Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64752

⸱

3 listopada 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Streszczenie

Protokół tutaj zapewnia prostą, wysoce powtarzalną metodologię do wywoływania in situ ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego u królika w eksperymentach bez przeżycia i przeżycia. Dorosły królik nowozelandzki biały jest uspokojony atropiną, acepromazyną, butorfanolem i izofluranem. Zwierzę jest intubowane i umieszczane pod wentylacją mechaniczną. Cewnik dożylny wprowadza się do żyły usznej brzeżnej w celu infuzji leków. Zwierzę jest wstępnie memedykowane heparyną, lidokainą i roztworem Ringera z mleczanami. Odcięcie tętnicy szyjnej wykonuje się w celu uzyskania dostępu do linii tętniczej w celu monitorowania ciśnienia krwi. Wybrane parametry fizjologiczne i mechaniczne są monitorowane i rejestrowane przez ciągłą analizę w czasie rzeczywistym.

Gdy zwierzę jest uspokojone i w pełni znieczulone, przeprowadza się czwartą torakotomię lewej lewej przestrzeni międzyżebrowej (przeżycie) lub sternotomię linii środkowej (brak przeżycia). Osierdzie jest otwarte i znajduje się lewa tętnica przednią zstępującą (LAD).

Polipropylenowy szew jest przepuszczany wokół drugiej lub trzeciej ukośnej gałęzi tętnicy LAD, a polipropylenowy filament jest przewlekany przez małą rurkę winylową, tworząc sidła. Zwierzę poddawane jest 30-minutowemu regionalnemu niedokrwieniu, osiąganemu przez zamknięcie LAD poprzez zaciśnięcie sidła. Niedokrwienie mięśnia sercowego potwierdza się wizualnie przez regionalną sinicę nasierdzia. Po regionalnym niedokrwieniu więzadło zostaje poluzowane, a serce może ponownie ulegnąć perfuzji.

Zarówno dla eksperymentów z przeżyciem, jak i bez przeżycia, funkcja mięśnia sercowego może być oceniana za pomocą echokardiografii (ECHO) pomiaru ułamkowego skrócenia. W przypadku badań bez przeżycia dane z sonomikrometrii zebrane za pomocą trzech cyfrowych piezoelektrycznych sond ultradźwiękowych wszczepionych w obszar niedokrwienny i ciśnienie rozwinięte w lewej komorze (LVDP) za pomocą wierzchołkowo wprowadzonego cewnika lewej komory (LV) mogą być stale pozyskiwane w celu oceny odpowiednio regionalnej i globalnej funkcji mięśnia sercowego.

W badaniach nad przeżyciem nacięcie jest zamykane, wykonywana jest toracenteza lewej igły w celu ewakuacji powietrza z opłucnej i osiągana jest kontrola bólu pooperacyjnego.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie i przyczyniają się do ponad 18 milionów zgonów rocznie1,2,3. Ostry zawał mięśnia sercowego (MI) jest częstym nagłym przypadkiem medycznym, który rozwija się, gdy skrzep krwi lub fragment blaszki miażdżycowej blokuje przepływ krwi w tętnicy wieńcowej. Powoduje to regionalne niedokrwienie mięśnia sercowego na obszarze, na którym tętnica ulega perfuzji.

Niniejsze badanie opisuje protokół, który wykorzystuje prostą i niezawodną metodologię do tworzenia in situ ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego w modelu królika do eksperymentów bez przeżycia i przeżycia. Początkowym celem tej metody była ocena wpływu przeszczepu mitochondriów na modulację martwicy mięśnia sercowego i zwiększenie funkcji serca po niedokrwieniu serca po zdarzeniu niedokrwiennym. Wcześniejsze badania wykazały występowanie zmian mitochondrialnych i gwałtowny spadek poziomu wysokoenergetycznych fosforanów po wystąpieniu niedokrwienia i zmniejszeniu dopływu tlenu, co spowodowało drastyczny spadek zapasów energii w sercu4. Badacze próbowali poprawić funkcję po niedokrwieniu i zmniejszyć martwicę tkanki mięśnia sercowego za pomocą interwencji farmakologicznych i/lub technik proceduralnych, ale techniki te zapewniają ograniczoną kardioprotekcję i mają minimalny wpływ na uszkodzenia i dysfunkcje mitochondriów5,6,7. Nasz zespół i inni wcześniej wykazali, że uszkodzenie mitochondriów występuje głównie podczas niedokrwienia i że regeneracja skurczu może być wzmocniona, a rozmiar zawału mięśnia sercowego zmniejszył się przy zachowaniu mitochondrialnej funkcji oddechowej podczas reperfuzji8,9,10. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że przeszczep mitochondriów z tkanek niedotkniętych niedokrwieniem do obszaru niedokrwienia przed reperfuzją stanowiłby alternatywne podejście do zmniejszenia martwicy mięśnia sercowego i poprawy funkcji mięśnia sercowego. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisujemy protokół zastosowany do przetestowania tej teorii oraz reprezentatywne wyniki uzyskane z naszej wstępnej analizy badania.

Ponadto, kilku badaczy skupiło się na innych tematach niezbędnych do zdefiniowania wpływu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego i ustalenia odpowiednich interwencji terapeutycznych. Jednym z takich obszarów badań jest kondycjonowanie wstępne. Kondycjonowanie niedokrwienne mięśnia sercowego jest mechanizmem kardioprotekcyjnym aktywowanym przez krótki stres niedokrwienny, który powoduje zmniejszenie częstości martwicy komórek serca podczas kolejnych epizodów przedłużonego niedokrwienia. Mechanizmy te mogą być aktywowane przez niedotlenienie lub niedrożność naczyń wieńcowych. Mandel i wsp. wykazali, że kondycjonowanie wstępne hipoksyjno-hiperoksyczne pomogło utrzymać równowagę metabolitów tlenku azotu, zmniejszyło nadprodukcję endoteliny-1 i wspomagało ochronę narządów11. Ponadto zbadano koncepcję zdalnego warunkowania niedokrwiennego, zjawiska, w którym warunkowanie wstępne jednego narządu zapewnia ochronę ogólnoustrojową. Ali i wsp. stwierdzili, że u pacjentów poddawanych planowej otwartej naprawie tętniaka aorty brzusznej, zdalne kondycjonowanie wstępne, wykonywane przez okresowe zaciskanie krzyżowe tętnicy biodrowej wspólnej, aby służyło jako bodziec, zmniejszyło częstość występowania pooperacyjnego uszkodzenia mięśnia sercowego, zawału mięśnia sercowego i zaburzenia czynności nerek12.

Modele królików oferują potencjalne korzyści w porównaniu z modelami z innymi gatunkami i są używane w wielu różnych scenariuszach od dziesięcioleci, w tym między innymi w indukcji arytmii, globalnych i regionalnych modelach niedokrwiennych oraz badaniach nad skurczami serca13,14,15. Chociaż serce królika jest mniejsze niż u psa czy świni, jest wystarczająco duże, aby z łatwością wykonywać zabiegi chirurgiczne przy znacznie niższych kosztach13. Serce królika jest często używane, ponieważ jest ściśle równoległe do serca ludzkiego; Rzeczywiście, ma podobne tempo przemiany materii, wyraża łańcuch ciężki β-miozyny i nie ma znaczącej oksydazy ksantynowej mięśnia sercowego16. Opisana tutaj technika wywoływania regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego jest prosta, powtarzalna i opłacalna. Metoda ta dopuszcza zarówno przypadki nieprzeżycia, jak i przeżycia, ponieważ indukowane jest tylko niedokrwienie regionalne, a nie globalne, a potrzebne materiały są niespecjalistyczne. Można zastosować dwa różne podejścia chirurgiczne (tj. sternotomię i mini-torakotomię), zapewniając w ten sposób operatorowi i protokołom eksperymentalnym większą swobodę w zakresie projektowania badania. Dodatkowo zabieg nie wymaga stosowania krążenia pozaustrojowego. W tym kontekście, minimalnie inwazyjne podejścia do pomostowania aortalno-wieńcowego stały się cenną alternatywą dla pacjentów wymagających wielonaczyniowej rewaskularyzacji17,18. Model ten może zostać wykorzystany do zbadania różnic między tymi podejściami i zapewnienia narzędzia do uczenia się opartego na zwierzętach dla stażystów chirurgicznych. Ponadto wykonywanie cewnikowania serca przy użyciu tego modelu może być przydatne w badaniach fizjologicznych i/lub szkoleniu chirurgicznym.

Nasz model dostarcza metodologii dla zastosowań, w których ważne jest wywołanie regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego, a następnie pomiar wielkości zawału, funkcji mięśnia sercowego i zmian komórkowych. Dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie ocenić kilka markerów funkcji komórkowych i adaptacji do niedokrwienia oraz proponowanej interwencji terapeutycznej (tj. przeszczepu mitochondriów) poprzez badanie internalizacji organelli, zużycia tlenu, wysokoenergetycznej syntezy fosforanów oraz indukcji mediatorów cytokin i szlaków proteomicznych. Wyniki te są ważne dla zachowania energetyki mięśnia sercowego, żywotności komórek i funkcji serca oraz pozwalają na obiektywną ocenę technik kardioprotekcyjnych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Model ten może być wykorzystany do badania podobnych szlaków biologicznych i alternatyw w dziedzinie patologii mięśnia sercowego po niedokrwieniu i rekonwalescencji.

Celem tego protokołu jest dostarczenie wysoce powtarzalnej metodologii wywoływania in situ ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego u królika do eksperymentów z nieprzeżyciem i przeżyciem. Model ten zapewnia metodologię z wysoką przeżywalnością, niską śmiertelnością śródoperacyjną i minimalną zachorowalnością19. Inne modele ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego zostały opisane przy użyciu materiałów znakowanych radioizotopem, środków kontrastowych, rezonansu magnetycznego lub symulacji komputerowych20,21,22. Nasz protokół zapewnia niezawodną i prostą metodologię, która jest opłacalna, konsekwentnie odtwarzalna i ma niskie wymagania techniczne, a zatem może być wykonywana przez badaczy bez wiedzy chirurgicznej. Protokół ten obejmuje albo projekt przeżycia z wykorzystaniem mini-torakotomii lewej, albo model bez przeżycia z wykorzystaniem sternotomii w linii środkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania i zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Bostonie (Protokół 20-08-4247R). Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.

1. Gatunki zwierząt, środki znieczulające i przeciwbólowe

  1. Gatunki zwierząt: Do badań eksperymentalnych należy używać królików nowozelandzkich białych (szczep dziki; płeć żeńska; dojrzałość płciowa w wieku 15-20 tygodni; 3-4 kg masy ciała).
  2. Środki znieczulające i przeciwbólowe:
    1. Stosować atropinę w dawce 0,01 mg/kg domięśniowo (IM)
    2. Acepromazynę należy stosować w dawce 0,5 mg/kg domięśniowo w przypadku sedacji początkowej i 0,5 mg/kg dożylnie (IV) w celu pełnego znieczulenia.
    3. Butorfanol należy stosować w dawce 0,5 mg/kg domięśniowo.
    4. Stosować izofluran za pomocą precyzyjnej maski na twarz w systemie waporyzacji w stężeniu 3% w celu indukcji, następnie intubacji w ilości 1%-2%, tlenu (O2) w 100% w dawce 2 l/min i znieczulenia ogólnego w dawce 1% w celu konserwacji.
    5. Medetomidynę należy stosować w dawce 0,25 mg/kg mc. domięśniowo.
    6. Stosować ketaminę w dawce 10 mg/kg dożylnie.
    7. Zastosować blokadę międzyżebrową bupiwakainy w miejscu torakotomii w dawce nieprzekraczającej 3 mg/kg mc. domięśniowo.
    8. Stosować 1% lidokainy w dawce 1-1,5 ml/kg dożylnie.
    9. Stosować plaster transdermalny z fentanylem o stężeniu 1-4 μg/kg przez 72 godziny.

2. Kroki proceduralne (Rysunek 1)

  1. Spokojne dorosłe króliki nowozelandzkie białe z pojedynczym połączonym wstrzyknięciem domięśniowym atropiny, acepromazyny i butorfanolu. Indukuj zwierzę 3% izofluranem za pomocą precyzyjnej maski na twarz z systemem odparowywania.
  2. Przygotowanie przed zaślepioną intubacją dotchawiczą (tj. bez wizualizacji głośni)
    1. Spryskaj krtań 1% lidokainą, aby zapobiec skurczowi krtani.
    2. Wstępnie zmierz długość rurki dotchawiczej (ETT) na zewnątrz królika od zębów do przewidywanej cariny i umieść królika w pozycji leżącej mostka z wyciągniętą szyją.
  3. Zaintubować zwierzę za pomocą mankietu pediatrycznego (3-0 lub 3-5 średnica wewnętrzna) ETT w ciągłym znieczuleniu wziewnym w tempie 1%-2% iO2 w 100% w dawce 2 l/min.
    1. Włóż ETT do ust i skieruj go przez torus do gardła.
    2. Przesuwaj ETT, aż końcówka rurki zetknie się z głośnią lub dźwięki oddechu zostaną utracone, co oznacza, że końcówka rurki przeszła przez otwór głośniowy.
    3. Lekko wycofaj rurkę, aż dźwięki oddechu zostaną odzyskane, a następnie ponownie przesuń i zabezpiecz rurkę na miejscu.
  4. Przewietrzyć zwierzę za pomocą wspomagania mechanicznego (objętość oddechowa: 10 ml/kg, frakcja wdychanego O2: 40%, częstość oddechów: 30-40 oddechów/min, dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe: 5-10 cmH2O).
    1. Dostosuj FiO2 zgodnie z tolerancją, aby osiągnąć wysycenieO2 większe niż 92%, mierzone za pomocą pulsoksymetrii, aby zapobiec hiperoksji, która może wywołać ogólnoustrojową odpowiedź zapalną.
  5. Sprawdź prawidłowe umieszczenie ETT poprzez badanie fizykalne (tj. osłuchiwanie), objawy kliniczne (tj. obserwacja kondensacji na końcu rurki dotchawiczej) oraz za pomocą obiektywnych pomiarów (tj. Dwutlenek węgla na końcu pływówki).
  6. Po około 10 minutach należy podać królikowi wstrzyknięcie domięśniowe medetomidyny, aby zapewnić jednoczesne działanie znieczulające i przeciwbólowe.
  7. Znieczulenie ogólne należy utrzymywać 1% izofluranem przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego.
  8. Wprowadzić cewnik dożylny 22 G do żyły ucha brzeżnego i zabezpieczyć go taśmą, aby uzyskać obwodowy dostęp dożylny.
    UWAGA: Żyła udowa może być używana jako alternatywne miejsce dostępu żylnego.
    1. W pełni znieczulij zwierzę acepromazyną IV i ketaminą IV.
    2. Przed nacięciem wstrzyknąć 1 000 j./ml heparyny w dawce 3 mg/kg dożylnie.
      1. Na początku podawać 1000 j./ml heparyny w dawce 3 mg/kg mc., a następnie powtarzać dawkę co godzinę do końca eksperymentu, aby utrzymać czas krzepnięcia po aktywacji wynoszący >400 s, zgodnie z obowiązującym protokołem chirurgicznym.
    3. W razie potrzeby należy podać 1% lidokainę dożylnie i/lub asynchroniczną defibrylację nasierdzia, jeśli migotanie komór wystąpi podczas operacji. Migotanie komór zwykle ustępuje po jednej lub dwóch dawkach lidokainy.
    4. Roztwór Ringera do przepełniania mleczanu w sposób ciągły przy 10 ml/kg/h,
      UWAGA: Biorąc pod uwagę małą objętość podawanych płynów i krótki czas operacji, zwierzęta w badaniach przeżywalności w tej pracy nie wymagały diurezy przed ekstubacją lub w okresie rekonwalescencji. Jeśli u zwierzęcia rozwija się pogarszający się stan płuc (tj. zwiększenie ustawień respiratora, objawy obrzęku płuc podczas osłuchiwania itp.), zaleca się diurezę.
  9. Wykonaj przecięcie tętnicy szyjnej i umieść 4 lub 5 francuskiej linii tętniczej, aby ułatwić śródoperacyjne monitorowanie ciśnienia tętniczego krwi (BP).
    UWAGA: Tętnica udowa może być używana jako alternatywne miejsce dostępu tętniczego.
  10. Monitoruj i rejestruj wszystkie zmienne fizjologiczne i mechaniczne dzięki ciągłej analizie w czasie rzeczywistym.
    1. Monitoruj ciśnienie tętnicze za pomocą linii tętniczej tętnicy szyjnej i rejestruj wysycenieO2 za pomocą pulsoksymetrii za pomocą czujnika umieszczonego na ogolonej łapie.
    2. Monitor z elektrokardiogramem (EKG) z trzema odprowadzeniami kończynowymi: I, II i III oraz trzema obliczeniowymi odprowadzeniami rozszerzonymi: aVL, aVR i aVF.
      1. Zapisuj zapisy EKG na początku przed niedokrwieniem, podczas niedokrwienia, podczas reperfuzji i seryjnie w 7-28 dniach rekonwalescencji (jeśli wykonujesz badanie przeżycia).
    3. Monitoruj poziom sedacji poprzez ciągłe monitorowanie ciśnienia tętniczego i tętna (HR).
    4. Monitoruj temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej.
    5. Użyj 2D ECHO z lewego widoku przymostkowego i wierzchołkowego, aby ocenić funkcję mięśnia sercowego w pożądanych punktach czasowych zarówno w przypadkach przeżycia, jak i bez przeżycia.
      1. Oceń czynność mięśnia sercowego za pomocą frakcyjnego skrócenia (FS), mierząc odległość końcoworozkurczową lewej komory (LVEDD) i odległość końcowoskurczową lewej komory (LVESD) i używając następującego wzoru:
        FS = (LVEDD − LVESD)/LVEDD × 100
  11. Podczas operacji umieść zwierzę na kocu z krążącą gorącą wodą, aby utrzymać stabilną temperaturę ciała.
  12. Przygotuj i ułóż zwierzę w sterylny sposób:
    1. Ogolić miejsce operacji i przygotować się za pomocą betadyny i 70% alkoholu izopropylowego, każdy nałożony w trzech egzemplarzach. Osusz obszar sterylnymi gazikami i obłóż całe zwierzę sterylnymi ręcznikami.
  13. Mini-torakotomia lewa (badania przeżycia)
    1. Wykonać blokadę międzyżebrową w ustalonym wcześniej miejscu torakotomii za pomocą bupiwakainy IM.
    2. Podawać 1% lidokainy dożylnie przez żyłę uszną przed nacięciem.
    3. Wykonaj lewą mini-torakotomię przez czwartą przestrzeń międzyżebrową wzdłuż górnej części piątego żebra, aby uniknąć pęczka nerwowo-mięśniowego, który znajduje się równolegle do dolnej powierzchni każdego żebra.
      1. Wykonaj torakotomię przednio-boczną, aby uzyskać najlepszą wizualizację przednio-bocznej powierzchni serca (tj. anatomicznej lokalizacji ukośnych gałęzi LAD).
      2. Ustaw królika z lewą stroną uniesioną pod kątem około 30° za pomocą poduszki lub worka fasoli.
      3. Zabezpiecz ipsilateralną nogę królika nad jego głową, aby zrobić miejsce zarówno na pole operacyjne, jak i między przestrzeniami żeber.
      4. Zbadaj palpacyjnie i obrysuj kostne punkty orientacyjne, w tym żebra, mostek i łopatkę, pisakiem z filcową końcówką. Naciąć skórę nad piątym żebrem za pomocą ostrza #10. Upewnij się, że nacięcie pozostaje równoległe do żebra.
      5. Użyj elektrokoagulacji, aby podzielić mięsień piersiowy większy i mięsień zębaty przedni. Podziel mięśnie międzyprzybrzeżne tuż nad piątym żebrem za pomocą elektrokoagulacji, aby zachować pęczek nerwowo-naczyniowy.
      6. Ostrożnie wejdź do przestrzeni opłucnej przez czwartą przestrzeń międzyżebrową z ostrym lub rozwarstwieniem. Przedłuż początkowe nacięcie opłucnej równolegle do żebra w obu kierunkach z ostrym lub rozcięciem, aż będzie można wprowadzić rozpieracz żeber lub retraktor mostka.
    4. Umieść rozpieracz żeber lub zwijacz mostka w przestrzeni żeber i poszerz, aby zapewnić odpowiednią wizualizację serca i worka osierdziowego. Podnieś osierdzie za pomocą kleszczy DeBakeya i otwórz osierdzie nożyczkami Metzenbauma.
    5. Izolacja tętnic LAD
      1. Otocić drugą lub trzecią ukośną gałąź tętnicy LAD szwem polipropylenowym (3-0) na igle stożkowej. Wyjmij igłę i przeciągnij oba końce włókna polipropylenowego przez małą winylową rurkę, aby utworzyć werbel.
      2. Umieść zastaw między sidłem a tętnicą wieńcową, aby uniknąć uszkodzenia naczynia wieńcowego i/lub spowodowania skurczu naczyń krwionośnych podczas podwiązania.
        1. Za pomocą kleszczy DeBakey podnieś prostokątny filc z PTFE (około 7 mm x 3 mm). Umieść zastaw między dwoma włóknami polipropylenowymi tak, aby był umieszczony między izolowaną tętnicą LAD a rurką winylową, gdy werbel jest napięty.
  14. Sternotomia linii środkowej (badania niedotyczące przeżycia)
    UWAGA: Podejście sternotomii w linii środkowej jest idealne w przypadkach bez przeżycia, w których można zastosować bardziej inwazyjne monitorowanie za pomocą LVDP i sonomikrometrii.
    1. Wykonaj sternotomię w linii środkowej za pomocą zakrzywionych nożyczek Mayo. Umieść zwijacz mostka i poszerz go, aby zapewnić odpowiednią wizualizację serca i worka osierdziowego.
    2. Podnieś osierdzie za pomocą kleszczy DeBakeya i otwórz osierdzie nożyczkami Metzenbauma.
    3. Umieszczanie trzech piezoelektrycznych kryształów sonomikrometrycznych:
      1. Wykonaj trzy małe nacięcia o średnicy 1 mm na nasierdziu LV, tworząc rogi trójkąta. Umieść piezoelektryczne kryształy sonomikrometryczne wewnątrz nacięć nasierdzia.
      2. Przymocuj druty do powierzchni serca za pomocą polipropylenowego ściegu w kształcie litery U 5-0. Podczas nagrywania za pomocą sonomikrometrii należy wstrzymać wentylację mechaniczną, aby umożliwić dokładny zapis przez dwa do trzech uderzeń serca.
        UWAGA: Jeśli serce migocze, 1% lidokainy nie jest skuteczne i potrzebna jest defibrylacja nasierdzia, wyłącz sonomikrometr i odłącz go od systemu akwizycji danych, aby chronić oba przed wejściem elektrycznym.
    4. Izolacja tętnicy LAD:
      1. Otocić drugą lub trzecią ukośną gałąź tętnicy LAD szwem polipropylenowym (3-0) na igle stożkowej.
      2. Wyjmij igłę i przeciągnij oba końce włókna polipropylenowego przez małą winylową rurkę, aby utworzyć werbel.
      3. Umieść zastaw między sidłem a tętnicą wieńcową, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy wieńcowej i/lub spowodowania skurczu naczyń za pomocą podwiązania.
      4. Za pomocą kleszczy DeBakey podnieś prostokątny filc z PTFE (około 7 mm x 3 mm). Umieść zastaw między dwoma włóknami polipropylenowymi tak, aby był umieszczony między izolowaną tętnicą LAD a rurką winylową, gdy werbel jest napięty.
    5. Pomiar LVDP:
      1. Umieść polipropylenowy ścieg w kształcie litery U 5-0 w wierzchołku LV. Wykonaj małe nacięcie 1 mm ostrzem 11 w wierzchołku LV.
      2. Wprowadzić 3-francuski cewnik balonowy do światła lewej wysokości. Przymocuj cewnik do lewej komory, przywiązując go do polipropylenowego szwu U 5-0.
      3. Podłącz cewnik do przetwornika podłączonego do monitora, aby zarejestrować LVDP. Nagraj LVDP za pomocą systemu akwizycji danych (opisanego poniżej). Wyzeruj cewnik, aby zarejestrować zmienne hemodynamiczne, otwierając trójdrożny kran do powietrza i zerując na monitorze.
    6. System akwizycji danych
      1. Uruchom system akwizycji danych (patrz tabela materiałów) na używanym komputerze/laptopie. Podłącz przewód od monitora do komputera/laptopa.
      2. Wybierz Kanał 1 w systemie akwizycji danych i nadaj mu nazwę LVDP. Wyzeruj przetwornik za pomocą monitora.
        UWAGA: Jeśli podłączasz BP i HR do systemu akwizycji danych, postępuj zgodnie z tym samym procesem: podłącz przewód do laptopa, wybierz Kanał i wyzeruj, jeśli mierzysz BP.
  15. Zatkaj tętnicę wieńcową, zaciskając werbel, naciskając rurkę winylową, jednocześnie ciągnąc za włókna szwu polipropylenowego. Utrzymuj pożądaną szczelność za pomocą opaski na komary, bezpośrednio zaciskając rurkę i mocując ją na miejscu.
  16. Potwierdź niedokrwienie mięśnia sercowego wizualnie za pomocą regionalnej sinicy nasierdzia. Niedokrwienie regionalne można również potwierdzić w EKG z obecnością odcinka ST i zmianami w załamku T.
  17. Po potwierdzeniu wzrokowym wywołać regionalne niedokrwienie przez 30 minut w znieczuleniu.
    1. Po 0 min, 10 min, 20 min i 30 min podczas regionalnego niedokrwienia oceń FS za pomocą 2D ECHO zarówno dla przypadków przeżycia, jak i bez przeżycia.
    2. Oceniaj LVDP i ultramikrometrię w sposób ciągły w okresie przed niedokrwieniem, niedokrwieniem mięśnia sercowego i czasem po niedokrwieniu w przypadkach bez przeżycia.
    3. W razie potrzeby wyznacz obszar zagrożony, ponownie podwiązując tętnicę za pomocą polipropylenowego ściegu szwowego pozostawionego na miejscu. Zaciśnij krzyżowo aortę i wstrzyknij niebieski pigment monastralny 98% (rozcieńczony 1:5 w PBS) przez aortę za pomocą igły do kardioplegii. Perfundowane obszary mięśnia sercowego zabarwią się na niebiesko, a obszar zagrożony pozostanie niezabarwiony.
    4. Stale monitoruj i rejestruj nasycenie HR, BP iO2.
    5. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez 2 godziny (brak przeżycia) lub 28 dni (czas przeżycia).
      UWAGA: EKG można wykorzystać do potwierdzenia reperfuzji. Chociaż nie zaobserwowano jej w eksperymencie przeprowadzonym w tym badaniu, hipokaliemia może często wystąpić podczas reperfuzji i można ją skorygować za pomocą kontroli potasu lub odpowiedniego wlewu.
  18. Zakończenie postępowania
    1. Przypadki przetrwania
      1. W przypadkach przetrwania należy przyciąć nić polipropylenową 3-0 używaną do wnyka, luźno związać końce ze sobą i pozostawić na miejscu. Zidentyfikuj obszar ryzyka i strefę zawału za pomocą nici polipropylenowej 3-0.
      2. Po zakończeniu zabiegu zamknij nacięcie w trzech warstwach.
        1. Zamknij pierwszą warstwę, zawiązując wokół żeber dwa ściegi 2-0 poliglaktyny 910 w kształcie ósemki.
        2. Zamknij warstwy mięśniowe i podskórne szwem 3-0 z polidioksanonu w sposób biegowy.
        3. Zamknij skórę w sposób podskórny za pomocą nici monofilamentowej 5-0. Użyj zakopanego szwu biegowego, aby zminimalizować podrażnienie odczuwane przez zwierzę.
      3. Opróżnij powietrze opłucnej, wykonując toracentezę igłową.
      4. Stosować plaster transdermalny z fentanylem przez 72 godziny, aby ułatwić leczenie bólu pooperacyjnego.
      5. Wykonaj echokardiografię przezklatkową w 1 tygodniu i 2 tygodniach po operacji, aby ocenić trendy w FS.
      6. Po upływie ustalonego okresu rekonwalescencji należy uspokoić, zaintubować i znieczulić zwierzę jak powyżej. Wykonaj sternotomię pośrodkową. Odsłoń i otwórz worek osierdziowy. Poddaj królika eutanazji w głębokim znieczuleniu, usuwając serce en bloc, pozwalając zwierzęciu umrzeć przez wykrwawienie.
    2. Przypadki niezwiązane z przeżyciem
      1. Po eksperymencie i zapewnieniu głębokiego znieczulenia należy całkowicie odsłonić serce i usunąć je en bloc w celu analizy biochemicznej i tkankowej. Zwierzę umiera w wyniku wykrwawienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem (Rysunek 1), niedokrwienie mięśnia sercowego potwierdzono natychmiast poprzez bezpośrednią wizualizację sinicy osierdzia.

Standardowe zapisy EKG (trzy odprowadzenia kończynowe: I, II i III oraz trzy obliczeniowe odprowadzenia wzmocnione: aVL, aVR i aVF) rejestrowano w sposób ciągły przed wystąpieniem niedokrwienia, w trakcie niedokrwienia oraz podczas reperfuzji (Rysunek 2). Zapisy EKG wykazują tachykardię, arytmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz protokół przedstawia wiarygodną metodologię wykonywania ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego u królika. Podejście lewostronnej mini-torakotomii jest idealne w przypadkach przeżycia, w których nacięcie i związany z nim ból muszą być zminimalizowane. Co ważne, leczenie moczopędne nie było konieczne przed ekstubacją i nie stwierdzono śmiertelności śródoperacyjnej w grupie bez przeżycia lub po 4 tygodniach od operacji w grupie przeżycia. Gdy projekt protokołu wymaga przypadku braku przeżycia lub gdy potr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Podziękowania

Oryginalne badanie, w którym użyto tego protokołu, było wspierane przez granty National Heart, Lung, and Blood Institute HL-103642 i HL-088206

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#10 ostrzeBard Parker371210
#11 ostrzeFisher ScientificB3L
22 G Igła PIVBD Insyte381423
AcepromazynaVETONENDC 13985-587-500,5 mg / kg IM i IV
Aline Worek ciśnieniowyInfu-Stat2139
AngiocathBecton Dickinson382512
Cewnik tętniczyTeleflexMC-004912
AtropinaHikma PharmaceuticalsNDC 0641-6006-01  0,01 mg/kg IM
Betadine i 70% alkoholu izopropylowegoMcKessonNDC 68599-2302-6
Gazometriakrwi SiemensMRK0025
BovieValleylabE6008
Zaciski BulldogWorld Precision Instruments14119
BupiwakainaAuromedicsNDC 55150-249-50  3 mg/kg IM
ButorfanolRoxaneNDC 2054-3090-360,5 mg/kg IM
Przezroczysty arkusz octanuOxford InstrumentsID 51-1625-0213
Maszynki do strzyżeniaAndisAGC2
DeBakeyIntegraP6280
Aparat do echokardiografiiPhilipsIE33 F1
ElektrokardiografMeditechMD908B
Rurka dotchawiczaMedline#922774
FentanylWest-WardNDC 0641-6030-011– 4 i mikro; g/kg plaster transdermalny
Roztwór formaldehydu 10%Epredia94001
Płytki szklane  United ScientificB01MUHX6MR
Heparyna SoduŚrodekNDC 69-0058-021000U w 1 ml 3 mg / kg
Koc z gorącą wodą3M55577
IsofluranePenn Veterinary Supply, INCNDC 50989-606-151%– 3%
KetaminaDechraNDC 42023-138-1010 mg/kg IV
Lab Chart 7 Oprogramowanie do akwizycjiAdinstruments
Mleczanowy roztwór RingeraICUmedicalNDC 0990-7953-0910 mL/kg/h
LaryngoskopWelch Allyn68044
Cewnik do światła lewej komory  3FrMcKesson385764-EA
Lidokaina (1%)Pfizer4276-011– 1,5 ml/kg IV
Przetwornik LVDPEdwardPDP-ED
Pisak do znakowaniaViscot1451SR-100 Niesterylne
nożyczki MayoMayoS7-1098
MedetomidineFullyoly Pets PharmacyNDC 015914-005-010,25 mg/kg IM
Nożyczki MetzenbaumCole-ParmerUX-10821-05
Monastra. Niebieski pigment 98%ChemsaversMBTR1100G
Monocryl 5-0EthiconY463G
Zacisk na komaryShioda802N
PDS 3-0Ethicon42312201
Piezoelektryczne kryształy sonomikrometryczneSonometriaMałe 2mm okrągłe
PlegetsDeRoyal32-363
Povuine Jodine Prep SolutionsMedlineMDS093940
Precyzyjna maska na twarz z systemem waporyzacjiYuwellB07PNH69BF
Prolene 3-0Ethicon8665G
Proline 5-0Ethicon8661G
Sonda pulsoksymetrycznaMasimo9216-U
Rozsiewacz żeberMedlineMDS5621025
S12 Sonda sektora pediatrycznegoPhillips21380A
BZ10123724
Sterylna gazaMedline3.00802E+13
Sterylne ręcznikiMcKessonMON 277860EA
Retraktor mostkaMedlineMDS5610321
Szwy do zamknięciaJ& J Dental8698G
Monitor telemetrycznyMeditechMD908B
Sonda temperaturyOmegaKHSS-116G-RSC-12
Chlorek trifenylotetrazolu (1%)MiliporeMFCD00011963
RespiratorMedGroupMSLGA 11
Vicryl 2-0EthiconV635H
Winyl rurkaABEDISW 3001
Sonomikrometr Sonometria

Bibliografia

  1. Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
  2. Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
  3. Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
  4. Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
  5. Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
  6. Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
  7. Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
  8. Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
  9. Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
  10. McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
  11. Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336(2020).
  12. Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
  13. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discovery Today: Disease Models. 5 (3), 185-193 (2008).
  14. Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
  15. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  16. Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
  17. Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
  18. Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130(2015).
  19. Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
  20. Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
  21. Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D. Modeling cardiac ischemia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1080, 395-414 (2006).
  22. Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
  23. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
  24. Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
  25. McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
  26. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
  27. Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
  28. Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
  29. Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
  30. Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
  31. Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Uszkodzenie reperfuzyjnemodel serca królikaniedokrwienie mięśnia sercowegozamknięcie LADniedokrwienie regionalneprocedura torakotomiisternotomia pośrodkowapomiar echokardiograficznyskrócenie frakcyjnemartwica mięśnia sercowego
Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.