Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia nową metodę syntezy hydrożeli decelularnej chrząstki zewnątrzkomórkowej (DC-ECM). Hydrożele DC-ECM mają doskonałą biokompatybilność i zapewniają doskonałe mikrośrodowisko do wzrostu komórek. Dlatego mogą być idealnymi rusztowaniami komórkowymi i biologicznymi systemami dostarczania.

Streszczenie

Hydrożele z bezkomórkową matrycą zewnątrzkomórkową (DC-ECM) są obiecującymi biomateriałami dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej ze względu na ich biokompatybilność i zdolność do naśladowania naturalnych właściwości tkanek. Protokół ten ma na celu wytworzenie hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują natywny ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje połączenie fizycznego i chemicznego zakłócenia oraz trawienia enzymatycznego w celu usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym zachowaniu struktury i składu ECM. DC-ECM jest sieciowany za pomocą środka chemicznego w celu utworzenia stabilnego i biologicznie aktywnego hydrożelu. Hydrożel DC-ECM charakteryzuje się doskonałą aktywnością biologiczną, strukturą przestrzenną i funkcją indukcji biologicznej, a także niską immunogennością. Cechy te są korzystne w promowaniu adhezji, proliferacji, różnicowania i migracji komórek oraz w tworzeniu doskonałego mikrośrodowiska dla wzrostu komórek. Protokół ten stanowi cenne źródło informacji dla badaczy i klinicystów w dziedzinie inżynierii tkankowej. Hydrożele biomimetyczne mogą potencjalnie przyczynić się do opracowania skutecznych strategii inżynierii tkankowej w zakresie naprawy i regeneracji chrząstki.

Wprowadzenie

Inżynieria tkanki chrzęstnej to szybko rozwijająca się dziedzina, która ma na celu regenerację uszkodzonej lub chorej tkanki chrzęstnej¹. Jednym z kluczowych wyzwań w tej dziedzinie jest opracowanie biomimetycznych rusztowań, które mogą wspierać wzrost i różnicowanie chondrocytów, komórek odpowiedzialnych za produkcję chrząstki². ECM tkanki chrzęstnej odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania chondrocytów. DC-ECM to skuteczne rusztowanie do zastosowań w inżynierii tkankowej³.

Opracowano szereg technik wytwarzania DC-ECM z tkanki chrzęstnej, w tym metody chemiczne, enzymatyczne i fizyczne. Jednak metody te często prowadzą do generowania hydrożeli ECM, które są niewystarczająco biomimetyczne, co ogranicza ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach inżynierii tkankowej^4,5. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bardziej efektywną metodę produkcji hydrożeli DC-ECM.

Rozwój tej techniki jest ważny, ponieważ może ona przyczynić się do postępu w dziedzinie inżynierii tkankowej, dostarczając nowego podejścia do tworzenia biomimetycznych rusztowań, które mogą wspierać regenerację i naprawę tkanek. Co więcej, technikę tę można łatwo zaadaptować do produkcji hydrożeli ECM z innych tkanek, rozszerzając tym samym jej potencjalne zastosowania.

W szerszej literaturze rośnie zainteresowanie wykorzystaniem DC-ECM jako rusztowania dla zastosowań inżynierii tkankowej⁶. Liczne badania wykazały skuteczność hydrożeli DC-ECM w promowaniu wzrostu i różnicowania komórek w różnych tkankach, w tym w chrząstce^7,8. Dlatego opracowanie protokołu produkcji hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują naturalny ECM tkanki chrzęstnej, jest znaczącym wkładem w tę dziedzinę.

Protokół przedstawiony w tym artykule odpowiada na tę potrzebę, dostarczając nowatorską metodę produkcji hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują naturalny ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje decelularyzację tkanki chrzęstnej, wyizolowanie powstałego ECM i wytworzenie hydrożelu poprzez usieciowanie ECM za pomocą biokompatybilnego polimeru. Uzyskany w ten sposób hydrożel wykazał obiecujące wyniki we wspieraniu wzrostu i różnicowania chondrocytów.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Tongde w prowincji Zhejiang.

1. Przygotowanie hydrożelu DC-ECM

UWAGA: W tym badaniu, chrząstka została uzyskana ze stawów kolanowych 12-miesięcznych miniaturowych świń Bama, unikając gromadzenia tkanki kostnej.

1. Weź zebraną chrząstkę, zablokuj ją i posiekaj na 1-2 mm³ kawałki skalpelem.
2. Umieść 20 g mielonej chrząstki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml hipotonicznego buforu Tris-HCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0), aby całkowicie zanurzyć tkankę. Umieścić probówkę wirówkową w zamrażarce w temperaturze −80 °C na 3 godziny, a następnie w piekarniku o temperaturze 37 °C na 3 godziny. Powtórz etap zamrażania i podgrzewania sześć razy. Na tym etapie hipotoniczny bufor Tris-HCl nie wymaga wymiany.
3. Potrząsaj probówką wirówkową przez 30 sekund za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min. Umieść sito ze stali nierdzewnej (wielkość porów: ~250 μm) na nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
4. Powoli zdekantuj zdecelularowaną chrząstkę na sito ze stali nierdzewnej, umyj tkankę trzykrotnie sterylnym PBS i zbierz chrząstkę.
5. Dodać 10 ml roztworu trypsyny (0,25% trypsyny w PBS) i umieścić probówkę na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 24 godziny. W tym okresie trypsynę należy wymieniać co 4 godziny. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sita ze stali nierdzewnej i zachować tkankę. Trypsyna może być poddawana działaniu przez noc podczas jednego z procesów trawienia, co nie wpłynie na końcowe trawienie.
6. Umyj trypsynizowaną tkankę buforem hipertonicznym (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).
7. Dodać 10 ml roztworu nukleazy (50 j./ml dezoksyrybonukleazy i 1 μ/ml rybonukleazy w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) i umieścić probówkę na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 4 godziny.
8. Usuń roztwór nukleazy, umyj chrząstkę trzykrotnie sterylnym PBS i dodaj hipotoniczny roztwór Tris-HCl. Umieść probówkę wirówkową na shakerze i płucz przez 20 godzin w temperaturze pokojowej (RT).
9. Usuń hipotoniczny roztwór Tris-HCl, umyj chrząstkę trzykrotnie sterylnym PBS i dodaj 1% roztwór Triton X-100, aby zanurzyć tkankę na 24 godziny.
10. Usuń roztwór Triton X-100 i dokładnie płucz pozbawioną komórek chrząstkę wodą destylowaną przez 3 dni, zmieniając wodę destylowaną co 12 godzin.
11. Namocz chrząstkę w roztworze kwasu nadoctowego (0,1% PAA w 4% etanolu) przez 4 godziny. Usuń roztwór kwasu nadoctowego i umyj chrząstkę trzykrotnie sterylną wodą destylowaną.
12. Umieść sito ze stali nierdzewnej (wielkość porów: ~250 μm) na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Powoli zdekantuj zdecelularowaną chrząstkę na sito ze stali nierdzewnej i zbierz chrząstkę. Przetestuj stopień decelularyzacji i retencję macierzy chrząstki, szacując zawartość DNA, kolagenu i glikozaminoglikanu (GAG).
13. Umieść zdecelularowaną chrząstkę do miski mielącej, dodaj ciekły azot i zmiel zdecelularowaną chrząstkę, aby uzyskać proszek. Weź 2 g decelularizowanego proszku chrząstki, dodaj 80 ml 0,5 M kwasu octowego i 20 mg pepsyny i traw przez 24 godziny. Wirować przy 400 x g przez 10 min; Usunąć osad i zebrać roztwór supernatantu (roztwór DC-ECM).
14. Zdekantować 1 ml roztworu DC-ECM na dołek do płytek 6-dołkowych. Umieść 6-dołkowe płytki w liofilizarze. Zamrozić roztwór DC-ECM. Gdy temperatura w liofilizatorze spadnie do -40 °C, włącz pompę próżniową i utrzymuj stopień próżni na poziomie 10 Pa przez 22 godziny.
15. Wyjąć liofilizowany roztwór DC-ECM, umieścić go w probówkach wirówkowych i przechowywać w temperaturze -20 °C. Minimalny okres przechowywania liofilizowanego roztworu DC-ECM przekracza pół roku.
16. Dodać 1 ml sterylnej wody destylowanej, aby rozpuścić 20 mg liofilizowanego roztworu DC-ECM w probówce wirówkowej. Wstrząsać przez 1 minutę za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min przy suchej smotylacji. Dodać 1 mg witaminy B2 (0,1% w/v) do roztworu DC-ECM, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut i naświetlać światłem UV (370 nm, 3,5 mW/cm²) przez 3 minuty, aby utworzyć hydrożel (hydrożel DC-ECM).

2. Wykrywanie chrząstki pozbawionej komórek

1. Wykrywanie zawartości DNA w chrząstce pozbawionej komórek
   UWAGA: Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu DNEasy Blood & Tissue Kit.
   1. Najpierw należy pobrać 20 mg chrząstki DC-ECM do probówki wirówkowej. Dodać 180 μl buforu GTL i 20 μl proteinazy K przez oscylację wirową i inkubować chrząstkę w temperaturze 56 °C przez 4 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   2. Potrząsać probówką wirówkową przez 15 sekund za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min przy temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 200 μl buforu GL i bezwodnego etanolu i dokładnie wymieszaj za pomocą wibracji wirowych. Odwirowywać próbki przez 1 minutę z prędkością 6 000 x g w temperaturze 4 °C.
   3. Dodać 500 μl buforu GW1 do kolumny adsorpcyjnej i odwirować próbki przez 1 minutę z prędkością 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Dodać 500 μl buforu GW2 do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Na koniec dodać 50 μl wysterylizowanej wody do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przez 1 minutę z prędkością 6 000 x g w temperaturze 4 °C w celu zebrania roztworu DNA. Oznaczyć zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.
2. Wykrywanie zawartości kolagenu w chrząstce pozbawionej komórek
   1. Aby wykryć zawartość kolagenu w chrząstce pozbawionej komórek, użyj hydroksyproliny jako markera aminokwasów kolagenu. Zakwasić 5 mg pozbawionej komórek chrząstki 5 ml 6 M kwasu solnego w temperaturze 100 °C przez 20 minut, a następnie zneutralizować ją 5 ml 6 M roztworu wodorotlenku sodu.
   2. Obliczyć zawartość hydroksyproliny, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru. Uzyskać regresję liniową stężenie-absorpcja przy użyciu standardowej próbki hydroksyproliny.
3. Wykrywanie zawartości GAG w chrząstce zdecelularizowanej
   UWAGA: Zawartość GAG w chrząstce DC-ECM została wykryta przy użyciu zestawu do ilościowego wykrywania kolorymetrycznego GAG w tkankach. Wszystkie poniższe odczynniki są dostępne w zestawie.
   1. Weź 200 mg proszku chrząstki DC-ECM i dodaj 500 μl odczynnika A przez oscylację wirową. Inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 16 godzin, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 10 minut.
   2. Weź 50 ml roztworu próbki i dodaj 50 μl roztworu o wysokiej zawartości soli (odczynnik B) i 50 μl roztworu kwasu (odczynnik C) przez oscylację wirową. Inkubować próbkę przez 10 minut.
   3. Dodać 750 μl roztworu barwnika (odczynnika D) przez oscylację wirową i inkubować próbkę przez 30 minut w ciemnych warunkach. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant.
   4. Dodać 1 μl roztworu czyszczącego (odczynnik E) i dobrze wymieszać. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
   5. Dodać 1 μl roztworu dysocjacyjnego (odczynnika F) do próbki i dobrze wymieszać. Inkubować próbkę przez 30 minut w ciemnych warunkach. Na koniec oznacz zawartość GAG za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm.
4. Analiza chrząstki pozbawionej komórek za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
   1. Porównaj chrząstkę pozbawioną komórek i normalną tkankę chrzęstną. Umieścić próbkę w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie trzykrotnie przemyć PBS.
   2. Utrwalić próbkę w 1% OsO4 na 1 godzinę, a następnie przemyć trzykrotnie PBS.
   3. Odwodnić próbkę przez sekwencyjne zanurzenie w 50%, 70%, 90% i 100% etanolu, a także 100% acetonie przez 15 minut każde. Umieścić próbkę w zmieszanym roztworze heksametylodilazanu i etanolu (1:1) na 15 minut, a następnie zanurzyć w czystym heksametylodilazanie na 15 minut.
   4. Umieścić próbkę w suszarce HCP-2, a następnie wysuszyć przy użyciu ciekłego azotu. Następnie pokryj całkowicie wysuszoną próbkę cienką warstwą złota-palladu za pomocą napylania i zobrazuj za pomocą SEM. Napylanie napylania wykonywano z mocą 120 W przez 5 min. Doświadczenie przeprowadzono w następujących warunkach: napięcie robocze 15 kV i stopień podciśnienia niższy niż 5 x 10⁻⁵ Pa.
   5. Do analizy TEM umieścić próbkę w mieszaninie bezwodnego acetonu i żywicy (1:1) na 1 godzinę, a następnie w mieszaninie bezwodnego acetonu i żywicy (1:3) na 3 godziny. Następnie umieść próbkę na noc w żywicy.
      1. Umieścić próbkę w kapsułkach wypełnionych pożywką i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 9 godzin.
      2. Po zatopieniu pokrój próbkę na cienkie plasterki o długości 70 nm za pomocą ultradrobnego mikrotomu i umieść na miedzianej siatce.
      3. Odmierzyć pipetą 20 μl roztworu barwiącego octan uranylu na siatkę miedzianą i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór barwiący, delikatnie myjąc siatkę dwukrotnie wodą destylowaną.
      4. Następnie odpipetować 20 μl roztworu barwiącego cytrynian ołowiu na siatkę miedzianą i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyć siatkę trzykrotnie wodą destylowaną.
      5. Umieść miedzianą siatkę na czystej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną. Po wysuszeniu na powietrzu sfotografuj sekcje za pomocą TEM. Sonda została przyłożona z siłą skierowaną w dół 500 nN, skanowana z częstotliwością 1 Hz i miała stałą sprężystości (wartość k) 40 ^Nm-1. Zmierzono promień końcówki sondy na 8 nm.

Wyniki

Aby przygotować lepszy hydrożel chrzęstny DC-ECM, przeanalizowano i przejrzano dotychczasową literaturę oraz porównano różne protokoły decelularyzacji pod kątem stopnia decelularyzacji, immunogenności oraz funkcjonalności mechanicznej⁹.

Na tej podstawie przygotowaliśmy hydrożel chrząstkowy DC-ECM i zbadaliśmy wpływ radialnie zorientowanego biotuszu składającego się z macierzy ekstrakcyjnej i egzosomów mezenchymalnych komórek macierzystych w leczeniu ubytków chrzęstno-ko...

Dyskusja

Protokół ten zapewnia systematyczne podejście do przygotowania bezkomórkowych hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bez komórek, które ściśle naśladują natywne ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje połączenie fizycznych, chemicznych i enzymatycznych zakłóceń w celu usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym zachowaniu struktury i składu ECM. Krytyczne kroki protokołu obejmują dostosowanie czasu i metod decelularyzacji oraz zapewnienie całkowitej decelularyzacji.

W porównani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M Tris-HCl, pH 7,6	Beyotime	ST776-100 ml
1 M Tris-HCl, pH 8,0	Beyotime	ST780-500 mL-80
° C Zamrażarka	Eppendorf	F440340034
Deoksyrybonukleaza	Aladyn	D128600-80KU
DNEasy Krew i Zestaw tkanek	Qiagen	nr 69506
Kolorymetryczny zestaw do wykrywania ilościowego GAG	Suszarka Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spektrofotometr
PBS (10x)	Gibco	70011044
Rybonukleaza	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Skaningowy mikroskop elektronowy
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmisyjny mikroskop elektronowy
Sito ze stali nierdzewnej	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsyna	Gibco	15050065
Lampa ultrafioletowa	Omnicure 2000	N/A
Witamina B2	Gibco	R4500-5G
Mikser wirowy	Shanghai Qiasen	78HW-1