Tutaj opisujemy metodę wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji apoplastycznych reaktywnych form tlenu (ROS) w tkankach ryżu w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez patogen wywołany wzorcem molekularnym. Ta metoda jest prosta, ustandaryzowana i generuje wysoce powtarzalne wyniki w kontrolowanych warunkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w różnych procesach biologicznych, w tym w wykrywaniu stresów abiotycznych i biotycznych. Po zakażeniu patogenem lub prowokacji substancjami chemicznymi związanymi z patogenami (wzorce molekularne związane z patogenem [PAMP]), w roślinach szybko indukowany jest szereg odpowiedzi immunologicznych, w tym wybuch ROS, co nazywa się odpornością wywołaną przez PAMP (PTI). Wybuch ROS jest charakterystyczną odpowiedzią PTI, która jest katalizowana przez grupę oksydaz NADPH zlokalizowanych w błonie plazmatycznej - białek z rodziny RBOH. Zdecydowana większość ROS składa się z nadtlenku wodoru (H2O2), który można łatwo i stabilnie wykryć metodą chemiluminescencji na bazie luminoli. Chemiluminescencja to reakcja wytwarzająca fotony, w której luminol lub jego pochodna (taka jak L-012) ulega reakcji redoks z ROS pod działaniem katalizatora. W artykule opisano zoptymalizowaną metodę chemiluminescencji opartą na L-012 do wykrywania produkcji ROS apoplastów w czasie rzeczywistym po wywołaniu PAMP w tkankach ryżu. Metoda jest łatwa, stabilna, ustandaryzowana i wysoce powtarzalna w ściśle kontrolowanych warunkach.
Wprowadzenie
Reaktywne formy tlenu (ROS) obejmują szereg chemicznie aktywnych pochodnych tlenu, w tym anionowe rodniki ponadtlenkowe (O2-) i ich pochodne, rodniki hydroksylowe (OH-), nadtlenek wodoru oraz produkty tlenu singletowego lub reakcji utleniania-redukcji, które są stale wytwarzane w plastydach i chloroplastach, mitochondriach, peroksysomach i innych miejscach subkomórkowych1. ROS odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych i są niezbędne dla wszystkich roślin2,3,4. Szerokie spektrum funkcji ROS waha się od regulacji wzrostu i rozwoju po percepcję stresów abiotycznych i biotycznych5,6,7,8.
W roślinnym układzie odpornościowym, receptory zlokalizowane w błonie komórkowej komórek roślinnych - tak zwane receptory rozpoznawania wzorców (PRR) - postrzegają substancje chemiczne pochodzące od patogenów - wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). To rozpoznanie wyzwala serię szybkich odpowiedzi immunologicznych, w tym napływ wapnia, wybuch ROS i kaskadę MAPK; w związku z tym ta warstwa odporności nazywana jest odpornością wyzwalaną przez PAMP (PTI). ROS burst jest charakterystyczną odpowiedzią PTI, której określenie jest szeroko stosowane w badaniach związanych z PTI9,10. Produkcja ROS wyzwalana przez PAMP jest przypisywana oksydazie NADPH rezydującej w błonie plazmatycznej lub białkom z rodziny homologów oksydazy wybuchowej układu oddechowego (RBOH), które przenoszą elektrony z cytozolowego NADPH lub NADH do tlenu zewnątrzkomórkowego w celu wytworzenia ponadtlenku (O2-), który jest spontanicznie przekształcany w nadtlenek wodoru (H2O2) przez dysmutazę ponadtlenkową8. Impuls ROS wywołany przez PAMP jest dość szybki, pojawia się zaledwie kilka minut po leczeniu PAMP i osiąga szczyt po ~10-12 minutach. Zdecydowana większość cząsteczek ROS zawiera nadtlenek wodoru (H2O2), który można łatwo i stabilnie wykryć za pomocą testu chemiluminescencji.
W chemiluminescencji, odczynnik chemiluminescencji reaguje z aktywnym tlenem, pod działaniem katalizatora, tworząc produkty pośrednie w stanie wzbudzonym. Następnie elektrony w produkcie wracają do stanu podstawowego poprzez przejście nieradiacyjne i emitują fotony. Popularne odczynniki chemiluminescencyjne to luminol i L-012, przy czym luminol dominuje w zastosowaniu11,12,13. Jednak coraz więcej badaczy wybiera L-012 do wykrywania produkcji ROS, ponieważ L-012 ma znacznie wyższą wydajność emisji światła w warunkach neutralnego lub prawie neutralnego pH w porównaniu z luminolem.
Ten artykuł opisuje zoptymalizowaną metodę chemiluminescencji, opartą na L-012, do wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji ROS po wywołaniu PAMP w tkankach ryżu (Oryza sativa) - krążki liściowe i pochewka. Przedstawiona tutaj metoda jest prosta, stabilna i ustandaryzowana oraz można ją w dużym stopniu dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych. Dane uzyskane tą metodą są wysoce powtarzalne w ściśle kontrolowanych warunkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Protokół można zastosować do różnych tkanek roślinnych. W niniejszym protokole do wykrywania ROS po wywołaniu odpowiedzi na PAMP wykorzystano pochwy i wycinki liści ryżu. Ponieważ różnice wynikają głównie z metody pobierania próbek, poniżej opisano jedynie wspólne procedury, wspominając o specyficznych krokach w razie potrzeby.
1. Hodowla roślin
- Zesterylizować łuskane nasiona ryżu w 70% etanolu przez 1 min, a następnie w 40% podchlorynie sodu (NaClO) przez 1 h. Następnie wypłukać nasiona 5 razy sterylną wodą, aby usunąć pozostałości chloru.
- Wysiać nasiona aseptycznie na pożywkę 1/2 MS (2,37 g/L pożywki Murashige and Skoog (MS), 30 g/L sacharozy, 2,1 g/L phytagelu, pH 5,7, autoklawowana).
- W metodzie pochwy ryżowej nasiona wysiać bezpośrednio do sterylnego naczynia szklanego z pożywką MS.
- W metodzie krążka liściowego wysiać nasiona na płytki z pożywką MS na 5-7 dni, a następnie przesadzić je do matrycy wzrostowej lub gleby (Rysunek 1A).
- Hodować siewki w komorze wzrostowej z fotoperiodem 12 h światła/12 h ciemności.
2. Przygotowanie i wstępna obróbka tkanek
- pochwa liścia ryżu
- Przetnij pochwę 10-dniowych siewek ryżu na segmenty o długości 3 mm za pomocą ostrego żyletek lub skalpela chirurgicznego w ramach wstępnej obróbki na 1 dzień przed testem ROS (Rycina 1B).
- Umieść pięć segmentów pochwy w oddzielnej studzience płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej zawierającej 100 µL ddH2O na 10-12 h, w ciemności w temperaturze 25 °C, co pozwala na ustąpienie wycieku jonów związanego z uszkodzeniem tkanek oraz odpowiedzi obronnych (Rycina 2).
UWAGA: Dbałość o to, aby cięcia były pionowe w celu zapewnienia spójnej powierzchni cięcia eksponowanej na roztwór elicytujący, jest istotnym krokiem do uzyskania wysokiej powtarzalności wyników. Przesuwaj segmenty delikatnie. Nie wykonuj dodatkowych cięć ani nie uszkadzaj segmentów, ponieważ mogłoby to być źródłem zmienności danych. Co do zasady, każdy test musi zawierać co najmniej pięć powtórzeń, ponieważ zmienność wartości ROS jest duża. Im więcej wykonanych powtórzeń, tym bardziej wiarygodne są dane.
- wycinek liścia
- Wytnij wycinki liści (o średnicy 4 mm) z 4-6-tygodniowych roślin ryżu za pomocą wycinaka biopsyjnego z tłoczkiem. Zawsze wycinaj wycinki z środkowej jednej trzeciej drugiego liścia (licząc od góry) głównego pędu, aby zmniejszyć zmienność danych (Rycina 1C).
- Umieść jeden wycinek liścia w oddzielnej studzience płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej zawierającej 100 µL ddH2O na 10-12 h w ramach wstępnej obróbki, co pozwala na ustąpienie odpowiedzi związanych z ranieniem, które mogłyby zakłócać indukcję ROS przez PAMPy (Rycina 2).
UWAGA: Operuj wycinkami liści delikatnie. Nie wykonuj dodatkowych cięć ani nie uszkadzaj wycinków podczas eksperymentu, ponieważ mogłoby to doprowadzić do zmienności danych. Indukcja ROS zachodzi głównie w komórkach krawędzi cięcia, ponieważ powierzchnie tkanek ryżu (liści lub pochw) są pokryte warstwami hydrofobowymi. Tylko komórki krawędzi cięcia są w kontakcie z roztworem elicytującym (patrz sekcja dyskusji). - Utrzymuj wszystkie wycinki liści w stanie pływania, powierzchnią abaksjalną skierowaną do góry, w studzienkach płytki mikrotitracyjnej podczas wstępnej obróbki wodą, aby uniknąć zmienności związanej ze stroną liścia.
Rycina 1: Warunki wzrostu i stadia rozwoju siewek ryżu do pobierania próbek pochwy oraz części pochwy i liści ryżu wykorzystane w analizie. (A) Siewki ryżu hodowane na podłożu 1/2 MS w warunkach sterylnych przez 10 dni mogą być pobierane do analizy ROS. Sterylne nasiona ryżu hodowano na podłożu 1/2 MS w fotoperiodzie 12 h światła/12 h ciemności w przezroczystych szklanych fiolkach o średnicy 8,5 cm i wysokości 15 cm. (B) Schematyczna ilustracja pobieranych części pochwy liściowych. Pochwy liściowe wycinano z 10-dniowych siewek ryżu. Położenie pochw liściowych znajdowało się nad korzeniami i poniżej pierwszego liścia. (C) Schematyczna ilustracja miejsca pobierania krążków liściowych. Krążki liściowe można wycinać z środkowej jednej trzeciej drugiego liścia (licząc od góry) głównego pęda zdrowych roślin ryżu na dowolnym etapie wzrostu. Skróty: ROS = reaktywne formy tlenu; MS = Murashige i Skoog. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schemat rozmieszczenia na płytce do pomiaru produkcji ROS w różnych liniach Oryza sativa. Obróbka wstępna i test tkanek ryżu z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej. Linia 1, Linia 2 i Linia 3 (do ośmiu linii na jednej płytce) mogą być dowolnymi materiałami badawczymi, różnymi odmianami, mutantami lub liniami transgenicznymi. Tkanki stymulowano roztworami wyzwalającymi z PAMP (PAMP, kolor biały) lub bez PAMP (ddH2O, kolor szary) w celu pomiaru odpowiedzi ROS. Należy zauważyć, że im więcej próbek do przetestowania, tym dłuższy odstęp czasu między odczytami. Skróty: ROS = reaktywne formy tlenu; PAMP = wzorce molekularne związane z patogenami; ddH2O = woda dwukrotnie destylowana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Przygotowanie roztworu elicytującego
- Rozpuścić proszek L-012 w wodzie ddH2O, aby przygotować 20 mM (6,23 mg/mL) roztwór wodny stanowiący roztwór zapasowy. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy w 50 mM buforze Tris HCl (pH 7,5), aby otrzymać roztwór roboczy o końcowym stężeniu 500 µM L-012. Roztwór zapasowy przechowywać w zamrożeniu i rozcieńczać do stężenia roboczego bezpośrednio przed użyciem.
- Przygotować roztwór elicytacyjny zawierający PAMP, L-012 oraz peroksydazę chrzanową (HRP; 10 mg/mL w ddH2O). Aby przygotować 10 mL roztworu elicytacyjnego, zmieszać 9,4 mL 50 mM roztworu Tris HCl (pH 7,5), 400 µL roztworu L-012, 100 µL HRP oraz 100 µL flg22 (PAMP; 10 mM w ddH2O). W przypadku kontroli negatywnej zamiast PAMP dodać 100 µL ddH2O.
UWAGA: Przygotowane roztwory elicytacyjne przechowywać w temperaturze pokojowej, aby uniknąć stresu termicznego tkanek ryżu. W zależności od potrzeb do traktowania można użyć innych PAMP, np. chityny (stężenie końcowe 20 ng/mL). Ponieważ L-012 jest światłoczuły, wszystkie probówki zawierające roztwór L-012 należy owinąć folią aluminiową.
4. Uruchomienie oprogramowania i konfiguracja protokołu dla wskazanego czytnika mikropłytek (patrz Tabela materiałów)
UWAGA: Konfiguracja parametrów oprogramowania czytnika mikropłytek zajmuje pewien czas. Zaleca się przygotowanie urządzenia i protokołu (jedno kliknięcie w celu kontynuacji) przed dodaniem roztworu wyzwalającego.
- Uruchom oprogramowanie. Kliknij przycisk Experiments, aby utworzyć nowy protokół lub użyć istniejącego protokołu.
- W oknie wyskakującym kliknij Procedure, aby skonfigurować płytkę. Wybierz otwory na płytce, które mają być monitorowane.
- Kliknij Start Kinetic, aby ustawić całkowity czas trwania pomiaru (run time) oraz interwał odczytu (reading interval). Ustaw Run time na 35 min lub więcej, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Aby uzyskać odczyty z jak największą częstotliwością, wybierz Minimum Interval. W przypadku czasu integracji wybierz 1 s lub więcej, w zależności od intensywności sygnału.
UWAGA: Interwał odczytu zależy od liczby próbek i czasu trwania integracji sygnału. - Kliknij Validate | OK, aby potwierdzić ustawienia.
- W oknie wyskakującym kliknij Detect the new plate i poczekaj, aż oprogramowanie wyświetli okno dialogowe ładowania płytki. Umieść płytkę do badania na nośniku.
- Zatrzymaj się w tym miejscu i poczekaj na ustanowienie systemu stymulacji (w następnej sekcji). Gdy tylko system stymulacji będzie gotowy, kliknij Run, aby rozpocząć odczyt.
5. Ustanowienie systemu elicytacji i pomiar produkcji ROS w czasie rzeczywistym
- Ostrożnie usuń ddH2O z dołków zawierających wstępnie potraktowane tkanki, unikając ich uszkodzenia lub wysuszenia.
- Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 µL roztworu elicytującego do dołków z tkankami.
- Delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać. Kliknij Run, aby rozpocząć detekcję.
UWAGA: W przypadku traktowania PAMP tkanki roślinne reagują i wytwarzają ROS bardzo szybko. Dlatego, przy zastosowaniu wielu traktowań, zaleca się, aby w pierwszej kolejności potraktować kontrolę negatywną bez PAMP w celu skrócenia czasu operacji. Postępuj jak najszybciej, aby zminimalizować opóźnienie elicytacji między traktowaniami. Im krótszy czas między dodaniem roztworu elicytującego a rozpoczęciem detekcji, tym dokładniej zostaną zarejestrowane istotne dane eksperymentalne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej procedurze wykorzystujemy materiał z ryżu jako przykład do oznaczenia ROS wytwarzanych po traktowaniu flg22. Generowanie ROS po elicytacji ma charakter przejściowy. W przypadku ryżu wzrost produkcji ROS został po raz pierwszy wykryty w 1-2 min, osiągnął szczyt w 10-12 min i powrócił do poziomu bazowego w ~30-35 min (Rycina 3). W porównaniu z testem kontrolnym, w którym w roztworze elicytującym brakowało PAMP, co skutkowało brakiem wyraźnej indukcji ROS, specyficzny wyrzut ROS zo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego badania było opracowanie wysoce wydajnej metody ilościowego określania wczesnej produkcji ROS w odpowiedzi na PAMP w tkankach ryżu. Metoda ta zapewnia znormalizowaną procedurę oznaczania w czasie rzeczywistym ROS apoplastu wytwarzanego z poddanych działaniu substancji tkanek ryżu. Ta metoda jest prosta w obsłudze, tania, przejrzysta w składzie i niezależna od zestawów komercyjnych. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą badać produkcję apoplastów ROS w czasie rzeczywistym, gdy rośliny są poddawane stresom bio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty od Shanghai Natural Science Foundation (numer grantu: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (program Agri-X, numer grantu:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numer grantu: ZXWH2150201/001) dla Jiangbo Fan oraz przez Medical-Engineering Collaboration Project Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju (numer grantu: 21X010301734) dla Can Li.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania | WHB WHB-96-01 | ||
| Absolut etanolu | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | Oprogramowanie BioTek | ||
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-fenylo-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pirydazyno-1,4-dion, CAS #:143556-24-5 |
| Czytnik mikropłytek | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroksydaza z chrzanu (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sacharoza | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Bibliografia
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
