Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64791

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj protokół do inicjowania, utrzymywania i analizowania hodowli mysich hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą ekspansji ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego, a także metody genetycznej manipulacji nimi za pomocą transdukcji lentiwirusowej i elektroporacji.

Streszczenie

Samoodnawiające się multipotencjalne hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są ważnym typem komórek ze względu na ich zdolność do wspierania hematopoezy przez całe życie i odtwarzania całego układu krwionośnego po przeszczepie. HSC są stosowane klinicznie w terapiach przeszczepów komórek macierzystych, które stanowią leczenie wielu chorób krwi. Istnieje duże zainteresowanie zarówno zrozumieniem mechanizmów regulujących aktywność HSC i hematopoezę, jak i opracowaniem nowych terapii opartych na HSC. Jednak stabilna hodowla i ekspansja HSC ex vivo stanowiła główną barierę w badaniu tych komórek macierzystych w wykonalnym systemie ex vivo. Niedawno opracowaliśmy system hodowli na bazie alkoholu poliwinylowego, który może wspierać długoterminową i zakrojoną na szeroką skalę ekspansję mysich HSC do przeszczepu oraz metody ich genetycznej edycji. Protokół ten opisuje metody hodowli i genetycznej manipulacji mysimi HSC poprzez elektroporację i transdukcję lentiwirusową. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla szerokiego grona hematologów eksperymentalnych zainteresowanych biologią HSC i hematopoezą.

Wprowadzenie

Układ krwiotwórczy wspiera szereg istotnych procesów u ssaków, od dostarczania tlenu do zwalczania patogenów, poprzez wyspecjalizowane typy komórek krwi i odpornościowych. Ciągła produkcja krwi (hematopoeza) jest wymagana do utrzymania homeostazy układu krwionośnego, która jest podtrzymywana przez hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC)1. Najbardziej prymitywną komórką krwiotwórczą jest hematopoeetyczna komórka macierzysta (HSC), która ma unikalne zdolności do samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego2,3. Jest to rzadka populacja komórek, występująca głównie w dorosłym szpiku kostnym4, gdzie występują z częstością zaledwie około jednej na 30 000 komórek. Uważa się, że HSC wspierają hematopoezę przez całe życie i pomagają przywrócić hematopoezę po stresie hematologicznym. Zdolności te pozwalają również HSC na stabilną rekonstytucję całego układu krwiotwórczego po przeszczepieniu do napromieniowanego biorcy5. Stanowi to funkcjonalną definicję HSC, a także stanowi naukową podstawę terapii transplantacyjnej HSC, leczenia wielu chorób krwi i układu odpornościowego6. Z tych powodów HSC są głównym przedmiotem zainteresowania hematologii eksperymentalnej.

Pomimo dużego zainteresowania badaniami, nadal wyzwaniem jest stabilne rozszerzenie HSC ex vivo7. Niedawno opracowaliśmy pierwszy długoterminowy system hodowli ekspansywnej ex vivo dla myszy HSCs8. Podejście to może zwiększyć przeszczepialne HSC o 234-899 razy w ciągu 4-tygodniowej hodowli. W porównaniu z alternatywnymi podejściami, główną zmianą w protokole było usunięcie albuminy surowicy i zastąpienie jej syntetycznym polimerem. Alkohol poliwinylowy (PVA) został zidentyfikowany jako optymalny polimer dla mysich kultur HSC8, który jest obecnie używany również do hodowli innych typów komórek krwiotwórczych9. Jednak niedawno zidentyfikowano również inny polimer o nazwie Soluplus (kopolimer przeszczepu poliwinylu kaprolaktamu i glikolu polietylenowego), który wydaje się poprawiać klonalną ekspansję HSC10. Przed zastosowaniem polimerów stosowano albuminę surowicy w postaci płodowej surowicy bydlęcej, frakcji V albuminy surowicy bydlęcej lub rekombinowanej albuminy surowicy, ale miały one ograniczone wsparcie dla ekspansji HSC i wspierały tylko krótkoterminowe (~1 tydzień) hodowle ex vivo7. Należy jednak zauważyć, że protokoły hodowli HSC, które utrzymują HSC w stanie spoczynku, mogą obsługiwać dłuższy czas hodowli ex vivo11,12.

W porównaniu z innymi metodami hodowli, główną zaletą kultur opartych na PVA jest liczba komórek, które można wygenerować, oraz czas, w którym protokół może być używany do śledzenia HSC ex vivo. W ten sposób pokonuje się szereg barier w dziedzinie hematologii eksperymentalnej, takich jak niska liczba HSC możliwych do wyizolowania na mysz (tylko kilka tysięcy) oraz trudności w śledzeniu HSC w czasie in vivo. Należy jednak pamiętać, że hodowle te stymulują proliferację HSC, podczas gdy pula HSC in vivo jest przeważnie spoczynkowa w stanie ustalonym13. Ponadto, chociaż kultury są selektywne dla HSC, dodatkowe typy komórek gromadzą się wraz z kulturami w czasie, a przeszczepialne HSC reprezentują tylko około jednej na 34 komórki po 1 miesiącu. Mieloidalne hematopoetyczne komórki progenitorowe wydają się być głównym typem komórek zanieczyszczających w tych hodowlach HSC8. Niemniej jednak możemy użyć tych kultur do wzbogacenia HSC z heterogenicznych populacji komórek (np. szpik kostny c-Kit+ HSPCs14). Obsługuje również transdukcję lub elektroporację HSC do manipulacji genetycznej14,15,16. Aby pomóc w identyfikacji HSC z heterogenicznej populacji HSPC, CD201 (EPCR) został niedawno zidentyfikowany jako użyteczny marker HSC ex vivo10,17,18, z przeszczepialnymi HSC ograniczonymi do frakcji CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.

Ten protokół opisuje metody inicjowania, utrzymywania i oceny mysich kultur ekspansji HSC opartych na PVA, a także protokoły manipulacji genetycznej w tych kulturach za pomocą elektroporacji lub transdukcji wektorów lentiwirusowych. Oczekuje się, że metody te okażą się przydatne dla wielu hematologów doświadczalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym hodowla i eutanazja, muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Eksperymenty opisane poniżej zostały zatwierdzone przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać listę wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych

  1. Roztwór podstawowy PVA
    1. Weź 50 ml wody o jakości kultur tkankowych do małej szklanej butelki (odpowiedniej do autoklawowania). Podgrzej wodę do prawie wrzenia w kuchence mikrofalowej.
    2. Odważyć 5 g proszku PVA i dodać do wody.
      UWAGA: Zaleca się rozpuszczenie tylko 1-5 g PVA. Rozpuszczanie większych ilości może spowodować niepełną rekonstytucję.
    3. Zamknij szczelnie pokrywkę i wstrząśnij, aby wymieszać. Następnie poluzuj pokrywę.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas ponownego otwierania, ponieważ ciśnienie może ulec zmianie ze względu na zmieniającą się temperaturę wody.
    4. Autoklaw i pozostawić do ostygnięcia. Zamknij szczelnie pokrywkę i wstrząśnij, aby wymieszać. Porcje należy przygotować w sterylnych probówkach i przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  2. Rozpuścić liofilizowane cytokiny w pożywce F-12 zawierającej 1 mg/ml PVA. Rozpuść czynnik komórek macierzystych do 10 μg/ml i trombopoetynę do 100 μg/ml, aby wytworzyć zapasy w stosunku 1:1000. Porcje należy przygotować w sterylnych probówkach i przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C. Alternatywnie, należy przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    UWAGA: Należy unikać rekonstytucji cytokin w albuminie surowicy bydlęcej ze względu na negatywny wpływ na ekspansję HSC u myszy.

2. Ekstrakcja szpiku kostnego HSC i wzbogacenie c-Kit+

  1. Wypreparuj kości udowe, piszczelowe, miednice i kręgosłup świeżo poddanych eutanazji 8-12-tygodniowym myszom C57BL/6 (poprzez uduszenie CO2 i/lub zwichnięcie szyjki macicy) i umieść kości w PBS na lodzie.
    UWAGA: Upewnij się, że powierzchnie i narzędzia są wysterylizowane 70% etanolem.
  2. Oczyść kości za pomocą niestrzępiących się, delikatnych chusteczek do ćwiczeń, usuwając mięśnie i rdzeń kręgowy, a następnie dodaj do moździerza z ~3 ml PBS.
    UWAGA: Upewnij się, że tłuczek i moździerz są wysterylizowane 70% etanolem, a następnie raz zmyte PBS.
  3. Zmiażdż kości tłuczkiem bez mielenia, aby zminimalizować siły ścinające. Rozdrobnić duże fragmenty szpiku kostnego uwolnione do PBS za pomocą igły 19 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę komórek przez filtr 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Po przeniesieniu zawiesiny powtarzać czynności z nowym PBS, aż kości zostaną wybielone i nie będzie widać szpiku. Dąż do końcowej objętości ~30 ml na mysz i ~50 ml dla dwóch myszy.
  5. Wymieszać komórki szpiku kostnego, zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:10-1:20 za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Oczekuje się, że jedna mysz da 2-5 × 108 całych komórek szpiku kostnego.
  6. Wirować z prędkością 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS (350 μl dla jednej myszy lub 500 μl dla dwóch myszy).
  7. Dodać 0,2 μl przeciwciała anty-c-Kit allofikocyjaniny (APC) na 10 milionów komórek i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  8. Dodaj 5 ml zimnego PBS do inkubowanych komórek, aby zmyć nadmiar przeciwciał i przefiltrować przez filtr 50 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Umyj oryginalną probówkę 7 ml zimnego PBS i przełóż przez filtr. Jeśli dojdzie do zatkania filtra, zarysuj powierzchnię filtra końcówką P1000.
  10. Wirować z prędkością 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS (350 μl dla jednej myszy lub 500 μl dla dwóch myszy).
  11. Dodać 0,2 μl mikrogranulek anty-APC na 10 milionów komórek i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Dodać 12 ml sterylnego PBS, aby zmyć nadmiar mikrogranulek.
  12. Odwirować komórki w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 2 ml zimnego PBS. Podczas gdy komórki obracają się w tym kroku, przejdź do kroku 2.13.
  13. Przygotuj się do wzbogacenia kolumny, umieszczając magnetyczną kolumnę filtracyjną w magnesie magnetycznego separatora kolumnowego, z filtrem 50 μm na górze i stożkową rurką o pojemności 15 ml poniżej.
  14. Przepuścić 3 ml sterylnego PBS przez filtr 50 μm i kolumnę filtracyjną. Po przejściu PBS przepuścić zawiesinę komórek przez kolumnę, a następnie za każdym razem trzykrotnie przepłukać 3 ml zimnego PBS. Przy każdym praniu poczekaj, aż kolumna przestanie kapać przed dodaniem następnego prania.
  15. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na świeżej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml zimnego PBS, założyć tłok kolumny na kolumnę i wymyć komórki, naciskając tłok.
  16. Wymieszaj komórki wzbogacone w c-Kit, zbierz 10 μl komórek i policz za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru. Typowa wydajność z jednej myszy wynosi 2-5 × 106 komórek c-Kit+.
    UWAGA: W tym momencie komórki można bezpośrednio rozsiać na pożywce HSC lub przygotować do oczyszczania HSC za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

3. Inicjowanie hodowli komórkowych za pomocą HSPC wzbogaconych o c-Kit

  1. Przygotować świeżą pożywkę (Tabela 1) dla wymaganej liczby komórek/studzienek. Wysiew: 0,5-1 miliona komórek na ml dla HSPC wzbogaconych w c-Kit.
  2. Odwiruj komórki wzbogacone w c-Kit i ponownie zawieś w podłożu HSC o żądanej gęstości komórek.
  3. Przenieś komórki na płytki pokryte fibronektyną lub naładowane ujemnie powierzchniowo, w ilości 200 μl na płytkę 96-dołkową lub 1 ml na płytkę 24-dołkową.
  4. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 .

4. Inicjowanie hodowli komórkowych za pomocą oczyszczonych HSC FACS

  1. Przygotować odpowiednią objętość biotynylowanego barwienia przeciwciałami rodowymi: 3 μl mieszanki wzorcowej (Tabela 2) na 10 milionów komórek, rozcieńczonych w stosunku 1:100 w PBS.
  2. Odwirować komórki wzbogacone w c-Kit i ponownie zawiesić w barwieniu przeciwciał linii przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć 10 ml sterylnego PBS i odwirowywać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować odpowiednią objętość świeżego barwnika przeciwciałem HSC (tabela 3): 300 μl na 10 milionów komórek. Równolegle z tym barwieniem próbki należy przygotować odpowiednie próbki kontrolne barwienia do kompensacji i bramkowania.
    UWAGA: Pracuj w kapturze do hodowli tkankowej przy wyłączonym świetle podczas stosowania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem.
  5. Ponownie zawiesić komórki w barwieniu przeciwciałem HSC i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut. Mieszać komórki co 20-30 minut, stukając, aby zapobiec osadzaniu się komórek.
  6. Przemyć 10 ml sterylnego PBS i odwirowywać w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant, przesunąć osad w celu rozbicia i ponownie zawiesić w sterylnym PBS z 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI).
  8. Przygotować świeżą pożywkę (Tabela 1) dla wymaganej liczby dołków i umieścić na płytkach z fibronektyną lub płytkami naładowanymi ujemnie (200 μl na płytkę 96-dołkową lub 1 ml na płytkę 24-dołkową).
  9. Przygotuj maszynę FACS do sortowania i sortuj CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- HSC bezpośrednio do studzienek zawierających pożywkę (patrz Rysunek 1 dla standardowej strategii bramkowania FACS stosowanej tutaj). Sortuj do 200 komórek na 96-dołkową płytkę lub do 1 000 komórek na 24-dołkową płytkę.
    UWAGA: Maszyny FACS powinny być obsługiwane przez przeszkolonego naukowca. Zaleca się, aby użytkownicy skontaktowali się z lokalną placówką FACS w celu omówienia tej strategii sortowania, jeśli nie mają doświadczenia w izolacji FACS mysich HSC.

5. Wprowadzanie zmian w mediach

  1. W przypadku hodowli komórkowych zainicjowanych z komórek wzbogaconych w c-Kit należy rozpocząć zmiany pożywki po 2 dniach. W przypadku hodowli komórkowych zainicjowanych z izolowanych przez FACS HSC, należy rozpocząć zmiany pożywki po 5 dniach.
  2. Przygotować wystarczającą ilość świeżego, wstępnie ogrzanego (~37 °C) podłoża HSC (Tabela 1) dla wszystkich studzienek.
  3. Delikatnie wyjąć płytkę z inkubatora do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Ponieważ HSPC na płytkach naładowanych ujemnie powierzchniowo łatwiej ulega zakłóceniu niż te na fibronektynie, należy zachować szczególną ostrożność podczas zmiany pożywki na płytkach naładowanych ujemnie powierzchniowo, aby uniknąć zakłócenia hodowli komórkowych.
  4. Za pomocą pipety lub pompy próżniowej powoli usuń ~90%-95% pożywki z menisku studzienki.
    UWAGA: Unikaj wyciągania pożywki z podstawy studzienki, w przeciwnym razie wiele komórek zostanie usuniętych.
  5. Dodać 200 μl (dla płytek 96-dołkowych; 1 ml dla płytek 24-dołkowych) świeżej pożywki do dołka.
  6. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  7. Powtarzać kroki 5.1-5.6 co 2-3 dni, aż do punktu końcowego eksperymentu.
  8. W przypadku kultur komórkowych zainicjowanych HSPC wzbogaconymi w c-Kit (sekcja 3), należy podzielić kultury w stosunku 1:2-1:3 po ~3 tygodniach. W przypadku kultur komórkowych zainicjowanych oczyszczonymi HSC FACS (sekcja 4), należy podzielić kultury w stosunku 1:2-1:3 po ~3 tygodniach i gdy kultury są >90% zlewne.
    UWAGA: Dokładny harmonogram będzie zależał od zainteresowań eksperymentalnych. Kultury te były charakteryzowane przez 4-8 tygodni8, ale możliwe są dodatkowe długości hodowli.

6. Elektroporowanie hodowanych HSPC

UWAGA: Ten protokół służy do elektroporacji rybonukleoproteiny Cas9/sgRNA (RNP), ale może być dostosowany do elektroporacji mRNA lub innych rekombinowanych białek. Rozpocznij hodowle z wystarczającą liczbą komórek, aby przeprowadzić to w pożądanym punkcie czasowym eksperymentu.

  1. Wykonać wymianę podłoża 1 dzień przed elektroporacją, jak opisano w punkcie 5.
    UWAGA: Zaleca się co najmniej posiew przez noc przed elektroporacją. Jednak komórki są zwykle hodowane przez 1-3 tygodnie przed transdukcją.
  2. W dniu elektroporacji ustaw nukleofektor. Włącz maszynę. Na ekranie dotykowym wybierz moduł X, a następnie używany rozmiar kuwety.
  3. Przygotować wystarczającą ilość roztworu P3 (zgodnie z instrukcjami producenta) do skali elektroporacji (100 μl na kuwetę lub 20 μl na mikrokuwetę) i pozostawić do wyrównania do temperatury pokojowej.
  4. Przygotować wystarczającą ilość świeżego podłoża (tabela 1) w stosunku do liczby dołków platerowanych i dodać 500 μl pożywki do 24-dołkowej płytki lub 100 μl pożywki do 96-dołkowej płytki.
  5. Rozmrozić sgRNA (wstępnie rozcieńczone do 2 μg/ml w wodzie wolnej od RNaz) na lodzie i wymieszać 16 μg sgRNA z 30 μg enzymu Cas9 (w stężeniu 10 μg/ml) w sterylnej probówce do PCR. Dołączyć dodatkową probówkę do PCR zawierającą tylko białko Cas9 jako kontrolę. Wymieszaj, przesuwając rurkę, a następnie krótko odwiruj. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut w termocyklerze w celu skompleksowania RNP, a następnie utrzymywać probówki na lodzie.
    UWAGA: Można to zmniejszyć pięciokrotnie, jeśli wykonujesz elektroporację w mikrokuwetach.
  6. Wymieszać i przenieść HSPC do elektroporacji do probówki; zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Zaleca się elektroportowanie 1-5 milionów ogniw na 100 μl kuwety (pięciokrotnie zmniejszone w przypadku mikrokuwety).
  7. Odwirować odpowiednie komórki liczbowe w probówce o pojemności 1,5 ml o masie 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić 100 μl buforu nukleofekcyjnego.
  8. Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do probówki PCR zawierającej skompleksowany RNP i powoli pipetuj w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać i przenieść do kuwety do elektroporacji o pojemności 100 μl. Wyrzuć mieszaninę do kuwety powoli i jednym płynnym ruchem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w kuwecie.
  9. Na elektroporatorze wybierz położenie elektroporowanych studzienek. Za pomocą ekranu dotykowego wybierz typ komórki, program CD34+, człowiek lub wpisz kod impulsu EO100. Naciśnij przycisk OK.
  10. Przenieś kuwety do elektroporatora. Naciśnij przycisk Start na ekranie dotykowym, aby rozpocząć elektroporację. Bezpośrednio po elektroporacji dodać 500 μl pożywki hodowlanej do kuwety (100 μl w przypadku użycia mikrokuwety).
  11. Delikatnie przenieś komórki na przygotowaną płytkę i wróć do inkubatora kultur tkankowych.
  12. W przypadku procedur wykorzystujących matrycę dawcy AAV6 należy dodać wektor natychmiast po przeniesieniu komórek na płytkę pokrytą fibronektyną w stężeniu 5 000 wektorów / komórkę.
  13. Po 6-18 godzinach przygotować świeżą pożywkę i dokonać wymiany pożywki zgodnie z opisem w punkcie 5. W przypadku tej zmiany podłoża usuń tylko 80%-90% podłoża.
    UWAGA: Unikaj wyciągania pożywki z podstawy studni.
  14. Analizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej po 2 lub więcej dniach (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 8).
  15. Kontynuuj wykonywanie zmian pożywki co 2 dni, jak opisano w sekcji 5, aż do osiągnięcia punktu końcowego doświadczenia.
    UWAGA: Szybkość edycji CRISPR/Cas9 przy użyciu tej metody zależy w dużym stopniu od skuteczności celowania zaprojektowanego sgRNA. Szybkość edycji do 95% została zaobserwowana za pomocą wydajnego przewodnika15. Wytyczne dotyczące projektowania sgRNA zostały wcześniej szczegółowo opisane w innym miejscu19,20.

7. Przenoszenie hodowanych HSPC za pomocą wektora lentiwirusowego

UWAGA: Zainicjuj hodowle z wystarczającą liczbą komórek, aby wykonać to w pożądanym punkcie czasowym eksperymentu.

  1. Wygenerowanie i mianowanie wektora lentiwirusowego (w zależności od celów eksperymentalnych). Rozmrozić wektor lentiwirusowy na lodzie.
  2. Wykonać zmianę pożywki (jak w sekcji 5), a następnie wymieszać i przenieść HSPC w celu transdukcji do probówki. Zebrać 10 μl komórek i policzyć za pomocą roztworu Türksa w rozcieńczeniu 1:2 za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Komórki mogą być transdukowane natychmiast po posiewaniu. Jednak komórki są zwykle hodowane przez 1-3 tygodnie przed transdukcją.
  3. Ponownie pokryć wymaganą dawkę komórek do transdukcji (zwykle 100 000 komórek na płytkę 96-dołkową). Oddzielnie, nietransdukowane na płytce komórki kontroli ujemnej.
    UWAGA: Jeśli używasz płytek naładowanych ujemną powierzchnią, przenieś komórki na płytki pokryte fibronektyną w celu transdukcji wektora lentiwirusowego.
  4. Dodaj wektor lentiwirusowy do każdej studzienki komórek: dodaj 20 jednostek transdukcji na komórkę, aby osiągnąć ~ 30% wydajności transdukcji. Należy jednak określić dawkę wektora lentiwirusowego empirycznie, w zależności od wymagań doświadczalnych.
    UWAGA: Upewnij się, że wektor lentiwirusowy jest usuwany zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  5. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na 6 godzin. Następnie wykonaj zmianę podłoża zgodnie z opisem w sekcji 5.
    UWAGA: Supernatant zawiera żywego wirusa. Utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
  6. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej (np. pod kątem ekspresji GFP) po 2 dniach lub dłużej. Szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 8.
  7. Kontynuować wykonywanie zmian pożywki co 2 dni, jak opisano w sekcji 5, aż do osiągnięcia punktu końcowego doświadczenia.

8. Analiza metodą cytometrii przepływowej kultur HSPC

  1. Przygotować skoncentrowaną mieszaninę przeciwciał HSC hodowanych ex vivo w PBS zawierającą 2% FBS (Tabela 4). Mieszaninę należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca.
    UWAGA: Pracuj w kapturze do hodowli tkankowej przy wyłączonym świetle w przypadku stosowania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem.
  2. Dodać 2 μl skoncentrowanej mieszanki przeciwciał do 50 μl komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Równolegle z tym barwieniem próbki należy przygotować odpowiednie próbki kontrolne barwienia do kompensacji i bramkowania.
  3. Dodać 200-1 000 μl PBS zawierającego 2% FBS i odwirować przy 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić w 100-500 μl PBS zawierającego 2% FBS i 0,5 μg/ml PI.
  4. Ustaw cytometr przepływowy i zapisz co najmniej 10 000 żywych komórek na próbkę.
    UWAGA: Cytometry przepływowe powinny być obsługiwane przez przeszkolonego naukowca. Użytkownicy muszą skontaktować się z lokalną placówką FACS w celu omówienia tej analizy, jeśli nie mają doświadczenia w cytometrii przepływowej.
  5. Eksportuj dane w formacie FCS i analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Zobacz Rysunek 2 przedstawia standardową strategię bramkowania zastosowaną tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku oczyszczania HSC metodą FACS przewidujemy, że w obrębie szpiku kostnego wzbogaconego o c-Kit około 0,2% komórek stanowi populacja CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- u młodych (8–12-tygodniowych) myszy C57BL/6 (Rysunek 1). Jest jednak prawdopodobne, że myszy transgeniczne lub myszy w różnym wieku wykazują odmienne częstotliwości występowania HSC. Po 4 tygodniach hodowli spodziewamy się, że frakcja CD201+CD150+

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mamy nadzieję, że ten protokół stanowi użyteczne podejście do badania biologii HSC, hematopoezy i hematologii bardziej ogólnie. Od czasu początkowego opracowania metody hodowli na bazie PVA dla HSCoczyszczonych metodą FACS 8, metoda ta została rozszerzona. Na przykład wykazano, że metoda działa z c-Kit wzbogaconym o szpik kostny i z płytkami naładowanymi ujemnie14. Wykazano również jego kompatybilność z transdukcją i elektroporacją14,15

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej WIMM za dostęp do cytometrii przepływowej, oraz Rdzeniowi Badań Przesiewowych Wirusów WIMM za generowanie wektorów lentiwirusowych. Praca ta została sfinansowana przez Kay Kendall Leukaemia Fund i Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
HemocytometrAppleton Woods LtdHC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonza V4XP-3024
Tłuczek i moździerzScientific Laboratory Supplies LimitedX18000
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Materiały
5 mL strzykawkaVWR International Ltd720-2519
Igła 19 GVWR International Ltd613-5394
50 μ m sitko do komórekSysmex04-004-2317
70 μ m Sitko komórkoweCorning431751
Kimtech chusteczkiVWR International Ltd115-2075
LS MACSkolumna Miltenyi Biotec130-042-401
odczynniki
Alt-R S.p. Cas9 Nukleaza V3, 100 μ gIDT 
Czynnik rekombinowanych mysich komórek macierzystych bez zwierząt PeprotechAF-250-03
Niezwierzęca rekombinowana trombopoetyna myszyPeprotechAF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (klon: 2B8)ThermoFisher17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (klon: 2B8)Biolegend105828
Anti-mouse CD127  APC/Cy7 (klon: A7R34)Biolegend135040
Biotyna przeciw myszom CD127 (klon: A7R34)Biolegend135006
Anti-mysz CD150 PE/Cy7 (klon: TC15-12F12.2)Biolegend115914
Anti-mouse CD201  APC (klon: eBio1560)ThermoFisher17-2012-82
Anty-mysz CD34 FITC (klon: RAM34)ThermoFisher11-0341-85
Anty-mysz CD4  APC/Cy7 (klon: RM4-5)Biolegend100526
Bio-mysia biotyna CD4 (klon: RM4-5)Biolegend100508
Anti-mysz CD45R  APC/Cy7 (klon: RA3-6B2)Biolegend103224
Bio-mysia biotyna CD45R (klon: RA3-6B2)Biolegend103204
Anti-mouse CD48 BV421 (klon: HM48-1)Biolegend103428
Anti-mysia biotyna CD8 (klon: 53-6.7)Biolegend100704
Anti-mouse CD8a  APC/Cy7 (klon: 53-6.7)Biolegend100714
Anty-mysz Ly6G/Ly6C  APC/Cy7 (klon: RB6-8C5)Biolegend108424
Anti-mysia biotyna Ly6G/Ly6C (klon: RB6-8C5)Biolegend108404
Anti-mouse Sca1 PE (klon: D7)Biolegend108108
Anti-mouse Ter119  APC/Cy7 (klon: TER-119)Biolegend116223
Anti-mysia biotyna Ter119 (klon: TER-119)Płytki Biolegend116204
CellBIND, 24-dołkoweCellBIND Corning3337naładowane ujemnym ładunkiem powierzchniowym
, 96-dołkowe Corning3330naładowany ujemnie naładowany powierzchniowo
Niestandardowy syntetyczny sgRNA Synthego, Sigma Aldrich, IDTNa zamówienie
Płodowa surowica bydlęcaMerck Life Science UK LimitedF7524-50ML
Płytki pokryte fibronektyną, 96-dołkoweBD Biosciences354409
Mieszanka składników odżywczych F-12 szynkiGibco11765054
Insulina-Transferyna-Selen-X (100x)Gibco51500.056
Solanka solankowa buforowana fosforanamiAlfa AesarJ61196.
Alkohol poliwinylowySigma AldrichP8136
Jodek propidynyEnzo Life Sciences (UK) LtdEXB-0018
Streptawidyna APC/Cy7Biolegend405208
Tü rks' powiedział: rozwiązanieSigma Aldrich109277
VirkonMettler-Toledo Ltd95015662
Zestaw preparacyjny Fisher Scientific 12764416 1081058 płytki AP

Bibliografia

  1. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  4. Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
  5. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  6. Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
  7. Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
  8. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
  9. Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
  10. Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
  11. Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
  12. Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938(2021).
  13. Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  14. Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568(2021).
  15. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686(2021).
  16. Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
  17. Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502(2022).
  18. Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
  19. Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
  20. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
  21. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
  22. Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla na alkoholu poliwinylowymekstrakcja szpiku kostnegotransdukcja lentiwirusowatechnika elektroporacjiwzbogacanie w komórki c-Kitsortowanie aktywowane fluorescencjątransplantacja komórek macierzystych
Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.