Method Article

Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

DOI:

10.3791/64793

⸱

February 24th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skomplikowane obwody genetyczne są czasochłonne do projektowania, testowania i optymalizacji. Aby ułatwić ten proces, komórki ssaków są transfekowane w sposób, który umożliwia testowanie wielu stechiometrii elementów obwodu w jednym dołku. Protokół ten określa etapy planowania eksperymentu, transfekcji i analizy danych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwody genetyczne ssaków wykazały potencjał do wykrywania i leczenia szerokiego zakresu stanów chorobowych, ale optymalizacja poziomów komponentów obwodów pozostaje wyzwaniem i pracochłonnym. Aby przyspieszyć ten proces, nasze laboratorium opracowało politransfekcję, wysokoprzepustowe rozszerzenie tradycyjnej transfekcji ssaków. W politransfekcji każda komórka w transfekowanej populacji zasadniczo przeprowadza inny eksperyment, testując zachowanie obwodu przy różnej liczbie kopii DNA i umożliwiając użytkownikom analizę dużej liczby stechiometrii w reakcji jednogarnkowej. Do tej pory zademonstrowano politransfekcje, które optymalizują proporcje obwodów trójskładnikowych w pojedynczej studzience komórek; Zasadniczo tę samą metodę można zastosować do opracowania jeszcze większych obwodów. Wyniki politransfekcji można łatwo zastosować w celu znalezienia optymalnych proporcji DNA do kotransfektu dla obwodów przejściowych lub do wyboru poziomów ekspresji dla składników obwodu w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych.

Tutaj pokazujemy użycie politransfekcji do optymalizacji obwodu trójskładnikowego. Protokół rozpoczyna się od eksperymentalnych zasad projektowania i wyjaśnia, w jaki sposób politransfekcja opiera się na tradycyjnych metodach kotransfekcji. Następnie przeprowadzana jest politransfekcja komórek, a kilka dni później cytometria przepływowa. Na koniec dane są analizowane poprzez badanie wycinków danych cytometrii przepływowej pojedynczej komórki, które odpowiadają podzbiorom komórek o określonych proporcjach składników. W laboratorium politransfekcja została wykorzystana do optymalizacji klasyfikatorów komórek, kontrolerów sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego, motywów bistabilnych i wielu innych. Ta prosta, ale skuteczna metoda przyspiesza cykle projektowania złożonych obwodów genetycznych w komórkach ssaków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedzina syntetycznej biologii ssaków szybko się rozwinęła, od opracowania prostych części wyczuwania i reagowania w hodowanych liniach komórkowych do optymalizacji złożonych sieci genów w celu sprostania rzeczywistym wyzwaniom w diagnostyce i terapii1. Te wyrafinowane obwody są w stanie wykrywać dane biologiczne, od profili mikroRNA, przez cytokiny, po leki małocząsteczkowe, oraz implementować obwody przetwarzania logicznego, w tym tranzystory, filtry pasmowo-przepustowe, przełączniki dwustabilne i oscylatory. Wykazały również obiecujące wyniki w modelach zwierzęcych chorób takich jak rak, zapalenie stawów, cukrzyca i wiele innych1,2,3,4,5. Jednak wraz ze wzrostem złożoności obwodu optymalizacja poziomów każdego z jego komponentów staje się coraz większym wyzwaniem.

Jednym szczególnie użytecznym typem obwodu genetycznego jest klasyfikator komórek, który można zaprogramować tak, aby wykrywał stany komórkowe i reagował na nie. Selektywna produkcja białek lub RNA w określonych stanach komórkowych jest potężnym narzędziem do kierowania i programowania różnicowania komórek i organoidów, identyfikowania i niszczenia chorych komórek i/lub niepożądanych typów komórek oraz regulowania funkcji komórek terapeutycznych1,2,3,4,5. Jednak stworzenie obwodów w komórkach ssaków, które mogą dokładnie klasyfikować stany komórkowe na podstawie wielu komórkowych gatunków RNA i/lub białek, było bardzo trudne.

Jednym z najbardziej czasochłonnych etapów tworzenia obwodu klasyfikacji komórek jest optymalizacja względnych poziomów ekspresji poszczególnych genów składowych, takich jak czujniki i czynniki przetwarzające, w obwodzie. Aby przyspieszyć optymalizację obwodów i umożliwić budowę bardziej wyrafinowanych obwodów, w ostatnich pracach wykorzystano modelowanie matematyczne obwodów klasyfikatorów komórek i ich komponentów do przewidywania optymalnych składów i topologii6,7. Chociaż do tej pory przyniosło to potężne wyniki, analiza matematyczna jest ograniczona potrzebą systematycznego charakteryzowania zachowania wejścia-wyjścia genów składowych w obwodzie, co jest czasochłonne. Co więcej, w złożonych obwodach genetycznych może pojawić się niezliczona ilość problemów zależnych od kontekstu, powodując, że zachowanie pełnego obwodu wymyka się przewidywaniom opartym na charakterystyce poszczególnych części8,9.

Aby szybciej rozwijać i testować złożone obwody ssaków, takie jak klasyfikatory stanów komórek, nasze laboratorium opracowało technikę zwaną politransfekcją10, ewolucję protokołów kotransfekcji plazmidu. Podczas kotransfekcji wiele plazmidowych gatunków DNA jest kompleksowanych razem z dodatnio naładowanym odczynnikiem lipidowym lub polimerowym, a następnie dostarczanych do komórek w skorelowany sposób (Rysunek 1A). W politransfekcji plazmidy są oddzielnie kompleksowane z odczynnikiem, tak że DNA z każdego kompleksu transfekcji jest dostarczane do komórek w sposób zdeskorelowany (Rysunek 1B). Korzystając z tej metody, komórki w transfekowanej populacji są wystawione na liczne kombinacje stosunków dwóch lub więcej ładunków DNA przenoszących różne składniki obwodu.

Aby zmierzyć proporcje składników obwodu dostarczanych do każdej komórki, każdy kompleks transfekcyjny w politransfekcji zawiera konstytutywnie wyrażony fluorescencyjny reporter, który służy jako wskaźnik dla komórkowego pobierania kompleksu. Wypełniacz DNA, który nie zawiera żadnych pierwiastków aktywnych w komórce ssaków, służy do dostrajania względnej ilości fluorescencyjnego reportera i składników obwodu dostarczanych do komórki w pojedynczym kompleksie transfekcji i jest omawiany bardziej szczegółowo w dyskusji. Przykładem wypełniacza DNA używanego w laboratorium Weissa jest plazmid zawierający sekwencję terminatora, ale bez promotora, sekwencji kodującej itp. Komórki o różnych proporcjach składników obwodu można następnie porównać, aby znaleźć optymalne proporcje dla funkcji obwodu genu. To z kolei daje użyteczne prognozy dotyczące wyboru promotorów i innych elementów obwodu w celu osiągnięcia optymalnych poziomów ekspresji genów podczas łączenia składników obwodu w jeden wektor w celu integracji genetycznej (np. lentiwirusa, transpozonu lub lądowiska). Tak więc, zamiast wybierać proporcje między składnikami obwodu w oparciu o intuicję lub czasochłonny proces prób i błędów, politransfekcja ocenia szeroki zakres stechiometrii między częściami genetycznymi w reakcji jednogarnkowej.

W naszym laboratorium politransfekcja umożliwiła optymalizację wielu obwodów genetycznych, w tym klasyfikatorów komórkowych, kontrolerów sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego oraz motywów bistabilnych. Ta prosta, ale skuteczna metoda znacznie przyspiesza cykle projektowania złożonych obwodów genetycznych w komórkach ssaków. Od tego czasu politransfekcja została wykorzystana do scharakteryzowania kilku obwodów genetycznych w celu ujawnienia ich wielowymiarowych funkcji transferu wejścia-wyjścia w wysokiej rozdzielczości10, optymalizacji alternatywnej topologii obwodu dla klasyfikacji stanu komórki11, oraz przyspieszenia różnych published12,13 i trwających projektów.

Tutaj opisujemy i opisujemy przebieg pracy przy użyciu politransfekcji do szybkiej optymalizacji obwodu genetycznego (Rysunek 2). Protokół pokazuje, jak generować wysokiej jakości dane politransfekcji i unikać kilku typowych błędów w protokole politransfekcji i analizie danych (Rysunek 3). Następnie pokazano, jak wykorzystać politransfekcję do scharakteryzowania prostych elementów obwodu, a w tym procesie porównać wyniki politransfekcji z kotransfekcją (Rysunek 4). Wreszcie, wyniki politransfekcji pokazują optymalizację obwodu klasyfikatora nowotworów (Rysunek 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Tabela 1 i Tabela 2 służą jako istotne odniesienia dla tego protokołu. Tabela 1 przedstawia skalowanie odczynników dla reakcji, a Tabela 2 przedstawia arytmetykę stosunku DNA dla przykładowej politransfekcji opisanej w protokole (górna połowa) i dla możliwego eksperymentu uzupełniającego (dolna połowa).

1. Przygotowanie komórek do transfekcji

  1. Upewnij się, że hodowla ludzkich komórek nerki embrionalnej (HEK293) jest zlewna w 60%-80% przed rozpoczęciem protokołu. W tym celu należy wysiać 1 x 106 komórek w kulturze tkankowej o wymiarach 100 mm x 15 mm na szalce Petriego 2 dni wcześniej i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Chociaż nasz protokół koncentruje się na komórkach HEK293, inne typy komórek mogą zostać zastąpione.
  2. Przygotuj pożywkę i komórki do transfekcji zgodnie z poniższym opisem.
    1. Podgrzej co najmniej 20 ml roztworu zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA; patrz tabela materiałów) do temperatury 37 °C. Podgrzej również do temperatury 37 °C co najmniej 2,4 ml trypsyny i 2,4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wstępnie rozgrzej zredukowaną pożywkę surowicy do ~16 °C.
      UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową należy wykonywać ostrożnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Ponownie zawiesić komórki w roztworze DMEM, jak opisano poniżej.
    1. Zassać i wyrzucić obecne media. Dozuj 2 ml PBS na hodowlę komórkową HEK293, aby umyć komórki. Odessać i wyrzucić PBS.
    2. Dozuj 2 ml trypsyny do hodowli komórkowej HEK293. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do szalki. Umieść naczynie z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozcieńcz roztwór komórek, dozując 8 ml roztworu DMEM do płytki.
    3. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Odessać całą pożywkę i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 3 minuty, aby je ogrzać. Odessać pożywkę (uważając, aby nie zassać komórek) i wyrzucić ją. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml roztworu DMEM, mieszając delikatnie pipetując w górę iw dół.
  5. Oszacuj aktualne stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (wymienionego w Tabeli materiałów). Wysiewaj sześć dołków (w tym przykładzie) na 24-dołkowej płytce z 1 x 105 komórek (dla gęstości wysiewu 50 000 komórek/cm2).
  6. Dodaj roztwór DMEM do 500 μL (najpierw dodaj roztwór DMEM do studzienek), a następnie oznacz jeden dołek na zabieg w następujący sposób: brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola NeonGreen, cała kontrola koloru i politransfekcja 1. Studnie kontrolne TagBFP, mKO2 i NeonGreen są jednokolorowymi kontrolami dla wszystkich białek fluorescencyjnych zawartych w politransfekcji.

2. Wykonywanie transfekcji

  1. Przygotuj probówki dla każdego agregatu DNA. Odłóż na bok probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i oznacz probówki jako: brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola NeonGreen, kontrola wszystkich kolorów, mieszanka politransfekcji 1 i mieszanka politransfekcji 2.
    1. Dodaj 36 μl zredukowanej pożywki surowicy do kontroli bez koloru, kontroli mKO2, kontroli TagBFP, kontroli NeonGreen i wszystkich probówek kontrolnych koloru. Dodać 18 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej z probówek mieszaniny politransfekcyjnej 1 i mieszaniny politransfekcji 2.
      UWAGA: Przyjmuje się, że stężenia plazmidu wynoszą 150 ng/μl.
    2. Dodaj 600 ng plazmidu wypełniającego do probówki bez kontroli koloru. Dodaj 300 ng mKO2 i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru mKO2. Dodaj 300 ng TagBFP i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru TagBFP.
    3. Dodaj 300 ng konstytutywnego plazmidu NeonGreen i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolującej kolor NeonGreen. Dodaj po 100 ng mKO2, TagBFP i składowego NeonGreen, a także 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej wszystkich kolorów.
    4. Dodać 150 ng mKO2 do 1 probówki do mieszania politransfekcji. Dodać 75 ng plazmidu reporterowego NeonGreen i 75 ng plazmidu wypełniającego do 1 probówki z mieszanką politransfekcji.
    5. Dodać 150 ng TagBFP do probówki z mieszanką politransfekcji 2. Dodać 75 ng plazmidu L7ae i 75 ng plazmidu wypełniającego do probówki z mieszanką politransfekcji 2.
  2. Stworzyć główną mieszaninę transfekcji w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, łącząc 216 μl zredukowanej pożywki surowicy z 9,48 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela 1 dla proporcji odczynników i skalowania reakcji). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i odstaw na bok.
  3. Dodaj 1,58 μl odczynnika wzmacniającego do każdej z probówek bez kontroli koloru, z pojedynczą kontrolą koloru i ze wszystkimi probówkami do kontroli koloru. Dodać 79 μl odczynnika wzmacniającego do każdej z probówek z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.
  4. Dodaj główną mieszankę transfekcji do każdej probówki zawierającej DNA.
    1. Dodaj 37,58 μl głównej mieszanki transfekcyjnej do każdej z probówek bez kontroli koloru, z pojedynczą kontrolą koloru i wszystkimi probówkami do kontroli koloru. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.
    2. Dodać 18,79 μl głównej mieszanki do transfekcji do każdej z probówek z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.
  5. Dozować mieszanki transfekcyjne do studzienek.
    1. Odpipetować 65,97 μl każdej mieszanki transfekcyjnej dla kontroli bez koloru, pojedynczego koloru i wszystkich kontrolek koloru do odpowiednich studzienek.
    2. Odpipetować 32,98 μl politransfekcji wymieszać 1 do studzienki politransfekcji i szybko, ale delikatnie zakręcić płytką w ciasny wzór ósemki wzdłuż płaskiej powierzchni, aby skutecznie rozprowadzić kompleksy. Następnie odpipetować 32,98 μl politransfekcji wymieszać 2 z tym samym dołkiem do politransfekcji i zawirować płytkę w ten sam sposób.
  6. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i bez wstrząsania, przez okres 48 h.
    UWAGA: Aby zwiększyć żywotność komórek, pożywkę komórkową można wymieniać co 6 godzin po transfekcji (choć nie zawsze jest to konieczne, a w przypadku komórek HEK293 i jego pochodnych należy uważać, aby nie odłączyć komórek od płytki podczas zmiany pożywki).
OdczynnikIlośćSkalowanie
Zredukowana pożywka surowicy do mieszaniny DNA36 μL na probówkę kontrolną, 18 μL na probówkę do politransfekcji 0,05 μL Zredukowana pożywka surowicy/ng DNA na probówkę, z 10-20% dodatkową objętością do uwzględnienia pipetowania
DNA300-600 ng na tubę
Zobacz materiał P30001,58 μl na probówkę kontrolną, 0,79 μl na probówkę do politransfekcji0,0022 μL P3000/ng DNA na probówkę, z 10-20% dodatkowym
Zredukowana pożywka surowicy do mieszanki Lipo Master36 μL na probówkę kontrolną, 18 μL na probówkę do politransfekcji0,05 μL zredukowanej pożywki surowicy/ng całkowitego DNA, z 10-20% dodatkową objętością do uwzględnienia pipetowania
Odczynnik do transfekcji i wzmacniacza1,58 μl na probówkę kontrolną, 0,79 μl na probówkę do politransfekcji0,0022 μL Lipofektaminy 3000/ng DNA, z 10-20% dodatkiem

Tabela 1: Skalowanie odczynnika dla transfekcji. Tabela wskazuje prawidłowy stosunek odczynnika, który należy uwzględnić dla ilości DNA zawartego w pojedynczym dołku. Można to wykorzystać do efektywnego skalowania reakcji i tworzenia miksów wzorcowych. Ilości odczynnika zostały przeskalowane tak, aby uwzględniały 20% nadmiaru.

3. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

  1. Podgrzać co najmniej 4,2 ml roztworu DMEM do temperatury 37 °C. Podgrzać co najmniej 4,2 ml trypsyny i 4,2 ml PBS do temperatury 37 °C. Roztwór buforowy do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
  2. Ponownie zawiesić komórki w roztworze buforowym FACS (PBS uzupełniony 1% BSA, 5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA] i 0,1% azydkiem sodu [NaN 3], w celu zmniejszenia zbrylania; patrz tabela materiałów), jak opisano poniżej.
    1. Zassać i wyrzucić obecne media w każdej studzience. Dozuj 5 ml PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki. Odessać i wyrzucić PBS.
    2. Dozuj 5 ml trypsyny do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do naczynia. Umieść płytkę z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozcieńcz roztwory komórkowe, dozując 5 ml roztworu DMEM do każdej studzienki.
    3. Dla każdej studzienki wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Do każdej studzienki odessać wszystkie podłoża i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 3 minuty, aby je ogrzać. Odessać pożywkę, uważając, aby nie zassać komórek i nie wyrzucić jej. W każdej probówce ponownie zawiesić komórki w 5 ml roztworu buforowego FACS, mieszając delikatnie pipetując w górę i w dół.
  4. Przepuścić każdy roztwór zawiesiny komórkowej przez sitko (w celu usunięcia grudek) do oddzielnych stożkowych probówek cytometrii przepływowej. Trzymaj te probówki na lodzie nie dłużej niż 1 godzinę i jak najszybciej wykonaj cytometrię przepływową.

4. Wykonywanie cytometrii przepływowej

UWAGA: Obsługa cytometru przepływowego wymaga odpowiedniego przeszkolenia i wiedzy na temat niezbędnych zadań. Ponieważ oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić, a użytkownicy powinni być ogólnie przeszkoleni, ta sekcja odnosi się do konkretnych operacji, które są przydatne do wykonania.

  1. Najpierw zbadaj komórki transfekowane plazmidem wypełniającym (bez kontroli koloru), aby wybrać cechy komórek i uniknąć anomalii (w tym agregatów, szczątków itp.). Chociaż istnieje wiele kombinacji parametrów do rozróżniania komórek, użyj następujących trzech ogólnych opcji, aby dobrze zwizualizować cechy wyróżniające.
    1. Spójrz na boczny obszar rozproszenia (skala logarytmiczna lub liniowa według preferencji/typu komórki) w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu (skala liniowa).
    2. Spójrz na wysokość bocznego rozrzutu (skala logarytmiczna) w porównaniu z szerokością bocznego rozrzutu (skala liniowa).
    3. Spójrz na szerokość rozproszenia do przodu (skala liniowa) w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu (skala liniowa).
  2. Następnie przyjrzyj się kontrolkom pojedynczego koloru. Użyj kontrolki wszystkich kolorów, aby dostroić napięcia instrumentu, tak aby sygnały z każdego białka fluorescencyjnego były znormalizowane do równoważnych dowolnych jednostek (au) fluorescencji. Następnie uruchom pojedyncze kontrolki koloru dla każdego białka fluorescencyjnego, które są używane do ustawiania macierzy kompensacji, co pozwala na korekcję przebijania.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby widoczny był pełny zakres dynamiczny wartości fluorescencji. Dalsza normalizacja fluorescencyjnych sygnałów białkowych może odbywać się poprzez konwersję do standaryzowanych jednostek (np. cząsteczek równoważnej fluoresceiny [MEFL; patrz Beal et al.15]). Aby włączyć konwersję MEFL podczas analizy, uruchom tęczowe koraliki kalibracyjne. Taka kalibracja jest również przydatna do zmniejszania różnic między instrumentami i codziennych zmian sygnału16.
  3. Uruchom probówkę z próbką politransfekcji.
    UWAGA: Tam, gdzie to możliwe, zaleca się uruchomienie komórek 1,000 x 10^ (^ = miesza), ponieważ bardziej wymiarowe politransfekcje muszą być podzielone na więcej pojemników podczas analizy, a każdy pojemnik potrzebuje wystarczającej liczby komórek (najlepiej >10), aby dokonać statystycznie istotnych porównań.

5. Przeprowadzanie analizy po eksperymencie

  1. Na początku użyj danych z kontrolek (i, w stosownych przypadkach, koralików), aby zapewnić dokładne wyniki. Użyj jednego z dostępnych narzędzi programowych, aby wykonać bramkowanie żywych komórek (przy użyciu bramek opisanych powyżej), kompensację i korekcję autofluorescencji.
    UWAGA: Zazwyczaj używamy niestandardowego kodu MATLAB (np. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis lub Cytoflow17), który ma zarówno graficzny interfejs użytkownika, jak i bibliotekę Pythona odpowiednią dla fazy wstępnego przetwarzania i analizy politransfekcji.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
metodakompleksng Marker fluorescencyjnyng L7ae (frakcja)ng Reporter (ułamek)ng Wypełniacz DNA (frakcja)Ogółem (ng)
Politransfekcja 1600
→115075 (1/2)75 (1/2)300
→cyfra arabska15075 (1/2)75 (1/2)300
Politransfekcja 2600
→115025 (1/6)125 (5/6)300
→cyfra arabska150125 (5/6)art. 25 ust. 1/6300

Tabela 2: Ilości DNA do politransfekcji pokazane w protokole oraz przykładowy eksperyment uzupełniający z dostrojonymi proporcjami plazmidu. Górna połowa tabeli przedstawia skład plazmidów użytych w prostym eksperymencie politransfekcji. Dolna połowa pokazuje skład zaktualizowanego eksperymentu, który dostosowuje proporcje plazmidu, aby lepiej podpróbkować hipotetyczną przestrzeń stężeń, w której modulator ekspresji genów ma bardziej optymalny stosunek 1:5 w stosunku do swojego reportera, co daje więcej transfekowanych komórek do pobrania próbki w okolicach tego stosunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 1, porównujemy kotransfekcję do politransfekcji. W kotransfekcji wszystkie plazmidy są dostarczane w tej samej mieszance transfekcyjnej, co skutkuje wysoką korelacją między ilością każdego plazmidu otrzymywanego przez pojedynczą komórkę (Rysunek 1A). Podczas gdy całkowita liczba plazmidów dostarczanych do każdej komórki różni się znacząco, fluorescencja dwóch białek reporterowych w poszczególnych komórkach w całej populacji jest dobrze skorelowana, co wskazuje, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody szybkiego prototypowania, takie jak projektowanie wspomagane komputerowo (CAD), płytki stykowe i druk 3D, zrewolucjonizowały dyscypliny mechaniczne, elektryczne i inżynierii lądowej. Możliwość szybkiego przeszukania wielu możliwych rozwiązań danego wyzwania znacznie przyspiesza postęp w danej dziedzinie. Uważamy, że politransfekcja jest analogiczną technologią dla inżynierii biologicznej, umożliwiającą szybkie prototypowanie obwodów genetycznych. Ponadto inne technologie szybkiego prototypowania wymagają praktyczn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.W. jest współzałożycielem Strand Therapeutics i Replay Bio; R.W. i R.J. złożyli tymczasowy patent związany z klasyfikatorem typów komórek.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować byłym członkom Weiss Lab, którzy prowadzili lub przyczynili się do rozwoju metody politransfekcji i jej zastosowania w klasyfikatorach komórek: Jeremy Gam, Bre DiAndreth i Jin Huh; innym członkom laboratorium Weiss, którzy przyczynili się do dalszego rozwoju/optymalizacji metody: Wenlong Xu, Lei Wang i Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard i członkowie grupy, w tym Patrickowi Donahue i Hailey Edelstein, za przetestowanie politransfekcji i przekazanie informacji zwrotnych; oraz prof. Nice Shakiba za zaproszenie do publikacji tego manuskryptu i przekazanie informacji zwrotnej. Chcielibyśmy również podziękować Narodowym Instytutom Zdrowia [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Narodowa Fundacja Nauki [1745645]; Grant Cancer Center Support (core) [P30CCA14051, częściowo] z NCI i National Institutes of Health [P50GM098792] na finansowanie tej pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml probówki stożkowe Corning FalconThermoFisher Scientific14-959-53A
szalka PetriegoDowolna firma do wyboru(bez pirogenów, sterylnych, RNaz, DNaz, DNA i pirogenów)
Albumina surowicy bydlęcejNEBB9000S
DowolnaMożliwość wystawienia 15 ml probówek Falcona na 300 rcf
Countess 3 Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificAMQAX2000
Countess Komora do liczenia komórek SzkiełkaThermoFisher ScientificC10228
CytoflowNiekomercyjny pakiethttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CVUżywaj nośnika odpowiedniego dla Twojego typu ogniwa
EDTA ThermoFisher Scientific03690-100ML
Płodowa surowica bydlęcaSigma AldrichF4135
Komórki HEKATCCCRL-1573Użyj odpowiedniego typu komórki do swoich eksperymentów. Komórki HEK mają tendencję do bardzo wydajnej transfekcji.
Ogniwa HeLaATCCCRL-12401Użyj odpowiedniego typu ogniwa do swoich eksperymentów.
Wzmacniacz lipofetaminy 3000 i P3000ThermoFisher Scientific L3000001Użyj odczynnika odpowiedniego do Twojego typu komórki; odczynnik do transfekcji i wzmacniacza
LSRFortessa cytometr przepływowyBD BiosciencesN/A
MEM Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140050
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlDowolna firma do wyboru
Opti-MEMThermoFisher Scientific 31985070zredukowana pożywka surowicy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher Scientific70011044
Tęczowe kulki kalibracyjneSpherotechURCP-100-2H
Azydek soduSigma AldrichS2002
TrypsynaVWR25-053-CI
24-dołkowa Wirówka wybrana firma oprogramowania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
  3. Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  4. Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
  5. Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).
  6. Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
  7. Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
  8. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
  9. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  10. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).
  11. Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).
  12. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).
  13. DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).
  14. Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).
  15. Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
  16. Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
  17. Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
  18. Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
  19. Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818(2019).
  20. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  21. Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
  22. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
  23. Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
  24. Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
  25. Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Poly TransfectionGenetic CircuitsCell State IdentificationMammalian CellsFlow CytometryCo TransfectionDNA Ratio OptimizationFluorescent ReportersCell ClassifierSynthetic Biology

Related Articles