Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64763

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ustanowienie ciąży to dynamiczny proces obejmujący skomplikowane przenikanie się zarodków i macicy. Dokładny wkład środowiska macicy matki w te procesy pozostaje aktywnym obszarem badań. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły, które mają pomóc w projektowaniu modeli zwierzęcych in vivo, aby odpowiedzieć na te pytania badawcze.

Streszczenie

Aby ciąża mogła zostać stwierdzona, żywotna blastocysta musi skutecznie współdziałać z receptywną błoną śluzową macicy (endometrium), aby ułatwić implantację i tworzenie łożyska oraz umożliwić kontynuowanie ciąży. Ograniczenia w powodzeniu ciąży spowodowane wadami embrionalnymi są dobrze znane i zostały w dużej mierze przezwyciężone w ostatnich dziesięcioleciach wraz z rozwojem zapłodnienia in vitro (IVF) i technologii wspomaganego rozrodu. Do tej pory jednak dziedzina ta nie przezwyciężyła ograniczeń spowodowanych nieodpowiednio receptywnym endometrium, co doprowadziło do stagnacji wskaźników powodzenia IVF. Funkcje jajnika i endometrium są ze sobą ściśle powiązane, ponieważ hormony wytwarzane przez jajnik są odpowiedzialne za cykliczność miesiączkową endometrium. W związku z tym, podczas korzystania z modeli ciąży u gryzoni, może być trudno ustalić, czy obserwowany wynik jest spowodowany deficytem jajników czy macicy. Aby temu zaradzić, opracowano mysi model owariektomii z transferem zarodków lub sztucznym decydualizacją, aby umożliwić badanie specyficznego dla macicy wpływu na ciążę. W tym artykule znajdziesz instrukcje, jak przeprowadzić owariektomię i zaoferujemy wgląd w różne techniki dostarczania hormonów egzogennych w celu wsparcia udanej sztucznej decydualizacji lub ciąży po transferze zarodków od zdrowych dawców. Techniki te obejmują wstrzyknięcie podskórne, granulki o powolnym uwalnianiu i mini pompy osmotyczne. Omówione zostaną kluczowe zalety i wady każdej z metod, co umożliwi badaczom wybór najlepszego projektu badania dla ich konkretnego pytania badawczego.

Wprowadzenie

Wraz z rosnącym wykorzystaniem technologii wspomaganego rozrodu w ostatnich dziesięcioleciach, wiele barier w poczęciu zostało pokonanych, co pozwoliło wielu parom na założenie rodziny pomimo problemów z płodnością1. Deficyty oocytów lub plemników można często ominąć za pomocą zapłodnienia in vitro lub docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika; Jednak kwestie związane z receptywnością macicy i endometrium pozostają nieuchwytną "czarną skrzynką" potencjału reprodukcyjnego2.

Ciąża jest ustalana, gdy wysokiej jakości zarodek pomyślnie wchodzi w interakcję z receptywnym endometrium (błoną śluzową macicy). Szanse na pomyślne zajście w ciążę w danym cyklu miesiączkowym są niewielkie i wynoszą około 30%3,4. Spośród tych, którym się powiedzie, tylko 50%-60% przechodzi powyżej 20 tygodnia ciąży, przy czym niepowodzenie implantacji jest odpowiedzialne za 75% ciąż, które nie osiągają 20 tygodnia3. Pomimo tych danych sięgających końca lat 90., dziedzina ta nie przezwyciężyła jeszcze ograniczeń spowodowanych nieodpowiednio receptywnym endometrium. Doprowadziło to do stagnacji, a czasem spadku liczby udanych zapłodnień in vitro w ostatnich latach5,6.

Kobiety z niewyjaśnioną niepłodnością często mają przesunięte okno wrażliwości lub nie są w stanie osiągnąć receptywności z nieznanych powodów. Niedawno opracowano macierz receptywności endometrium, która ocenia ekspresję setek genów w celu dostosowania czasu transferu zarodka do indywidualnego okna receptywności7,8,9. Jednak w tej dziedzinie nadal brakuje wiedzy na temat patogenezy powikłań ciąży, które ujawniają się po zakończeniu procesu implantacji.

Żeński układ rozrodczy jest bardzo dynamiczny i znajduje się pod ścisłą kontrolą hormonalną. Oś podwzgórze-przysadka-gonady (HPG) kontroluje uwalnianie hormonu luteinizującego i hormonu folikulotropowego, które regulują aspekty cyklu jajnikowego, w tym dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych oraz aktywność estrogenu i progesteronu. Z kolei cykl menstruacyjny macicy jest regulowany przez estrogeny i progesteron10,11. Tak więc badanie mechanizmów biologicznych macicy jest skomplikowane ze względu na wpływ jajników. Na przykład, badając, w jaki sposób terapie przeciwnowotworowe mogą wpływać na macicę, może być trudno odróżnić, czy jakikolwiek zaobserwowany fenotyp macicy (taki jak utrata ciąży lub acykliczność miesiączkowania) jest wynikiem bezpośredniego uszkodzenia macicy, czy też wynikającego z uszkodzenia jajników.

Aby kompleksowo zrozumieć płodność, należy scharakteryzować wpływ macicy na ciążę. Co ważne, wiedza ta musi wykraczać poza funkcję macicy pod kontrolą jajników. Nie można tego badać u ludzi; Dlatego często stosuje się modele zwierzęce. W związku z tym owariektomia (OVX) jest powszechnie stosowana, aby umożliwić naukowcom regulację cykli rujowych gryzoni (analogicznie do cyklu miesiączkowego) poprzez egzogenne dostarczanie hormonów. Dodatkowo, OVX umożliwia badanie reakcji macicy niezależnie od wpływu jajników12. Jeśli jednak hormony nie zostaną natychmiast dostarczone po OVX, dojdzie do fenotypu menopauzy, który musi być dokładnie rozważony przez naukowców.

OVX jest często stosowany w modelach gryzoni13,14,15,16,17 i jest stosunkowo łatwy do wykonania po odpowiednim przeszkoleniu. Metody różnią się w zależności od tego, czy usuwa się sam jajnik, czy jajnik i jajowód, a także w zależności od wieku zwierzęcia (dorosłe, jeżdżące na rowerze zwierzęta mają większe jajniki z widocznym ciałkiem żółtym na ich powierzchni, co oznacza, że ich jajniki są łatwiejsze do uwidocznienia). Podobnie, istnieje wiele metod suplementacji hormonalnej, w tym zastrzyki podskórne14, granulki o spowolnionym uwalnianiu15, mini pompy osmotyczne18 oraz przeszczep jajników.

W tym artykule znajdują się szczegółowe instrukcje, jak przeprowadzić owariektomię i przygotować trzy rodzaje suplementacji hormonalnej, w tym zastrzyki podskórne, granulki o spowolnionym uwalnianiu i mini pompy osmotyczne. Podano dwa szczegółowe protokoły dla eksperymentalnych punktów końcowych, które są korzystne dla OVX, a następnie suplementacji hormonami egzogennymi (transfer zarodków i sztuczne decydualizacja). W tym artykule omówiono mocne i słabe strony każdego podejścia, mając na celu wskazanie badaczom, jak przeprowadzać badania w celu wyizolowania wpływu na macicę, szczególnie w dziedzinie badań nad ciążą i płodnością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były trzymane w obiektach o kontrolowanej temperaturze, wysokich barierach (Monash University Animal Research Laboratory) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody oraz 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą komisji etycznej Monash Animal Research Platform (#21908, 17971) i wykonane zgodnie z Kodeksem postępowania Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt.

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazę i ręczniki papierowe wymagane do zabiegów należy sterylizować w autoklawie w cyklu twardych/suchych materiałów w temperaturze 121 °C z czasem utrzymywania 30 minut i czasem schnięcia 30 minut.
  2. Rozłóż sterylną podkładkę na ławkę do miejsca pracy chirurgicznej i przygotuj leki przeciwbólowe.
    1. Rozcieńczyć karprofen w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do 1 mg/ml i rozcieńczyć bupiwakainę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do 0,5% (w/v) roztworu.
    2. Dodaj 3,5 ml meloksykamu do 400 ml butelki z wodą w klatce.
  3. Wstępnie podgrzej poduszki grzewcze do klatek regeneracyjnych i ustaw lampy grzewcze tak, aby świeciły pośrednim światłem na powracające do zdrowia zwierzęta.
  4. Upewnij się, że noszone są wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym siatka na włosy, maska na twarz, fartuch i rękawiczki.
  5. Stosuj dobrą technikę sterylną, w tym regularne spryskiwanie rękawic etanolem i pozwalanie im odparować przed kontaktem ze zwierzętami lub narzędziami chirurgicznymi, aby uniknąć zanieczyszczenia etanolem.

2. Wykonywanie jajnikomii

  1. Za pomocą aparatu do znieczulenia gazowego z izofluranem należy wstępnie napełnić pojemnik indukcyjny na 3-5 minut przy 5% izofluranie o natężeniu przepływu ustawionym na 4 l/min.
  2. Umieść mysz w pudełku indukcyjnym, a gdy stracisz przytomność, przesuń ją do stożka nosowego i zmniejsz natężenie przepływu do 0,4 l/min, z parownikiem izofluranu ustawionym na ~2,5%.
    UWAGA: Procentowa zawartość izofluranu stosowana w pozostałej części procedury różni się w zależności od szczepu myszy, wieku i ekspozycji na leczenie (np. chemioterapię) i powinna być dostosowana w oparciu o dokładną ocenę wzorców oddychania każdego zwierzęcia. Wzorce oddychania powinny pozostać takie same jak regularne oddechy brzuszne. Szybkie oddechy w klatce piersiowej mogą wskazywać, że głęboka płaszczyzna chirurgiczna nie została osiągnięta lub utrzymana; W takim przypadku należy dostosować zawartość procentową parownika Isoflurane, jeśli to konieczne.
  3. Nałóż obficie lubrykant pod oczy, ściskając tubkę i delikatnie wklepując w oko.
  4. Ogol niewielki obszar (2 cm x 2 cm) na i poniżej zgarbienia kręgosłupa.
  5. Podawać 5 mg/kg karprofenu z rozcieńczonego roztworu 1 mg/ml podskórnie w kark szyi.
  6. Przetestuj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palca u nogi, ściskając tylny palec myszy . Jeśli nie ma reakcji na uszczypnięcie palca, zwierzę znajduje się w głębokiej płaszczyźnie chirurgicznej, a procedura może być kontynuowana.
  7. Nałóż betadynę na obszar operacyjny i przykryj serwetą chirurgiczną (gazą z wyciętym okienkiem o wymiarach 2 cm x 2 cm).
  8. Za pomocą kleszczy z zębami szczura pociągnij skórę przy garbie pleców do góry i wykonaj podłużne nacięcie ~5 mm.
    UWAGA: Nacięcie skóry na tej wysokości na grzbiecie zwierzęcia jest najlepsze do umieszczenia klipsa chirurgicznego, aby zmniejszyć ryzyko usunięcia klipsów przez zwierzę i konieczności naprawy klipsa.
  9. Używając kleszczy, przystąp do wycinania skóry z dala od leżącej pod spodem warstwy mięśni, przesuwając się w dół i na bok w kierunku nerki.
  10. Zidentyfikuj wizualnie nerki, jajnik i poduszeczkę tłuszczową jajnika przez ścianę mięśniową.
    UWAGA: Nerka będzie miała ciemnoczerwony kolor, poduszeczka tłuszczowa będzie jasnobiała, a jeśli będzie widoczna, jajnik będzie wyglądał jak mała różowa kropka w poduszce tłuszczowej.
  11. Za pomocą kleszczy chwyć i podnieś warstwę mięśni. Wykonaj nacięcie ~0,5-1 cm ostrymi nożyczkami chirurgicznymi. Kontynuuj trzymanie ściany mięśniowej kleszczami i zmień nożyczki na kleszcze, aby przeciągnąć poduszeczkę tłuszczową jajnika przez nacięcie.
  12. Za pomocą zakrzywionego uchwytu igły zacisnąć pod jajnikiem i jajowód na dystalnym końcu rogu macicy.
    UWAGA: Alternatywnie można usunąć sam jajnik, pozostawiając jajowód nienaruszony. Jednak mikroskop preparacyjny jest wymagany, aby dokładnie uwidocznić różnicę między jajnikiem a jajowodem.
  13. Usuń jajnik nożyczkami lub skalpelem. Kontynuuj zaciskanie przez 30 sekund, aby uniknąć nadmiernego krwawienia.
  14. Zdejmij zacisk i w razie potrzeby przetrzyj go sterylną gazą.
  15. Aby zamknąć nacięcie ściany mięśniowej, użyj kleszczy, aby podnieść górną część nacięcia, tak aby nacięcie naturalnie się połączyło.
  16. Użyj jedwabnych szwów (rozmiar 3-0), aby zamknąć nacięcie ściany mięśniowej węzłem chirurgicznym.
  17. Nanieść miejscowo dwie do trzech kropli bupiwakainy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml bez dołączonej igły i powtórzyć kroki 2,9-2,17 po drugiej stronie.
  18. Aby zamknąć nacięcie skóry, użyj gazy, aby osuszyć obszar z nadmiaru bupiwakainy i ściśnij obie strony skóry razem.
  19. Zastosuj jeden lub dwa klipsy chirurgiczne o średnicy 7 mm, pozostawiając miejsce na obrzęk w ramach procesu gojenia.
  20. Przenieś mysz do klatki odzyskiwania i uważnie monitoruj przez 15 minut.
    UWAGA: Zwierzęta powinny się szybko obudzić; Pamiętaj, aby uważnie monitorować oddech pod kątem normalnych wzorców oddychania w klatce piersiowej.

3. Preparat hormonalny: wstrzyknięcie podskórne

  1. Przygotować 1 mg/ml roztwór podstawowy estradiolu.
    1. Odważyć 0,001 g (1 mg) estradiolu w proszku do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodaj 1 ml 100% etanolu do probówki i wiruj przez kilka sekund.
      UWAGA: Etanol pozostanie klarowny z widocznymi drobinkami estradiolu w proszku.
    3. Owiń rurkę folią, aby zapobiec parowaniu etanolu.
    4. Zawiń probówkę w folię aluminiową i umieść ją na noc na kołysce, aby całkowicie rozpuścić proszek estradiolu.
    5. Rozcieńczyć ten 1 mg/ml bulionu w oleju sezamowym do pożądanego stężenia końcowego.
      UWAGA: Dawki 100 ng przez 3 dni są wymagane do gruntowania przed sztucznym decydualizacją, a dodatkowe niskie dawki 25 ng są wymagane, gdy podawany jest progesteron. Ma to na celu zwalczanie pętli sprzężenia zwrotnego kontrolującej ekspresję receptora progesteronu. Do transferu zarodków wymagane są dwie dawki po 100 ng w dniu 1 i w dniu 3 przed transferem zarodków w dniu 4. W momencie transferu zarodków wymagana jest również niska dawka 25 ng.
    6. Pobrać wymaganą ilość estradiolu zawartego w oleju do strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie założyć końcówkę igły o pojemności 26 G.
    7. Odpowiednią dawkę wstrzyknąć podskórnie (w kark lub bok; 100 ng/100 μl lub 25 ng/100 μl do przygotowania przed transferem zarodka lub sztucznym decydualizacją lub w czasie transferu zarodka) z wymaganą częstotliwością.
      UWAGA: Olej jest bardzo lepki, więc należy wstrzykiwać go powoli i zrobić przerwę na kilka sekund przed wyjęciem igły. Zminimalizuje to ilość oleju, który wycieka z miejsca wtrysku.
  2. Przygotować 200 mg/ml roztworu podstawowego progesteronu.
    1. Odważyć 0,4 g (400 mg) progesteronu w proszku do sterylnej probówki o pojemności 5 ml.
    2. Dodaj 2 ml 100% etanolu do probówki i wiruj przez kilka sekund.
      UWAGA: Etanol stanie się biały
      3. .
    3. Powtórz kroki 3.1.3-3.1.4.
    4. Rozcieńczyć 200 mg/ml bulionu w oleju sezamowym do pożądanego stężenia końcowego.
      UWAGA: Dawki 2 mg na dobę są wymagane do wspomagania transferu zarodków.
    5. Odpowiednią dawkę (np. 2 mg/100 μl na dobę w celu utrzymania ciąży) należy wstrzyknąć podskórnie, jak opisano w krokach 3.1.6-3.1.7.

4. Preparat hormonalny: granulki o spowolnionym uwalnianiu

  1. Połóż folię na powierzchni okapu z przepływem laminarnym lub okapu bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  2. Umieść cały sprzęt (rękawiczki, szalki Petriego, strzykawki 1 ml, kleszcze) w kapturze i włącz UV na 20 minut
    UWAGA: Nie włączaj UV, gdy uszczelniacz znajduje się wewnątrz okapu, ponieważ się ustawi.
  3. Umyj rurkę silastyczną w 100% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w okapie. Po wyschnięciu zaznacz odcinki ~1 cm wzdłuż rurki i przetnij skalpelem.
  4. Wyjąć tłok ze strzykawki i wcisnąć ~200 μl szczeliwa. Wymienić tłok i wycisnąć niewielką ilość szczeliwa ze strzykawki.
  5. Nałóż niewielką ilość szczeliwa na jeden koniec rurki i wygładź go palcem w rękawiczce.
  6. Pozostaw do wyschnięcia na noc lub na 20-30 minut w świetle UV wewnątrz okapu.
  7. Wlej odpowiednią ilość progesteronu do wysterylizowanej szalki Petriego. Za pomocą kleszczy nabierz granulki do proszku progesteronu, aby napełnić granulkę.
    1. Postukaj w szczelny koniec granulki o powierzchnię kaptura, aby skondensować progesteron. Alternatywnie, użyj końcówki wysterylizowanych kleszczy, aby wepchnąć progesteron. Pozostaw wystarczająco dużo miejsca na więcej szczeliwa.
  8. Uszczelnij otwarty koniec szczeliwem, jak opisano w krokach 3.4-3.5.
  9. Zawiń szalkę Petriego zawierającą granulki progesteronu w folię, aby chronić ją przed światłem.
  10. Aktywować granulki przez co najmniej 72 godziny przed podskórnym wprowadzeniem przez inkubację w 1% FCS pozbawionym węgla drzewnego (cs-FCS: PBS) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pelety można wytwarzać luzem z pojedynczym uszczelnionym końcem z góry. Jednak za każdym razem do ich wypełnienia należy stosować świeży progesteron. Upewnij się, że gotowe granulki są sterylizowane promieniami UV przed napełnieniem progesteronem. Granulki będą wydzielać ~ 500 μg / dzień przez 6-10 dni, co jest wystarczającym wsparciem dla procedur sztucznego decydualizacji i transferu zarodków, chociaż może być wymagane dodatkowe wstrzyknięcie estrogenu w niskiej dawce, aby utrzymać aktywność receptora progesteronu przez 4-5 dni. Po upływie 10 dni może być wymagana wymiana granulki progesteronu.

5. Preparat hormonalny: Mini pompy osmotyczne

  1. Przygotuj progesteron w żądanym stężeniu w roztworze wodnym i wybierz odpowiedni model mini pompy osmotycznej (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: W przypadku punktu 7 (procedura doświadczalna: transfer zarodków) wymagane jest podawanie 2 mg/dobę przez 12 dni. Dlatego rozpuść 28 mg progesteronu w ~100 μl sterylnej wody na zwierzę (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konkretnej objętości). Mogą być wymagane seryjne rozcieńczenia. W przypadku sekcji 8 (procedura doświadczalna: sztuczne decydualizacja) wymagane jest podawanie 500 μg dziennie przez 3 dni. Dlatego rozpuść 1,500 μg progesteronu w ~100 μL sterylnej wody na zwierzę. Przygotuj dodatkowy roztwór, aby uwzględnić objętość utraconą podczas procedury napełniania.
  2. Ustaw sprzęt (rękawice, chusteczki niestrzępiące się, szalki Petriego, sterylną sól fizjologiczną, strzykawki o pojemności 1 ml, małe łódeczki wagowe, folię i wagę o dokładności do 0,01 g) w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, a następnie włącz promieniowanie UV na 20 minut.
  3. Pobrać roztwór hormonu do strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie założyć sterylną rurkę do napełniania, ostrożnie upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Zważyć pompę i jej moderator przepływu w sterylnej łódce wagowej.
  5. Włóż rurkę napełniającą przez otwór w górnej części pompy, aż nie będzie mogła iść dalej.
  6. Trzymając pompę w pozycji pionowej, powoli naciskać tłok strzykawki, aby napełnić rurkę.
    UWAGA: Należy unikać szybkiego napełniania, ponieważ może to spowodować wprowadzenie pęcherzyków powietrza do pompy.
  7. Gdy roztwór wyleje się z górnej części pompy, delikatnie wyjmij rurkę napełniającą i zetrzyj nadmiar roztworu sterylną, niestrzępiącą się chusteczką.
  8. Włóż regulator przepływu przez otwór w górnej części pompy, aż nie będzie mógł iść dalej. Po całkowitym włożeniu mocno dociśnij do siebie pompę i moderator przepływu.
  9. Zważyć napełnioną pompę z założonym regulatorem przepływu.
    UWAGA: Różnica w masie uzyskana z kroku 5.3 i kroku 5.8 da masę netto załadowanego roztworu (tj. wzrost o 0,1 g = 100 μl dodanego roztworu).
  10. Umieść napełnioną pompę na sterylnej szalce Petriego wypełnionej sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
  11. Po napełnieniu wszystkich pomp zawiń szalkę Petriego w folię i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 4-6 godzin (lub do momentu, gdy będzie gotowa do użycia).

6. Zabieg chirurgiczny: Wprowadzenie podskórnych granulek hormonów i mini pompek

  1. Przygotować obszar zgodnie z punktem 1 (przygotowanie chirurgiczne).
  2. Znieczulić zwierzęta zgodnie z krokami 2.1-2.3.
  3. Ogol niewielki obszar na karku (~1 cm x 1 cm).
  4. Podawać 5 mg/kg karprofenu z rozcieńczonego roztworu 1 mg/ml podskórnie w bok nogi.
  5. Przetestuj odruch szczypania palców u stóp. Jeśli nie ma odruchu, zwierzę znajduje się w głębokiej płaszczyźnie chirurgicznej i można rozpocząć procedurę.
  6. Nałóż betadynę na obszar operacyjny i przykryj go serwetą chirurgiczną (gaza z wyciętym okienkiem o wymiarach 2 cm x 2 cm).
  7. Za pomocą kleszczy z zębami szczura pociągnij skórę na karku szyi (w połowie odległości między prawdziwym karkiem a garbem pleców) do góry i wykonaj podłużne nacięcie ~5 mm.
  8. Za pomocą kleszczy odetnij skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśni w kierunku w dół.
    UWAGA: W celu włożenia mini pompy osmotycznej należy utworzyć kieszeń wzdłuż jednej strony zwierzęcia, tak aby pompka nie ograniczała ruchów zwierzęcia ani nie naciskała na miejsce nacięcia.
  9. Po zrobieniu wystarczającej ilości miejsca na granulat hormonu lub mini pompkę, użyj sterylnych kleszczyków, aby podnieść granulkę lub mini pompkę i włóż ją do kieszeni podskórnej wykonanej rozwarstwieniem.
  10. Aby zamknąć nacięcie skóry, upewnij się, że granulka lub mini pompka znajduje się wystarczająco głęboko w kieszeni, aby klipsy chirurgiczne jej nie uszkodziły.
  11. Bupiwakainę należy stosować miejscowo zgodnie z krokiem 2.17.
  12. Zamknij ranę jednym klipsem chirurgicznym. Przenieś mysz do klatki odzyskiwania i uważnie monitoruj przez 15 minut. Ponieważ jest to krótka procedura, zwierzęta powinny być w stanie przejść do ruchu ambulatoryjnego w ciągu kilku minut.

7. Procedura eksperymentalna: transfer zarodków

  1. W przypadku zwierząt poddanych owariektomii, hormon prime na 3 dni przed transferem zarodka poprzez podskórne wstrzyknięcie 100 ng/100 μl estradiolu (krok 3.1).
  2. Na dzień przed transferem zarodków należy przygotować zwierzęta hormonalnie za pomocą podskórnego wstrzyknięcia 2 mg/100 μl octanu medroksyprogesteronu (krok 3.2).
  3. Przygotować obszar zgodnie z punktem 1 (przygotowanie chirurgiczne).
  4. Znieczulić zwierzęta zgodnie z krokami 2.1-2.3.
  5. Rozpocznij procedurę zgodnie z krokami 2.4-2.10.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym utworzyć wewnątrzmaciczny punkt iniekcji za pomocą końcówki igły 26 G.
  7. Odpipetuj pięć blastocyst do kropli M2 Media, a następnie przenieś je do rogu macicy.
  8. Aby zamknąć nacięcie ściany mięśniowej, podnieś górną część nacięcia za pomocą kleszczy, tak aby nacięcie naturalnie się połączyło.
  9. Za pomocą jedwabnych szwów zamknij miejsce ściany mięśniowej węzłem chirurgicznym. Krople bupiwakainy należy stosować miejscowo.
  10. Powtórz kroki 7.5-7.8 po drugiej stronie.
  11. Aby zamknąć nacięcie skóry, użyj gazy, aby osuszyć obszar z nadmiaru bupiwakainy i ściśnij obie strony skóry razem.
  12. Zastosuj jeden lub dwa klipsy chirurgiczne, pozostawiając miejsce na obrzęk w ramach procesu gojenia.
    UWAGA: Jeśli zwierzęta są poddawane owariektomii, w momencie transferu zarodków wymagane są hormony egzogenne. Albo wstrzyknąć podskórnie progesteron (2 mg), albo wprowadzić podskórnie granulkę progesteronu lub mini pompkę osmotyczną. Aby zwalczyć nadmiar progesteronu, w momencie transferu zarodków wymagane jest podskórne wstrzyknięcie małej dawki (25 ng/100 μl) estrogenu.
  13. Ostrożnie przenieś mysz do klatki odzyskiwania i uważnie monitoruj przez 15 minut.
    UWAGA: Zwierzęta powinny się szybko obudzić; Pamiętaj, aby uważnie monitorować oddech pod kątem normalnych wzorców oddychania w klatce piersiowej.

8. Procedura eksperymentalna: Sztuczne decydualizacja

  1. Hormonalnie zaszczepić zwierzęta 100 ng / 100 μl estradiolu w dniu 1, dniu 2 i dniu 3, zgodnie z sekcją 3 (przygotowanie hormonu: wstrzyknięcie podskórne) 8 dni przed sztucznym decydualizacją.
  2. Hormony należy zaszczepić zwierzęta 5 ng/100 μl estradiolu w 7, 8. i 9. dniu, zgodnie z sekcją 3 (przygotowanie hormonu: wstrzyknięcie podskórne) na 2 dni przed sztucznym zdziesiątkowaniem.
    UWAGA: Ostatnie wstrzyknięcie musi nastąpić co najmniej 3 godziny (a maksymalnie 4 godziny) przed zabiegiem sztucznego decydualizacji.
  3. Zwierzęta z hormonami z podskórnym granulem progesteronu lub mini pompą osmotyczną (500 μg / dzień), zgodnie z sekcją 4, sekcją 5 i sekcją 8, 2 dni przed sztucznym zdziesiątkowaniem.
  4. Przygotować obszar zgodnie z punktem 1 (przygotowanie chirurgiczne).
  5. Znieczulić zwierzęta zgodnie z krokami 2.1-2.2.
  6. Przetestuj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palca u nogi. Jeśli nie ma reakcji na uszczypnięcie palca, zwierzę znajduje się w głębokiej płaszczyźnie chirurgicznej, a procedura może być kontynuowana.
  7. Umieść mysz w pozycji leżącej, unieś ogon i powoli włóż wziernik o średnicy 6 mm do pochwy.
  8. Trzymając nos zwierzęcia w stożku znieczulającym nos, umieść dolną część ciała zwierzęcia między pierwszym i drugim palcem ręki niedominującej. Użyj kciuka, aby delikatnie popchnąć ogon do góry, aby otwór pochwy był widoczny.
  9. Przenieś 20 μl oleju sezamowego do jednego rogu macicy za pomocą niechirurgicznej końcówki do transferu zarodków (dołączonej do pipety o pojemności 20 μl).
    1. Trzymając pipetę na poziomie otworu pochwy, włóż końcówkę do pochwy i przez szyjkę macicy do rogu macicy. Gdy końcówka znajdzie się w rogu macicy, delikatnie dociśnij końcówkę do powierzchni endometrium (jeśli używasz powyższej techniki obsługi, ruch ten będzie wyczuwalny na drugim palcu) i powoli wydalaj olej.
      UWAGA: Trzymaj tłok pipety wciśnięty, odczekaj 10 sekund, aby upewnić się, że cały olej się rozproszył, i powoli wyjmij końcówkę transferową, trzymając tłok wciśnięty.
  10. Usuń wziernik z pochwy.
  11. Ostrożnie przenieś mysz do klatki odzyskiwania i uważnie monitoruj przez 15 minut.
    UWAGA: Zwierzęta powinny się szybko obudzić. Uważnie monitoruj ich oddech pod kątem normalnych wzorców oddychania w klatce piersiowej.
  12. Należy ograniczyć obchodzenie się ze zwierzętami i trzymać je w cichym otoczeniu przez 96 godzin po zabiegu.
    UWAGA: Głośne dźwięki lub nagłe zmiany ich cyklu światła i ciemności będą miały wpływ na powodzenie zabiegu. W momencie rozwarstwienia tkanki stopień powodzenia decydualizacji można zmierzyć jako stosunek masy macicy do masy ciała. Procedura sztucznego decydualizacji ma 80% wskaźnik sukcesu. Dlatego należy wykluczyć zwierzęta, które nie są w stanie dokonać decydualności, i uwzględnić to przy wyborze wielkości próby do eksperymentów.

9. Zabieg chirurgiczny: rekonwalescencja pooperacyjna, monitorowanie i naprawa klipsów

  1. Pozwól zwierzętom odzyskać częściowo założone, częściowo zdjęte poduszki grzewcze przez noc przed powrotem do klatki domowej.
  2. Monitoruj zwierzęta codziennie przez 5 dni po operacji, zwracając szczególną uwagę na miejsce rany pod kątem oznak infekcji.
  3. W razie potrzeby wykonaj naprawę zacisku.
    1. Przygotować obszar zgodnie z punktem 1 (przygotowanie chirurgiczne).
    2. Znieczulić zwierzęta zgodnie z krokami 2.1-2.3.
    3. Usuń istniejący klip za pomocą narzędzia do usuwania klipów, jeśli klip jest nadal obecny.
    4. Zastosuj nowy klips chirurgiczny, zgodnie z krokami 2.19-2.21.
  4. Klipsy chirurgiczne należy usunąć 7 dni po operacji, zgodnie z krokami 9.3.1-9.3.3 lub gdy zwierzę jest w następnej narkozie (np. w przypadku transferu zarodków, procedury sztucznego decydualizacji lub wstrzyknięcia podskórnego po operacji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej publikacji opisano dobrze scharakteryzowany model sztucznej decidualizacji (Rycina 1A). W tym modelu młode dorosłe myszy żeńskie (w wieku 8 tygodni) poddano chirurgicznej owariektomii, zgodnie z opisem w sekcji 1 i sekcji 2. Następnie myszy pozostawiono na 2 tygodnie, aby zapewnić całkowity zanik endogennych hormonów jajnika przed rozpoczęciem podaży hormonów egzogennych, opisanej w sekcjach 3-7 oraz sekcji 9. Sztuczną decidualizację wywołano poprzez dopoch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać OVX i dostarczyć hormony egzogenne do badań koncentrujących się na zrozumieniu wpływu macicy na ciążę i płodność. Podano dwa szczegółowe protokoły dotyczące dwóch eksperymentalnych zastosowań tych metod, w tym przeprowadzania transferu zarodków i sztucznego wywoływania decydualizacji.

Chociaż wykonywanie OVX może być początkowo trudne - szczególnie dla badaczy początkujących w modelach gryzoni - jest to stosunkowo prosta procedura, gdy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub innych.

Podziękowania

Ta praca była możliwa dzięki Wsparciu Infrastruktury Operacyjnej Rządu Stanu Wiktoria oraz Narodowej Radzie ds. Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Rządu Australii IRIISS. Prace te były wspierane przez Wydział Medycyny, Pielęgniarstwa i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Monash Grant Access Grant dla A.L.W. (Winship-PAG18-0343) w celu uzyskania dostępu do platformy usług reprodukcyjnych Monash. A.L.W. jest wspierany przez DECRA DE21010037 finansowania z Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (ARC). J.N.H. i L.R.A. są wspierane przez stypendium Australijskiego Rządowego Programu Szkoleń Badawczych. L.R.A. jest wspierana przez stypendium Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. jest wspierany przez FT190100265 ARC Future Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mini pompy osmotyczne ALZET 1002BioScientific1002Dostarcza 0,25 &mikro; L/h przez 14 dni. Stosowanie w sekcji 7 (Procedura doświadczalna - Transfer zarodków).
Mini pompy osmotyczne ALZET 1003DBioScientific1003DDostarcza 1 i mikro; L/h przez 14 dni. Stosować w sekcji 8 (Procedura doświadczalna - Sztuczne decydualizowanie).
Klipsy ALZET Reflex 7 mmBioScientific0009971W zależności od preferencji do zamykania ran można używać klipsów Reflex lub klipsów Michel, w zależności od preferencji
Aplikator klipsów ALZET ReflexBioScientific0009974Do zamykania ran można używać klipsów Reflex lub klipsów Michel, w zależności od preferencji
Do usuwania klipsów ALZET ReflexBioScientific0009976Do zamykania ran można użyć klipsów Reflex lub klipsów Michel, w zależności od preferencji
Bupiwakaina do wstrzykiwańPfizerNAStock 0,5%. Stosować w stężeniu 0,05% w soli fizjologicznej
EstradiolSigmaE8875
MeloxicamIliumNASkładnik aktywny 0,5 mg/ml. Użyj 3,5 ml na 400 ml butelki z klatką lub zgodnie z zaleceniami weterynarza Twojej instytucji.
Klipsy MichelDanielsNS-000242
Wielofunkcyjny uszczelniaczDow Corning732
Niechirurgiczne urządzenie do transferu zarodków (NSET)ParaTechs60010Zawiera wziernik 6 mm. Tylko do jednorazowego użytku.
ProgesteronSigmaP0130Rozpuszczalny w etanolu. Posługiwać się do  sekcja 3 (Preparat hormonalny - wstrzyknięcie podskórne) i  sekcja 4 (Preparat hormonalny - granulki o powolnym uwalnianiu)
ProgesteronSigmaP7556Rozpuszczalny w wodzie. Stosować w sekcji 5 (Preparat hormonalny - mini pompy osmotyczne)
Odświeżająca maść do oczuAllerganNA42,5% w/v ciekła parafina, 57,3% w/v miękka biała parafina
Rimadyl CarprofenZoetisNAStock 50 mg/mL. Stosować w dawce 1 mg/ml (dla dawki 5 mg/kg)
Rurka gumowaDow Corning508-008Umyte w 100% etanolu i pokrojone na 1 cm kawałki. Średnica wewnętrzna 1,57 mm ±   0,23 mm; średnica zewnętrzna 3,18 mm ± 0,23 mm; ścianka 0,81 mm.
Olej sezamowySigmaS3547
Szwy Sofsilk Silk rozmiar 3-0CovidienGS-832

Bibliografia

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sztuczna decidualizacjatransfer zarodkaegzogenne podawanie hormon winiekcja podsk rnapellety progesteronureceptywno endometriumr g macicy
Metody badania wkładu macicy w powstanie ciąży w mysim modelu owariektomii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.