Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64792

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  , 
1Helmholtz Pioneer Campus (HPC), Helmholtz Munich, 2Institute of Computational Biology, Computational Health Department, Helmholtz Munich, 3Division of Infectious Diseases and Tropical Medicine, Ludwig-Maximillian-Universität Klinikum, 4TUM School of Medicine, Technical University of Munich

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Streszczenie

Wątroba jest złożoną i niejednorodną tkanką odpowiedzialną za wykonywanie wielu kluczowych funkcji fizjologicznych, takich jak między innymi utrzymanie homeostazy energetycznej i metabolizm ksenobiotyków. Zadania te są wykonywane poprzez ścisłą koordynację między komórkami miąższowymi wątroby i niemiąższowymi. Dodatkowo, różne czynności metaboliczne są ograniczone do określonych obszarów zrazika wątroby - zjawisko zwane strefą wątroby. Niedawne postępy w technologiach sekwencjonowania pojedynczych komórek umożliwiły naukowcom zbadanie niejednorodności tkanek w rozdzielczości pojedynczej komórki. W wielu złożonych tkankach, w tym w wątrobie, ostre protokoły dysocjacji enzymatycznej i/lub mechanicznej mogą negatywnie wpływać na żywotność lub jakość zawiesin jednokomórkowych potrzebnych do kompleksowego scharakteryzowania tego narządu w zdrowiu i chorobie.

Ten artykuł opisuje solidny i powtarzalny protokół izolowania jąder z zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby. Metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości jądra, które są kompatybilne z dalszymi podejściami omicznymi do pojedynczych komórek, w tym sekwencją RNA pojedynczego jądra, testem chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq), a także multimodalnym omicznym (joint RNA-seq i ATAC-seq). Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do izolacji jąder od zdrowych i chorych próbek wątroby od ludzi, myszy i naczelnych. Takie podejście pozwala na bezstronną izolację wszystkich głównych typów komórek w wątrobie, a zatem oferuje solidną metodologię badania wątroby w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

Genomika pojedynczej komórki szybko staje się podstawową metodologią do badania funkcji wątroby i oceny wpływu heterogeniczności komórkowej na zdrowie i warunki chorobowe1. Szybki rozwój "multiomiki" do jednoczesnego pomiaru różnych warstw informacji i równoległa ekspansja solidnych potoków obliczeniowych toruje drogę do odkrycia nieznanych wcześniej typów i podtypów komórek w prawidłowej i chorej wątrobie2.

Możliwość eksploracji biobanków i archiwalnych zamrożonych próbek znacznie zwiększyła możliwości ponownego przyjrzenia się i odkrycia roli komórek niemiąższowych3,4,5 i zbadania roli poliploidalnych hepatocytów podczas starzenia się i w chorobach przewlekłych6,7,8,9. Dlatego ten artykuł opisuje solidny i powtarzalny protokół izolacji pojedynczego jądra dla zarchiwizowanych wątrób zamrożonych błyskawicznie (FF), który jest kompatybilny z sekwencjonowaniem RNA pojedynczego jądra i sekwencjonowaniem ATAC, a także z multimodalną omiką (joint RNA-seq i ATAC-seq) (Rysunek 1).

Ten przepływ pracy pozwala na badanie transkryptomu i dostępności chromatyny wszystkich typów komórek w wątrobie, niezależnie od wielkości komórki lub kruchości, w protokołach dysocjacji enzymatycznej. Można go wykonać z małymi skrawkami tkanek (15-30 mg lub 5-10 mm3) z cennych próbek ludzkich lub myszy transgenicznych. Określenie wysokiej czystości izolacji jąder obejmuje kwantyfikację i pomiar wielkości jądra, co może korelować ze zwiększonym rozmiarem komórki i starzeniem się10,11, a czystość ta jest istotna dla analizy zarówno ploidy hepatocytów12 jak i mechanizmów transkrypcyjnych zależnych od wielkości komórki11,13,14,15. Dodatkowo jądra wyizolowane z zamrożonej wątroby zachowują cenne informacje na temat strefowości wątroby. Przebieg pracy i pobieranie tkanek pozwalają na walidację danych genomicznych pojedynczych komórek lub dalsze analizy uzupełniające, takie jak immunohistochemia lub transkryptomika przestrzenna z tej samej tkanki i tej samej osoby. Dlatego podejście to może być systematycznie i niezawodnie stosowane do wielu chorób wątroby i organizmów modelowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt i przepisami rządu Górnej Bawarii. Pomieszczenia inwentarskie zostały zatwierdzone zgodnie z § 11 niemieckiej ustawy o dobrostanie zwierząt i prowadzone zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Ofiaruj 3-miesięcznego do 22-miesięcznego samca myszy C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Połóż zwierzę na desce sekcyjnej, zabezpiecz kończyny szpilkami i zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.
  2. Przeprowadzić sekcję zwłok zgodnie z zaleceniami Treuting et al.16.
    1. Otwórz brzuch aż do klatki piersiowej, wizualizuj wątrobę i użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć wątrobę bez przebijania zrazików.
    2. Wyciągnij nienaruszoną wątrobę, przytrzymując przeponę kleszczami i usuwając tkankę łączącą nożyczkami.
  3. Umyj narząd w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), osusz go czystym ręcznikiem papierowym i pokrój zraziki wątroby na kilka części do różnych celów: FF do izolacji pojedynczego jądra i multiomiki; utrwalony paraformaldehydem (10% PFA) do zatapiania parafiny; i/lub osadzony w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do dalszych analiz histologicznych (Rysunek 1A).
  4. Porcje wątroby rozmieścić w kriowialach lub probówkach z nakrętką o pojemności 5 ml i natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Przechowuj zamrożone próbki wątroby w temperaturze -80 °C do dalszych eksperymentów multiomicznych jednojądrowych (Rysunek 1B, C).
    UWAGA: Kriokonserwowana tkanka może być bezpiecznie przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka lat i zawsze powinna być transportowana na suchym lodzie w temperaturze -80 °C przed użyciem.

2. Izolacja jąder

  1. Czyszczenie blatów stołowych i przygotowanie i materiałów eksploatacyjnych
    1. Wyczyść blaty robocze i pipety 70% etanolem i roztworem do odkażania RNazy lub użyj dedykowanych blatów i materiałów wolnych od RNaz.
    2. Schłodź wstępnie zarówno wahadłowe wiadro, jak i wirówki o stałym kącie nachylenia, probówki 1,5 ml/2 ml i płytki wielodołkowe do temperatury 4 °C, jak opisano poniżej.
    3. Bez-RNazową, jednorazową pęsetę używaną do pracy z chusteczkami, jednorazowy sterylny skalpel i szalkę Petriego schłodzić na suchym lodzie (-60 °C).
    4. Schłodź wstępnie homogenizator szklany Dounce i tłuczki na lodzie (4 °C). Umieść każdy tłuczek (A i B) w probówce o pojemności 5 ml, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z lodem i potencjalnego zanieczyszczenia RNazą.
    5. Przygotować rozcieńczalnik pożywki jodiksanolowej (IDM) (tabela 1A) i użyć go do rozcieńczenia 50% i 29% pożywki o gradiencie gęstości 60% jodiksanolu (odpowiednio tabela 1B i tabela 1C).
    6. Wstępnie schłodzić wszystkie rurki. Dla każdej próbki, która ma być przetworzona, należy przygotować następujące probówki:
      1. Przygotować trzy probówki wiążące o niskiej zawartości DNA o pojemności 1,5 ml (jedna do przefiltrowanego homogenatu tkankowego, druga zawierająca 250 μl 50% rozcieńczonego roztworu jodiksanolu i trzecia do czystej zawiesiny jąder).
      2. Przygotować jedną probówkę okrągłodenną o pojemności 2 ml zawierającą 500 μl roztworu jodiksanolu o 29% rozcieńczeniu do rozdzielania w gradinie gęstości.
      3. Przygotować jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml do izolacji jąder-2 (NIM-2) i buforu homogenizacyjnego (HB).
    7. Przygotować pożywkę do izolacji jąder-1 (NIM-1) (tabela 1D) i użyć jej do wytworzenia NIM-2 (tabela 1E), a następnie HB (tabela 1F). Dodaj oba inhibitory RNAzy tuż przed użyciem, jak opisano poniżej w protokole.
    8. Przygotować bufor do przechowywania jąder (NSB) zgodnie z opisem w tabeli 1G. Dodaj rekombinowany inhibitor RNAzy tuż przed użyciem. Dodaj inhibitor RNAzy na bazie białka do NSB przed użyciem do sortowania FACS (opcjonalnie).
    9. Przygotuj zlewkę o pojemności 500 ml ze sterylną wodą, aby namoczyć homogenizatory i tłuczki Dounce po homogenizacji tkanek w celu optymalnego czyszczenia i konserwacji homogenizatorów.
  2. Homogenizacja tkanek
    1. Pokrój kawałek tkanki o grubości 20-30 mg (lub 5 mm3) za pomocą schłodzonego skalpela wewnątrz szalki Petriego na suchym lodzie. Następnie natychmiast przenieść szalkę Petriego do mokrego lodu (4 °C). Dodaj 1 ml HB i za pomocą zimnego skalpela zmiel tkankę tak bardzo, jak to możliwe, aby można ją było łatwo zassać końcówką o szerokim otworze o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Zawsze używaj końcówek z szerokimi otworami do wszystkich transferów tkanek/jąder. Alternatywnie, końcówki o pojemności 1 ml można przeciąć sterylnym skalpelem na sterylnej plastikowej osłonie, aby uzyskać szerokie otwory (Rysunek 2A).
    2. Zebrać zawiesinę tkankową i przenieść ją do wstępnie schłodzonego szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 2 ml (Rysunek 2B).
    3. Umyj szalkę Petriego dodatkowymi 0,5-1 ml HB i zbierz wszystkie pozostałe kawałki tkanki, trzymając wszystko na lodzie.
    4. Powoli i ostrożnie wykonaj pięć uderzeń luźnym tłuczkiem A na lodzie. Unikaj tworzenia bąbelków, używając ruchów skręcających tłuczek podczas ciągnięcia go w górę iw dół. Upewnij się, że tłuczek przesuwa się ostrożnie od góry do dołu homogenizatora przy każdym pociągnięciu.
    5. Następnie wykonaj 10-15 powolnych pociągnięć ciasnym tłuczkiem B na lodzie. Unikaj tworzenia bąbelków.
      UWAGA: Zaleca się wzrokowe sprawdzenie jąder pod mikroskopem po 10 pociągnięciach tłuczkiem B, aby upewnić się, czy potrzebne są dalsze pociągnięcia. W tym celu należy zastosować barwienie błękitem trypanowym (stosunek trypana do próbki wynoszący 1:1) i hemocytometru ręcznego (np. zmieszać 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny jąder i użyć 10 μl mieszaniny do badania pod mikroskopem; Rysunek 2C).
    6. Przefiltrować homogenat przez sitko o pojemności 50 μm, przenosząc go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Stosować więcej niż jeden filtr i/lub rurkę w przypadku homogenatów zawierających dużą ilość grudek tkanki łącznej.
    7. Przepłucz homogenizator i użyte filtry dodatkowymi 0,5-1 ml HB, aby dokładnie zebrać cały homogenat tkankowy. Przejdź do wirowania w gradimencie gęstości.
  3. Wirowanie w gradiacji gęstości
    1. Przefiltrowany homogenat należy odwirować w wstępnie schłodzonej wirówce o stałym kącie nachylenia 1 000 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Podczas wirowania próbki przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 250 μl 50% roztworu jodiksanolu i jedną probówkę o pojemności 2 ml zawierającą 500 μl roztworu jodiksanolu o stężeniu 29%. Trzymaj obie probówki na lodzie.
    3. Po odwirowaniu odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej.
      UWAGA: Ręczne pipetowanie może mieć negatywny wpływ na jakość końcowej zawiesiny jąder.
    4. Dodać 250 μl HB do granulki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml z szeroką kryzą i bardzo powoli zawiesić.
    5. Przenieść 250 μl zawiesiny jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 250 μl 50% roztworu jodiksanolu i delikatnie, ale dokładnie wymieszać w celu uzyskania 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder.
    6. Przenieść 500 μl 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 500 μl roztworu 29% jodiksanolu.
      UWAGA: 500 μl 25% zawiesiny jodiksanolu/jąder należy delikatnie nałożyć na 500 μl 29% roztworu jodiksanolu, tak aby mieszaniny 25%/29% jodiksanolu wykazywały wyraźną separację faz. Użyj boku ścianki probówki z końcówką pipety umieszczoną pod kątem 45°, aby utworzyć ten gradientowy interfejs. Od tego momentu z rurką należy obchodzić się delikatnie, aby nie zaburzyć tego gradientu.
    7. Odwirować probówkę w wirówce z kubełkiem wahadłowym ze schłodzonym stężeniem 12 500 g przez 20 minut z hamulcem ustawionym w pozycji OFF.
    8. Tuż przed zakończeniem etapu wirowania dodaj inhibitory RNAzy do bufora NSB, przechodząc do rurociągów scRNA-seq (patrz Tabela 1G).
    9. Po odwirowaniu odessać supernatant bez naruszania osadu za pomocą pompy próżniowej.
      UWAGA: Ręczne pipetowanie może mieć negatywny wpływ na jakość końcowej zawiesiny jąder.
    10. Używając końcówki pipety o pojemności 1 ml z szeroką kryzą, delikatnie zawiesić osad w 100-300 μl NSB i przenieść zawiesinę jąder do czystej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
    11. Policzyć jądra za pomocą roztworu błękitu trypanowego (stosunek trypana do próbki 1:1) i hemocytometru ręcznego (np. zmieszać 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny jąder i użyć 10 μl mieszaniny do liczenia; Rysunek 2D).
    12. Otrzymaną zawiesinę jąder należy natychmiast wykorzystać do testu genomiki jednojądrowej.
      UWAGA: Zawiesina jąder w NSB może być przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia w celu dalszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej i/lub obrazowej cytometrii przepływowej, ale nie w przypadku sekwencji snRNA lub sekwencji snATAC.

3. Sortowanie jąder w celu profilowania ploidalności hepatocytów lub dobrze opartych metod sekwencjonowania

  1. W przypadku sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej należy przefiltrować zawiesinę jąder przez filtr 50 μm do wstępnie schłodzonej probówki FACS o pojemności 5 ml.
  2. Użyj sortera do cytometrii przepływowej wyposażonego w dyszę 100 μm. Załaduj probówkę FACS do sortera i wyświetl podgląd próbki.
  3. Ustaw strategię bramkowania dla sortowania jąder, zaczynając od bramki rozproszenia, wykreślając obszar rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia bocznego (FSC-A/SSC-A), następnie Wysokość Hoechsta w stosunku do Obszaru Hoechsta (bramka jąder), a następnie Szerokość Hoechsta w stosunku do obszaru Hoechsta (bramka pojezdna). Wizualizacja profilu ploidalności jąder na histogramie obszaru Hoechsta.
    UWAGA: Aby uzyskać lepszą rozdzielczość szczytową, zwizualizuj kanał Hoechsta (450/50) na skali liniowej (Rysunek 3A).
  4. W przypadku sortowania na płytki 96-/384-dołkowe należy ustawić opóźnienie kropli i zoptymalizować wyrównanie płytki za pomocą metody kolorymetrycznej z substratem benzydyny-peroksydazą chrzanową (TMB-HRP), jak opisano wcześniej6.
  5. Ustawić chłodzenie próbki i uchwyt płytki na schładzanie w temperaturze 4 °C, przy włączonym obrocie próbki przy 300 obr./min.
  6. Sortować pojedyncze jądra przy stężeniu próbki ~1 x 105 jąder/ml i przy natężeniu przepływu 200-500 zdarzeń/s.

4. Oględziny i kwantyfikacja parametrów jądrowych za pomocą cytometrii obrazowej (opcjonalnie)

  1. Załadować probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą 50 μl zawiesiny jąder o stężeniu 2 × 107 jąder/ml.
  2. Ustaw bramkę wszystkich zdarzeń w oparciu o współczynnik proporcji w stosunku do kanału fluorescencji Hoechsta, aby zobrazować profil ploidalności jąder (Rysunek 3B).
  3. Pobrać próbkę w 40-krotnym powiększeniu za pomocą jasnego pola (BF) i kanału fluorescencyjnego Hoechsta.
  4. Zbadaj i określ ilościowo jądra 2n i 4n za pomocą pomiaru jasnego pola i intensywności fluorescencji Hoechsta za pomocą oprogramowania do cytometrii obrazowej (Rysunek 3C).

5. Budowa i sekwencjonowanie jednojądrowych RNA, ATAC-seq lub wieloomowych bibliotek

  1. W przypadku podejść sekwencyjnych opartych na kropelkach, należy załadować oczyszczoną zawiesinę jąder bezpośrednio do urządzenia mikroprzepływowego w celu automatycznego partycjonowania równoległego i molekularnego kodowania kreskowego17.
  2. Po zakończeniu przebiegu mikroprzepływowego w urządzeniu do partycjonowania pojedynczych komórek, zbierz jądra otoczone kulkami żelowymi, inkubuj i oczyść, jak opisano wcześniej w wytycznych producenta17.
  3. Wykonać 11 cykli reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) dla wstępnej amplifikacji cDNA przy użyciu następującego programu: 3 min w 98 °C, (15 s w 98 °C, 20 s w 63 °C i 1 min w 72 °C) x 11, 1 min w 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C. Kontynuować naprawę końca i etap A-tailing oraz podwiązanie adaptera, Zgodnie z zaleceniami producenta17. W celu późniejszej ostatecznej konstrukcji biblioteki ekspresji genów należy wykonać 10 cykli PCR przy użyciu następującego programu: 45 s w 98 °C (20 s w 98 °C, 30 s w 54 °C, 20 s w 72 °C) x 10, 1 min w 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C.
  4. Sekwencjonuj uzyskane biblioteki do głębokości odczytu ~ 20 000-50 000 średnich odczytów na jądro.
  5. W przypadku sekwencjonowania kropelkowego w multiomice stawów (RNA + ATAC) należy inkubować jądra wątroby w buforze do lizy przez 5 minut, a następnie znakować je przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej18.
  6. Załaduj oznakowane jądra bezpośrednio do urządzenia mikroprzepływowego w celu automatycznego partycjonowania równoległego i molekularnego kodowania kreskowego.
  7. Po zakończeniu przebiegu mikroprzepływowego zbierz jądra otoczone kulkami żelu, inkubuj i wyczyść zgodnie z opisem producenta18.
  8. Wykonać sześć cykli PCR dla etapu wstępnej amplifikacji cDNA przy użyciu następującego programu: 5 min w 72 °C, 3 min w 98 °C, (20 s w 98 °C, 30 s w 63 °C, 1 min w 72 °C) x 6, 1 min w 72 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  9. Pobrać 35 μl wstępnie amplifikowanej próbki i przeprowadzić amplifikację cDNA w następujący sposób: 3 min w temperaturze 98 °C (15 s w 98 °C, 20 s w 63 °C, 1 min w 72 °C) x 6, 1 min w temperaturze 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C. Kontynuować naprawę końcową i etap A-tailing oraz podwiązanie adaptera, Zgodnie z zaleceniami producenta18 . W celu przeprowadzenia kolejnej fazy PCR z indeksacją próbki końcowej należy wykonać 15 cykli PCR w następujący sposób: 45 s w temperaturze 98 °C (20 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 54 °C, 20 s w temperaturze 72 °C) x 15, 1 min w temperaturze 72 °C i utrzymać w temperaturze 4 °C.
  10. Do budowy bibliotek ATAC należy użyć 40 μl i amplifikować przez sześć cykli PCR w celu indeksowania próbki za pomocą następującego programu: 45 s w 98 °C, (20 s w 98 °C, 30 s w 67 °C, 20 s w 72 °C) x 6, 1 min w 72 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  11. Sekwencjonuj uzyskane biblioteki ekspresji genów multiomu do minimalnej głębokości odczytu 20 000 par odczytu na jądro, a biblioteki multiomu ATAC do minimalnej głębokości odczytu 25 000 par odczytu na komórkę, zgodnie z zaleceniami producenta18.

Wyniki

Ten proces izolacji pojedynczego jądra z zamrożonych próbek wątroby jest dostosowany do multiomiki pojedynczego jądra i opiera się na trzech głównych krokach, które można podsumować jako: i) pobieranie próbek do równoległej analizy heterogeniczności komórkowej i architektury tkankowej, ii) zawieszenie pojedynczego jądra, oraz iii) multiomika pojedynczego jądra (Rysunek 1). Wyekstrahowane wątroby są preparowane od myszy poddanych eutanazji i cięte na kawałki w celu przeprowadzenia kontroli histologicznej w celu zatopienia parafiny, kriosekcji lub obu. Inne wycięte kawałki są natychmiast zamrażane w ciekłym azocie w celu dalszej izolacji pojedynczego jądra w celu przeprowadzenia analiz multiomicznych. Ten system pobierania tkanek pozwala użytkownikowi na dalszą walidację danych omicznych z jednego jądra na skrawkach tkanek od tej samej osoby, uzupełniając w ten sposób zestaw danych o transkryptomikę przestrzenną lub analizy immunohistochemiczne, jeśli zajdzie taka potrzeba.

Mikroskopowe badanie jąder pobranych z zamrożonych wątrob metodą opisaną tutaj pokazuje, że etap wirowania w gradionym gradiencie gęstości znacznie ułatwia usuwanie niechcianych resztek komórkowych i tkankowych (Rysunek 2C,D). Co więcej, metodologia ta zachowuje wszystkie poziomy ploidalności, które mogą być walidowane i określane ilościowo za pomocą analiz cytometrycznych (Rysunek 3).

Aby jeszcze bardziej zweryfikować wydajność tego protokołu, przeprowadziliśmy sekwencję snRNA opartą na kropelkach na nieposortowanych i posortowanych przez FACS jądrach i przeanalizowaliśmy dane podążając za potokiem Seurat. Krótko mówiąc, wyekstrahowane pojedyncze jądra przygotowano do sekwencjonowania snRNA na bazie kropelk, jak opisano wcześniej19. W przypadku sekwencji snRNA jąder 2n i 4n lub wyższych poziomów ploidalności, 11 cykli zastosowano na etapie amplifikacji cDNA i 10 cykli na końcową konstrukcję biblioteki ekspresji genów. Powstałe biblioteki zostały zsekwencjonowane do głębokości odczytu ~25 000-39 000 średnich odczytów na jądro. Uzyskane odczyty pojedynczych jąder zmapowano do genomu myszy GRCm39/mm39. Podczas uruchamiania potoku przetwarzania wstępnego dodano polecenie --include-intron, aby upewnić się o włączeniu i kwantyfikacji niesplicowanego informacyjnego RNA (mRNA) obecnego w jądrach. Algorytm EmptyDrops wbudowany w nakładkę odfiltrował i usunął puste kropelki.

Pakiet R Seurat (wersja 4.1.1) został użyty do obliczenia metryk kontroli jakości (QC) przy użyciu macierzy zliczania unikalnego identyfikatora molekularnego (UMI) wyprowadzonej przez potok analizy snRNA-seq. Usunięto liczby z mniej niż 100 cechami (genami) i mniej niż 10 komórkami. Jądra przefiltrowano według zidentyfikowanych progów QC: minimalna liczba genów = 200 i maksymalna liczba genów = 8 000, frakcja mitochondrialna <1% i frakcja rybosomalna <2%. 3000 najbardziej zmiennych genów (HVG) wykorzystano do analizy głównych składowych (PCA), zaimplementowanej w Seurat. Grupowanie oparte na grafach przeprowadzono po wprowadzeniu 15 pierwszych wymiarów komputera wynikających z analizy PCA. Aby pogrupować komórki, zastosowaliśmy technikę optymalizacji modułowości (algorytm Louvain) z parametrem rozdzielczości ustawionym na 0,5. Aby zwizualizować i zbadać ten zestaw danych, przeprowadziliśmy nieliniową redukcję wymiarów, a mianowicie Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Tożsamość każdego klastra została przypisana na podstawie wcześniejszej wiedzy na temat genów markerowych6,20,21.

Rysunek 4A pokazuje wysokiej jakości metryki z danych uzyskanych przy użyciu tej metody ekstrakcji jąder. UMAP reprezentuje liczbę zliczeń we wszystkich jądrach i głównych typach komórek, które można z pewnością zidentyfikować tylko za pomocą transkryptomu jądrowego i stosunkowo płytkiego sekwencjonowania (~ 25 000-40 000 średnich odczytów na komórkę) (Rysunek 4B). Takie podejście pozwala na badanie specyficznych dla wątroby czynników transkrypcyjnych, takich jak Hnf4a, Mlxipl i Ppara, a także dalszych genów docelowych zaangażowanych w metabolizm ksenobiotyków (tj. Cyp2e1 i Cyp2f2)(Figura 4C). Warto zauważyć, że wyekstrahowane jądra zachowały krytyczne informacje na temat strefowości wątroby, jak pokazuje komplementarny wzór charakterystycznych genów, takich jak pericentral Cyp2e1 i periportal Cyp2f2 (Figura 4C).

Dalej oceniliśmy zgodność niesortowanych jąder ekstrahowanych tą metodą z nowszymi testami multiomicznymi do jednoczesnego profilowania krajobrazu epigenomicznego (ATAC) i ekspresji genów (RNA) w tym samym pojedynczym jądrze18. Zoptymalizowaliśmy czas inkubacji lizy jąder do 5 minut przed transpozycją. Biblioteki sekwencjonowania zostały skonstruowane poprzez przeprowadzenie sześciu cykli PCR w celu wstępnej amplifikacji cDNA. Ze wstępnie amplifikowanej próbki pobrano 35 μl i poddano dalszej amplifikacji w 15 cyklach PCR w celu indeksowania próbki w celu skonstruowania biblioteki ekspresji genów. Reprezentatywny elektroferogram śladu cDNA pokazano w Rysunek 5A (u góry). Do budowy bibliotek ATAC użyto 40 μl wstępnie amplifikowanej próbki, którą prowadzono przez dodatkowe sześć cykli PCR w celu indeksowania próbki, z reprezentatywnym elektroferogramem śladu DNA pokazanym w Rysunek 5A (na dole). Uzyskana biblioteka ekspresji genów (RNA) została zsekwencjonowana do głębokości 44 600 odczytów na jądro, a biblioteka ATAC do głębokości 43 500 odczytów na jądro (Figura 5B).

Podobnie jak w opisanym powyżej, jednomodalny, oparty na kropelkach protokół sekwencjonowania, mapowanie odczytu, wyrównywanie, usuwanie pustych kropli i zliczanie fragmentów zostały przeprowadzone zgodnie ze standardowymi wytycznymi, jak opisano wcześniej, przy użyciu genomu referencyjnego GRCm39/mm3918. Korzystając z pakietów Seurat i Signac22, przeprowadziliśmy analizę "ważonego najbliższego sąsiada" (WNN) dla wielu pomiarów obu modalności (RNA + ATAC) (Rysunek 5C), co pozwoliło nam zidentyfikować i opisać zarówno główne, jak i drugorzędne typy komórek wątroby bez widocznych uprzedzeń spowodowanych rozmiarem komórki lub kruchością jądra (Rysunek 5D). Procedura produkcyjna, opublikowana przez laboratorium Satija22,23, obejmuje standardowe etapy kontroli jakości - wstępne przetwarzanie i redukcję wymiarów - wykonywane na obu testach niezależnie. Aby dobrze odwzorować ważoną kombinację modalności RNA-seq i ATAC-seq, wykres WNN został wykreślony i wykorzystany do wizualizacji, grupowania i adnotacji UMAP na podstawie wcześniej zidentyfikowanych genów markerowych6,20,21. Podobnie jak w przypadku testów wykorzystujących pojedynczą modalność, wykryliśmy również regulatory transkrypcji (Hnf4a, Ppara, Mlxipl) i charakterystyczne geny zonacji wątroby (Hamp, Cyp2e1 i Cyp2f2) (Figura 5E).

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd eksperymentów, przepływ pracy i zastosowania genomiki pojedynczej komórki. (A) Ilustracyjne przedstawienie pobierania próbek tkanek do histologii (po lewej, trzy sekcje są wybrane do zatapiania parafiny i/lub kriosekcji), pobieranie tkanek zamrożonych błyskawicznie do genomiki pojedynczej komórki (w środku) oraz reprezentatywne analizy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne (po prawej); Podziałka = 100 μm. (B) Kluczowe etapy dla wysokiej jakości zawiesin jednojądrowych. (C) Zawiesiny jąder mogą być załadowane na 10-krotny chip chromowy lub wykorzystane do sortowania FACS i podejść opartych na płytkach. Skróty: H&E = hematoksylina i eozyna; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozwarstwienie wątroby i homogenizacja tkanki Dounce-glass. (A) Reprezentatywna wątroba myszy C57BL6/J (po lewej); Sekcja wątroby używana do izolacji pojedynczego jądra przed (w środku) i po rozdrobnieniu tkanki skalpelem (po prawej). Podziałka = 1 cm. (B) Ilustracyjne obrazy homogenizacji 2 ml szkła odbijanego przed pociągnięciami "luźnym" tłuczkiem A (po lewej) i po "ciasnym" tłuczku B (po prawej). Monitorowanie homogenizacji tkanek za pomocą hemocytometru (C) przed wirowaniem gradientowym i (D) po wirowaniu gradientowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek i obrazowanie cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowej charakterystyki jąder. (A) Strategia bramkowania dla jednojądrowego sortowania FACS na płytce w celu zbadania różnych poziomów ploidalności. Bramka rozproszenia oparta na przednim obszarze rozproszenia w porównaniu z bocznym obszarem rozproszenia ustawionym tak, aby wykluczać gruz; bramka jąder oparta na wysokości Hoechsta w porównaniu z obszarem Hoechsta zawierającym wiele populacji jąder; bramka podkoszulkowa oparta na Hoechst-Width kontra zestaw Hoechst-A do dyskryminacji dubletów; histogram Hoechst-A pozwala na wizualizację profilu ploidalności jąder. (B) Reprezentatywna cytometria obrazowa kwantyfikacja wszystkich zdarzeń (po lewej) i pojedynczych (po prawej) zdarzeń, pokazująca jądra diploidalne i tetraploidalne. (C) Obrazy Brightfield i Hoechst jąder 2n i 4n oraz ich kwantyfikacja za pomocą cytometrii obrazowej. Skróty: FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją; FSC-A = obszar rozproszenia do przodu; SSC-A = obszar rozproszenia bocznego; Hoechst-H = Hoechst-Wysokość; Hoechst-A = Obszar Hoechst; Hoechst-W = Hoechst-Szerokość. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Głęboka charakterystyka ploidalności hepatocytów z sekwencją snRNA. (A) Wykresy skrzypiec pokazujące liczbę genów, liczby, procent wykrytych genów mitochondrialnych i procent wykrytych genów rybosomalnych. (B) UMAP demonstrujący typy komórek wykryte za pomocą sekwencjonu snRNA (po lewej), z kwantyfikacją wyrażoną w procentach jąder (po prawej). (C) UMAP ilustruje liczbę zliczeń i wskazuje na ekspresję genów specyficznych dla hepatocytów. Wszystkie jądra (górny rząd), 2n jądra (środkowy rząd) i 4n jądra (dolny rząd). Skróty: snRNA-seq = sekwencja RNA pojedynczego jądra; UMAP = Uniform Manifold Approximation and Projection; mitok. = geny mitochondrialne; Rybos. = geny rybosomalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Kontrola jakości i analiza multiomiki (wspólne sekwencje RNA i sekwencje ATAC) z zamrożonych, zarchiwizowanych młodych wątrób. (A) Reprezentatywne automatyczne ślady elektroforetyczne uzyskane po procesie multiomicznym pokazujące produkt masy cząsteczkowej po syntezie cDNA i ATAC. (B) Wykres skrzypcowy przedstawiający liczbę zliczeń dla sekwencji ATAC, sekwencji RNA, procentową zawartość genów mitochondrialnych oraz procentową zawartość genów rybosomalnych przed i po filtrowaniu. (C) UMAP pokazuje ekspresję genów z sekwencji RNA (po lewej), sekwencji ATAC (w środku) oraz modalności stawów - sekwencji RNA i sekwencji ATAC (po prawej). (D) Różne typy komórek są oznaczone różnymi kolorami, z ekspresją wskazanych genów specyficznych dla hepatocytów. (E) Wykres cech przedstawiający specyficzną dla klastra ekspresję wskazanych genów we wskazanych typach komórek. Skróty: ATAC-seq = test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości; Mid Hep = hepatocyty śródstrefowe; Endo = komórki śródbłonka; PV Hep = hepatocyty okołowrotne; Non-z Hep = hepatocyty niestrefowe; CV Hep = hepatocyty okołocentralne; Kup & DC = Kupffer & komórki dendrytyczne; SC = komórki gwiaździste, Neu = neutrofile; Chol = cholangiocyty; mitok. = geny mitochondrialne; Rybos. = geny rybosomalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. .
Odczynnikskład10 ml 15 ml50 ml
(A) Pożywka jodiksanolowa (IDM)
250 mM Sacharoza1 mln12,5 ml
150 mM KCl2 mln3,75 ml
30 mM MgCl21 mln1,5 ml
60 mM Bufor Tris pH 8,01 mln3 ml
Ultraczysta woda wolna od RNaz29,25 ml
(B) 50 % IDM
Jodixanol60 proc12,5 ml
IDM2,5 ml
(C) 29% IDM
Jodixanol60 proc7,25 ml
IDM7,75 ml
(D) Podłoże do izolacji jąder-1 (NIM-1)
250 mM Sacharoza1 mln12,5 ml
25 mM KCl2 mln0,625 ml
5 mM MgCl21 mln0,25 ml
10 mM Bufor Tris pH 8,01 mln0,5 ml
Ultraczysta woda wolna od rnazy36,125 ml
(E) Podłoże do izolacji jąder-2 (NIM-2)
Bufor NIM-19,99 ml
Dithiothreitol (DTT)1 mM0,01 ml
Tabletka inhibitora proteazy (bez EDTA)11 tabletka
(F) Bufor homogenizacyjny (HB)
Bufor NIM-29,697 ml
Rekombinowany inhibitor RNazy40 U/μL0,1 ml
Inhibitor RNAzy na bazie białka (SUPERase•IN) 20 U/μL0,1 ml
0.1% Triton-X10%0,1 ml
3 μg/ml Hoechst 3334210 mg/ml0,003 ml
(G) Bufor pamięci jądrowej (NSB)
166.5 mM Sacharoza1 mln 1,665 ml
5 mM MgCl21 mln 0,05 ml
10 mM Tris pH 8,01 mln 0,1 ml
Rekombinowany inhibitor RNazy40 U/μL0,1 ml
Inhibitor RNazy na bazie białka (SUPERase•IN) *20 U/μL0,1 ml
Ultraczysta woda wolna od RNaz8,085 ml
* Opcjonalnie (tylko do sortowania FACS)

Tabela 1: Przepisy na rozwiązania. A) Przygotowanie pożywki jodiksanolowej (IDM); (B) 50% rozcieńczenie roztworu jodiksanolu; (C) 29% rozcieńczenie roztworu jodiksanolu. (D) Przygotowanie podłoża do izolacji jąder-1 (NIM-1). (E) Przygotowanie podłoża do izolacji jąder-2 (NIM-2). (F) Przygotowanie buforu homogenizacyjnego (HB). (G) Przygotowanie buforu do przechowywania jąder (NSB).

Dyskusja

Analiza składu komórkowego wątroby za pomocą sekwencji RNA pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra zapewnia głębsze zrozumienie rozwoju i progresji choroby wątroby 3,4,5,24. Izolacja pojedynczych komórek z wątroby jest czasochłonna i wymaga protokołów, które obejmują ostrą dysocjację mechaniczną lub enzymatyczną 25,26,27. Powszechnie przyjmuje się, że każda tkanka wymaga systematycznej oceny w celu określenia optymalnego protokołu dysocjacji tkanek, a także odpowiedniej metody przechowywania w celu wychwycenia delikatnych typów komórek lub jąder28. W zależności od dostępności tkanki, choroby będącej przedmiotem zainteresowania, stadium rozwoju lub organizmu modelowego, przygotowanie zawiesiny jednojądrowej do dalszego przetwarzania może być bardziej odpowiednią metodologią niż stosowanie zawiesin jednokomórkowych. Co ważne, w wątrobie scRNA-seq i snRNA-seq wykazały wysoką korelację między jądrowym i cytoplazmatycznym mRNA, co sugeruje, że oba podejścia prezentują komplementarną informację 2,3,4,6,29.

Niniejszy artykuł zawiera znormalizowaną, solidną i powtarzalną izolację pojedynczego jądra z zamrożonych, zarchiwizowanych próbek wątroby myszy i innych gatunków, w tym ludzi i makaków. Metoda ta może być stosowana u myszy typu dzikiego karmionych karmą i dietą wysokotłuszczową (HFD) oraz u myszy z modelami zwłóknienia wątroby przy użyciu podejść genomicznych jednojądrowych opartych zarówno na płytkich studzienkowych, jak i kropelkowych6. Metoda ta opiera się na protokole opisanym pierwotnie dla tkanki mózgowej przez Krishnaswamiego i wsp.30 z dodatkowymi modyfikacjami dostosowanymi do błyskawicznie mrożonej wątroby. Optymalna homogenizacja uwalnia większość jąder z tkanki bez negatywnego wpływu na integralność błony jądrowej. Nadmierne dozowanie może jednak uszkodzić delikatne jądra i obniżyć ich ogólną jakość. Młode i/lub stłuszczone wątroby zwykle wymagają tylko 5 uderzeń tłuczkiem A i 10 uderzeń tłuczkiem B, podczas gdy stare i/lub zwłóknieniowe wątroby mogą wymagać 15 uderzeń tłuczkiem B , ale nie więcej. W związku z tym nie zaleca się wykonywania większej liczby uderzeń poza wskazane tutaj liczby. Nadmierne dozowanie może negatywnie wpłynąć na jakość zawiesiny jednojądrowej i zwiększyć ilość RNA w otoczeniu. W związku z tym może to prowadzić do konieczności wykonania dodatkowych kroków filtrowania obliczeniowego podczas dalszych analiz danych.

Przedstawiony tutaj protokół jest wszechstronny i można go dostosować do różnych schorzeń wątroby u młodych (3 miesiące) i starych (24 miesiące) myszy. Ponieważ stwierdziliśmy, że większa część wątroby jest niezbędna dla starych, HFD i zwłóknieniowych tkanek, rozmiar tkanki dostępnej do przetwarzania może stanowić ograniczenie dla niektórych użytkowników z mniejszymi ilościami wyjściowego materiału biologicznego. Jednak oczyszczanie gradientowe jest wysoce zalecane do natychmiastowego przetwarzania próbki za pomocą kropelkowych testów genomowych. Jeśli jądra muszą być posortowane metodą FACS na płytki 96-/384-dołkowe do dobrze opartych testów, można pominąć oczyszczanie gradientowe. Zachęcamy użytkowników do przeprowadzenia oczyszczania gradientowego, jeśli próbka tkanki jest wystarczająca do uzyskania zalecanego stężenia jąder do sortowania FACS (tj. ~1 × 105 jąder / ml).

Wątroba charakteryzuje się poliploidalnym charakterem hepatocytów9, ale rola ploidalności hepatocytów w normalnej fizjologii i chorobie nie jest jeszcze jasna. Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że ploidalność zapewnia zmienność genomu31, a dobrze wiadomo, że ploidalność wzrasta wraz z wiekiem32,33. Wzbogacenie monojądrzastych tetraploidalnych hepatocytów jest jednak klinicznie związane ze złym rokowaniem w ludzkim raku wątrobowokomórkowym (HCC)34. Podobnie, zmiany w poziomach ploidalności hepatocytów są związane z przewlekłymi chorobami wątroby związanymi ze starzeniem się, takimi jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD)35,36,37. Ploidalność to stan posiadania więcej niż dwóch kopii genomu, który można zbadać, barwiąc zawartość genomu barwnikiem DNA, takim jak Hoechst38. Barwnik Hoechst, który jest dodawany do HB przed ekstrakcją, znakuje wszystkie jądra podczas protokołu izolacji. Pozwala to na rozróżnienie jąder diploidalnych i poliploidalnych na podstawie zawartości ich DNA po wzbudzeniu laserem UV (350 nm) lub fioletowym (450 nm) na przyrządzie do cytometrii przepływowej. Dzięki zaprezentowanej strategii bramkowania można badać 2n, 4n, 8n i wyższe poziomy ploidalności hepatocytów w zamrożonych, zarchiwizowanych wątrobach, aby lepiej zrozumieć rolę heterogeniczności komórkowej w funkcji tkanek1 (Figura 3A). Ponadto morfologię jądra, w tym rozmiar i objętość, można określić ilościowo za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej w celu skorelowania zmian wielkości jądra ze zmianami całkowitej liczby zliczeń lub liczby genów w zależności od poziomu ploidalności (ryc. 3B, C).

Multimodalne pomiary omiczne dają możliwość jednoczesnego badania kilku warstw organizacji genomu. Podejście multiomiczne oparte na wspólnym RNA + ATAC pozwala na badanie regulatorów i genów metabolicznych w dół, zapewniając kompleksowe podejście do badania sieci transkrypcyjnych i architektury chromatyny związanej z funkcją wątroby w rozdzielczości pojedynczej komórki. Co więcej, dzięki postępom w metodach obliczeniowych, które mogą wyjaśnić rzadkość danych i zmniejszenie kosztów sekwencjonowania, multiomika jednokomórkowa jest pionierem w ocenie wielu modalności z tej samej komórki. Ten protokół izolacji pojedynczego jądra jest zgodny z indywidualną i wspólną oceną zestawów danych dotyczących ekspresji i chromatyny. Użyliśmy standardowych potoków ustanowionych przez Stuarta i wsp.23 (pakiet Signac), aby zilustrować jakość danych, podczas gdy kilka dostępnych i alternatywnych metod obliczeniowych można łatwo zastosować do dalszych analiz 23,39,40,41.

Ogólnie rzecz biorąc, multiomika jednojądrowa umożliwia badanie bioarchiwizowanych tkanek wątroby naczelnych myszy FF, ludzi i innych niż ludzie przy użyciu bardzo małej ilości materiału próbki wyjściowej poprzez wdrożenie przedstawionego tutaj protokołu ekstrakcji jądra. To nieocenione narzędzie umożliwi biologom zajmującym się wątrobą badanie zarówno ekspresji genów, jak i dostępności chromatyny w kontekście różnych patologii wątroby. Dodatkowo, różne poziomy ploidalności hepatocytów i wynikające z tego dostosowanie ekspresji genów w zależności od ich lokalizacji w zraziku wątroby mogą ujawnić ich rolę w patologiach wątroby. Dlatego przewidujemy, że badanie heterogeniczności komórkowej stworzy nowe możliwości dla rozwoju medycyny precyzyjnej i ukierunkowanych interwencji przeciwko chorobom takim jak HCC i NAFLD.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Helmholtz Pioneer Campus (M.S., K.Y., C.P.M.-J.) oraz Instytut Biologii Obliczeniowej (C. T.-L.). Badania te były również wspierane przez AMED w ramach grantu o numerze JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). Dziękujemy Core Genomics w HMGU (I. de la Rosa) i Bioinformatics (T. Walzthoeni), a w szczególności Xavierowi Pastorowi za szkolenia i wskazówki. Dziękujemy A. Feuchtingerowi, U. Buchholzowi, J. Bushe'owi i wszystkim pozostałym pracownikom Głównego Ośrodka Patologii i Analizy Tkanek HMGU za ich wsparcie techniczne i naukowe, a także J. Zornowi, R. Erdelenowi, D. Würzingerowi, pracownikom E-Streifen, a także głównej placówce Laboratory Animal Services za ich ciągłe wsparcie naukowe i dyskusję. Jesteśmy wdzięczni Core Facility Cell Analysis w TranslaTUM (R. Mishra) oraz Luminex, A DiaSorin Company (P. Rein). Dziękujemy Dr. I Deligiannisowi za wsparcie techniczne. Dr M. Hartman, dr A. Schröder i pani A. Barden (Helmholtz Pioneer Campus) odegrali kluczową rolę w ich wsparciu prawnym, zarządczym i administracyjnym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Tween 20 - 5 mLBio-Rad1662404
2100 Bioanalizator InstrumentAgilentG2939BA
Samoprzylepna folia PCRBioanalizator Thermo Fisher ScientificAB0558
Analiza DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
C1000 Dotykowy termocyklerBio-Rad1851196
SortownikDo sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS); np. sorter komórek BD FACSAria.
Wirówka 5430REppendorf5428000619Stosować schłodzona w temperaturze 4 & st; C
Kontroler chromu i Następny Zestaw akcesoriów GEM10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Zestaw pojedynczych komórek10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Chip J Zestaw pojedynczych komórek, 16 reakcji10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reakcje10X Genomics1000269
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reakcje10X Genomics1000285
cOmpete, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazySigma Aldrich11873580001
Ditiotreitol (DTT) 1 M roztwórSigma Aldrich646563Przygotuj 1 mM roztwór podstawowy i użyj przy 1 &mikro; M stężenie końcowe.
DNA AWAY Odkażacz powierzchniThermo Fisher Scientific10223471Wytrzyj powierzchnie i pipety przed rozpoczęciem eksperymentu
Probówki DNA LoBind, 1,5 mlThermo Fisher Scientific16628742
Probówki DNA LoBind, 2,0 mlThermo Fisher Scientific16638742
Bufor elucyjny (EB) - 250 mlQiagen19086
Eppendorf ThermoMixer CThermo Fisher Scientific13527550
Eppendorf ThermoMixer C Akcesorium: SmartblockThermo Fisher Scientific13518470
Etanol, absolutny (200 proof), klasa biologii molekularnej - 100 mL do 10517694Thermo Fisher Scientific
50 i mikro; m, sterylne   SYSMEX PARTEC - CELLTRICS04-004-2327Dostosuj średnicę filtra do rozmiaru tkanki i jąder
Gliceryna (glicerol), 50% (v/v) - 1 LRicca Chemical Company3290-32
Hard-Shell, 384-dołkowe płytki PCR, cienkościenne, listwowe, przezroczyste/białeBio-RadHSP3905
Herenz Heinz Kleszcze ABSThermo Fisher Scientific1131884
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian, 10 mg/ml roztwór w wodzieInvitrogenH3570światłoczuły
obrazujący cytometrdo obrazowania Do obrazowej analizy cytometrii przepływowej, np. Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE Buffer - 100 mlThermo Fisher Scientific11568846
KCl (2 M), bez RNaz, 100 mlThermo Fisher ScientificAM9640G
MgCl2 (1 M), 100 mlThermo Fisher ScientificAM9530G
MicroAmp 8-Cap Strip, przezroczyste 300 paskówThermo Fisher Scientific10209104
MicroAmp 8-rurkowe paski, 0,2 mL-125 paskówThermo Fisher Scientific10733087
Mö rser 2 mL DOUNCEWagner & Munz GmbH9651632RNase zap i spłucz MillQ przed użyciem
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012Benchmark ScientificC1012Lub dowolna inna mini wirówka paskowo-probówkowa
Hemocytometr NeubaueraOMNILAB  LABORZENTRUM5435293Wizualizacja i liczenie jąder pod mikroskopem
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)Thermo Fisher ScientificAM9937
OptiPrep Density Gradient MediumSigma AldrichD1556
Końcówki do pipet RT LTS 1000 µ L, Wide-OMettler Toledo30389218
Pistill "A" 2 mlWagner & Munz GmbH 9651621przed użyciem zap RNazę i spłucz MillQ Pistill
"B" 2 mlWagner & Munz GmbH9651627RNazę i spłucz MillQ przed użyciem
Polipropylenowa probówka wirówkowa 15 mlThermo Fisher Scientific10579691
Polistyrenowa szalka Petriego, 60 mm x 15 mmThermo Fisher Scientific10634141
Polistyren Okrągłodenny 5 ml Probówki FACSThermo Fisher Scientific10100151
Protector - 2,000 USigma Aldrich3335399001Trzymaj się -20 ° C do użycia
Inhibitor RNazy na bazie białka SUPERaza i byk; W (20 U/μ L)Thermo Fisher ScientificAM2696Przechowywać w -20 & stopni; C do czasu użycia
Rekombinowany inhibitor RNazyClontech Takara2313BPrzechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C do czasu użycia
probówki do mikrofuge wolne od RNAzy - 0,5 mlThermo Fisher ScientificAM12450
RNaseZap RNase Dekontaminacja RoztwórThermo Fisher ScientificAM9780Wytrzyj powierzchnie i pipety przed rozpoczęciem eksperymentu
SPRIselect - 60 mlBeckman CoulterB23318Podwielokrotność i przechowywać w 4 & stopni; C
Sacharoza, 500 gSigma AldrichS0389-500GPrzygotuj 1 M roztwór podstawowy
Swann-Morton Sterylne jednorazowe skalpele ze stali nierdzewnejThermo Fisher Scientific11798343
Tris-HCI (1M), pH 8,0Invitrogen15568025
Triton X-100, 98%, 100 mLThermo Fisher Scientific10671652Przygotuj 10% roztwór podstawowy. Trzymaj się 4 stopni; C i chronić przed światłem.
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific11538886
Vortex- MieszalnikVWR444-1372Lub dowolny inny rodzaj wiru
komórek Filtry przepływowy

Bibliografia

  1. Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now. Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).
  2. Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).
  3. Ramachandran, P., et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level. Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).
  4. Andrews, T. S., et al. Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity. Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).
  5. Xiong, X., et al. Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis. Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).
  6. Richter, M. L., et al. Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy. Nature Communications. 12 (1), 4264(2021).
  7. Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).
  8. Chen, F., et al. Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).
  9. Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy in liver development, homeostasis and disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).
  10. Lengefeld, J., et al. Cell size is a determinant of stem cell potential during aging. Science Advances. 7 (46), 0271(2021).
  11. Lanz, M. C., et al. Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence. Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).
  12. Kim, J. Y., et al. PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis. Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).
  13. Padovan-Merhar, O., et al. Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms. Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).
  14. Miettinen, T. P., et al. Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size. Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).
  15. Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells. Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).
  16. Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 3 (2018).
  17. Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2019).
  18. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide (2021).
  19. MacParland, S. A., et al. Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations. Nature Communications. 9 (1), 4383(2018).
  20. Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism. Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).
  21. Schmidt, D., et al. Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding. Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).
  22. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  23. Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. Single-cell chromatin state analysis with Signac. Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).
  24. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver. Science. 371 (6531), 839-846 (2021).
  25. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism. Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).
  26. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  27. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  29. Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).
  30. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  31. Duncan, A. W., et al. Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation. Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).
  32. Kreutz, C., et al. Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis. Frontiers in Physiology. 8, 862(2017).
  33. Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. Hallmarks of aging in the liver. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).
  34. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. 69 (2), 355-364 (2019).
  35. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  36. Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age. Liver. 9 (2), 93-99 (1989).
  37. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).
  38. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  39. Granja, J. M., et al. ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis. Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).
  40. Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. MUON: Multimodal omics analysis framework. Genome Biology. 23 (1), 42(2022).
  41. Velten, B., et al. Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO. Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja j der kom rkowychwirowanie w gradiencie g sto cihomogenizacja metod Dounce acytometria przep yewowatkanka zamro onatranskryptom j drowysekwencjonowanie ATACzonacja w troby

Powiązane artykuły