Artykuł metodologiczny

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena specyficznych dla typu komórki zmian epigenomicznych i transkryptomicznych jest kluczem do zrozumienia starzenia się jajników. W tym celu przeprowadzono optymalizację metody oczyszczania translacji powinowactwa rybosomów (TRAP) oraz metodę izolacji jąder znakowanych określonymi typami komórek (INTACT) w celu późniejszego sparowanego badania transkryptomu i epigenomu jajników specyficznych dla komórki przy użyciu nowego transgenicznego modelu myszy NuTRAP. Ekspresja allelu NuTRAP jest kontrolowana przez kasetę STOP z floksacją i może być ukierunkowana na określone typy komórek jajnika za pomocą linii Cre specyficznych dla promotora. Ponieważ ostatnie badania wykazały, że komórki zrębu jajnika odpowiadają za fenotypy przedwczesnego starzenia, system ekspresji NuTRAP został ukierunkowany na komórki zrębu przy użyciu sterownika Cyp17a1-Cre. Indukcja konstruktu NuTRAP była specyficzna dla fibroblastów zrębu jajnika, a z pojedynczego jajnika uzyskano wystarczającą ilość DNA i RNA do badań sekwencjonowania. Przedstawiony tu model NuTRAP i przedstawione metody mogą być wykorzystane do badania dowolnego typu komórek jajnika z dostępną linią Cre.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajniki odgrywają główną rolę w starzeniu się somatycznym1, z wyraźnym udziałem określonych populacji komórek. Heterogeniczność komórkowa jajnika utrudnia interpretację wyników molekularnych z masowych testów całego jajnika. Zrozumienie roli określonych populacji komórek w starzeniu się jajników jest kluczem do zidentyfikowania czynników molekularnych odpowiedzialnych za płodność i pogorszenie stanu zdrowia u starszych kobiet. Tradycyjnie, multiomiczna ocena określonych typów komórek jajnika była osiągana za pomocą technik takich jak mikrodysekcja laserowa2, podejścia jednokomórkowe3 lub sortowanie komórek4. Jednak mikrodysekcja może być kosztowna i trudna do przeprowadzenia, a sortowanie komórek może zmienić profile fenotypowe komórek5.

Nowatorskie podejście do oceny profili epigenomicznych i transkryptomicznych specyficznych dla komórek jajnika wykorzystuje mysi model NuTRAP (nuclear tagging and transling ribosomity affinity purification). Model NuTRAP umożliwia izolację kwasów nukleinowych specyficznych dla danego typu komórki bez konieczności sortowania komórek przy użyciu metod oczyszczania powinowactwa: translacji oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) i izolacji jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT)6. Ekspresja allelu NuTRAP jest kontrolowana przez kasetę STOP z floksacją i może być ukierunkowana na określone typy komórek jajnika za pomocą linii Cre specyficznych dla promotora. Poprzez skrzyżowanie myszy NuTRAP z linią Cre specyficzną dla typu komórki, usunięcie kasety STOP powoduje znakowanie eGFP kompleksu rybosomalnego i znakowanie biotyny/mCherry jądra w sposób zależny od Cre6. Techniki TRAP i INTACT mogą być następnie wykorzystane do wyizolowania mRNA i jądrowego DNA z interesującego typu komórki i przejścia do analiz transkryptomicznych i epigenomicznych.

Model NuTRAP został użyty w różnych tkankach, takich jak tkanka tłuszczowa6, brain tissue7,8,9, oraz retina10, aby ujawnić specyficzne dla typu komórki zmiany epigenomiczne i transkryptomiczne, które mogą nie być wykryte w homogenacie całej tkanki. Korzyści płynące z podejścia NuTRAP w porównaniu z tradycyjnymi technikami sortowania komórek obejmują: 1) zapobieganie artefaktom aktywacyjnym ex vivo8, 2) zminimalizowane zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt (tj. sortery komórek) oraz 3) zwiększona przepustowość i obniżone koszty analiz specyficznych dla typu komórek. Ponadto zdolność do izolowania DNA i RNA specyficznych dla danego typu komórki od jednej myszy pozwala na analizy sparowane, które zwiększają moc statystyczną. Ponieważ ostatnie badania wykazały związek komórek zrębu jajników z fenotypami przedwczesnego starzenia się11,12,13, skierowaliśmy system ekspresji NuTRAP do komórek zrębu i osłonki za pomocą sterownika Cyp17a1-Cre. Tutaj pokazujemy, że indukcja konstruktu NuTRAP jest specyficzna dla komórek zrębu jajnika i osłonki, a z pojedynczego jajnika uzyskuje się wystarczającą ilość DNA i RNA do badań sekwencjonowania. Przedstawiony tu model NuTRAP i metody mogą być wykorzystane do badania dowolnego typu komórek jajnika z dowolną dostępną linią Cre.

Do wytworzenia specyficznej dla typu komórki linii myszy NuTRAP, allel NuTRAP do znakowania jądrowego i translacji powinowactwa rybosomów (NuTRAP) ma floksowany kodon STOP, który kontroluje ekspresję BirA, peptydu rozpoznającego ligazę biotyny (BLRP) oznaczonego mCherry/mRANGAP1 i eGFP/L10a. Po skrzyżowaniu z linią Cre specyficzną dla typu komórki, ekspresja kasety NuTRAP znakuje białko jądrowe mRANGAP1 biotyną/mWiśnią, a białko rybosomalne L10a eGFP w sposób zależny od Cre. Pozwala to na izolację jąder i mRNA od określonych typów komórek bez konieczności sortowania komórek. W celu oceny tego można połączyćklocek/flox NuTRAP z Cre specyficznym dla typu komórki, istotnym dla typów komórek jajnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Myszy rodzicielskie zakupiono w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i wyhodowano oraz trzymano w warunkach SPF w środowisku barierowym HEPA w cyklu 14 godzin / 10 godzin światła / ciemności (światła włączone o 6:00 rano) w OMRF.

UWAGA: W tej demonstracji używamy samca Cyp17iCre+/−(Szczep # 028547, The Jackson Laboratory) sparowanego z samicą NuTRAP (Szczep # 029899, The Jackson Laboratory). Pożądane potomstwo Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) będzie wykazywać ekspresję allelu NuTRAP pod kontrolą promotora Cyp17a1 w komórkach zrębu jajników. Do przygotowania manuskryptu użyliśmy 4-miesięcznych samic myszy Cyp17-NuTRAP (n = 4). DNA wyekstrahowano z próbek kolczyka w uszach myszy w celu genotypowania w celu potwierdzenia dziedziczenia transgenów Cyp17iCre i NuTRAP oraz w celu wykrycia PCR 1) generycznego Cre, 2) Cyp17iCre i 3) NuTRAP floxowanego przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli Materiałów, jak opisano wcześniej7,8.

1. Rozwarstwienie jajników myszy

  1. Przeprowadzić eutanazję myszy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zgodą instytucji, a następnie pobrać jajniki.
  2. Wypreparuj jajniki w celu usunięcia tkanki tłuszczowej lub części jajowodów, które mogą być przyczepione do tkanki jajnika, przed umieszczeniem jajników w rurkach z buforem. Natychmiast przejdź do technik PUŁAPKI lub INTACT.
    UWAGA: Ten protokół nie został zoptymalizowany do użytku z zamrożoną tkanką. Użycie jednego jajnika z tej samej myszy dla każdej techniki jest zalecane do przyszłej analizy statystycznej.

2. Izolacja jąder od określonych typów komórek jajnika

  1. Przygotowanie buforu
    1. Bufor do oczyszczania jądrowego (NPB): Aby przygotować 100 ml NPB, połącz 2 ml 1 M HEPES (końcowe stężenie: 20 mM HEPES), 0,8 ml 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 ml 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 ml 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 ml 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), i 92,2 ml wody wolnej od nukleaz. Suplement z 1x inhibitorem proteazy w dniu izolacji jąder.
      UWAGA: NPB można przygotować bez inhibitora proteazy z wyprzedzeniem i utrzymuje się do 3 tygodni w temperaturze 4 °C.
    2. Bufor do lizy jąder (kompletny): Uzupełnij bufor do lizy jąder o 1x inhibitor proteazy w dniu izolacji jąder.
  2. Tworzenie zawiesiny jąder
    UWAGA: Próbki należy przez cały czas przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
    1. Pobrać jeden jajnik od myszy Cyp17-NuTRAP (lub innego odpowiedniego Cre-NuTRAP) w 500 μl buforu do lizy jąder (kompletny). Pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek.
    2. Za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze przenieś rozdrobniony jajnik i 500 μl buforu do lizy do szklanego homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizować jajnik 10x-20x za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 μl buforu do lizy do homogenizatora Dounce, tłuczka myjącego A.
    3. Homogenizuj jajnik za pomocą ciasnego tłuczka B 10x-20x. Dodać 1 000 μl buforu do lizy, tłuczka myjącego B. Przenieść homogenat (1,9 ml) do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.
    4. Wirować przy 200 x g przez 1,5 minuty w temperaturze 4 °C w celu usunięcia niezdysocjowanych tkanek i naczyń krwionośnych14. Supernatant zawiera jądra; Wyrzucić osad z niezdysocjowanej tkanki.
    5. Po wstępnym zwilżeniu sitka komórkowego o wielkości 30 μm ze 100 μl buforu do lizy i przefiltrowaniu supernatantu przez sitko do komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie przenieść mieszaninę zawierającą jądra do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.
    6. Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Osad zawiera jądra.
    7. Zawiesić ponownie osad jądrowy w 250 μl lodowatego buforu do lizy, krótko wirując z umiarkowaną lub dużą prędkością. Zwiększyć objętość do 1,75 ml, dodając 1,5 ml buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj i odłóż zawiesinę jądrową na lodzie na 5 minut.
    8. Osadzać jądra przez odwirowywanie w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant, nie naruszając osadu jądrowego. Ponownie zawiesić pastylkę w 200 μl lodowatego bufora do przechowywania i krótko wirować, aby całkowicie ponownie zawiesić pastylkę jądrową.
    9. Zachować 10% zawieszonego osadu (20 μl) jako wsadową próbkę jąder do dalszych analiz.
    10. Pobrać zawieszone jądra osadu i uzupełnić objętość do 2,0 ml lodowatym NPB. Przystąp do izolowania znakowanych jąder przy użyciu metody oczyszczania opartej na powinowactwie INTACT.
  3. Izolacja jąder znakowanych w określonych typach komórek (INTACT)
    1. Wirować kulki streptawidyny w fiolce przez 30 s ze średnią prędkością, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone. Dodać 30 μl zawieszonych kulek do każdej próbki do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml (kulki na maksymalnie 10 próbek można umyć w jednej probówce), dodać 1 ml NPB i dobrze zawiesić przez pipetowanie.
    2. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby oddzielić koraliki. Odrzucić supernatant i wyjąć rurkę z magnesu. Ponownie zawiesić umyte kulki magnetyczne w 1 ml NPB.
    3. Powtórz krok prania, w sumie trzy prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki w początkowej objętości NPB (30 μl na próbkę).
    4. Dodać 30 μl przemytych kulek do 2 ml zawiesiny jądrowej z kroku 2.2.10. Dobrze zawiesić mieszaninę koralików i jąder, pipetując i delikatnie odwracając probówkę.
    5. Umieść rurki na obrotowym mikserze w chłodni lub lodówce na 30 minut na niskich obrotach. Inkubować próbki wejściowe bez kulek w tych samych warunkach.
    6. Umieść probówki z zawiesiną jądrową i koralikami na magnesie i oddziel biotynylowane jądra związane z kulkami streptawidyny (frakcja dodatnia) od ujemnej frakcji jąder. Pozwól koralikom rozdzielić się na magnesie przez 3 minuty.
    7. Usunąć supernatant, przenieść frakcję ujemną do świeżej probówki o pojemności 2,0 ml i odłożyć na lód. Dla każdej probówki z frakcją dodatnią wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś zawartość w 1 ml NPB.
    8. Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś przemytą mieszaninę koralików i jąder w 1 ml NPB.
    9. Powtórz krok 2.3.8, co daje w sumie trzy prania. Po wykonaniu trzech płukań ponownie zawiesić mieszaninę frakcji dodatniej i jąder frakcji dodatniej w 30 μl NPB.
    10. Dla każdej probówki z frakcją ujemną odwirować zawiesinę jądrową z etapu 2.3.7 przy 500 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać i odrzucić supernatant. Zawiesić osad jąder frakcji ujemnej w 30 μl NPB.
    11. Jądra z materiału wejściowego (etap 2.2.9), frakcji ujemnej (etap 2.3.10) i frakcji dodatniej (etap 2.3.9) należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze −80 °C, aż będą gotowe do izolacji jądrowego DNA lub RNA.
      UWAGA: Jąder nie należy zamrażać w przypadku protokołów wymagających nienaruszonych jąder jako danych wejściowych (tj. test chromatyny dostępnej dla transpozazy, immunoprecypitacja chromatyny).

3. Izolacja mRNA z określonych typów komórek jajnika

  1. Przygotowanie
    1. Baza buforowa TRAP: Przygotuj 100 ml bazy buforowej TRAP, łącząc 78,8 ml wody wolnej od RNaz, 5 ml 1 M Tris-HCl (końcowe stężenie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 ml 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 ml 1 M MgCl2 (12 mM MgCl2) i 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    2. Bufor o wysokiej zawartości soli: Przygotuj 100 ml bazy buforowej o wysokiej zawartości soli, łącząc 68,8 ml wody wolnej od RNaz, 5 ml 1 M Tris-HCl (końcowe stężenie: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml 1M MgCl2 (12 mM MgCl2) i 10 ml 10% NP-40 (1% NP-40). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    3. Bufor homogenizacyjny TRAP (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w dniu pobrania tkanki. Przygotować 10 ml buforu homogenizacyjnego TRAP, łącząc 10 ml zasady buforowej TRAP (z kroku 3.1.1) z 10 μl 100 mg/ml cykloheksymidu (końcowe stężenie: 100 μg/ml cykloheksymidu), 10 mg heparyny sodowej (1 mg/ml heparyny sodu), 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT), 50 μl 40 U/μL inhibitora RNazy (200 U/ml inhibitora RNazy), 200 μl 0,1 M spermidyny (2 mM spermidyny) i jedna tabletka inhibitora proteazy bez EDTA (1x).
    4. Bufor do przemywania o niskiej zawartości soli (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w dniu pobrania tkanki. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania o niskiej zawartości soli, należy połączyć 10 ml zasady buforowej TRAP (z kroku 3.1.1) z 10 μl cykloheksymidu 100 mg/ml (100 μg/ml cykloheksymidu) i 20 μl 0,5 M DTT (1 mM DTT).
    5. Bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli (kompletny): Przygotować 1,5 ml na próbkę w drugim dniu izolacji TRAP. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli, należy połączyć 10 ml buforu o wysokiej zawartości soli (z kroku 3.1.2) z 10 μl cykloheksymidu o stężeniu 100 mg/ml i 20 μl 0,5 M naziemnej telewizji cyfrowej.
  2. Przeprowadzanie translacyjnego oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP)
    1. Pobrać drugi jajnik od myszy Cyp17-NuTRAP (lub innego odpowiedniego Cre-NuTRAP) i umieścić go w 1,5 ml probówce wolnej od RNaz zawierającej 100 μl lodowatego buforu homogenizacyjnego TRAP (od kroku 3.1.3). Pokrój jajnik na osiem części w buforze za pomocą samootwierających się mikronożyczek.
    2. Za pomocą końcówek o szerokim otworze przenieś jajnik i 100 μl buforu homogenizacyjnego do szklanego homogenizatora Dounce. Homogenizować 10x-20x za pomocą luźnego tłuczka A. Dodać 400 μL buforu homogenizacyjnego TRAP, tłuczka myjącego A.
    3. Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Umyć homogenizator Dounce dodatkowym 1 ml buforu homogenizacyjnego TRAP i przenieść umytą objętość do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.
    4. Odwirować homogenat o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść oczyszczony supernatant do świeżej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Wyrzuć granulkę.
    5. Przenieść 100 μl oczyszczonego homogenatu do świeżej probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml i odłożyć jako wsad na lodzie.
    6. Pozostałą część oczyszczonego homogenatu (z etapu 3.2.4) inkubować z przeciwciałem anty-GFP (5 μg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, obracając się od końca do końca. Inkubować próbkę wejściową w tych samych warunkach.
    7. W ciągu ostatnich 15 minut inkubacji przemyć kulki magnetyczne białka G w buforze do przemywania o niskiej zawartości soli, wykonując następujące czynności (3.2.8-3.2.11).
    8. Wirować fiolkę z kulkami magnetycznymi białka G przez 30 sekund, aby całkowicie zawiesić. Przenieś 50 μl kulek magnetycznych białka G dla każdej próbki (w jednej probówce można umyć do 10 próbek) do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml.
    9. Dodaj 500 μl buforu do płukania o niskiej zawartości soli do kulek i delikatnie odpipetuj do wymieszania. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    10. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i dodaj do niej 1 ml buforu do płukania o niskiej zawartości soli. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby zebrać koraliki z boku rurki. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    11. Powtórz krok 3.2.10, co daje w sumie trzy prania. Po końcowym płukaniu wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w początkowej objętości buforu do płukania o niskiej zawartości soli (50 μl na próbkę).
    12. Przenieść ponownie zawieszone umyte kulki (50 μl) do mieszaniny próbki antygenu i przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, obracając się w mieszadle typu "koniec po końcu". Próbki wejściowe należy inkubować, obracając się od końca do końca w temperaturze 4 °C przez noc w celu utrzymania równoważnych warunków.
    13. Po całonocnej inkubacji wyjmij probówki z rotatora i oddziel kulki magnetyczne z docelowymi rybosomami/RNA (frakcja dodatnia) od supernatantu (frakcja ujemna) za pomocą podstawki magnetycznej na 2,5-3 min. Odessać frakcję ujemną, umieścić ją w świeżej probówce okrągłodennej o pojemności 2 ml i odstawić na lód podczas przetwarzania frakcji dodatniej.
    14. Dodać 500 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli (z kroku 3.1.5) do probówki z frakcją dodatnią i delikatnie odpipetować do wymieszania. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym utrzymywanym na lodzie na 1 minutę, aby oddzielić koraliki. Odrzucić supernatant i wyjąć rurkę z magnesu.
    15. Powtórz krok 3.2.14, co daje w sumie trzy prania. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś kulki w 350 μl buforu do lizy RNA uzupełnionego 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (BME). Inkubować probówki w temperaturze pokojowej, mieszając przez 10 minut przy 900 obr./min w wytrząsarce cyfrowej.
    16. Oddziel kulki od roztworu, który zawiera teraz docelowe rybosomy/RNA, za pomocą podstawki magnetycznej na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zebrać eluowaną frakcję dodatnią (supernatant) w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 350 μl 100% etanolu. Odwróć, aby wymieszać. Przejdź do izolacji RNA.
    17. Opcjonalnie: Aby wyizolować RNA z próbki wejściowej (krok 3.2.5) i frakcji ujemnej (krok 3.2.13), przenieś 100 μl frakcji wejściowej i ujemnej do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml. Do każdej próbki dodać 350 μl buforu do lizy RNA uzupełnionego 3,5 μl BME. Odwróć, aby wymieszać. Dodaj 250 μl 100% etanolu do każdej probówki i odwróć do mieszania. Przejdź do izolacji RNA.
  3. Izolacja RNA
    1. Przenieść 700 μl frakcji dodatniej i, opcjonalnie, frakcji wejściowej i/lub ujemnej do kolumny wirowej RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyizolować RNA z kolumny wirowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat protokołów TRAP i INTACT jest pokazany w Rysunek 1. W tym przypadku specyficzność mysiego modelu Cyp17-NuTRAP dla komórek zrębu/osłonki jajnika wykazano za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego i sekwencji RNA z izolowanego RNA TRAP. W pierwszej kolejności wykonano obrazowanie immunofluorescencyjne sygnału eGFP w jajniku oraz lokalizację sygnału eGFP do komórek osłonki i zrębu. Krótko mówiąc, odcinki o wielkości 5 μm zostały odparafinowane gradientem ksylenu i etanolu. Aby uzysk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi modelNuTRAP 6 to potężne podejście do znakowania transgenicznego do sparowanego badania transkryptomu i epigenomu z określonych typów komórek, które można dostosować do dowolnego typu komórki za pomocą dostępnego sterownika Cre. W tym miejscu pokazujemy specyfikę mysiego modelu Cyp17-NuTRAP w celowaniu w komórki osłonki jajnika i zrębu. Model Cyp17-NuTRAP może być wykorzystany do dalszego wyjaśnienia specyficznych dla komórek osłonki i zrębu mechanizmów epigenetycznych związanych ze starzenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) i Presbyterian Health Foundation. Prace te były również częściowo wspierane przez I01BX003906 z nagrodą MERIT oraz nagrodą Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) przyznaną ISIBX004797 przez Stany Zjednoczone (USA). Departament ds. Weteranów, Laboratorium Biomedyczne Dział Badawczo-Rozwojowy. Autorzy chcieliby również podziękować Clinical Genomics Center (OMRF) i Imaging Core Facility (OMRF) za pomoc i korzystanie z instrumentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 M SpermidynaSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo Scientific AM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/ml CykloheksymidSigma-AldrichC4859-1ML
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
30 &mikro; Filtr siatkowy M Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
przeciwciało anty-GFPAbcamAb290Do buforu TRAP i IHC (poliklonalny królik do GFP)
RLTQiagen79216Bufor do lizy RNA w protokole
cKompletne, mini, wolne od EDTA tabletki inhibitora proteazyRoche11836170001do homogenizacji TRAP Bufor
Model myszy Cyp17iCreThe Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
Magnes DynaMag-2Invitrogen12321D
Podkłady genotypowaniaIDTNiestandardowyogólny Cre - Jackson Laboratory protokół 22392, Startery: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Protokół Laboratorium Jacksona 30847, Startery: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Protokół Jackson Laboratory 21509, Startery: 21306, 24493, 32625, 32626
Koktajl inhibitora proteazy Halt (100X)Thermo Scientific1861278Do buforu NPB
M-280 Streptawidin Dynabeads Invitrogen11205D2.8 & mikro; m średnica kulki
MixMateEppendorf5353000529
Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNUC101zawiera bufor do lizy jąder i bufor do przechowywania jąder
1 m HEPESGibco15630-080
5 m NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
Model myszy NuTRAPThe Jackson Laboratory29899B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Białko G DynabeadsThermoFisher10004DDo TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Heparyna sodowaFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7,5Invitrogen15567-027
Rotator rurowy VWRFisher ScientificNC9854190

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570(2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824(2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307(2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72(2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transkryptom jajnikaspecyficzny dla typu kom rekmodel mysi NuTRAPpowinowactwo rybosom w translacyjnychmetoda INTACTkom rki zr bu jajnikadost pno chromatynysekwencjonowanie RNAobrazowanie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły