/mL (0 μg/mL, 25 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL, 1 000 μg/mL, 1 500 μg/mL, 2 000 μg/mL), wykorzystując albuminę surowicy bydlęcej (BSA). Przygotować próbki ślepe zawierające wyłącznie bufor do lizy.
  2. Do płaskodنnej płytki 96-dołkowej zawierającej próbki, o której mowa w kroku 3.7, dodać 10 μL każdego standardu.
  3. Zmieszać odczynnik BCA 1 z odczynnikiem BCA 2 w stosunku 50:1 (patrz Tabela materiałów). Do każdej próbki i każdego standardu dodać 200 μL zmieszanego odczynnika BCA.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  5. Zmierzyć absorbancję przy 562 nm na urządzeniu fluorometrycznym i określić stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej.

5. Analiza aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 w populacji komórek

UWAGA: Nie należy pozostawiać lizatów komórkowych w płytce na lodzie przez więcej niż 3 h. W przypadku obecności aktywności kaspaz, wzrasta ona z czasem, mimo przetrzymywania próbek na lodzie. Jeśli próbki były zamrożone, należy je rozmrozić na lodzie i przystąpić do pracy natychmiast po rozmrożeniu lizatów.

  1. Uruchom urządzenie fluorometryczne (patrz Tabela materiałów) i rozgrzej aparat do 37 °C. Przygotuj program pomiarowy w następujący sposób:
    1. Wykonuj pojedyncze odczyty w każdej minucie przez 40 min w celu określenia kinetyki reakcji.
    2. Ustaw wzbudzenie na 360 nm i emisję na 465 nm. Dziesięć błysków na dołek jest wystarczające.
  2. Przygotuj kontrolę pozytywną z rekombinowaną kaspazą-3 (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj 1 U enzymu rekombinowanej kaspazy-3 w 50 μL buforu do lizy (probówka 1). Do trzech dodatkowych probówek dodaj po 25 μL buforu do lizy. Przenieś 25 μL z probówki 1 do probówki 2. Wymieszaj poprzez pipetowanie.
    1. Powtórz czynność dla probówki 3 i probówki 4. Probówka 5 będzie zawierać tylko 50 μL buforu do lizy. Dodaj 25 μL każdego standardu do białej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem do analizy aktywności kaspazy-3, wspomnianej w kroku 3.6.
  3. Przygotuj na lodzie główną mieszaninę reakcyjną (master mix) do analizy aktywności kaspazy. Na jedną reakcję wymieszaj 50 μL 2x buforu do cięcia kaspazy (0.2M HEPES pH 7.5; 20% sacharozy lub PEG; 0.2% CHAPS), 5 μL 1 mM DEVD-AMC (substrat tetrapeptydowy kaspazy-3), 2 μL 500 mM DTT oraz 18 μL wody dejonizowanej (patrz Tabela materiałów).
  4. Dodaj 75 μL mieszaniny reakcyjnej do każdej próbki i standardu, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 100 μL.
  5. Natychmiast zmierz fluorescencję za pomocą urządzenia fluorometrycznego skonfigurowanego w kroku 5.1.
  6. Dla każdego pomiaru fluorescencji odejmij odczyt fluorescencji dla próbki ślepej (sam bufor do lizy) od fluorescencji próbki. Znormalizuj odczyt, dzieląc go przez stężenie białka w próbce (obliczone w kroku 4.5)27:
    Wzór na ilościowe oznaczenie białka; różnica fluorescencji/stężenie białka; równanie badawcze.
  7. Oblicz szybkość aktywności kaspazy, wyznaczając nachylenie krzywej znormalizowanej fluorescencji na osi y oraz czasu na osi x.

6. Analiza aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 w pojedynczych komórkach (analiza metodą cytometrii przepływowej)

  1. Wysiej komórki zgodnie z opisem w sekcji 2.
  2. Zbierz komórki do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL. W przypadku pracy z komórkami adherentnymi, zbierz pożywkę do probówki 5 mL. Do płytki z hodowlą komórkową dodaj 1 mL zimnego PBS, a następnie zbierz PBS do probówki 5 mL. Dodaj do komórek trypsynę (100 μL w przypadku pracy z płytkami 6-dołkowymi). Pozostaw trypsynę do czasu odklejenia się komórek od płytki, a następnie zbierz je do probówki 5 mL. Użyj 1 mL zimnego PBS, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
    UWAGA: W przypadku pracy z komórkami w zawiesinie, ostrożnie przenieś pożywkę i komórki do probówki 5 mL.
  3. Odwiruj próbki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadosad za pomocą aspiratora próżniowego.
  4. Przygotuj mieszaninę barwiącą. Optymalne stężenie barwienia wynosi 1 x 106-2 x 106 komórek w 50 μL. Rozcieńcz substrat fluorogenny zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów, cytometria przepływowa). Pobierz 1 μL roztworu treściwego substratu i rozcieńcz w 150 μL PBS. Dodaj 50 μL na próbkę.
  5. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 30 min w ciemności, mieszając co 15 min.
  6. W przypadku cytometru przepływowego wykorzystanego w tym badaniu, użyj lasera czerwonego o długości fali 640 nm i detekcji przy 675/25 nm. Najpierw zanalizuj niebarwioną próbkę kontrolną i zarejestruj minimum 10 000 zdarzeń z pożądanej populacji. Wyklucz debris, stosując bramkę (P1) na wykresie kropkowym FSC-A i SSC-A.
    1. Użyj histogramu wyświetlającego zdarzenia w bramce P1 oraz detekcję dla substratu kaspazy (oś y), aby wyznaczyć medianę intensywności fluorescencji (MFI).
      UWAGA: Substrat kaspazy opisany w tej metodzie wymaga wzbudzenia przy 590 nm i emituje przy 628 nm.

Wyniki

Pierwotne makrofagi mysie różnicowano przez 6 dni. Po 6 dniach komórki zebrano, policzono i wysiano. Zastosowano następujące traktowania: brak traktowania oraz mimetyk Smac (Compound A)22 w stężeniach 250 nM i 500 nM przez 16 h (Rycina 1). Eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, aby umożliwić ocenę aktywacji kaspazy-3/kaspazy-7 za pomocą testu populacyjnego lub analizy pojedynczych komórek z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Stężenie białka w lizatach komórkowych określono za pomocą testu BCA (Tabela uzupełniająca 1). Jest to niezbędne, aby zapewnić taką samą ilość białka użytego w teście aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 we wszystkich próbkach. W tym teście opartym na populacji dane można przedstawić na dwa sposoby. Pierwszy polega na ukazaniu kinetyki poprzez wykreślenie skorygowanej fluorescencji (oś y) w funkcji czasu (oś x) (Rysunek 2A). Alternatywnie można obliczyć nachylenie krzywej, aby bezpośrednio porównać próbki (Rysunek 2B). Wzrost nachylenia po zastosowaniu 500 nM mimetyku Smac nie był istotny statystycznie w oparciu o jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z wielokrotnymi porównaniami (test wielokrotnych porównań Dunnetta28).

W celu analizy aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 za pomocą cytometrii przepływowej zebrano komórki oraz nadsącz. Jako kontrolę negatywną wykorzystano komórki niebarwione lub kontrolę fluorescence minus one, a także komórki niepoddane działaniu leku. Histogram komórek analizowanych cytometrycznie wykazał przesunięcie fluorescencji w przypadku komórek traktowanych mimetykami Smac w porównaniu do komórek niepoddanych działaniu leku (Rycyna 2C). Dane można przedstawić jako medianę intensywności fluorescencji (Rycina 2D) lub jako krotność zmiany względem komórek niepoddanych działaniu leku (Rycina 2E).

Różnicowanie i analiza makrofagów szpiku kostnego; schemat z testem fluorogennym i cytometrią przepływową.
Rycina 1: Schemat badania. (A) Kości udowe i piszczelowe zostały pobrane od myszy C57Bl/6. Kości zostały przepłukane, a następnie poddane różnicowaniu w obecności 20 ng/mL M-CSF przez 6 dni. (B) W 6. dniu makrofagi zostały zebrane i ponownie wysiane w celu przeprowadzenia zabiegów. Jedną partię komórek pobrano w celu przygotowania lizatów i oceny aktywności fluorogennej, natomiast drugą partię pobrano, inkubowano z podłożem fluorogennym i poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza aktywności kaspazy-3; wykresy, histogramy; detekcja DEVD AFC, badanie apoptozy; fluorescencja.
Rysunek 2: Analiza kinetyczna aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 oraz rozszczepiania substratu metodą cytometrii przepływowej. (A,B) Reprezentatywne dane z analizy kinetycznej aktywności kaspazy-3/kaspazy-7 (C-E) oraz rozszczepiania substratu metodą cytometrii przepływowej. Makrofagi traktowano dwiema koncentracjami mimetyku Smac (Związek A; 250 nM i 500 nM) przez 16 h. (A) Detekcja rozszczepionego substratu DEVD AFC w czasie. Dane znormalizowano do stężenia białka w próbce. (B) Szybkość rozszczepiania (nachylenie) DEVD AFC dla każdej próbki znormalizowano do nachylenia próbki nietraktowanej i przedstawiono jako krotność zmiany względem komórek nietraktowanych. (C) Histogramy cytometryczne komórek inkubowanych z substratem kaspazy-3. (D,E) Porównanie MFI oraz krotność zmiany MFI w porównaniu z próbką nietraktowaną. Każdy punkt danych reprezentuje niezależną próbkę; przedstawiono średnią ± błąd standardowy średniej; *p < 0.05 przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testów porównań wielokrotnych (test Dunnetta). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

KaspazaGatunki Sekwencja substratuDomeny białkowe
Kaspaza-1Hs, Mm(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-2Hs, MmDEXDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-4Hs(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-5Hs(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-9Hs, Mm(I/V/L)E(H/T)DCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-11Mm(W/L)EHDCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-12MmATADCARD, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-8Hs, Mm(I/V/L)E(H/T)DDED, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-10Hs(I/V/L)E(H/T)DDED, duża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-3Hs, MmDEXDduża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-6Hs, Mm(I/V/L)E(H/T)Dduża domena, mała domena katalityczna
Kaspaza-7Hs, MmDEXDduża domena, mała domena katalityczna
kaspaza-14hs, mm(W/L)EHDduża domena, mała domena katalityczna
KARTAdomena aktywacji i rekrutacji kaspaz
DEDdomena efektora śmierci
Hshomo sapiens
Mmmus musculus

Tabela 1: Specyficzność substratowa i domeny białkowe kaspaz. Tabela została opracowana na podstawie prac McStay i wsp.20; Shalini i wsp.3; oraz van Opdenboscha i Lamkanfi4.

Tabela uzupełniająca 1: Analiza kinetyczna DEVD. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tej metodzie substrat fluorogenny jest używany w teście populacyjnym lub analizie pojedynczej komórki w celu pomiaru aktywności kaspazy-3 / kaspazy-7. Obie metody mierzą aktywność kaspazy w sposób ilościowy w oparciu o rozszczepienie substratu. Jedną z zalet jest możliwość wykorzystania tych metod do wielu próbek. Dzięki tym metodom aktywność kaspazy-3 / kaspazy-7 jest wykrywana w pierwotnych makrofagach traktowanych mimetykami Smac.

Krytycznym aspektem populacyjnego testu fluorometrycznego jest czas od lizy do odczytu fluorescencji. Próbki muszą być przechowywane na lodzie przez cały czas trwania procedury, w szczególności przed "odczytaniem" testu. Zapobiega to przedwczesnemu rozszczepianiu i fluorescencji podłoża. Korzystając z testu populacyjnego, może być wymagana mniejsza optymalizacja. Ilość białka użytego w teście jest znormalizowana, co pozwala na bezpośrednie porównanie próbek. Jednym zastrzeżeniem jest to, że w późnym stadium apoptotycznej śmierci komórki całkowita ilość białka jest zmniejszona; W związku z tym wykrycie aktywności kaspazy może nie być możliwe. Aby obejść ten problem, zaleca się stosowanie różnych kinetyki lub różnych dawek leczniczych. Ponadto do dokładnej oceny szybkości aktywności kaspazy można użyć innego oprogramowania oprócz oprogramowania opisanego w tej metodzie.

W przypadku testu cytometrii przepływowej wymagana jest wystarczająca liczba zdarzeń lub komórek, aby pewnie zabramować populacje. Ponadto może być wymagana większa optymalizacja w teście opartym na przepływie, aby osiągnąć optymalny stosunek substratu do liczby komórek. Jednak w przypadku cytometrii przepływowej metoda ta nadaje się do pomiaru dodatkowych parametrów, takich jak markery powierzchni komórki do identyfikacji typu komórki.

Zarówno metody populacyjne, jak i jednokomórkowe mogą być stosowane do innych kaspaz. Należy jednak pamiętać, że sekwencja rozpoznawania jest mniej dyskryminowana w przypadku innych kaspaz. W związku z tym należy stosować inne metody aktywności kaspazy. Obejmuje to hamowanie aktywności kaspazy, CRISPR lub knock-down określonych kaspaz oraz western blot w celu wykrycia rozszczepienia znanych substratów.

Jedną z alternatywnych metod wykrywania aktywności kaspazy jest obrazowanie poklatkowe. Ten sam przepuszczalny substrat kaspazy może być używany wraz z innymi markerami żywotności, takimi jak aneksyna V, w celu uzyskania informacji na temat kinetyki śmierci komórki. Obrazowanie pozwoliłoby również oddzielić aktywność kaspazy od przeżycia komórki, co pozwoliłoby na wykrycie subletalnych ilości aktywności kaspazy w populacji komórek. Nieśmiertelne funkcje kaspazy-3 / kaspazy-7 są związane z regulacją przeciwwirusową we wrodzonych komórkach odpornościowych29, w szczególności z aktywacją IFN typu I poprzez uwalnianie mitochondrialnego DNA15,16. W związku z tym te testy do pomiaru aktywności kaspazy mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji różnych sposobów śmierci komórki i mogą być przydatne w ocenie funkcji niezwiązanych ze śmiercią komórki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

W.W.W. jest wspierany przez grant Clöetta Medical Research Fellow, S.R. jest wspierany przez CanDoc UZH Forschungskredit, a J.T. jest wspierany przez Chińską Radę Stypendialną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki do mikrofugeSarstedt72.706.400
15 cm płytki PetriegoSarstedt82.1184.500
Wytrząsarka do inkubatora 37 stopniWytrząsarka IKA KS 4000i97014-816dystrybuowana przez VWR
6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowychSarstedt83.392
96-dołkowe płaskie dno, biały polistyren, niesterylnySigmaCLS3600
96-dołkowa płaska płytkaSarstedt82.1581
Ac-DEVD-AFCEnzo Life SciencesALX-260-032-M005Podłoże kaspazy-3
BD FortessaBDzadziała dowolny cytometr przepływowy z odpowiednim detektorem wzbudzenia i emisji
b-glicerolfosforanSigmaG9422-10G
kaspaza-3 rekombinant Enzo Life SciencesALX-201-059-U025
CHAPSSigma1.11662
DMEM, niska glukoza, pirogronianThermoscientific31885023
DMSOSigmaD8418-250ML
EDTASigma03685-1KG
EGTASigma324626-25GM
EtopozydMedChem ExpressHY-13629
FBSThermoscientific26140
Probówki do cytometrii przepływowejFalcon352008
FlowjoFlowjoWymagana jest licencja, ale wystarczy dowolny program, który może analizować pliki .fcs
GlycerolSigmaG5516-500ML
HEPESSigmaH4034
Zestaw do oznaczania kaspazy Magic Red-3/7; cytometria przepływowa lub obrazowanieImmunochemistry Technologies935
M-CSFebioscience14-8983-80obecnie spółka zależna Thermoscientific
M-PlexTecankażdy czytnik fluorometryczny będzie współpracował z odpowiednimi detektorami wzbudzenia i emisji
NaClRoth3957.1
PBS pH 7.4Thermoscientific10010023
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)Thermoscientific10378016
Zestaw do oznaczania białek BCA PierceThermoFisher Scientific23225oznaczania stężenia białka
inhibitory proteazyBiomolP9070.100
Mimetyk Smac, Związek ATetralogicsznany również jako 12911; struktura pokazana na dodatkowych rysunkach Vince'a et al., Komórka 2007
Fluorek soduSigmaS7920-100G
orthovanadat soduSigmaS6508-10G
pirofosforan soduSigmaP8010-500G
StaurosporineMedChem ExpressHY-15141
sacharozaSigma1.07687
Tris BaseSigmaT1503-1KG
Triton X100SigmaT8787-50ML
TrypLEThermoscientificA1285901W protokole jest wymieniony jako Trypsyna
Test do

Bibliografia

  1. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
  2. Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. Caspases: Killer proteases. Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).
  3. Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. Old, new and emerging functions of caspases. Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).
  4. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  5. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  6. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  7. Jiang, X., Wang, X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).
  8. Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation. Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).
  9. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  10. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  11. Rühl, S., et al. ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation. Science. 362 (6417), 956-960 (2018).
  12. Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis. Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).
  13. Newton, K., et al. Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis. Nature. 574, 428-431 (2019).
  14. Fritsch, M., et al. Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis. Nature. 575, 683-687 (2019).
  15. White, M. J., et al. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production. Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).
  16. Rongvaux, A., et al. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).
  17. Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E. Caspase-dependent non-apoptotic processes in development. Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).
  18. Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. The role of caspases as executioners of apoptosis. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).
  19. Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis. FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).
  20. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).
  21. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  22. Vince, J. E., et al. IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell. 131 (4), 682-693 (2007).
  23. McComb, S., et al. cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation. Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).
  24. Wong, W. W. -L., et al. cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner. Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).
  25. Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-Protocol. 5 (20), e1631(2015).
  26. Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells. Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).
  27. Caspase activity assay buffer. Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).
  28. Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).
  29. Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. Caspases control antiviral innate immunity. Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie apoptozytest śmierci komórekaktywność kaspazy-3/7makrofagi szpiku kostnegosubstrat fluorogennyilościowe oznaczanie białekmikroskopia żywych komórek
Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.