Artykuł metodologiczny

Techniki i praktyki hodowli komórkowych w celu uniknięcia zanieczyszczenia grzybami i bakteriami w laboratorium badawczym hodowli komórkowych

20.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64769

⸱

7 lipca 2023

1Laboratory of Membrane Biology and Biophysics, The Rockefeller University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia podstawowe techniki i praktyki hodowli komórkowych, które mają być stosowane w laboratorium badawczym hodowli komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia przez grzyby i bakterie. W kategorii bakterii szczególny nacisk zostanie położony na zapobieganie zakażeniu mykoplazmą.

Streszczenie

Hodowla komórkowa to delikatna umiejętność niezbędna do hodowli komórek ludzkich, zwierzęcych i owadzich, lub innych tkanek, w kontrolowanym środowisku. Celem protokołu jest podkreślenie prawidłowych technik stosowanych w laboratorium badawczym, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami i bakteriami. Szczególny nacisk kładzie się na uniknięcie zanieczyszczenia mykoplazmą, co stanowi poważny problem w pomieszczeniu do hodowli komórkowych ze względu na jego niewielkie rozmiary i oporność na większość antybiotyków stosowanych w hodowli komórkowej. Te same techniki zapewniają ciągły wzrost i utrzymanie zdrowych komórek. Zarówno dla nowych, jak i doświadczonych użytkowników kultur komórkowych ważne jest konsekwentne przestrzeganie tych najlepszych praktyk w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia. Raz w roku laboratoria powinny dokonać przeglądu najlepszych praktyk w zakresie hodowli komórkowych i w razie potrzeby przeprowadzić dyskusję lub dodatkowe szkolenie. Podjęcie wczesnych działań w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu w pierwszej kolejności pozwoli zaoszczędzić czas i pieniądze w porównaniu z czyszczeniem po wystąpieniu zanieczyszczenia. Uniwersalne najlepsze praktyki utrzymują hodowle komórkowe w dobrym stanie, zmniejszając w ten sposób potrzebę ciągłego rozmrażania nowych komórek, zakupu drogich pożywek do hodowli komórkowych oraz zmniejszając ilość dekontaminacji inkubatora i przestoje.

Wprowadzenie

Hodowla komórkowa ma wiele zastosowań w laboratorium badawczym. Od początków hodowli komórkowych na początku XX wieku linie komórkowe przyczyniły się do postępu nauki. Linie komórkowe mają kilka zalet; Różne linie komórkowe mogą pomóc naukowcom w badaniu biologii komórki, produkcji bakulowirusa do dalszych badań lub produkcji dużych ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania, żeby wymienić tylko kilka1. Niektóre dodatkowe zastosowania obejmują badanie wzrostu tkanek, pomoc w rozwoju szczepionek, badania toksykologiczne, badanie roli genów w zdrowych organizmach i modelach chorobowych oraz produkcję hybrydowych linii komórkowych2,3. Linie komórkowe mogą również umożliwiać produkcję leków3. Podczas pracy z liniami komórkowymi konieczne są odpowiednie techniki aseptyki; Praktyki i techniki opisane w tym manuskrypcie mają zastosowanie w laboratoriach badawczych, w których prowadzone są prace związane z hodowlami komórkowymi. Inne warunki laboratoryjne nie są omawiane.

Zanieczyszczenie jest często głównym problemem podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową. W kontekście niniejszego artykułu zanieczyszczenie ogólnie odnosi się do grzybów i bakterii. Ogólnym celem metody przedstawionej w niniejszym artykule jest dokładne opisanie najlepszych praktyk w zakresie unikania zanieczyszczeń. Wszyscy członkowie laboratorium powinni przestrzegać tych praktyk podczas pracy w pomieszczeniu do hodowli komórkowych w laboratorium badawczym. Laboratoria powinny dopilnować, aby wszyscy pracownicy aktywnie uczestniczyli w stosowaniu tych najlepszych praktyk w celu zapobiegania zanieczyszczeniu. Wiedza na temat prawidłowych praktyk i technik pomoże zapewnić, że hodowle komórkowe pozostaną żywotne, zdrowe i wolne od zanieczyszczeń. Opracowanie tej techniki opiera się na badaniach literatury, siedmioletnim doświadczeniu w pracy z kulturami komórkowymi oraz potrzebie metody, do której mogą odwoływać się co roku zarówno nowicjusze, jak i doświadczeni pracownicy zajmujący się hodowlami komórkowymi.

Istnieje potrzeba jasnej, ustandaryzowanej techniki, którą powinny stosować wszystkie laboratoria badawcze hodowli komórkowych. Znaczna część literatury na temat zanieczyszczenia kultur komórkowych omawia wykrywanie mykoplazmy, techniki aseptyczne, źródła skażenia, eliminację zanieczyszczeń i zapobieganie poprzez stosowanie antybiotyków i regularne testy4,5,6,7,8. Chociaż informacje te są pomocne, w literaturze nie ma filmów pokazujących prawidłowe techniki hodowli komórkowych, których należy przestrzegać. Przewagą przedstawionych praktyk nad technikami alternatywnymi jest skupienie się na zapobieganiu zanieczyszczeniu, zanim do niego dojdzie, a nie na wykrywaniu i korygowaniu błędów w późniejszym czasie. Co więcej, dokładna demonstracja technik aseptycznych, dyskusja na temat zapobiegania rozwojowi grzybów i bakterii oraz informacje dotyczące przepływu powietrza w komorze bezpieczeństwa biologicznego są cenne zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych pracowników zajmujących się hodowlami komórkowymi.

Bakterie i grzyby to dwa najczęstsze rodzaje zanieczyszczeń. W kategorii bakterii mykoplazma jest poważnym problemem ze względu na jej mały rozmiar i zdolność do namnażania się, pozostając niezauważonym. Są to samoreplikujące się organizmy bez sztywnej ściany komórkowej, które do wzrostu opierają się na komórkach eukariotycznych. Mają zmniejszone zdolności metaboliczne i mogą się znacznie namnażać, pozostając nierozpoznanymi w rutynowej kontroli wzrokowej kultur komórkowych i regularnej analizie mikroskopowej, chociaż transmisyjna mikroskopia elektronowa może wykryć mykoplazmę9,10. Ponadto mogą przechodzić przez filtry mikrobiologiczne10. Pożywka do hodowli komórkowych dostarcza mykoplazmie składników odżywczych, chociaż niestety uzupełnianie pożywki antybiotykami nie wpływa na mycoplasma10. Należy zauważyć, że generalnie nie jest konieczne uzupełnianie pożywki antybiotykami; Odpowiednie techniki powinny wystarczyć do powstrzymania zanieczyszczenia. Zakażenie mykoplazmą nie prowadzi do natychmiastowej śmierci komórki, ale jest niepokojące dla badaczy, ponieważ wpływa na odtwarzalność i jakość danych.

Wszyscy pracownicy laboratorium powinni ściśle przestrzegać dobrych praktyk hodowli komórkowych. Kultury powinny być testowane na obecność mykoplazmy po ich zakupie, podczas ich trwającej hodowli, przed kriopkonserwacją i po rozmrożeniu z ciekłego azotu2,10. Na rynku dostępne są różne testy wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), test immunoenzymatyczny (ELISA) lub barwienie immunologiczne. 3 Literatura wskazuje, że "ludzkie izolaty stanowią duży procent zanieczyszczeń mykoplazmy znajdujących się w hodowli komórkowej"5. Chociaż opisano ponad 200 gatunków mykoplazm, około sześciu z nich odpowiada za większość infekcji. Te sześć gatunków to M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale i Acholeplasma laidlawii10. Podobnie jak w przypadku innych rodzajów zanieczyszczeń, powietrze i aerozole wprowadzają je do kultur komórkowych5. Znajduje to odzwierciedlenie w innych artykułach, ponieważ "ludzki operator jest potencjalnie największym zagrożeniem w laboratorium"7. Chociaż odbywa się to poprzez błąd ludzki, ryzyko można wyeliminować, przestrzegając standardowej procedury. Wydalanie przez personel nie ogranicza się tylko do skażenia mykoplazmą; Hodowle komórkowe w jednym laboratorium są zwykle zakażone tym samym gatunkiem mykoplazmy, co wskazuje, że zanieczyszczenie rozprzestrzenia się z jednej kolby do drugiej z powodu niewłaściwych technik hodowli komórkowych10.

Zapobieganie zakażeniu krzyżowemu to także kolejny powód, dla którego powinny być przestrzegane odpowiednie techniki hodowli komórkowych. Należy zauważyć, że co najmniej 15%–18% linii komórkowych na całym świecie może być zanieczyszczonych krzyżowo lub błędnie zidentyfikowanych11,12. Oprócz testowania linii komórkowych pod kątem skażenia mykoplazmą, powinny one być również testowane pod kątem zanieczyszczenia krzyżowego10. W przypadku ludzkich linii komórkowych uwierzytelnianie linii komórkowych za pomocą niedrogiej techniki opartej na DNA, zwanej profilowaniem z krótkimi powtórzeniami tandemowymi (STR), jest obecnie międzynarodowym standardem referencyjnym, ponieważ jest to łatwy sposób na potwierdzenie tożsamości linii komórkowej2,10,13,14. STR może zidentyfikować błędnie oznakowane lub zanieczyszczone krzyżowo linie komórkowe, ale nie może wykryć nieprawidłowego pochodzenia tkankowego10,13,14. Wiarygodność danych badawczych może być zagrożona, jeśli linie komórkowe są błędnie oznakowane, błędnie zidentyfikowane lub zanieczyszczone13. Podobnie jak w przypadku innych rodzajów zanieczyszczeń, zanieczyszczenie krzyżowe może wystąpić z powodu złej techniki powodującej rozprzestrzenianie się aerozoli, błędnego kontaktu prowadzącego do wprowadzenia niewłaściwego typu komórki do kolby lub użycia tej samej butelki z pożywką i odczynników z różnymi liniami komórkowymi10. Nie powinno się dzielić butelkami z pożywką; Dzielenie jednej butelki pożywki między dwiema różnymi liniami komórkowymi może pozwolić na wymieszanie tych populacji komórek, co prowadzi do tego, że szybciej rosnący typ komórek całkowicie przejmuje kolbę. Ta zamiana nie jest zauważalna i prowadzi do błędnego etykietowania i błędnej identyfikacji2. Linia komórkowa może być również pomylona z inną, jeśli kultury zostaną pomylone podczas obchodzenia się lub etykietowania10. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby odczynniki, pożywki i kolby były od siebie oddzielone. Każdy członek laboratorium powinien mieć własne butelki z pożywką; Nie powinno być udostępniania między członkami laboratorium. Same linie komórkowe powinny być zakupione w wykwalifikowanym banku komórek i od odpowiedniego dostawcy. Laboratoria nie powinny dzielić się komórkami. Badania pokazują, że chociaż testy STR i mykoplazmy są regularnie stosowane, w wielu artykułach naukowych w literaturze wykorzystano już błędnie zidentyfikowane lub zanieczyszczone linie komórkowe15. Przesiewanie badań w celu znalezienia tych problematycznych dokumentów i wstecznego poinformowania czytelników o tej sprawie jest uciążliwe. Zapobieganie jest najlepszym sposobem, aby upewnić się, że ten problem nie wystąpi w pierwszej kolejności.

Prosta czynność polegająca na spryskiwaniu przedmiotów 70% EtOH może zabijać organizmy; 70% EtOH działa poprzez denaturację białek i rozpuszczanie lipidów w najbardziej zanieczyszczających organizmach, w tym bakteriach i grzybach16. Badania wykazały, że 70% to najskuteczniejsze stężenie; Białka powierzchniowe nie koagulują szybko z 70% EtOH, dzięki czemu mogą dostać się do komórki, podczas gdy zawarta w nich woda jest niezbędna do procesu denaturacji białek. Ze względu na różnicę stężeń wody i alkoholu po obu stronach ściany komórkowej, 70% EtOH dostaje się do komórki, aby denaturować zarówno białka enzymatyczne, jak i strukturalne. Jeśli w kolbach zaobserwuje się rozwój pleśni, cały inkubator musi zostać odkażony, najpierw spryskując go 70% EtOH i wycierając do sucha, a następnie 16-godzinną nocną inkubację w temperaturze 60 °C17. To zabija większość pleśni i wszelkich bakterii.

Główną zaletą praktyk prewencyjnych nad alternatywnymi technikami eliminowania skażenia po jego wystąpieniu jest to, że dzięki wczesnemu zapobieganiu skażeniu, pracownicy laboratorium mogą być pewni, że ich hodowle komórkowe są zdrowe i nie będzie wysokich kosztów związanych z dekontaminacją inkubatorów lub wyrzucaniem kultur komórkowych. Eliminacja zanieczyszczeń mykoplazmą po, na przykład, nie jest efektywna7. Wczesne poświęcenie czasu na upewnienie się, że personel laboratoryjny jest odpowiednio przeszkolony, pomieszczenie do hodowli komórkowych jest samowystarczalne, a standardowa procedura pozwoli zaoszczędzić czas i pieniądze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

  1. Ogólne
    1. Nosić czysty fartuch laboratoryjny przeznaczony do noszenia tylko w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i w żadnych innych częściach laboratorium.
      UWAGA: Fartuch laboratoryjny nie musi być sterylny.
    2. Nosić nowe rękawice, które nie dotykały żadnych innych powierzchni. Upewnij się, że rękawice są dobrze dopasowane. Najlepsze są rękawice nitrylowe, bezpudrowe.
      UWAGA: Rękawice nie muszą być sterylne.
    3. Aby przygotować się do pracy, spryskaj rękawice, rękawy fartuchów laboratoryjnych i wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego 70% EtOH. Wytrzyj powierzchnię roboczą i szklany panel do sucha niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Użycie 70% EtOH zabija bakterie z najwyższą skutecznością16. Ręcznik papierowy nie musi być sterylny.
    4. Łaźnie wodne należy przechowywać w pomieszczeniu do hodowli komórkowych i używać ich wyłącznie do podgrzewania pożywek hodowlanych lub rozmrażania komórek. Opróżnij i umyj łaźnie wodne raz w tygodniu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi czyszczenia.
  2. Wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego
    1. Ogranicz liczbę przedmiotów wnoszonych do szafki. Nie przerywaj przepływu powietrza wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego, blokując przednią lub tylną kratkę.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby dowiedzieć się, jak powietrze przepływa wewnątrz szafy.
    2. Spryskaj wszystkie przedmioty umieszczone w szafce 70% EtOH i wytrzyj je do sucha. Zacznij od spryskania górnej części butelki z pożywką i pracy w dół. Podobnie czystym ręcznikiem papierowym wytrzyj go do sucha, stopniowo przesuwając się do dna. Nie wracaj w kierunku czapki.
    3. Jeśli szafka jest wystarczająco duża, aby pomieścić pipety serologiczne, można je umieścić w środku, w przeciwnym razie można je przechowywać w pojemniku zamontowanym na zewnątrz szafki. Przed użyciem sprawdź, czy po obu stronach dołączonej pipety nie ma, rozdarć lub nakłuć w opakowaniu. Nie zrywaj opakowania. Zamiast tego delikatnie oderwij końce opakowania, włóż pipetę serologiczną do pomocnicy do pipet i usuń opakowanie jednym płynnym ruchem.
    4. Nie najeżdżaj kursorem na otwarte butelki lub kolby; sięgaj po otwarte butelki lub kolby, ani nie otwieraj przedmiotów nad górną częścią już otwartych przedmiotów w szafie bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Strumień powietrza wewnątrz szafy naciska na powierzchnię roboczą, więc wszelkie zanieczyszczenia obecne na przykład na rękawie mogą dostać się do kultur komórkowych.
    5. Nie nalewać płynów. Zamiast tego dodaj je za pomocą pipety serologicznej. Po uzupełnieniu pożywki dokładnie wymieszać zawartość i parafować butelkę. Upewnij się również, że dołączyłeś etykietę z informacją o tym, czym nośnik został uzupełniony.

2. Praca z przylegającymi liniami komórkowymi

  1. Jeśli potrzebna jest plastikowa kolba, spryskaj całą torbę i umieść ją w szafce.
  2. Do zasysania pożywki lub roztworów myjących należy używać szklanych pipet z autoklawem lub jednorazowych sterylnych pipet plastikowych. Ostrożnie zdejmij metalową nakrętkę z pojemnika do przechowywania. Odizoluj jedną szklaną pipetę, delikatnie potrząsając pojemnikiem pod kątem. Sięgając do pojemnika, unikaj dotykania innych pipet.
    UWAGA: Z wybraną pipetą należy obchodzić się tylko z jednym końcem.
  3. Szybko wymień nakrętki na butelkach tak szybko, jak to możliwe. Umieść zaślepki na powierzchni roboczej do góry nogami, tak aby obręcz nie dotykała powierzchni roboczej. Nie chwytaj nasadki od góry ani od dołu; Zamiast tego dotknij nasadek z boków.
  4. Podczas zasysania cieczy należy użyć termosu umieszczonego na zewnątrz szafki w dodatkowym pojemniku na podłodze.
    UWAGA: Nie wrzucaj żadnych odpadów płynnych do worków na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne, ponieważ worki będą przeciekać. Podczas pracy wewnątrz szafy powstaną odpady. Zbyt częste wsuwanie i wysuwanie rąk z szafki spowoduje przerwanie przepływu powietrza. Wszelkie odpady należy tymczasowo pozostawić w szafce. Odłóż go na bok, aby nie przerywał pracy.
  5. Obficie spryskaj rękawice 70% EtOH za każdym razem, gdy wyschną. Pocieraj dłonie o siebie, aby rękawiczki nie ociekały wodą.
  6. Jeśli pipeta serologiczna omyłkowo dotknie czegoś w szafce, nie wahaj się jej wyrzucić. Zacznij od nowa od czystej pipety serologicznej zamiast używać tej, która może być zanieczyszczona.

4. Sprawdzanie i przechowywanie komórek

  1. Przed umieszczeniem komórek w inkubatorze sprawdź, jak wyglądają pod mikroskopem. Jeśli komórki zostały dokładnie zawieszone, należy obserwować pojedyncze komórki.
  2. Nie mów, nie kichaj, nie kaszl ani nie oddychaj ciężko do inkubatorów. Szybko otwieraj i zamykaj drzwi inkubatora. Pozostawienie otwartych drzwi dłużej niż jest to konieczne może spowodować przedostanie się zanieczyszczeń obecnych w powietrzu do inkubatorów.
    UWAGA: Noszenie maski podczas pracy w pomieszczeniu do hodowli komórkowych może pomóc, ponieważ mykoplazma może być obecna w jamie ustnej człowieka. Unikaj korzystania z telefonów komórkowych w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, ponieważ rozmowa nie jest zalecana.
  3. Upewnij się, że nakrętki wszystkich butelek są szczelnie zamknięte przed wyjęciem butelek z szafki.
  4. Pożywkę do hodowli komórkowych należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana, ponieważ jest wrażliwa na światło.
  5. Po zakończeniu prac nad hodowlą komórkową ponownie spryskaj wnętrze szafki 70% EtOH i wytrzyj powierzchnię do sucha ręcznikiem papierowym. Opróżnij worki na śmieci stanowiące zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces i załóż rękawiczki podczas przełączania na inną linię komórkową.

5. Praca z liniami komórek zawiesinowych

  1. W przypadku komórek zawiesinowych hodowanych w szklanych kolbach, upewnij się, że rękawice są dokładnie spryskane 70% EtOH, a następnie dotknij folii aluminiowej mokrymi rękawicami i spryskaj tylko dno kolby przed umieszczeniem jej w szafce.
  2. Pobierając próbkę do zliczania komórek, wyjmij z pojemnika tylko jedną probówkę o pojemności 1,5 ml. Nie dotykaj żadnych innych rurek. Umieść nasadkę do góry nogami na powierzchni roboczej. Nie dotykaj wewnętrznej krawędzi. Obchodź się z nim ostrożnie z boków i wymień go po zakończeniu.
  3. Ostrożnie zdjąć podwójnie złożony kawałek folii aluminiowej, który pokrywa całą szyjkę kolby. Szklaną kolbę należy obchodzić wyłącznie od dołu - nie dotykać jej od szyjki - po zdjęciu folii. Użyj pipety serologicznej o pojemności 1 ml, aby pobrać próbkę do zliczenia komórek.
  4. Nie pozwól, aby media spływały po bokach kolb; jeśli tak się stanie, spryskaj ręcznik papierowy 70% EtOH i natychmiast go umyj.
  5. Upewnij się, że nakrętki i folia aluminiowa są dokręcone przed wyjęciem butelek lub kolb z szaf bezpieczeństwa biologicznego.

6. Inkubacja komórek

  1. Używaj oddzielnych inkubatorów dla różnych typów komórek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu różnych typów komórek.

7. Zbiórka odpadów płynnych

  1. Odpady płynne należy zbierać w syforze próżniowym umieszczonym na zewnątrz szafki na podłodze w pojemniku wtórnym oznaczonym "Odpady".
    UWAGA: Wąż jest podłączony do wysokowydajnego filtra pochłaniającego cząstki stałe (HEPA), który jest wymieniany co miesiąc.

8. Sprzątanie

  1. Wyjmij worek na odpady biologiczne i umyj szklane kolby tak szybko, jak to możliwe. Zachowaj protokół mycia szkła przy zlewie. Patrz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem prania.
  2. Szklane naczynia do hodowli komórkowych należy sterylizować w autoklawie, zamiast wysyłać je do myjni szkła. Przechowuj go oddzielnie od naczyń szklanych w głównej części laboratorium.
    UWAGA: Ogniwa SF-9 pozostawiają obrzeża martwych komórek z boku kolb, jeśli szkło nie jest dobrze wyszorowane. Patrz Plik Uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem autoklawu.

9. Organizacja

  1. Zorganizuj pomieszczenie do hodowli komórkowych tak, aby wszystkie zapasy znajdowały się w jednym obszarze, minimalizując w ten sposób potrzebę opuszczania pomieszczenia przez członków laboratorium w poszukiwaniu zapasów.
  2. Wszystkie plastikowe butelki używane do pobierania komórek, a następnie ponownie wykorzystane w hodowli komórkowej, należy oznaczyć jako "Wyłącznie do hodowli komórkowych". Używaj wyznaczonych butelek do hodowli komórkowych dla jednego określonego typu komórek. Przechowuj butelki w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, aby mieć do nich łatwy dostęp.

10. Identyfikacja skażenia bakteriami, grzybami i mykoplazmą

UWAGA: Nieprzestrzeganie powyższego toku pracy może prowadzić do skażenia bakteryjnego, grzybowego i mykoplazmowego.

  1. Zawsze przed rozpoczęciem pracy należy obserwować, czy kolby są mocno zmętnione, mają dodatkowy wzrost w postaci rozmytych kulek i gęste nagromadzenie komórek z boku, z których wszystkie są wskaźnikami zanieczyszczenia.
    UWAGA: Doświadczone oko może odróżnić zmętnienie spowodowane zanieczyszczeniem mikrobiologicznym od rzeczywistych komórek. Podczas gdy komórki powodują, że zwykle przezroczyste podłoże wydaje się mętne, zanieczyszczenie bakteryjne powoduje duże zmętnienie o białym kolorze.
    1. Wizualnie zidentyfikuj zanieczyszczenie pleśnią, zwracając uwagę na pojawienie się okrągłych, rozmytych kulek unoszących się w podłożu (patrz Rysunek 2).
    2. Wizualnie identyfikuj skażenie bakteryjne, jeśli podłoże jest mętne, białe lub burzliwe (patrz Rysunek 2).
    3. Zidentyfikuj zanieczyszczenie mykoplazmą, wykonując comiesięczny test na obecność mykoplazmy. Jeden test oparty na PCR instruuje użytkowników, aby pobrali 1,5 ml próbki komórek, przeprowadzili liczenie komórek przy użyciu 10 μl, rozcieńczyli do 0,08 x 106 komórek/ml, odwirowali komórki, zlizowali komórki za pomocą buforu zawartego w zestawie i odwirowali po raz ostatni. Supernatant jest inkubowany ze starterami, które amplifikują szereg gatunków mykoplazmy. Uruchom żel DNA, aby uwidocznić prążki. Brak prążków oznacza, że mykoplazma nie została zidentyfikowana.
      UWAGA: To główne zanieczyszczenie może być obecne w jamie ustnej człowieka. Dobrą praktyką jest badanie pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą w komórkach po ich rozmrożeniu i przed użyciem do eksperymentów. Następnie raz w miesiącu monitoruj komórki pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Wiele firm oferuje zestawy do testów na mykoplazmę. Wybierz taki, który jest odpowiedni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli nie przestrzega się odpowiednich technik i praktyk hodowli komórkowych opisanych w tym artykule, w laboratorium badawczym może dojść do skażenia grzybami i bakteriami. Rysunek 2 pokazuje kolby zawierające zanieczyszczenia zarówno w zawiesinie, jak i w kulturach przylegających.

Jeśli nie przestrzegasz technik aseptycznych, zanieczyszczenie pleśnią może wystąpić 2-3 dni później. Okrągłe, rozmyte kulki unoszące się w podłożu są zauważalne w komórkach zawiesinow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż zanieczyszczenie jest jednym z głównych problemów podczas wykonywania prac związanych z hodowlą komórkową, praktyki i techniki opisane w tym manuskrypcie pomogą złagodzić ryzyko. Kluczowe kroki obejmują noszenie czystego fartucha laboratoryjnego, który jest używany tylko w pomieszczeniu do hodowli komórkowych, używanie czystych, bezpudrowych rękawiczek, które są często spryskiwane 70% EtOH i które są zmieniane podczas przełączania między liniami komórkowymi, zachęcanie każdej osoby do niedzielenia się butelkami z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca stała się możliwa dzięki finansowaniu z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (HHMI). Pragniemy podziękować naszej szefowej laboratorium, Jue Chen, za przeczytanie manuskryptu i za jej nieustające wsparcie, Donnie Tallent za jej pomocne edycje i komentarze, a także Jeffowi Hennefeldowi z Wydziału Technologii Informacyjnych Uniwersytetu Rockefellera za jego pomoc w tworzeniu części wideo tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DPBSGibco14-190-144
DMEM F-12 MediaATCC30-2006
Szklana kolba z przegrodąPyrex 09-552-40
Pipety szklaneFisher 13-678-6B
Pomocnica do pipetDrummond13-681-15A 
Pipeta serologicznaCorning07-200-573
Kolba T75Corning07-202-004
TrypsinGibco25-300-054
*Elementy mogą się różnić, ponieważ ten film dotyczy ogólnych technik
hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
  2. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  3. Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
  4. Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
  5. Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
  6. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
  7. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  8. Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).
  9. Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
  10. Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098(2019).
  11. Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
  12. Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
  13. Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676(2019).
  14. Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
  15. Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281(2017).
  16. Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
  17. United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
  18. Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
  19. Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
  20. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
  21. Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98(2020).
  22. Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
  23. Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zapobieganie kontaminacjiwykrywanie Mycoplasmakomora z laminarnym przep ywem powietrzahodowle zawiesinowehodowla kom rek adherentnychtechnika sterylnadekontaminacja inkubatoratest PCRsterylizacja szk a laboratoryjnego

Powiązane artykuły