Artykuł metodologiczny

Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64816

⸱

2 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół bada ochronne działanie platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro wywołanym kwasem palmitynowym.

Streszczenie

Występowanie niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wzrasta w zastraszającym tempie na całym świecie. Platycodon grandiflorum jest szeroko stosowany jako tradycyjna etnomedycyna w leczeniu różnych chorób i jest typową żywnością funkcjonalną, którą można włączyć do codziennej diety. Badania sugerują, że platykodyna D (PD), jeden z głównych składników aktywnych Platycodon grandiflorum, ma wysoką biodostępność i znacznie łagodzi postęp NAFLD, ale mechanizm leżący u podstaw tego jest nadal niejasny. Badanie to ma na celu zbadanie efektu terapeutycznego PD przeciwko NAFLD in vitro. Komórki AML-12 poddano wstępnej obróbce kwasem palmitynowym (PA) o stężeniu 300 μM przez 24 godziny w celu modelowania NAFLD in vitro. Następnie komórki były albo leczone chorobą Parkinsona, albo nie otrzymywały żadnego leczenia chorobą Parkinsona przez 24 godziny. Poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) analizowano za pomocą barwienia dioctianem 2′,7′-dichloro-dihydrofluoresceiny (DCFH-DA), a potencjał błony mitochondrialnej określono metodą barwienia JC-1. Ponadto poziomy ekspresji białek LC3-II/LC3-I i p62/SQSTM1 w lizatach komórkowych analizowano metodą western blot. Stwierdzono, że PD znacznie obniża poziomy ROS i potencjału błony mitochondrialnej w grupie leczonej PA w porównaniu z grupą kontrolną. Tymczasem PD zwiększyło poziomy LC3-II/LC3-I i zmniejszyło poziomy p62/SQSTM1 w grupie leczonej PA w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki wykazały, że choroba Parkinsona łagodzi NAFLD in vitro poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego i stymulację autofagii. Ten model in vitro jest użytecznym narzędziem do badania roli choroby Parkinsona w NAFLD.

Wprowadzenie

Platycodon grandiflorus (PG), który jest wysuszonym korzeniem Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., jest stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM). Jest produkowany głównie w północno-wschodnich, północnych, wschodnich, środkowych i południowo-zachodnich regionach Chin1. Składniki PG obejmują saponiny triterpenoidowe, polisacharydy, flawonoidy, polifenole, glikole polietylenowe, olejki lotne i minerały2. PG ma długą historię stosowania jako żywność i ziołolecznictwo w Azji. Tradycyjnie zioło to było używane do wytwarzania leków przeciwko chorobom płuc. Współczesna farmakologia dostarcza również dowodów na skuteczność PG w leczeniu innych chorób. Badania wykazały, że PG ma wpływ terapeutyczny na różne modele uszkodzeń wątroby wywołanych lekami. Suplementacja diety ekstraktami PG lub platykodyny może złagodzić otyłość wywołaną dietą wysokotłuszczową i związane z nią choroby metaboliczne3,4,5. Polisacharydy z PG mogą być stosowane w leczeniu ostrego uszkodzenia wątroby spowodowanego przez LPS/D-GalN u myszy6. Co więcej, saponiny z korzeni PG łagodzą wysokotłuszczowe niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby wywołane dietą (NASH)7. Co więcej, platykodyna D (PD), jeden z najważniejszych składników terapeutycznych PG, może zwiększać ekspresję receptora lipoprotein o niskiej gęstości i wychwyt lipoprotein o niskiej gęstości w ludzkich komórkach raka wątrobowokomórkowego (HepG2) 8. Co więcej, PD może również indukować apoptozę i hamować adhezję, migrację i inwazję w komórkach HepG29,10. Tak więc w tym badaniu mysie komórki hepatoma AML-12 są wykorzystywane do budowy modelu in vitro oraz do dalszego badania efektów farmakologicznych i mechanizmów leżących u podstaw PD w tym modelu.

Termin niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) odnosi się do grupy chorób wątroby, która obejmuje proste stłuszczenie, NASH, marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego11. Chociaż patogeneza NAFLD nie jest w pełni poznana, od klasycznej teorii "dwóch trafień" do obecnej teorii "wielokrotnych trafień", insulinooporność jest uważana za kluczową w patogenezie NAFLD12,13,14. Badania wykazały, że insulinooporność hepatocytów może prowadzić do zwiększenia ilości wolnych kwasów tłuszczowych, które tworzą trójglicerydy, które odkładają się w wątrobie i powodują otłuszczenie wątroby15,16. Nagromadzenie tłuszczu może prowadzić do lipotoksyczności, dysfunkcji mitochondriów wywołanej stresem oksydacyjnym, stresu retikulum endoplazmatycznego i uwalniania cytokin zapalnych, co skutkuje patogenezą i progresją NAFLD17,18. Ponadto autofagia odgrywa również rolę w patogenezie NAFLD, ponieważ bierze udział w regulacji komórkowej wrażliwości na insulinę, metabolizmu lipidów komórkowych, uszkodzenia hepatocytów i odporności wrodzonej19,20,21.

Ustalono różnorodność modeli zwierzęcych i komórkowych, które stanowią podstawę do badania patogenezy i potencjalnych celów terapeutycznych NAFLD22,23. Jednak pojedyncze modele zwierzęce nie są w stanie w pełni naśladować wszystkich procesów patologicznych NAFLD24. Indywidualne różnice między zwierzętami prowadzą do różnych cech patologicznych. Wykorzystanie linii komórkowych wątroby lub hepatocytów pierwotnych w badaniach in vitro NAFLD zapewnia maksymalną spójność warunków eksperymentalnych. Rozregulowanie metabolizmu lipidów w wątrobie może prowadzić do wyższych poziomów akumulacji kropelek lipidów hepatocytów w NAFLD25. Wolne kwasy tłuszczowe, takie jak kwas oleinowy i olej palmowy, zostały użyte w modelu in vitro do naśladowania NAFLD spowodowanej dietą wysokotłuszczową26,27. Ludzka linia komórkowa hepatoblastoma HepG2 jest często wykorzystywana do budowy modeli NAFLD in vitro, ale jako linia komórek nowotworowych, metabolizm komórek HepG2 znacznie różni się od metabolizmu komórek wątroby w normalnych warunkach fizjologicznych28. Dlatego użycie hepatocytów pierwotnych lub hepatocytów pierwotnych myszy do skonstruowania modelu NAFLD in vitro do badań przesiewowych leków jest korzystniejsze niż stosowanie linii komórek nowotworowych. Porównując synergiczne badanie efektów działania leków i celów terapeutycznych zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w modelach hepatocytów in vitro, wydaje się, że wykorzystanie mysich hepatocytów do budowy modelu NAFLD in vitro ma większy potencjał aplikacyjny.

Wolne kwasy tłuszczowe dostające się do wątroby są utleniane do produkcji energii lub przechowywane jako trójglicerydy. Co istotne, wolne kwasy tłuszczowe mają pewną lipotoksyczność i mogą wywoływać dysfunkcję komórkową i apoptozę12. Kwas palmitynowy (PA) jest najobficiej występującym nasyconym kwasem tłuszczowym w ludzkim osoczu29. Gdy komórki w tkance tłuszczowej są wystawione na działanie wysokich stężeń PA przez długi czas, stymuluje to produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i powoduje stres oksydacyjny, akumulację lipidów, a nawet apoptozę30. Dlatego wielu badaczy używa PA jako induktora stymulującego komórki wątroby do produkcji ROS, a tym samym konstruuje model stłuszczeniowej choroby wątroby in vitro i ocenia ochronne działanie niektórych substancji czynnych na komórki31,32,33,34. Badanie to wprowadza protokół badania ochronnego wpływu choroby Parkinsona na model komórkowy NAFLD indukowanej przez PA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komórki AML-12 (normalna linia komórkowa hepatocytów myszy) są używane do badań na komórkach. Ogniwa są pozyskiwane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Wstępna obróbka komórek AML-12 w celu modelowania NAFLD in vitro

  1. Utrzymuj komórki w normalnych pożywkach do hodowli komórkowych (DMEM plus F12 Ham's [1:1] zawierający 0,005 mg / ml insuliny, 5 ng / ml selenu, 0,005 mg / ml transferyny, 40 ng / ml deksametazonu i 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
  2. Wysiewaj komórki na 12-dołkowych płytkach (1 ml / dołek) o gęstości 2,8 x 105 komórek / dołek.
    UWAGA: Wszystkie operacje trawienia komórek i wymiany pożywki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek.
  3. Po całonocnej inkubacji (~10 h) usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie przemyć komórki dwa razy 1 ml pożywki bez surowicy (na dołek).
  4. Podziel 12-dołkową płytkę komórkową na cztery różne grupy leczenia od lewej do prawej, w tym (1) grupę kontrolną, (2) grupę leczoną chorobą Parkinsona, (3) grupę leczoną PA i (4) grupę traktowaną PA + PD.
    UWAGA: Trzy powtórzenia każdej eksperymentalnej grupy badanej są ułożone od góry do dołu na tej samej 12-dołkowej płytce komórkowej.
  5. Dodaj normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) do grupy kontrolnej i grupy leczonej PD i dodaj normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA do grupy traktowanej PA i PA + PD.
  6. Po 24 godzinach inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, a następnie przemyć komórki 1 ml pożywki bez surowicy (na dołek) dwa razy.
  7. Dodać normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione nośnikiem (dimetylosulfotlenek, DMSO, 0,1% v/v) do grupy kontrolnej; dodać normalne pożywki do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 1 μM PD do grupy poddanej PD; dodać normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA do grupy poddanej działaniu PA; dodać normalne podłoża do hodowli komórkowych (1 ml / basenik) uzupełnione 300 μM PA i 1 μ M PD do grupy leczonej PA + PD.
  8. Po inkubacji przez dodatkowe 24 godziny zbadaj ochronne działanie PD na komórki za pomocą barwienia dioctanem 2′,7′-dichloro-dihydrofluoresceiny (DCFH-DA) (etap 2), barwienia JC-1 (etap 3) i western blotting (etap 4).
    UWAGA: Wszystkie operacje inkubacji przeprowadza się w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .

2. Pomiar zmiany w produkcji ROS

UWAGA: Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w komórkach są oceniane na podstawie testu barwienia DCFH-DA.

  1. Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji (etap 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na studzienkę (1x PBS, pH 7,4), a następnie wybarwić komórki 100 μl 10 μM DCFH-DA na studzienkę (patrz Tabela Materiałów). Inkubować komórki w ciemności przez 30 min.
    UWAGA: Jeśli po 30 minutach inkubacji nie zaobserwuje się wyraźnej zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek można odpowiednio wydłużyć (30-60 min). Jeśli po 30 minutach inkubacji zaobserwuje się prześwietlenie wartości zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek może zostać odpowiednio skrócony (15-30 min).
  2. Umyj komórki 1x PBS (1 ml / studzienkę) trzy razy. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.
  3. Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu (patrz Tabela materiałów), a następnie użyj obiektywu 20x, aby obserwować morfologię komórek (powiększenie: 200x).
  4. Uchwyć trzy reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (powiększenie: 200x) dla każdej studzienki na mikroskopie fluorescencyjnym za pomocą zielonego kanału fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 530 nm.
    UWAGA: Do wykrywania DCFH-DA zalecany jest zielony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 530 nm. Dodatkowo DCFH-DA można wykryć za pomocą ustawień parametrów dla GFP i FITC w mikroskopie fluorescencyjnym35,36.
  5. Na koniec przetwórz obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów), a następnie użyj oprogramowania ImageJ do obliczenia średniej intensywności fluorescencji każdej grupy lub proporcji różnych grup.
    UWAGA: Szczegóły techniczne mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej37,38.

3. Pomiar zmiany potencjału błony mitochondrialnej

UWAGA: Zmiany w potencjale błony mitochondrialnej są monitorowane za pomocą testu barwienia JC-1.

  1. Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji (krok 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1 ml 1 PBS na studzienkę, a następnie zabarwić komórki 100 μl roztworu roboczego JC-1 o stężeniu 5 μg/ml (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
    UWAGA: Jeśli po 30 minutach inkubacji nie zaobserwuje się wyraźnej zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek można odpowiednio wydłużyć (30-60 min). Jeśli po 30 minutach inkubacji zaobserwuje się prześwietlenie wartości zielonej fluorescencji, czas inkubacji sondy i komórek może zostać odpowiednio skrócony (15-30 min).
  2. Umyj komórki 1x PBS (1 ml / studzienkę) trzy razy. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej studzienki.
  3. Umieść 12-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu 20x, aby obserwować morfologię komórek (powiększenie: 200x).
  4. Uchwyć trzy reprezentatywne obrazy fluorescencyjne (powiększenie: 200x) dla każdej studzienki na mikroskopie fluorescencyjnym przy użyciu zielonego kanału fluorescencyjnego o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 nm i 535 nm oraz kanału czerwonej fluorescencji o długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 550 nm i 600 nm.
    UWAGA: Zielony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 535 nm służy do wykrywania monomeru JC-1, który jest traktowany jako zdepolaryzowane mitochondria39,40,41, a czerwony kanał fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 550 nm i długości fali emisji 600 nm służy do wykrywania dimera JC-1, który jest traktowany jako spolaryzowane mitochondria39,40,41.
  5. Na koniec przetwórz obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu, a następnie użyj oprogramowania Image J, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji każdej grupy lub proporcje różnych grup.
    UWAGA: Szczegóły techniczne mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej37,38.

4. Pomiar poziomów ekspresji białek LC3-II/LC3-I i p62/SQSTM1

  1. Po poddaniu działaniu substancji (krok 1.8) przemyć komórki trzykrotnie 1x PBS (1 ml/studzienkę), który został wstępnie schłodzony w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać bufor do lizy RIPA (100 μl/basenik) uzupełniony proteazą i koktajlem inhibitorów fosfatazy (1x) (patrz tabela materiałów) do płytki 12-dołkowej i lizować na lodzie przez 5 minut.
  3. Zebrać lizat komórkowy do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przy 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie białka w supernatantach metodą BCA zgodnie ze standardowymi procedurami42.
  4. Dodać bufor ładujący próbkę SDS-PAGE (5x, patrz Tabela materiałów) do supernatantów lizatu komórkowego (stosunek objętości = 1:4).
  5. Wymieszać przez wirowanie (z dużą prędkością przez ~15 s) i podgrzewać zmieszane próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu denaturacji białka.
  6. Umieść 12-dobrze przygotowany 12% żel SDS-PAGE do zbiornika do elektroforezy, a następnie dodaj bufor do up-sample SDS (1x) rozcieńczony ultraczystą wodą do pozycji granicznej wysokości.
    UWAGA: Żel SDS-PAGE przygotowuje się przy użyciu komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Dodać marker białkowy (5 μl/studzienkę) i próbki (20 μg/basenik) do różnych dołków żelu SDS-PAGE.
  8. Ustaw tryb stabilnego napięcia na 100 V i wykonuj elektroforezę przez 80 minut.
  9. Po elektroforezie SDS-PAGE należy przeprowadzić elektrotransfer białek do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (0,45 μM, patrz tabela materiałów) zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami43,44.
  10. Po elektrotransferze białek przemyj membranę PVDF 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) dwa razy (5 min/czas) w wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  11. Zablokować błonę PVDF 5 ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA, 5%) w wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  12. Przemyć membranę PVDF trzykrotnie 10 ml TBST (10 min/czas). Następnie inkubować błonę PVDF w 5 ml specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w buforze blokującym dla LC3 (mysie mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1 (zwane dalej p62, mysie mAb, 1:2,000) i β-aktyny (mysie mAb, 1:2,000) (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.
  13. Umyć membranę PVDF 10 ml TBST trzykrotnie (10 min/czas) w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować błonę PVDF z drugorzędowym przeciwciałem przeciw mysim IgG (HRP) królika rozcieńczonym w buforze blokującym (1:10 000) (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej i osłoniętym przed światłem przez 2 godziny.
  14. Umyć membranę PVDF 10 ml TBST trzykrotnie (10 min/czas) w temperaturze pokojowej. Następnie umieścić membranę PVDF na folii foliowej, dodać odpowiednią ilość roztworu roboczego ECL (200 μl/membranę) (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 2 minuty.
  15. Po inkubacji należy usunąć roztwór roboczy ECL i naświetlić membranę PVDF w systemie obrazowania w celu wywołania obrazu. Na koniec użyj oprogramowania Image J, aby przeanalizować wartości szarości każdego pasma.
    UWAGA: Szczegóły techniczne oprogramowania western blotting i Image J używanego do obrazowania zostały opisane wcześniej45,46.

5. Analiza statystyczna

  1. Przedstaw dane z eksperymentów jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
  2. Przeprowadź analizę istotności za pomocą opisanego wcześniej narzędzia statystycznego47.
  3. Oblicz różnice statystyczne między dwiema grupami za pomocą testu t. Wartość P poniżej 0,05 jest uważana za statystycznie istotną: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wewnątrzkomórkowy ROS w komórkach
Komórki AML-12 indukowano 300 μM PA przez 24 godziny i ustalono model komórkowy NAFLD. Następnie komórki były leczone PD przez 24 godziny. Komórki znakowano sondą fluorescencyjną DCFH-DA, a produkcję ROS obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wyniki barwienia DCFH-DA wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach przedstawiono na Rysunek 1. Wyniki wykazały, że PD może znacznie obniżyć poziom wewnątrzkomórkowych ROS w komórkach inkubowanych z 300 μM PA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania wykazały fakt, że NAFLD jest zespołem kliniczno-patologicznym, od stłuszczenia wątroby do NASH, który może przekształcić się w marskość wątroby i raka wątroby51. Dieta wysokotłuszczowa i nieaktywny tryb życia są typowymi czynnikami ryzyka NAFLD. Badano zarówno terapie niefarmakologiczne, jak i terapie farmakologiczne w leczeniu NAFLD 51,52,53. Jednak patogeneza NAFLD nie została w pełni wyjaśniona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty z Komisji Nauki i Technologii Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013, i jbky20210029) oraz China Postdoctoral Science Foundation (nr 2021MD703919).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5% bufor blokujący BSASolarbio, Pekin, ChinySW3015
AML12 (alfa mysia wątroba 12) liniakomórkowa Procell Life Science& Technology Co., Ltd, ChinyAML12
Beyo ECL  PlusBeyotime, Szanghaj, ChinyP0018S Szafa
bezpieczeństwa biologicznegoEsco Micro Pte Ltd, SingapurAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokio, Japonia1.8
Inkubator CO2 do hodowliEsco Micro Pte Ltd, SingapurCCL-170B-8
DeksametazonBeyotime, Szanghaj, ChinyST125
DimetylosulfotlenekSolarbio, Pekin, ChinyD8371
Hyklon DMEM/F12,  Logan,  UT,  USASH30023.01
płodowej surowicy bydlęcej, Tauranga, Nowa ZelandiaSH30406.05
OprogramowanieGraphpad GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinyAS003
Hydrofobowa membrana transferowa PVDFMerck, Darmstadt, NiemcyIPFL00010
Insulina, transferyna, roztwór selenu, 100 razy;Beyotime, Szanghaj, ChinyC0341
MAP LC3β PrzeciwciałoSanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej z JC-1Solarbio, Pekin, ChinyM8650
Olympus IX53Olympus, Tokio, JaponiaIX53
Kwas palmitynowySigma, NiemcyP0500
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)Hyklon,  Logan,  UT,  Stany ZjednoczoneSV30010
Fenylometanosulfonyl  fluorekBeyotime, Szanghaj, ChinyST506
Roztwór buforowany fosforanem Hyklon,  Logan,  UT,  USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinyCSA: 58479-68-8
Koktajl inhibitorów proteazy do ogólnego użytku, 100xBeyotime, Szanghaj, ChinyP1005
Solarbio, Pekin, ChinyPR1910
Zestaw do oznaczania reaktywnych form tlenuSolarbio, Pekin, ChinyCA1410
RIPA  Lizacja  BufferBeyotime, Szanghaj, ChinyP0013E
SDS-PAGE Gel Zestaw do szybkiego przygotowaniaBeyotime, Szanghaj, Chińska Republika LudowaBufor
SDS-PAGE, 5xBeyotime, Szanghaj, ChinyP0015
WirówkaSigma Sigma, NiemcyPrzeciwciało 3K15
SQSTM1/p62Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer, 10xSolarbio, Pekin, ChinyD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinyAC004
Hyklon Mikroskop odwrócony Marker białkowy do ładowania próbki P0012AC

Bibliografia

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480(2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532(2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71(2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834(2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622(2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973(2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479(2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13(2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128(2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87(2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590(2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359(2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976(2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459(2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060(2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model kwasu palmitynowegokom rki AML 12stres oksydacyjnyindukcja autofagiipotencja b ony mitochondrialnejbarwienie DCFH DAbarwienie JC 1Western blot

Powiązane artykuły