Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Podsumowanie

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Streszczenie

Rola struktury RNA w praktycznie każdym procesie biologicznym staje się coraz bardziej oczywista, zwłaszcza w ostatniej dekadzie. Jednak klasyczne podejścia do rozwiązywania struktury RNA, takie jak krystalografia RNA lub cryo-EM, nie nadążają za szybko rozwijającą się dziedziną i zapotrzebowaniem na rozwiązania o wysokiej przepustowości. Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu (DMS) MaPseq to podejście oparte na sekwencjonowaniu, które pozwala wywnioskować strukturę RNA na podstawie reaktywności zasady z DMS. DMS metyluje azot N1 w adenozynach i N3 w cytozynach na powierzchni Watsona-Cricka, gdy zasada jest niesparowana. Odwrotna transkrypcja zmodyfikowanego RNA za pomocą termostabilnej odwrotnej transkryptazy intronowej grupy II (TGIIRT-III) prowadzi do włączenia metylowanych zasad jako mutacji do cDNA. Podczas sekwencjonowania powstałego cDNA i mapowania go z powrotem do referencyjnego transkryptu, względne wskaźniki mutacji dla każdej zasady wskazują na "status" zasady jako sparowanej lub niesparowanej. Mimo że reaktywności DMS charakteryzują się wysokim stosunkiem sygnału do szumu zarówno in vitro, jak i w komórkach, metoda ta jest wrażliwa na stronniczość w procedurach obchodzenia się z nimi. Aby zmniejszyć to odchylenie, w niniejszym artykule przedstawiono protokół leczenia RNA za pomocą DMS w komórkach oraz za pomocą RNA transkrybowanego in vitro.

Wprowadzenie

Od czasu odkrycia, że RNA ma zarówno właściwości strukturalne^1,2 i catalytic³, stopniowo odkrywane jest znaczenie RNA i jego funkcji regulacyjnej w wielu procesach biologicznych. Rzeczywiście, wpływ struktury RNA na regulację genów zyskuje coraz większą uwagę⁴. Podobnie jak białka, RNA ma struktury pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe, odnosząc się odpowiednio do sekwencji nukleotydów, mapowania 2D oddziaływań parowania zasad i fałdowania 3D tych sparowanych struktur zasadowych. Podczas gdy określenie struktury trzeciorzędowej jest kluczem do zrozumienia dokładnych mechanizmów stojących za procesami zależnymi od RNA, struktura drugorzędowa jest również bardzo pouczająca w odniesieniu do funkcji RNA i stanowi podstawę do dalszego składania 3D⁵.

Jednak określenie struktury RNA było z natury rzeczy wyzwaniem przy konwencjonalnych metodach. Podczas gdy w przypadku białek krystalografia, magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) umożliwiły określenie różnorodności motywów strukturalnych, co pozwoliło na przewidywanie struktury na podstawie samej sekwencji⁶, podejścia te nie mają szerokiego zastosowania do RNA. Rzeczywiście, RNA to elastyczne cząsteczki z blokami budulcowymi (nukleotydami), które mają znacznie większą swobodę konformacyjną i rotacyjną w porównaniu z ich odpowiednikami aminokwasowymi. Co więcej, interakcje poprzez parowanie zasad są bardziej dynamiczne i wszechstronne niż w przypadku reszt aminokwasowych. W rezultacie, klasyczne podejścia okazały się skuteczne tylko w przypadku stosunkowo małych RNA o dobrze zdefiniowanych, bardzo zwartych strukturach⁷.

Innym podejściem do określenia struktury RNA jest sondowanie chemiczne połączone z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS). Strategia ta generuje informacje o statusie wiązania każdej zasady w sekwencji RNA (tj. jej strukturze drugorzędowej). Krótko mówiąc, zasady w cząsteczce RNA, które nie angażują się w parowanie zasad, są różnie modyfikowane przez małe związki chemiczne. Odwrotna transkrypcja tych RNA za pomocą wyspecjalizowanych odwrotnych transkryptaz (RT) obejmuje modyfikacje komplementarnego kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA) jako mutacje. Te cząsteczki cDNA są następnie amplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i sekwencjonowane. Aby uzyskać informacje o ich "statusie" jako związanym lub niezwiązanym, częstości mutacji na każdej zasadzie w RNA będącym przedmiotem zainteresowania są obliczane i wprowadzane do oprogramowania do przewidywania struktury jako ograniczenia⁸. Na podstawie reguł najbliższego sąsiedztwa⁹ i obliczeń minimalnej energii swobodnej¹⁰, oprogramowanie to generuje modele struktur, które najlepiej pasują do uzyskanych danych eksperymentalnych^11,12.

DMS-MaPseq używa DMS, który metyluje azot N1 w adenozynach i azot N3 w cytozynach na powierzchni Watsona-Cricka w bardzo specyficzny sposób¹³. Użycie termostabilnej odwrotnej transkryptazy intronowej grupy II (TGIIRT-III) w odwrotnej transkrypcji tworzy profile mutacyjne o niespotykanych dotąd stosunkach sygnału do szumu, umożliwiając nawet dekonwolucję nakładających się profili generowanych przez dwie lub więcej alternatywnych konformacji^14,15. Co więcej, DMS może przenikać przez błony komórkowe i całe tkanki, umożliwiając sondowanie w kontekstach fizjologicznych. Generowanie dobrej jakości danych jest jednak trudne, ponieważ różnice w procedurze obsługi mogą mieć wpływ na wyniki. W związku z tym udostępniamy szczegółowy protokół zarówno dla DMS-MaPseq in vitro, jak i in cell, aby zmniejszyć stronniczość i przeprowadzić nowicjuszy w tej metodzie przez trudności, jakie mogą napotkać. Szczególnie w świetle niedawnej pandemii SARS-CoV2 wysokiej jakości dane dotyczące wirusów RNA są ważnym narzędziem do badania ekspresji genów i znajdowania możliwych środków terapeutycznych.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, oprogramowania, odczynników, instrumentów i komórek używanych w tym protokole.

1. Specyficzny dla genu in vitro DMS-MaP

1. Transkrypcja RNA in vitro
   1. Uzyskaj sekwencję interesującego RNA jako dwuniciowe (ds)DNA (np. Jako fragmenty DNA, plazmidy lub PCR z wcześniej istniejącego/genomowego DNA). Jeśli sekwencja DNA zawiera promotor polimerazy, przejdź do kroku 3.
   2. Wykonaj nakładanie się PCR, aby przyłączyć promotor polimerazy RNA przed pożądanym fragmentem DNA (starter do przodu dla polimerazy T7: 5' TAATACGACTCACTATAGG + pierwsze zasady sekwencji docelowej 3').
   3. In vitro transkrybować fragment DNA na RNA. Zawsze utrzymuj RNA na lodzie.
   4. Trawić DNA za pomocą DNazy.
   5. Wyizolować RNA, stosując podejście kolumnowe (etap 2.4) lub przez wytrącanie etanolu (etap 2.5). Elutę w odpowiedniej objętości, spodziewając się plonu ~50 μg.
   6. Zapewnić integralność RNA, umieszczając go w żelu agarozowym; przed uruchomieniem denaturować RNA przez 2-3 minuty w temperaturze 70 °C.
      UWAGA: Bufor i agaroza mogą zawierać RNazy, które degradują RNA i mogą zanieczyścić próbkę RNA. Prefabrykowane żele agarozowe były wcześniej używane w tym laboratorium; wyniki (zwłaszcza w przypadku RNA) były czasami niejednoznaczne. Najlepsze efekty uzyskano przy użyciu żeli z agarozy lub PAGE.
   7. Bezpośrednie stosowanie przechowywać RNA w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy, chyba że po rozmrożeniu widoczna jest degradacja.
2. Modyfikacja DMS in vitro (przy 105 mM DMS)
   1. Przygotować wystarczającą ilość buforu do ponownego składania (0,4 M kakodylan sodu, pH 7,2, zawierający 6 mM MgCl₂).
      UWAGA: Do każdej reakcji (końcowa objętość 100 μL) dodać 89 μL buforu do ponownego fałdowania.
   2. Dla każdej reakcji przenieść 89 μl buforu do ponownego składania do wyznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml i ogrzać w temperaturze 37 °C w wytrząsarce umieszczonej pod kapturem chemicznym.
      UWAGA: DMS jest wysoce toksyczny i musi być zawsze przechowywany pod kapturem chemicznym do czasu ugaszenia przez środek redukujący.
   3. Eluować 1-10 pmol RNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz (NF_H2O); przenieść do probówki PCR.
   4. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 1 minutę w celu denaturacji RNA.
   5. Natychmiast umieść na bloku lodu, aby uniknąć nieprawidłowego złożenia.
   6. Dodać próbkę RNA do wyznaczonej probówki z buforem do ponownego składania w temperaturze 37 °C, dobrze wymieszać i inkubować przez 10-20 minut w celu ponownego złożenia RNA.
      UWAGA: Większość RNA składa się w kolejności od milisekund do sekund, chociaż istnieją wyjątki¹⁶.
   7. Dodać 1 μl 100% (10,5 M) DMS do próbki RNA i inkubować przez 5 minut, wytrząsając z prędkością 800-1,400 obrotów na minutę (rpm).
      UWAGA: Wytrząsanie (lub inne sposoby mieszania) na tym etapie ma kluczowe znaczenie, ponieważ DMS jest hydrofobowy i może nie rozpuścić się całkowicie w buforze do ponownego składania. Odchylenia w czasie reakcji mogą mieć wpływ na odtwarzalność reaktywności DMS. Aby zminimalizować błąd pipetowania, DMS można rozpuścić w 100% etanolu przed dodaniem go do próbki, jeśli utrzymane jest końcowe stężenie 1% (105 mM) DMS. W przypadku nieleczonej kontroli DMS można zastąpić dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub wodą.
   8. Po 5 minutach reakcji schłodzić 60 μl 100% β-merkaptoetanolu (BME), dobrze wymieszać i natychmiast umieścić RNA na lodzie.
      UWAGA: RNA można bezpiecznie usunąć z kaptura po wygaszeniu reakcji z BME w celu jego oczyszczenia. Jednak nadal należy unikać bezpośredniego narażenia BME na otoczenie ze względu na jego silny zapach i właściwości drażniące.
   9. Oczyścić RNA przez wytrącanie octanu sodu i etanolu (patrz krok 2.5) lub podejście kolumnowe (patrz krok 2.6) i eluować w 10 μl wody.
   10. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru.
   11. Bezpośrednie zastosowanie przechowywania zmodyfikowanego RNA w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: Należy unikać długotrwałego przechowywania, ponieważ RNA jest mniej stabilne po leczeniu DMS.
3. Specyficzny genowo RT-PCR zmodyfikowanego RNA
   UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla konfiguracji RT-PCR fragmentów poddanych działaniu DMS.
   1. Eluować 100 ng zmodyfikowanego RNA w 10 μl H₂O. Przenieść do probówki PCR.
   2. Do probówki dodać 4 μl 5x buforu pierwszej nici (FSB), 1 μl mieszanki dNTP (po 10 mM każdy), 1 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT) (unikać cykli zamrażania i rozmrażania), 1 μl inhibitora RNazy, 1 μL 10 μM startera odwrotnego (pojedynczy starter lub pula starterów) i 1 μL TGIRT III.
      UWAGA: W przypadku puli starterów nie należy dodawać 1 μL z 10 μM każdego startera bezpośrednio do RT; zamiast tego najpierw wymieszaj startery i dodaj 1 μl z mieszanki (przy całkowitym stężeniu startera 10 μM).
   3. Inkubować w temperaturze 57 °C przez 30 minut do 1,5 godziny (zazwyczaj 30 minut wystarcza do wytworzenia produktu o masie 500 nt) w termocyklerze.
   4. Dodać 1 μl 4 M NaOH, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty w celu degradacji RNA.
      UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ uwalnia TGIRT z cDNA poprzez degradację RNA. W przypadku pominięcia może to mieć wpływ na dalszy PCR.
   5. Oczyścić przy użyciu podejścia kolumnowego (patrz krok 2.6), które w wystarczającym stopniu usuwa startery, i eluować w 10 μl NF_{H 2}O.
   6. Amplifikacja cDNA metodą PCR przy użyciu 1 μl produktu odwrotnej transkrypcji na 25 μl reakcji za pomocą zestawu do PCR zaprojektowanego w celu zrównoważenia wydajności i wierności.
      UWAGA: Podkłady powinny mieć temperaturę topnienia ~60 °C.
   7. Uruchom 2 μl produktu PCR na żelu agarozowym lub prefabrykowanym żelu agarozowym, aby zweryfikować powodzenie PCR.
   8. Idealnie byłoby, gdyby po PCR pokazało się tylko jedno pasmo. Jeśli tak, oczyść reakcję, stosując podejście oparte na kolumnach. Jeśli obecne są alternatywne prążki, użyj pozostałej reakcji PCR, aby wyciąć właściwą prążek z żelu. Eluować w wystarczająco małej objętości (np. 10 μl).
   9. Określić ilościowo wyekstrahowane fragmenty za pomocą spektrofotometru.
   10. Indeksuj fragmenty dsDNA do sekwencjonowania przy użyciu podejścia dostosowanego do pożądanej platformy sekwencjonowania.

Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja dla RT-PCR dużych fragmentów poddanych działaniu DMS. Podczas wykonywania odwrotnej transkrypcji na zmodyfikowanym RNA, modyfikacje sekwencji, do której wyżarza się starter, nie zostaną zarejestrowane. Tak więc, gdy długość fragmentów przekracza 400-500 pz, należy zaprojektować fragmenty nakładające się na siebie w obszarach startera, jak pokazano tutaj. Długość fragmentów zależy od potrzeb sekwencjonowania. W przypadku sekwencjonowania 150 cykli sparowanych końców fragmenty nie powinny przekraczać 300 pz. Skróty: RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; DMS = siarczan dimetylu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Pełnogenomowy DMS-MaP z wykorzystaniem komórek zainfekowanych wirusem

UWAGA: W komórkach leczenie DMS może być również połączone z opisanym powyżej podejściem do amplifikacji specyficznym dla genu. Biblioteka całego genomu wymaga ogromnej głębokości sekwencjonowania, aby uzyskać pełne pokrycie pojedynczego genu. Jeśli jednak wirusowe RNA stanowią znaczną część rybodepleżowanego RNA po ekstrakcji, odpowiednie byłoby sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto inne metody wzbogacania można połączyć z metodą generowania biblioteki całego genomu.
UWAGA: Niezainfekowane komórki zostały wykorzystane do celów demonstracyjnych w protokole wideo.

1. Leczenie DMS
   1. Hoduj komórki zakażone wirusem aż do pożądanego etapu infekcji.
   2. Przenieść pojemnik na komórki do specjalnego dygestoria, który jest odpowiedni do obchodzenia się zarówno z wirusami na wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego, jak i z oparami chemicznymi wytwarzanymi przez czynniki takie jak DMS.
   3. Dodać 2,5% objętości DMS do pożywki hodowlanej i zamknąć pojemnik (zwykle płytkę o średnicy 10 cm) parafilmem.
      UWAGA: Za pomocą DMS łatwo jest zmodyfikować w dół i w nadmiarze. Podczas dodawania DMS bezpośrednio do komórek bardzo ważne jest, aby dobrze wymieszać. Alternatywnie, podgrzej nową pożywkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C i dodaj DMS bezpośrednio, energicznie wstrząsając. Zdekantować zużytą pożywkę na komórki i powoli pipetować pożywkę zawierającą DMS.
   4. Przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C na 5 min.
      UWAGA: W zależności od czasu potrzebnego na obsługę DMS na zewnątrz inkubatora, możliwe jest, że 5 minut doprowadzi do nadmiernej modyfikacji. Skróć czas od dodania DMS do inkubacji do ≤1 minuty. W przypadku przeprowadzania eksperymentu po raz pierwszy zaleca się wykonanie miareczkowania DMS i zmianę czasu inkubacji (od 3 minut do 10 minut) w celu znalezienia optymalnej szybkości modyfikacji i zapewnienia, że wyniki są wiarygodne w całym zakresie stężeń.
   5. Ostrożnie odpipetować pożywkę zawierającą DMS (do odpowiednich odpadów chemicznych) i delikatnie dodać 10 ml buforu zatrzymującego (PBS z 30% BME [np. 3 ml BME i 7 ml PBS]).
      UWAGA: Dodanie DMS i BME może podnieść komórki z płytki, jeśli komórki nie są silnie przylegające. Jeśli komórki się podnoszą, można je traktować jako komórki zawiesinowe - zamiast usuwać pożywkę zawierającą DMS, dodaj bezpośrednio bufor zatrzymujący i zeskrob komórki za pomocą DMS i BME do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 3 minuty w temperaturze 3 000 × g; upewnij się, że pozbyłeś się wszelkich resztek DMS, które mogą osadzać się pod komórkami w dużych kropelkach. Dodatkowy etap mycia w 30% BME jest zalecany, jeśli początkowo nie można usunąć medium DMS.
   6. Zeskrob komórki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   7. Osad przez odwirowanie w ilości 3 000 × g przez 3 min.
   8. Usunąć sklarowany osad i przemyć 2x 10 ml PBS.
   9. Ostrożnie usuń jak najwięcej resztek PBS.
   10. Rozpuścić osad w odpowiedniej ilości odczynnika do izolacji RNA (np. 3 ml dla kolby hodowlanej T75, 1 ml dla płytki 10 cm).
       UWAGA: Niewystarczająca ilość odczynnika może mieć wpływ na wydajność RNA.
2. Ekstrakcja RNA i zubożenie rybosomalnego RNA (rRNA)
   1. Do 1 ml homogenizowanych komórek w odczynniku do izolacji RNA dodać 200 μl chloroformu, wirować przez 15-20 s do uzyskania jasnoróżowego koloru, a następnie inkubować do 3 minut, aż do widocznego rozdzielenia faz.
      UWAGA: Różowa faza lipidowa powinna osiąść na dnie. Jeśli tak nie jest, czas wirowania był prawdopodobnie niewystarczający.
   2. Wirować z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki.
   4. Oczyścić RNA przez wytrącanie octanu sodu i etanolu (patrz krok 2.5) lub podejście kolumnowe (patrz etap 2.6) i eluować w wystarczającej ilości NF_H2O.
   5. Sprawdź integralność RNA na żelu agarozowym. Poszukaj dwóch pasm odpowiadających dwóm podjednostkom rybosomalnym.
   6. Zubożyć rRNA przy użyciu preferowanego podejścia i wymyć w odpowiedniej objętości (zwykle 20-50 μl) NF H₂O.
      UWAGA: W przypadku dalszych zastosowań sugeruje się ~500 ng całkowitego RNA w objętości 8 μL. Nierybosomalne RNA zwykle stanowią tylko 5%-10% całkowitego RNA.
   7. Określić ilościowo za pomocą spektrofotometru.
3. Generowanie biblioteki
   1. Użyj specyficznego dla genu RT-PCR lub innych podejść do generowania bibliotek¹⁵. W przypadku używania losowych heksamerów do gruntowania, należy dodać etap inkubacji przy niskiej temperaturze_{T m} (37-42 °C), aby umożliwić wyżarzanie heksameru.
      UWAGA: Zestawy do generowania bibliotek standardowych mogą być również używane poprzez zastąpienie enzymu RT przez TGIRT i zmianę temperatury RT na 57 °C.
4. Oczyszczanie RNA na podstawie kolumn za pomocą kolumn RNA Clean & Concentrator
   UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w temperaturze pokojowej.
   1. Dodać NF_H2Odo probówki z próbką, aby uzyskać objętość 50 μl.
   2. Do próbki dodać 100 μl buforu wiążącego i 150 μl 100% etanolu.
   3. Wymieszaj i przenieś do kolumny wirowej.
   4. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   5. Dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA.
   6. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   7. Dodać 700 μl buforu do przemywania RNA.
   8. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   9. Dodać 400 μl buforu do przemywania RNA.
   10. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   11. (Opcjonalnie) Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wiruj z prędkością 10 000-16 000 × g przez 2 minuty.
   12. Przenieść kolumnę do czystej probówki wolnej od RNAzy i dodać odpowiednią ilość NF_H2O.
   13. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 1 minutę.
5. Ekstrakcja kwasowego fenolowo-chloroformowego RNA.
   1. Dodać równą objętość kwasu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy.
   2. Dokładnie zmieszać i odwirować przy 14 000 × g przez 5 minut.
   3. Jeśli nie ma separacji faz, dodać 20 μl 2 M NaCl i powtórzyć wirowanie.
   4. Przenieś fazę wodną do nowej probówki.
   5. Dodać 500 μl izopropanolu i 2 μl współstrącacza.
   6. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.
   7. Osadzać RNA przez odwirowanie z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Umyj granulat 200 μl lodowatego 70% etanolu.
   9. Wirować z maksymalną prędkością (~ 20 000 × g) przez 5 minut; wyrzucić przepływ.
   10. Zawiesić osad w odpowiedniej ilości NF_H2O.
6. Oczyszczanie cDNA w oparciu o kolumny za pomocą kolumn Oligo Clean i Koncentratora
   UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w temperaturze pokojowej.
   1. Dodać NF_H2Odo probówki z próbką, aby uzyskać objętość 50 μl.
   2. Dodać 100 μl buforu wiążącego i 400 μl 100% etanolu.
   3. Wymieszaj i przenieś do kolumny wirowej.
   4. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   5. Dodać 750 μl buforu do przemywania DNA.
   6. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 30 s; wyrzucić przepływ.
   7. (Opcjonalnie) Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej i wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 2 minuty.
   8. Przenieść kolumnę do czystej probówki wolnej od RNAzy i dodać odpowiednią ilość NF_H2O.
   9. Wirować z prędkością 10 000-16 000 × g przez 1 minutę.

3. Analiza danych sekwencjonowania

UWAGA: Aby utworzyć modele struktury drugorzędowej RNA na podstawie danych sekwencjonowania DMS-MaP, wynikowe pliki .fastq muszą być przetworzone w kilku różnych krokach. Kroki te można wykonać automatycznie za pomocą przycisku

1. Przytnij sekwencje adapterów za pomocą TrimGalore lub Cutadapt.
2. Mapuj odczyty do sekwencji referencyjnych (format .fasta) za pomocą Bowtie2.
3. Policz odczyty za pomocą specjalistycznego oprogramowania do tworzenia struktury RNA (np. DREEM¹⁴, RNA-Framework¹⁷ lub podobne) i utwórz profile reaktywności.
4. (Opcjonalnie) Grupuj odczyty, aby znaleźć alternatywne konformacje RNA za pomocą DREEM¹⁴, DRACO¹⁷, DANCE-MaP¹⁸ lub podobnego.
5. Przewiduj minimalną strukturę energii swobodnej na podstawie profili reaktywności za pomocą RNAStructure¹², ViennaRNA lub podobnego.
6. Wizualizacja struktury RNA¹¹ za pomocą VARNA (https://varna.lri.fr/) lub podobnego.
   UWAGA: Dla praktyczności, oprogramowanie takie jak DREEM (www.rnadreem.org) i RNA-Framework¹⁹ w znacznym stopniu uwzględnia kroki 1–-5 w swoich potokach, co usprawnia proces analizy. Jednak z każdym przewidywaniem struktury należy obchodzić się ostrożnie (np. weryfikując zgodność struktury z data²⁰.

Wyniki

Gene-specific in vitro DMS-MaP
Aby zbadać 5'UTR SARS2, pierwsze 300 pz wirusa zostało uporządkowane jako sekwencja gBlock wraz z trzema starterami. Obejmowały one dwa startery do propagacji fragmentu ("FW" i "RV") za pomocą PCR, a także jeden do dołączania promotora T7 ("FW-T7"). Sekwencje te przedstawiono w tabeli 1.

powiedział:

nazwa	Sekwencja (5'->3')
Fw	ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
Rv	GCAAACTGAGTTGGACGTGTGT
FW-T7	TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC

Tabela 1: Sekwencja startera dla DMS-MaP RT-PCR SARS-CoV2 5'UTR. W tym przypadku FW-T7 i RV są potrzebne do wygenerowania matrycy DNA do transkrypcji in vitro, RV jest używany w odwrotnej transkrypcji, a para starterów FW-RV jest używana w późniejszej amplifikacji PCR cDNA. Startery wygrzewają się na samym początku genomu SARS-CoV2 (FW) i sekwencji tuż za obszarem zainteresowania. Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; SARS-CoV2 = zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej – koronawirus 2; UTR = region nieprzetłumaczony; RV = odwrócony podkład; FW = starter do przodu.

Aby wygenerować RNA z fragmentu gBlock, sekwencja promotora polimerazy T7 została dołączona za pomocą nakładającego się PCR przy użyciu premiksu PCR zgodnie ze schematem widocznym w Rysunek 2A. Z wydłużonego fragmentu RNA zostało wygenerowane przy użyciu zestawu do transkrypcji T7. Matryca DNA została następnie wytrawiona przy użyciu DNazy i RNA wyizolowanej za pomocą kolumn RNA Clean & Concentrator.

Kontrola jakości transkrypcji in vitro została przeprowadzona poprzez uruchomienie produktu RNA na 1% żelu agarozowym wraz z drabinką ssRNA. Ponieważ widoczne było tylko jedno prążkowanie, przeprowadzono sondowanie DMS in vitro i RT-PCR (patrz Ryc. 2B).

Aby zweryfikować powodzenie reakcji PCR, próbka została przeprowadzona na 2% żelu agarozowym przy użyciu drabiny dsDNA. Po indeksowaniu pasmo powinno biec ~150 pz wyżej na tym samym żelu, biorąc pod uwagę wielkość indeksujących starterów.

Rysunek 2: Transkrypcja in vitro matrycy DNA. orazAby dokonać transkrypcji in vitro matrycy DNA, która nie ma jeszcze wewnętrznego promotora polimerazy RNA, matryca musi być najpierw dołączona przez nakładanie się PCR. Odbywa się to za pomocą startera do przodu, który zawiera sekwencję TAATACGACTCACTATAGG (w przypadku polimerazy RNA T7) przed pierwszymi zasadami nakładającymi się na pożądany fragment. Podkreślona podstawa symbolizuje tutaj miejsce rozpoczęcia transkrypcji polimerazy. Gdy promotor przyłączy się do fragmentu dsDNA, może zostać transkrybowany przez polimerazę T7. Co ważne, polimeraza wykorzystuje nić przeciwstawną do wspomnianej sekwencji promotora jako matrycę (kolor niebieski), skutecznie tworząc RNA identyczne z sekwencją znajdującą się bezpośrednio za wskazaną sekwencją promotora (kolor czerwony). (B) 1% żel agarozowy z drabinką ssRNA (tor 1) i transkrybowany in vitro produkt RNA w temperaturze 300 nt (ścieżka 2). (C) 2% żel agarozowy z GeneRuler 1 kb plus drabinka (tor 1), produkt PCR po RT-PCR biegnący w temperaturze 300 pz (tor 2) i zindeksowany fragment po przygotowaniu biblioteki biegnący w temperaturze 470 pz (tor 3). Skróty: RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; DMS = siarczan dimetylu; nt = nukleotydy; dsDNA = dwuniciowy DNA; ssRNA = jednoniciowy RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Cały genom in vivo DMS-MaP z wykorzystaniem komórek zakażonych wirusem
Przed leczeniem DMS komórki HCT-8 były zakażone OC43. Gdy zaobserwowano efekt cytopatyczny (CPE) 4 dni po zakażeniu (dpi) (jak widać w Figura 3A), komórki te poddano leczeniu, a RNA wyekstrahowano i rybodeplekowano. Podczas przeprowadzania całkowitego RNA na żelu agarozowym widoczne były dwie jasne prążki, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S rybosomu, które stanowią około 95% całkowitej masy RNA (patrz Rysunek 3B). Gdy ekstrakcja RNA nie powiodła się lub uległa degradacji (np. przez wiele cykli zamrażania i rozmrażania), produkty degradacji RNA były widoczne na dnie żelu (patrz Rysunek 3C, drugi pas). Co więcej, po wyczerpaniu rRNA, dwa jasne pasma zniknęły, pozostawiając smugę na pasie (patrz Rysunek 3C, trzeci pas). Ostatecznie, po przygotowaniu biblioteki, próbki miały różny rozkład wielkości i zostały pokazane jako rozmaz na końcowym żelu PAGE. Pasmo zostało wycięte między 200 nukleotydami (nt) a 500 nt, zgodnie z sekwencjonowaniem sparowanych końców 150 x 150 planowanym do analizy tych bibliotek. Co najważniejsze, dimery adaptera pracujące z prędkością ~150 nt zostały oddzielone (patrz Rysunek 3D).

Rysunek 3: Punkty kontrolne in vivo DMS-MaP z komórkami zainfekowanymi wirusem. (A) Obraz mikroskopowy komórek HCT-8 zakażonych wirusem, 4 dni dpi. Aby uzyskać najwyższą możliwą wydajność wirusowego RNA z całkowitego RNA przy jednoczesnej minimalizacji niekorzystnych skutków spowodowanych śmiercią komórki, DMS należy dodać po rozpoczęciu CPE lub nawet wcześniej, jak widać na obrazie. (B) 1% żel agarozowy z sześcioma próbkami po 1 μg całkowitego RNA. Na każdym pasie widoczne są dwa jasne pasma, odpowiadające za podjednostki 40S i 60S, ponieważ rybosomalne RNA stanowi ~95% całkowitego RNA. Uwaga: Leczenie DMS w komórce powoduje pewną fragmentację i rozmazywanie RNA, ale dwa pasma rRNA powinny być nadal widoczne. Łagodna fragmentacja po modyfikacji jest tolerowana, ponieważ informacje zawierające znacznik metylacji są generowane i informują o strukturze RNA podczas inkubacji DMS, gdy komórki są jeszcze żywe. (C) 1% żel agarozowy GeneRuler 1 kb plus drabinkowy marker DNA (ścieżka 1) całkowite RNA przechowywane wcześniej w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy (ścieżka 2) i rybodeplerowany RNA (tor 3). Podczas przechowywania RNA przez długi czas z kilkoma cyklami zamrażania i rozmrażania, RNA zaczyna ulegać degradacji i prawdopodobnie nie powinno być używane do eksperymentów sondujących. Co więcej, po rybodeplenacji całkowitego RNA, dwa jasne pasma, stanowiące podjednostki 40S i 60S rybosomu, zanikają i zaczyna pojawiać się rozmaz resztkowych RNA. (D) Żel PAGE z GeneRuler 1 kb plus drabinkowy marker DNA (tor 1) i próbka biblioteczna RNA przygotowanego z całego genomu. Żel należy wyciąć w zależności od potrzeb sekwencjonowania. W przypadku sekwencjonowania z parami końców obejmującego 150 cykli z obu stron, żel należy wyciąć w zakresie od 300 pz do 500 pz. Dimery adaptera (pracujące z prędkością 170 pz) powinny być oddzielone. Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; DPI = dni po zakażeniu; CPE = efekt cytopatyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po sekwencjonowaniu, pliki .fastq zostały przeanalizowane poprzez wysłanie zadania na serwer WWW DREEM (http://rnadreem.org/), wraz z plikiem referencyjnym .fasta. Dane wyjściowe generowane przez serwer obejmują pliki kontroli jakości generowane przez fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) i TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), a także inne pliki wyjściowe zawierające średnie częstości mutacji w populacji. Oprócz diagramu pokazującego częstość mutacji w formacie interaktywnego .html (patrz Rysunek 4A) oraz pliku .csv z surowymi reaktywacjami na zasadę i plikiem struct_constraint.txt, który można odczytać za pomocą kilku programów do przewidywania struktury RNA, zawiera on również plik bitvector.txt informujący o mutacjach z odczytu. Na tej podstawie obliczono struktury średniej populacji, przesyłając pliki .fasta i struct_constraint.txt do serwera WWW RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). Wykorzystuje to oprogramowanie ViennaRNA do generowania przewidywań struktury w oparciu o minimalną energię swobodną, które można przeglądać online lub pobrać w formacie ct lub wiedeńskim. Aby wygenerować modele struktury RNA, te pliki do pobrania zostały przesłane do VARNA (https://varna.lri.fr/, patrz Rysunek 4B). Wreszcie, pliki bitvector.txt mogą być używane przez stabilną wersję DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) do poszukiwania alternatywnych konformacji RNA. Aby uzyskać dobre modele struktury za pomocą DREEM, należy osiągnąć pokrycie 10 000 odczytów na bazę; W przypadku klastrowania może być wymagane do 100 000 odczytów na bazę. Przegląd całego przepływu pracy można znaleźć w Rysunek 4C.

Rysunek 4: Przykładowe dane uzyskane z eksperymentów chemicznych SARS-CoV2 5'UTR. (A) Profil reaktywności pierwszych 300 zasad genomu SARS-CoV2 pokolorowany według zasady (A: czerwony, C: niebieski, U: zielony, G: żółty). Surowe reaktywności oblicza się jako bezwzględną częstość mutacji podzieloną przez pokrycie. Zasady o otwartej budowie mają wysokie wartości reaktywności; Zasady angażujące się w parowanie zasad mają niskie wartości reaktywności. U i G nie są modyfikowane przez DMS i mają niskie wartości reaktywności, wynikające z niewierności polimerazy. Przewidywania zostały wykonane za pomocą serwera WWW DREEM. (B) Model struktury SARS-CoV2 5'UTR przewidywany na podstawie wartości reaktywności wykonanych za pomocą VARNA. Zasady o wysokich wartościach reaktywności są pokolorowane na czerwono; Zasady o niskich wartościach reaktywności są pokolorowane na biało. (C) Przebieg analizy DMS-MaP rozpoczynający się od plików .fastq uzyskanych z sekwencjonowania. Mogą one być kontrolowane pod względem jakości za pomocą fastqc; sekwencje adaptera są przycinane za pomocą TrimGalore, a następnie mapowane z powrotem do sekwencji referencyjnej za pomocą Bowtie2. Z uzyskanych plików .bam DREEM zlicza mutacje w każdym odczycie, tworząc mapę mutacji lub plik .bitvector.txt. Informują one o mutacjach każdego odczytu w sposób zależny od pozycji, na podstawie których można stworzyć średnie profile reaktywności populacji. Alternatywnie, wektory bitowe mogą być grupowane za pomocą DREEM w celu poszukiwania alternatywnych konformacji RNA. Na koniec uzyskane modele konstrukcji są wizualizowane za pomocą oprogramowania (np. VARNA). Skróty: DMS-MaP = profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem przy użyciu siarczanu dimetylu; SARS-CoV2 = zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej - koronawirus 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje, jak badać RNA in vitro i w komórkach za pomocą eksperymentów z profilowaniem mutacji DMS. Ponadto podaje instrukcje, jak przygotować biblioteki do sekwencjonowania Illumina w celu generowania danych specyficznych dla genów i analizy uzyskanych plików .fastq. Ponadto można zastosować podejścia biblioteczne obejmujące cały genom. Jednak specyficzny dla genu RT-PCR daje dane najwyższej jakości i najbardziej wiarygodne. Dlatego w przypadku porównywania próbek ważne jest, aby upewnić się, że są one przygotowane przy użyciu identycznych strategii sekwencjonowania, ponieważ generowanie biblioteki powoduje pewne odchylenia. Odtwarzalność należy zawsze mierzyć przy użyciu kontrprób.

Kilka środków ostrożności
RNA jest niestabilną cząsteczką, która jest wrażliwa na degradację zarówno przez podwyższone temperatury, jak i przez RNazy. Dlatego zaleca się stosowanie specjalnych środków ochrony osobistej (PPE), materiałów wolnych od RNAzów i inhibitorów RNAzy. Co najważniejsze, RNA powinno być trzymane na lodzie, gdy tylko jest to możliwe. Dotyczy to zwłaszcza metylowanego RNA, który jest jeszcze bardziej wrażliwy na wysokie temperatury.

Ważne jest, aby potwierdzić, że struktura RNA, która jest przedmiotem zainteresowania, nie jest wrażliwa na stężenie DMS i warunki buforowe. takie jak 100 mM Tris, 100 mM MOPS i 100 mM HEPES przy pH 7-7,5 dają wysoki sygnał, ale mogą nie być wystarczające do utrzymania pH podczas reakcji²¹. Ponieważ DMS hydrolizuje w wodzie, co obniża pH, silny bufor ma kluczowe znaczenie dla utrzymania neutralnego pH podczas reakcji modyfikacji. Wykazano, że dodatek biciny pomaga utrzymać pH jako lekko zasadowe²¹ , ale powoduje niską modyfikację DMS na Gs i Us, co może być pouczające, ale powinno być analizowane oddzielnie ze względu na wytwarzanie znacznie niższego sygnału niż As i Cs i nie jest dalej omawiane w tym protokole.

W specyficznym dla genu RT-PCR zmodyfikowany RNA jest odwrotnie transkrybowany do DNA i amplifikowany we fragmentach przez PCR. Chociaż rozmiar RNA może być teoretycznie nieograniczony, te fragmenty PCR nie powinny przekraczać długości 400-500 par zasad (bp), aby zapobiec stronniczości podczas reakcji odwrotnej transkrypcji. Idealnie byłoby, gdyby fragmenty znajdowały się w zakresie sekwencjonowania (tj. jeśli sekwencjonowanie jest przeprowadzane przy użyciu programu sekwencjonowania sparowanych końców w cyklu 150 x 150, pojedynczy fragment nie powinien przekraczać 300 pz). W przypadku korzystania z programów sekwencjonowania z mniejszą liczbą cykli, produkty PCR mogą być fragmentowane za pomocą dsDNazy. Ponadto, ponieważ sekwencje w sekwencjach starterowych nie zawierają żadnych informacji strukturalnych, fragmenty muszą się na siebie nakładać, gdy badany RNA składa się z >1 fragmentu. Reakcje RT mogą zawierać wiele starterów RT dla różnych fragmentów (do 10 różnych starterów RT). W zależności od sekwencji, łączenie starterów RT może sprawić, że odwrotna transkrypcja będzie mniej wydajna, ale zazwyczaj działa dobrze. Każda reakcja PCR powinna być przeprowadzana osobno.

Podczas sondowania RNA za pomocą DMS warunki eksperymentalne odgrywają dodatkową rolę, ponieważ wiele RNA jest niestabilnych termodynamicznie i zmienia swoją konformację w zależności od czynników środowiskowych, takich jak temperatura. Aby uniknąć nieprawidłowości, warunki doświadczalne powinny być utrzymywane na jak najbardziej stałym poziomie, również w odniesieniu do czasów reakcji. Warunki buforowe wydają się być do pewnego stopnia wymienne 17,20,22,23, gdy spełnione są podstawowe warunki - pojemność buforowa i obecność jonów jednowartościowych (Na) i dwuwartościowych (Mg) - w celu zapewnienia prawidłowego fałdowania RNA²⁴.

Jeśli chodzi o przygotowanie biblioteki zmodyfikowanych RNA, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Po pierwsze, jak wspomniano wcześniej, zmodyfikowane RNA są mniej stabilne niż ich niezmodyfikowane odpowiedniki, co oznacza, że mogą wymagać optymalizacji czasów fragmentacji w celu uzyskania optymalnego rozkładu wielkości fragmentów. Co więcej, niektóre zestawy do przygotowywania bibliotek RNA, a także wiele innych podejść RNAseq, wykorzystują losowe startery w zestawie do odwrotnej transkrypcji. Może to prowadzić do mniejszego pokrycia odniesienia, zwłaszcza w 3' genu, a ostatecznie do niewystarczającej głębokości pokrycia. Jeśli pokrycie określonego regionu jest zbyt niskie, może być konieczne usunięcie tych zasad z przewidywania struktury. Oprócz zestawów RT-PCR i RNAseq całego genomu można stosować inne podejścia do przygotowania bibliotek. Protokoły obejmujące ligację adapterów 3' i/lub 5' do RNA są korzystne w przypadku stosowania małych fragmentów RNA lub gdy należy uniknąć utraty informacji sondujących w regionach starterowych.

Wreszcie, analiza eksperymentów z sondami chemicznymi musi być zawsze interpretowana ostrożnie. Obecnie nie ma oprogramowania, które z dużą dokładnością przewiduje strukturę RNA dowolnego RNA na podstawie samej sekwencji. Chociaż ograniczenia sondowania chemicznego znacznie poprawiają dokładność, generowanie dobrych modeli dla długich RNA (>500 nt) jest nadal wyzwaniem. Modele te powinny być dalej testowane za pomocą innych podejść i/lub mutagenezy. Oprogramowanie do przewidywania RNA optymalizuje pod kątem maksymalnej liczby par zasad, co znacznie karze otwarte konformacje, które mogą nie reprezentować dokładnie fałdowania RNA⁵. W związku z tym uzyskany model struktury powinien zostać przetestowany poprzez ilościowe określenie zgodności prognoz z podstawowymi danymi z sond chemicznych (np. za pomocą AUROC) oraz między powtórzeniami (np. za pomocą mFMI), jak pokazano w Lan i ^wsp.20.

Idealnie byłoby, gdyby przeprowadzono kilka eksperymentów w różnych systemach, aby zakwestionować uzyskany model struktury, aby wzmocnić swoją hipotezę. Mogą one obejmować stosowanie metod in vitro i wewnątrzkomórkowych, mutacje kompensacyjne oraz różne linie i gatunki komórek. Co więcej, surowe reaktywności są często tak samo lub nawet bardziej pouczające niż przewidywania dotyczące struktury, ponieważ rejestrują migawkę "prawdy podstawowej" zespołu fałdowania RNA. W związku z tym reaktywności na surowo są bardzo odpowiednie i pouczające do porównywania zmian struktury w różnych warunkach. Co ważne, struktury o najniższej energii swobodnej obliczone za pomocą ograniczeń sondowania chemicznego z predykcją obliczeniową powinny być używane jedynie jako hipoteza wyjściowa w kierunku kompletnego modelu struktury.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 Kb Plus DNA Ladder	10787018	Thermo
2-merkaptoetanol	M6250-250ML	Sigma
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5	AM9720	Thermo
Advantage PCR	639206	Takara
CloneAmp HiFi PCR Premix	639298	Takara
DMS	D186309	Sigma
dNTPs 10 mM każdy	U151B	Promega
E-Gel EX Żele agarozowe, 2%	G402022	Prefabrykowane żele agarozowe	Thermo
Etanol (200 proof)	E7023-4X4L	Sigma
Falcon, 15 mL, 50 mL
GlycoBlue			współstrącające
HCT-8 komórki	ATCC #CCL-244
Invitrogen  MgCl2  (1 mln)	AM9530G	fisherscientific
Isopropanol	278475	Sigma
Megascript T7 transkrypcja	AM1334
			NanoDrop
Żele Novex TBE, 8%, 10 dołków	EC6215BOX	Thermo
OC43	ATCC #VR-1558
RiboRuler Drabinka RNA niskiego zasięgu	SM1831	Thermo
RNAzystw H	M0297L	NEB
Kakodylan sodu, 0,4 M, pH 7,2	102090-964	VWR
Roztwór wodorotlenku sodu	S8263-150ML	Sigma
SuperScript II Odwrotna transkryptaza dla FSB i DTT	18064014	Thermo
Enzym TGIRT-III	TGIRT50	Ingex
Oligo Clean & Koncentrator	D4060	Genesee
RNA Clean & Zestawy koncentratorów to zestawy do czyszczenia RNA	odczynniki R1016	Genesee
TRIzol	15596018	odczynnik do izolacji	termicznego
Woda, (do pracy z RNA) (traktowane DEPC, DNASE, wolne od RNAZ/Mol. Biol.)	BP561-1	fisherscientific
xGen Przygotowanie biblioteki RNA o szerokim zakresie 16rxn	10009865	IDT
Zymo RNA czyste i koncentratorowe kolumny