Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64826

⸱

10 lutego 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

Streszczenie

Obrazowanie Ca2+ może być używane jako wskaźnik aktywności komórkowej, w tym potencjałów czynnościowych i różnych mechanizmów sygnalizacyjnych obejmujących wejście Ca2+ do cytoplazmy lub uwolnienie wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2+. Obrazowanie Ca2+ oparte na Pirt-GCaMP3 pierwotnych neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego (DRG) u myszy ma tę zaletę, że umożliwia jednoczesny pomiar dużej liczby komórek. Można monitorować do 1800 neuronów, co pozwala na badanie sieci neuronalnych i procesów somatosensorycznych jako zespołu w ich normalnym kontekście fizjologicznym na poziomie populacji in vivo. Duża liczba monitorowanych neuronów pozwala na wykrycie wzorców aktywności, które byłyby trudne do wykrycia przy użyciu innych metod. Bodźce można stosować do tylnej łapy myszy, co pozwala na badanie bezpośredniego wpływu bodźców na zespół neuronów DRG. Liczba neuronów wytwarzających stany przejściowe Ca2+, a także amplituda stanów przejściowych Ca2+ wskazuje na wrażliwość na określone modalności sensoryczne. Średnica neuronów dostarcza dowodów na aktywowane typy włókien (nieszkodliwe włókna mechaniczne vs. szkodliwe włókna bólowe, włókna Aβ, Aδ i C). Neurony wyrażające określone receptory mogą być genetycznie znakowane td-Tomato i specyficznymi rekombinazami Cre razem z Pirt-GCaMP. W związku z tym obrazowanie Pirt-GCaMP3 Ca2+ DRG stanowi potężne narzędzie i model do analizy określonych modalności sensorycznych i podtypów neuronów działających jako zespół na poziomie populacji w celu badania bólu, swędzenia, dotyku i innych sygnałów somatosensorycznych.

Wprowadzenie

Pierwotne neurony czuciowe bezpośrednio unerwiają skórę i przenoszą informacje somatosensoryczne z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego1,2. Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to skupiska komórek składające się z 10 000-15 000 pierwotnych neuronów czuciowych3,4. Neurony DRG mają różną wielkość, poziomy mielinizacji oraz wzorce ekspresji genów i receptorów. Neurony o mniejszej średnicy obejmują neurony odczuwające ból, a neurony o większej średnicy zazwyczaj reagują na niebolesne bodźce mechaniczne5,6. Zaburzenia w pierwotnych neuronach czuciowych, takie jak urazy, przewlekłe stany zapalne i neuropatie obwodowe, mogą uwrażliwiać te neurony na różne bodźce i przyczyniać się do przewlekłego bólu, allodynii i nadwrażliwości na ból7,8. Dlatego badanie neuronów DRG jest ważne dla zrozumienia zarówno somatosensacji ogólnie, jak i wielu zaburzeń związanych z bólem i swędzeniem.

Neurony uruchamiane in vivo są niezbędne do somatosensacji, ale do niedawna narzędzia do badania nienaruszonych zwojów in vivo były ograniczone do stosunkowo małej liczby komórek9. W tym miejscu opisujemy potężną metodę badania potencjałów czynnościowych lub aktywności neuronów na poziomie populacji in vivo jako zespołu. Metoda wykorzystuje obrazowanie w oparciu o cytoplazmatyczną dynamikę Ca2+. Wskaźniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2 + są dobrymi wskaźnikami zastępczymi do pomiaru aktywności komórkowej ze względu na zwykle niskie stężenie cytoplazmatycznego Ca2 +. Wskaźniki te umożliwiły jednoczesne monitorowanie setek do kilku tysięcy pierwotnych neuronów czuciowych u myszy9,10,11,12,13,14,15,16 i rats17. Opisana w tym badaniu metoda obrazowania Ca2+ in vivo może być wykorzystana do bezpośredniej obserwacji reakcji na poziomie populacji na bodźce mechaniczne, zimne, termiczne i chemiczne.

Białko błonowe wiążące fosfoinozytyd, Pirt, ulega ekspresji na wysokim poziomie w prawie wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych18,19 i może być używane do sterowania ekspresją czujnika Ca2+, GCaMP3, do monitorowania aktywności neuronów in vivo20. W tym protokole opisano techniki wykonywania operacji DRG in vivo, obrazowania Ca2 + i analizy w prawym odcinku lędźwiowym 5 (L5) DRG myszy Pirt-GCaMP3 14 przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Texas Health Science Center w San Antonio.

UWAGA: Po rozpoczęciu, operacja zwierzęcia (krok 1) i obrazowanie (krok 2) muszą zostać przeprowadzone w sposób ciągły. Analiza danych (krok 3) może zostać wykonana w późniejszym terminie.

1. Operacja i unieruchomienie zwierzęcia do obrazowania prawostronnego zwoju korzeniowego tylnego L5

UWAGA: W badaniu wykorzystano myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J obu płci w wieku 8 tygodni lub więcej. Choć obrazowanie obu płci jest równie skuteczne, myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni, ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję Pirt u młodszych osobników. Myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J zostały wyhodowane na Uniwersytecie Johns Hopkins14. Można obrazować zwoje korzeni grzbietowych (DRG) po dowolnej stronie, a także inne lędźwiowe DRG (np. lędźwiowy 4). Podane czasy są szacunkowe dla doświadczonego chirurga. Sporadyczne problemy techniczne, takie jak zwiększone krwawienie, mogą wydłużyć wymagany czas.

  1. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną zawierającą 40 mg/mL ketaminy i 6 mg/mL ksylazyny. Całkowita objętość powinna wynosić co najmniej 9 µL/g masy ciała, zarówno na potrzeby operacji, jak i eutanazji po obrazowaniu.
    OSTROŻNIE: Ketamina jest szkodliwa w przypadku wstrzyknięcia, połknięcia lub kontaktu z oczami. Należy obchodzić się z nią ostrożnie.
  2. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są czyste i wysterylizowane w autoklawie lub inną metodą zatwierdzoną przez NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
  3. Od 15 do 25 min przed operacją wstrzyknij myszy Pirt-GCaMP3 doprzewnowicznie (i.p.) ~2,25 µL ketaminy/ksylazyny na każdy gram masy ciała (90 mg/kg ketaminy, 13,5 mg/kg ksylazyny). Nie przekraczaj dawki 120 mg/kg ketaminy.
  4. W ciągu 15 do 25 min po podaniu znieczulenia (krok 1.3) sprawdź, czy mysz osiągnęła chirurgiczną głębokość znieczulenia, uciskając przeciwstawną tylną łapę (nie prawą tylną łapę/ipsilateralną). Brak odruchu cofnięcia kończyny tylnej potwierdza osiągnięcie chirurgicznego poziomu znieczulenia.
    UWAGA: Odruch cofnięcia kończyny tylnej jest wykorzystywany w trakcie całego eksperymentu do monitorowania znieczulenia. Zawsze używaj przeciwstawnej tylnej łapy.
  5. Umieść mysz na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
    UWAGA: Pomocne może być unieruchomienie głowy myszy za pomocą ramion stereotaktycznych (patrz Tabela Materiałów) lub innej ramki, zależnie od preferencji badacza.
  6. Zlokalizuj zgrubienie lędźwiowe, badając palcami kość miedniczą myszy. Ogól grzbiet myszy nad obszarem zgrubienia lędźwiowego. Ten krok powinien zająć ~90 s.
    UWAGA: Na czas golenia mysz można na krótko zdjąć z podgrzewanej podkładki.
  7. Za pomocą nożyczek wykonaj trójboczny prostokątne nacięcie (8 mm x 20 mm) nad zgrubieniem lędźwiowym i odchyl skórę pęsetą (Rysunek 1A). Ten krok zajmuje ~2 min.
    UWAGA: Badacze mogą również użyć pęsety hemostatycznej lub rozieracza, aby utrzymać nacięcie otwarte. Nie jest to operacja z przeżyciem, więc dodatkowe oczyszczanie pola operacyjnego nie jest konieczne; można jednak zastosować povidone-iodine. Podano tutaj maksymalny dopuszczalny rozmiar nacięcia. Mniejsze nacięcie jest preferowane nad większym.
  8. Użyj sprężynowych nożyczek do dyssekcji 13 mm, aby wykonać nacięcia o długości 3-4 mm po prawej stronie kręgosłupa. Użyj nożyczek, aby odsunąć skórę i mięśnie na boki w celu odsłonięcia kręgosłupa (Rysunek 1B). Ten krok zajmuje ~3 min.
  9. Użyj nożyczek 8 mm, aby oczyścić wyrostek poprzeczny prawego zwoju rdzeniowego L5 (DRG), wycinając mięśnie i tkankę łączną, starając się zminimalizować krwawienie. Do wchłaniania krwi użyj waty i/lub gelfoamu. Kręg L5 jest pierwszym kręgiem rostralnie względem kości miedniczej.
    UWAGA: Ten krok zajmuje ~3 min i może wymagać więcej czasu, jeśli zwierzę krwawi mocniej niż zwykle.
  10. Otwórz prawy wyrostek poprzeczny L5 za pomocą kleszczy kostnych Friedmana-Pearsona lub mocnej pęsety precyzyjnej. Uważaj, aby nie dotknąć DRG (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ten krok zajmuje ~2 min, ale może wymagać więcej czasu, jeśli zwierzę krwawi mocniej niż zwykle.
  11. Nie kontynuuj, dopóki krwawienie całkowicie nie ustąpi. Zapobiegaj przedostawaniu się krwi na powierzchnię DRG, używając gelfoamu lub waty. Ten krok zajmuje 1-4 min.
  12. Przenieś mysz i podgrzewaną podkładkę na specjalnie przygotowany stolik (Rysunek 2A,B). Użyj taśmy montażowej, aby unieruchomić zwierzę i podkładkę grzewczą. Umieść nos zwierzęcia w stożku nosowym, aby zwierzę mogło otrzymywać ciągłe znieczulenie izofluranem. Unieruchom prawą tylną łapę wystającą poza stolik, aby bodźce mogły być łatwo przykładane do łapy. Ten krok zajmuje 3 min.
  13. Unieruchom kręgosłup za pomocą zacisków stolika nad skórą na kręgach i/lub kości miednicznej bezpośrednio rostralnie i kaudalnie względem L5 DRG. Dostosuj zaciski i stolik tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej pozioma (Rysunek 2B,C).
    UWAGA: Może być konieczne usunięcie tkanki znajdującej się między DRG a obiektywem.
  14. Umieść stolik pod mikroskopem tak, aby obiektyw po opuszczeniu znajdował się 8 mm bezpośrednio nad DRG (Rysunek 3A,B). Wprowadź termometr rektalny.
    UWAGA: Odległość od DRG do obiektywu może się różnić w zależności od obiektywu, mikroskopu i zwierzęcia.
  15. Podłącz przewody zasilające do podkładki grzewczej i termometru rektalnego. Podłącz stożek nosowy do linii gazu z izofluranem.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przykład operacji odsłonięcia zwoju rdzeniowego (DRG). (A) Wygolono niewielki obszar, a następnie nacięto i odchylono skórę. Cięcie wzdłuż osi rostralno-kaudalnej ma długość ok. 10 mm. (B) Wykonano nacięcie po prawej stronie kręgosłupa i odcięto mięśnie oraz tkankę łączną, odsłaniając prawy wyrostek poprzeczny kręgu L5. Krew wchłonięto za pomocą gąbki żelatinowej (gelfoam). (C) Oczyszczono wyrostek poprzeczny i usunięto kość nad zwojem DRG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rycina 2: Mocowanie myszy na specjalnie przygotowanym stole do obrazowania zwojów korzeni grzbietowych (DRG). (A) Przedstawiono specjalnie przygotowany stół. Składa się on z płyty podstawy i płyty do mocowania zwierzęcia. Płyta do mocowania zwierzęcia znajduje się na blokowanym przegubie kulowym. Do płyty mocującej przyklejono taśmą stożek nosowy z przewodami do podawania mieszaniny tlenu / izofluranu i linią odprowadzającą gazy resztkowe, a także podkładkę grzewczą owiniętą w folię aluminiową. Do płyty podstawy przykręcono dwa ramiona, z których każde składa się z trzech blokowanych przegubów kulowych. Każde ramię posiada zacisk wykonany z pęsety z wkrętem do dokręcania i luzowania. (B) Zwierzę jest zamocowane na płycie mocującej. Jego nos znajduje się w stożku nosowym. Zaciski są umieszczone nad skórą, stabilizując kręgosłup i kość miednicy. Prawa (ipsylateralna) tylna łapa jest przyklejona taśmą tak, aby wystawała, co umożliwia łatwy dostęp w celu podawania bodźców. (C) Powiększony obraz unieruchomionego kręgosłupa i kości miednicy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Zwierzę na specjalistycznym stoliku umieszczone pod obiektywem mikroskopu. (A) Szeroki widok stolika, zwierzęcia i mikroskopu. Po lewej stronie widoczne są przewody do kontrolera temperatury DC oraz linie doprowadzające tlen / izofluran i linia odprowadzania gazów odpadowych. (B) Zbliżenie na zwierzę pod obiektywem mikroskopu. DRG znajduje się ok. 8 mm poniżej obiektywu. Termometr rektalny jest wprowadzony, a nos znajduje się wewnątrz stożka nosowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie zwojów rdzeniowych (DRG)

  1. Do obrazowania należy użyć pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem DIC 10x/0,4 oraz powiązanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów). Należy zastosować ustawienia dla filtra zielonego (FITC): wzbudzenie 495 nm, emisja 519 nm, długość fali detekcji 50-580 nm, urządzenie obrazujące GaAsP-Pmt1, detektor GaAsP-PMT.
    UWAGA: W przypadku innych mikroskopów należy stosować ustawienia zalecane przez producenta.
  2. Za pomocą mikroskopu należy zlokalizować powierzchnię zwoju korzeniowego tylnego (DRG). Należy wyregulować zaciski na stoliku tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej pozioma i aby w płaszczyźnie ogniskowej wizualizowano maksymalną powierzchnię.
    UWAGA: Wybór obiektywu może się różnić w zależności od użytego mikroskopu i preferencji użytkownika. Wybór oprogramowania zależy od mikroskopu. Poziome ustawienie DRG skutkuje wyraźniejszymi obrazami, umożliwia oprogramowaniu stworzenie bardziej przejrzystych filmów, pozwala na obrazowanie większej liczby neuronów oraz sprawia, że analiza jest łatwiejsza i dokładniejsza.
  3. Do stożka nosowego należy podawać 1%-1,5% izofluranu w strumieniu tlenu, aby zapewnić utrzymanie znieczulenia myszy. Należy uważnie monitorować zwierzę przez cały czas trwania procedury, aby utrzymać znieczulenie izofluranem bez przedawkowania.
    UWAGA: Ilość izofluranu niezbędna do utrzymania znieczulenia może się różnić w zależności od poszczególnych zwierząt i bodźców. Zazwyczaj wystarczająco jest 1,5%. Jeśli zwierzę porusza się podczas podawania bodźca, należy zwiększyć stężenie izofluranu. Jeśli oddech staje się płytki, należy zmniejszyć stężenie izofluranu. Przed każdym bodźcem należy sprawdzić odruch wycofania kończyny tylnej z przeciwległej łapy.
    OSTRZEŻENIE: Izofluran może być szkodliwy lub powodować zawroty głowy lub senność w przypadku wdychania. Należy unikać wdychania i stosować go wyłącznie w dobrze wentylowanych pomieszczeniach.
  4. Należy załadować protokół szybkiego skanowania mikroskopu.
    1. Stosuje się typowe ustawienia dla szybkiego skanowania: rozmiar woksela 2,496 µm x 2,496 µm x 16 µm, 512 x 512 pikseli, Z-stack z 10 przekrojami optycznymi, 1 jednostka Airy (AU)/32 µm, moc lasera 48 nm 1% (5 mW), czas piksela 1,52 µs, czas linii 0,91 ms, czas klatki 465 ms, prędkość skanowania LSM 8, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 650 V, wzmocnienie cyfrowe 1. Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierzęcia.
    2. Aby skonfigurować protokół szybkiego skanowania, należy kliknąć zakładkę Acquisition. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Frames. Należy wybrać Presets > 512 x 512, aby ustawić mikroskop na rejestrację obrazu o rozmiarze 512 x 512 pikseli. To z kolei ustawi wartości X i Y rozmiaru woksela na podstawie rozmiaru obrazu określonego przez oprogramowanie mikroskopu.
    3. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Channels. Należy kliknąć pole Track2. Z menu rozwijalnego obok pola Track2 należy wybrać kolor Green (FITC). Poniżej Track2 otworzy się nowa zakładka.
    4. Obok sekcji Lasers należy kliknąć pole 488. Ustawi to długości fal wzbudzenia i emisji.
    5. Przy suwaku 48 nm należy ustawić Laser Power na 1%. Należy kliknąć przycisk 1 AU, aby ustawić aperturę na 1 jednostkę Airy. W sekcji FITC należy ustawić Master Gain na 650 V, Digital Offset na 0 oraz Digital Gain na 1.
    6. W zakładce Acquisition należy zaznaczyć pole Z-Stack. Należy kliknąć przycisk Live, aby wyświetlić obraz zwoju w czasie rzeczywistym. Należy obracać pokrętło płaszczyzny ogniskowej w górę, aż widoczny będzie tylko niewielki łuk neuronów.
    7. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack > przycisk Set Last. Należy obracać pokrętło płaszczyzny ogniskowej w dół, aż widoczny będzie tylko niewielki łuk neuronów. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack > przycisk Set First. Należy kliknąć przycisk Live, aby wyłączyć obraz w czasie rzeczywistym.
    8. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack. W polu Slices należy wpisać 10. Ustawi to 10 przekrojów optycznych i automatycznie określi głębokość woksela.
    9. W zakładce Acquisition należy zaznaczyć pole Time Series. Pod sekcją Acquisition Parameters pojawi się nowa zakładka Time Series. W zakładce Time Series > w polu Cycles należy wpisać liczbę cykli, które mają zostać wykonane. W tym przypadku jest to 8.
    10. Należy ustawić prędkość i kierunek skanowania. W sekcji Acquisition Parameters, Acquisition Mode zakładka > > Direction > Double Headed Arrow dla skanowania dwukierunkowego. Należy wybrać Acquisition Mode zakładka > Frame > Scan Speed Slider > 8.
      UWAGA: Zazwyczaj można załadować ustawienia z poprzedniego eksperymentu i skorygować jedynie moc lasera, jeśli obraz jest zbyt jasny lub ciemny, a także ustawienia Z-Stack Set Last i Set First.
  5. Należy wykonać krótki skan DRG obejmujący 8 cykli, klikając Start Experiment w zakładce Acquisition. Należy stworzyć film poprzez wykonanie projekcji ortogonalnej skanów (jeden skan na klatkę) w czasie i ręcznie sprawdzić przejrzystość obrazu oraz obecność artefaktów, takich jak „fale” jasności przecinające DRG. Należy skorygować położenie zacisków i grubość przekroju optycznego, powtarzając ten krok aż do uzyskania wyraźnego filmu wysokiej jakości.
    UWAGA: Krok ten należy powtórzyć, jeśli zwierzę się poruszy lub zostanie przesunięte przez badacza. Należy zwrócić uwagę na obszary zwoju (nie tylko pojedyncze neurony), które wydają się stawać jaśniejsze i ciemniejsze w trakcie eksperymentu, co tworzy falujący obraz lub powoduje znikanie obszarów bądź ich rozjaśnianie. Problemem jest również ruch większy niż około połowa średnicy małego neuronu (<20 µm). Falowanie można często naprawić, zbliżając do siebie pierwszą i ostatnią pozycję Z-Stack (patrz krok 2.4.4 powyżej) i zmniejszając grubość przekroju optycznego. Film 1 przedstawia przykład falującego zwoju przed wypoziomowaniem i ustawieniem prawidłowej grubości przekroju optycznego. Film 2 przedstawia obraz po korekcie poziomu i grubości przekroju optycznego. Różnica jest subtelna, ale ma ogromny wpływ na analizę.
  6. Należy załadować protokół skanowania o wysokiej rozdzielczości mikroskopu.
    1. Stosuje się typowe ustawienia dla skanowania o wysokiej rozdzielczości: rozmiar woksela 1,248 µm x 1,248 µm x 14 µm, 1024 x 1024 pikseli, Z-stack z 6 przekrojami optycznymi, 1,2 jednostki Airy (AU)/39 µm, moc lasera 48 nm 5%/25 mW, czas piksela 2,06 µs, czas linii 4,95 ms, czas klatki 5,06 s, prędkość skanowania LSM 6, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 650 V, wzmocnienie cyfrowe 1. Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierzęcia.
    2. Aby skonfigurować protokół skanowania o wysokiej rozdzielczości, należy kliknąć zakładkę Acquisition. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Frames. Należy wybrać Presets > 1024 x 1024, aby ustawić mikroskop na rejestrację obrazu o rozmiarze 1024 x 1024 pikseli. To z kolei ustawi wartości X i Y rozmiaru woksela na podstawie rozmiaru obrazu określanego przez oprogramowanie mikroskopu.
    3. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Channels. Należy kliknąć pole Track2. Z menu rozwijalnego obok pola Track2 należy wybrać kolor Green (FITC). Poniżej Track2 otworzy się nowa zakładka.
    4. Obok sekcji Lasers należy kliknąć pole 48. Ustawi to długości fal wzbudzenia i emisji. Należy kliknąć pole High Intensity Laser Range.
    5. Przy suwaku 48 nm należy ustawić Laser Power na 5%. Należy kliknąć przycisk 1 AU, aby ustawić aperturę na 1 jednostkę Airy. W sekcji FITC należy ustawić Master Gain na 650 V, Digital Offset na 0 oraz Digital Gain na 1.
    6. W zakładce Acquisition należy zaznaczyć pole Z-Stack. Należy kliknąć przycisk Live, aby wyświetlić obraz zwoju w czasie rzeczywistym. Należy obracać pokrętło płaszczyzny ogniskowej w górę, aż widoczny będzie tylko niewielki łuk neuronów.
    7. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack > przycisk Set Last. Należy obracać pokrętło płaszczyzny ogniskowej w dół, aż widoczny będzie tylko niewielki łuk neuronów. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack > przycisk Set First. Należy kliknąć przycisk Live, aby wyłączyć obraz w czasie rzeczywistym.
    8. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Z-Stack. W polu Slices należy wpisać 6. Ustawi to 6 przekrojów optycznych i automatycznie określi głębokość woksela.
    9. W zakładce Acquisition należy upewnić się, że pole Time Series nie jest zaznaczone (brak serii czasowych).
    10. Należy ustawić prędkość i kierunek skanowania. W sekcji Acquisition Parameters należy kliknąć zakładkę Acquisition Mode > Frame > Presets > 1024 x 1024. Należy wybrać Acquisition Mode zakładka > Frame > Direction > Double Headed Arrow dla skanowania dwukierunkowego. Należy wybrać Acquisition Mode zakładka > Frame > Scan Speed Slider > 6.
    11. Jeśli komórki są znakowane td-Tomato, należy ustawić mikroskop tak, aby skanował kanał czerwony (wzbudzenie 592 nm / emisja 614 nm, długość fali detekcji 60-70 nm) dodatkowo do kanału zielonego. Należy to ustawić, przechodząc do sekcji Acquisition Parameters i klikając zakładkę Channels > pole Track1. Z menu rozwijalnego obok pola Track1 należy wybrać kolor Red (Texas Red). Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.6.3, z wyjątkiem tego, że należy kliknąć pole 561 zamiast pola 48. Laser Power należy ustawić na 1%. Td-Tomato jest znacznie jaśniejszy niż GCaMP3 i wymaga mniejszej mocy lasera.
  7. Należy wykonać obraz DRG o wysokiej rozdzielczości, klikając przycisk Start Experiment w zakładce Acquisition.
  8. Należy załadować protokół szybkiego skanowania mikroskopu (patrz krok 2.4). Należy rejestrować aktywność spontaniczną w DRG przez 80 cykli (około 10 min). Należy wygenerować film z projekcją ortogonalną i zweryfikować, czy obraz jest wystarczającej jakości do analizy.
    UWAGA: Kryteria jakości są takie same jak w kroku 2.5.
  9. W celu podawania bodźców należy ustawić mikroskop tak, aby wykonał 15-20 skanów. Należy odczekać na zakończenie skanów 1-5 w celu uzyskania linii bazowej. Bodziec należy podać podczas skanów 6-10. Po każdym bodźcu należy odczekać co najmniej 5 min przed podaniem kolejnego, aby zapobiec desensytyzacji.
    UWAGA: W pierwszej kolejności należy podawać bodźce mechaniczne, a następnie zimne, termiczne i chemiczne. Słabsze bodźce (np. niska siła mechaniczna, temperatury bliższe temperaturze pokojowej) powinny być podawane przed silniejszymi bodźcami (np. wyższa siła mechaniczna, temperatury bardziej oddalone od pokojowej). Podczas podawania bodźców należy uważać, aby nie spowodować żadnego ruchu DRG. W przypadku silnych bodźców termicznych często konieczne jest podanie 2% izofluranu przez 1-2 min przed rozpoczęciem bodźca. W mikroskopie użytym w tej badaniu każdy skan jest wyraźnie słyszalny, dzięki czemu badacz może łatwo zidentyfikować koniec skanowania, co pozwala na podanie bodźca natychmiast po skanie 5. Jednak każda metoda ułatwiająca podawanie bodźców w spójnym punkcie czasowym będzie skuteczna.
  10. W przypadku nacisku mechanicznego należy trzymać szczypce algometru tak, aby łapa znajdowała się między łopatkami bez dotykania jej, a następnie zacisnąć szczypce natychmiast po zakończeniu skanu 5 i przestać natychmiast po skanie 10. Siłę nacisku należy monitorować za pomocą algometru (patrz Tabela materiałów). Należy utrzymać siłę nacisku jak najbliżej żądanej wartości (tutaj stosujemy bodziec nacisku 10 g) i upewnić się, że nie przekracza ona żądanej siły o więcej niż 10 g.
    UWAGA: Można wykrywać bodźce o sile od 0,07 g (włókna von Freya) do 600 g siły nacisku.
  11. W przypadku bodźców zimnych i termicznych należy schłodzić lub podgrzać zlew z wodą do temperatury nieco poniżej (dla zimnych) lub powyżej (dla termicznych) żądanej temperatury i rozpocząć skanowanie. W tym przypadku stosuje się bodziec 45 °C. Gdy woda osiągnie odpowiednią temperaturę, bodziec należy podać natychmiast po skanie 5, zanurzając łapę w wodzie. Zlew należy odsunąć natychmiast po skanie 10.
    UWAGA: Temperatura podczas skanu 5 powinna mieścić się w granicach 1 °C od temperatury żądanej. Jeśli temperatura wody w zlewie jest niewłaściwa, nie należy podawać bodźca, ponieważ mogłoby to doprowadzić do desensytyzacji neuronów. Zamiast tego należy ponownie schłodzić lub podgrzać wodę i spróbować ponownie. Mierzyliśmy temperatury od 0 °C (woda z lodem) do 95 °C. Należy jednak pamiętać, że temperatury powyżej 50 °C mogą uszkodzić tkanki i zakłócić późniejsze eksperymenty. Podobnie niektóre substancje chemiczne (np. tetrodotoksyna, kapsaicyna) działają nieodwracalnie lub nie mogą zostać wypłukane, co może uniemożliwić dalsze eksperymenty na zwierzęciu.
  12. Po podaniu i zarejestrowaniu wszystkich bodźców należy uśmiercić zwierzę poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny (200 mg/kg ketaminy, 30 mg/kg ksylazyny lub 5 µL na gram masy ciała roztworu przygotowanego w kroku 1.1), a następnie przeprowadzić dekapitację.

3. Analiza danych

  1. Otwórz pliki obrazów, przeciągając i upuszczając je do programu ImageJ. Po otwarciu pliku wybierz typ obrazu w menu Image > Type > RGB color.
    UWAGA: Wtyczka StackReg21 w menu Plugins > StackReg jest przydatna do korygowania i wyrównywania artefaktów ruchowych. ImageJ potrafi odczytać większość formatów plików oprogramowania mikroskopowego. Wybór typu obrazu zależy od preferencji użytkownika. Format RGB ułatwia tworzenie kolorowych obrazów do publikacji. Pakiety oprogramowania od producenta mikroskopu lub cytoNet2 mogą również pomóc w analizie. Pobranie, instalacja i użycie StackReg nie jest konieczne, ale jest zalecane.
  2. Użyj narzędzia obszaru zainteresowania (ROI), aby zaznaczyć aktywne neurony w menu Analyze > Tool > ROI Manager. Rysuj ROI za pomocą narzędzi ellipse (elipsa) lub rectangle (prostokąt) na pasku narzędzi i dodawaj je do pliku ROI, naciskając przycisk Add w oknie ROI manager lub naciskając klawisz „t”.
    UWAGA: Pamiętaj o częstym zapisywaniu pliku ROI. Użytkownicy mogą zawsze przywrócić ROI, przeciągając i upuszczając plik ROI do programu ImageJ i klikając pole Show All na dole okna ROI Manager. Zapisywanie jako nakładka (overlay) nie jest zalecane. Z doświadczenia wynika, że zapisywanie jako plik ROI.zip upraszcza analizę.
  3. W menu Analyze > Set Measurements upewnij się, że zaznaczono opcję mean gray value; odznacz wszystkie pozostałe pola w Set Measurements. Użyj narzędzia wielopomiary w menu ROI manager, aby obliczyć intensywność w obrębie ROI. Pomiar intensywności wykonaj w oknie ROI w menu More > Multimeasure.
    UWAGA: Czasami sąsiednie neurony znajdują się zbyt blisko siebie, aby narysować osobne ROI. Takich neuronów nie można użyć do pomiaru intensywności przejściowej, ale mogą one zostać uwzględnione w zliczaniu neuronów aktywujących się.
  4. Zapisz plik CSV wygenerowany przez Multimeasure i otwórz go w dowolnym programie do arkuszy kalkulacyjnych.
    UWAGA: Przykładowy szablon arkusza ułatwiający analizę znajduje się w Supplementary File 1.
  5. Oblicz intensywność przejściową Ca2+ jako ΔF / F0 = (Ft- F0) / F0, gdzie Ft to intensywność pikseli w ROI w interesującym punkcie czasowym, a F0 to intensywność bazowa wyznaczona poprzez uśrednienie intensywności albo 2-4 klatek przed przejściem Ca2+ w przypadku aktywności spontanicznej, albo pierwszych 1-5 klatek ROI dla przejść Ca2+ występujących podczas stymulacji. Wyklucz neurony generujące piki Ca2+ przed bodźcem i nie analizuj aktywności po zakończeniu stymulacji.
  6. Do analizy intensywności przejść Ca2+ wybierz losowo w przybliżeniu taką samą liczbę neuronów z każdego zwoju, aby uniknąć zniekształcenia danych na korzyść zwojów, w których wystąpiła największa liczba odpowiadających neuronów. Wyklucz piki, w których ΔF / F0 < 0.15.
    UWAGA: W literaturze istnieją alternatywne opublikowane metody analizy oraz kryteria włączania/wykluczania neuronów11,12,23,24,25,26,27,28.
  7. Zmierz średnice neuronów za pomocą narzędzia line (linia) na pasku narzędzi w programie ImageJ. Oblicz średnią średnicę z linii narysowanych wzdłuż najdłuższej i najkrótszej średnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy zwojów korzeni grzbietowych L5 myszy Pirt-GCaMP3. (A,D) Przedstawiono pojedyncze klatki skanów o wysokiej rozdzielczości zwojów korzeni grzbietowych L5 myszy Pirt-GCaMP3. (B,E). Projekcje średniej intensywności 15 klatek zwojów L5 DRG myszy Pirt-GCaMP3 odpowie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uporczywy ból występuje w szerokim zakresie zaburzeń, powodując osłabienie i/lub obniżenie jakości życia u około 8% osób29. Pierwotne neurony czuciowe wykrywają szkodliwe bodźce na skórze, a ich plastyczność przyczynia się do uporczywego bólu8. Podczas gdy neurony mogą być badane w hodowli komórkowej i eksplantatach, usuwa to je z ich normalnego kontekstu fizjologicznego. Chirurgiczne naświetlenie DRG, a następnie obrazowanie Pirt-GCaMP3 Ca2 +, pozwala na badanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01DE026677 and R01DE031477 (do Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), Rising STAR Award od University of Texas System (Y.S.K.), oraz Craniofacial Oral-biology Student Training in Academic Research (COSTAR) National Institute of Health Grant 5T32DE014318 (J.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anazed Injection (ksylazyna)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Aplikatory z bawełnianą końcówkąMcKesson24-106-1S Zakrzywiony
HemostatFine Science Tools13007-12
Regulator temperatury DCFHC40-90-8D
Regulator temperatury DC Poduszka grzewczaFHC40-90-2-05
Kleszcze z powłoką ceramiczną DumontFine Science Tools11252-50
Regulator temperatury FHC DCFHC40-90-8D
Fluriso (izofluran)MWI Zdrowie zwierząt, Grupa Piramal501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamina)ZoetisKET-00002R2
Luminescencyjna zielona taśma scenicznaJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Waporyzator izofluranowyMidmark91305430
Mikro nożyczki preparacyjneRobozRS-5882
Mikro sprężyna preparcyjna nożyczkiFine Science Tools15023-10
nożyczki preparacyjneRobozRS-5677
Mini sonda termistora doodbytniczegoFHC40-90-5D-02
Nożyczki operacyjneRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J myszyUniwersytet Johnsa HopkinsaN/AKażda płeć może być równie dobrze zobrazowana. Myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję promotora Pirt u młodszych myszy.
Algometr dla małych zwierząt SMALGOBioseb Instrumenty badawcze In vivoBIO-SMALGO
Rama stereotaktycznaKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J myszyJackson Laboratory7909
Płyta górna, 6 cali x 10 caliNewport290-TP
TrpV1-CRE C57BL/6J myszyJackson Laboratory17769
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 800Cal ZeissLSM800
Oprogramowanie Zeiss Zen 2.6 Blue EditionCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6
Mikro sprężynowe

Bibliografia

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450(2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171(2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie in vivomikroskopia konfokalnamyszy Pirt-GCaMP3aktywność zespołów neuronalnychmodalności sensorycznenadwrażliwość na bólbodźce mechaniczne
In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.