Artykuł metodologiczny

Badanie metylacji białka argininy: podejścia i metody

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 stycznia 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Hutchinson, A., Seitova, A. Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych Baculovirus. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Ilościowe metody badania aktywności białkowej metylotransferazy argininy 1-9 w komórkach. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Test ligacji zbliżeniowej pozwala na wykrycie, lokalizację i kwantyfikację metylacji białka argininy w tkance stałej. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Artykuł redakcyjny

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja białka argininy jest modyfikacją potranslacyjną, która bierze udział w regulacji szerokiego spektrum procesów biologicznych 1,2,3. Dziewięciu członków rodziny metylotransferaz białkowych argininy (PRMT) może metylować argininy w sposób monometylowy i di-metylosymetryczny lub asymetryczny. Zrozumienie konsekwencji funkcjonalnych i skatalogowanie metylowanych substratów PRMT znacznie poszerzyło wiedzę na temat enzymów PRMT i ułatwiło ich powiązanie z chorobątypu 2. Ponadto opracowanie silnych i selektywnych inhibitorów umożliwiło opracowanie metod opartych na biologii chemicznej do badania PRMT i przyspieszyło rozwój kliniczny środków ukierunkowanych na PRMT3. Wraz z postępem w dziedzinie PRMT, nowe metody i ich zastosowania umożliwią dalsze wyjaśnienie regulacji i biologii tych enzymów.

W tym zbiorze metod znajduje się artykuł na temat rekombinowanej produkcji białek PRMT, który zawiera szczegółowy opis systemu ekspresji opartego na bakulowirusie4. Przy użyciu ekspresji bakteryjnej można wygenerować kilka PRMT; jednak większe lub złożone zależne PRMT, takie jak PRMT7 lub PRMT5, wymagają systemu ekspresji komórek owadów. Metoda ta przyniosła już korzyści w licznych badaniach in vitro mających na celu określenie substratów PRMT.

Badanie substratów PRMT w środowisku komórkowym wymaga zaawansowanych metod wykrywania. Dwa artykuły w tym zbiorze przedstawiają odrębne metodologie, które opierają się na wzbogacaniu przeciwciał metylowanych arginin, a następnie na kwantymetrii spektrometrii mas lub kwantyfikacji niezależnej od przeciwciał za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Opracowano kilka przeciwciał rozpoznających różne stany metylacji, które zostały wykorzystane w badaniach identyfikujących substraty PRMT5. Metoda spektrometrii mas umożliwia ilościową ocenę metylacji argininy białek komórkowych poprzez zastosowanie znakowania metabolicznego, kolejnych zaawansowanych technik separacji i wzbogacania opartego na przeciwciałach6. Kilku członków rodziny PRMT preferuje argininy metylujące, które znajdują się w powtarzających się motywach RGG znajdujących się w wewnętrznie nieuporządkowanych regionach białek7. Metoda oparta na spektroskopii NMR umożliwia określenie stanu metylacji i położenia wszystkich pochodnych argininy (mono i di, symetrycznych i asymetrycznych), w których można je wiarygodnie określić ilościowo w złożonych próbkach biologicznych8.

Wreszcie, aby zidentyfikować metylowane reszty argininy w określonych białkach, w dwóch artykułach przedstawiono podejścia oparte na western blotting i teście ligacji zbliżeniowej (PLA). Obie te metody wykorzystują wykrywanie oparte na przeciwciałach, ale różnią się metodą wykrywania i dostarczonymi informacjami. Metoda western blot jest ilościowa i była cenna w charakterystyce sond chemicznych9. PLA dostarcza informacji na temat lokalizacji przestrzennej metylowanej argininy, ponieważ wykorzystuje docelowe przeciwciało białkowe i przeciwciało generyczne dla mono lub di-metyloargininy, omijając w ten sposób potrzebę wytwarzania specyficznych przeciwciał i może być niezwykle stosowany w utrwalonych tkankach10.

Razem, te różnorodne metodologie umożliwią solidne odkrycie metylowanych arginin w różnych układach komórkowych i stanach chorobowych oraz pogłębią podstawową wiedzę na temat biologicznej funkcji enzymów PRMT.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. jest wspierany przez Kanadyjską Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). Structural Genomics Consortium jest zarejestrowaną organizacją charytatywną (nr: 1097737), która otrzymuje fundusze od Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada za pośrednictwem Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [grant EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (a.k.a. EMD w Kanadzie i USA), Pfizer i Takeda.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Powiązane artykuły