In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Pierwotne neurony czuciowe bezpośrednio unerwiają skórę i przenoszą informacje somatosensoryczne z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego^1,2. Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to skupiska komórek składające się z 10 000-15 000 pierwotnych neuronów czuciowych^3,4. Neurony DRG mają różną wielkość, poziomy mielinizacji oraz wzorce ekspresji genów i receptorów. Neurony o mniejszej średnicy obejmują neurony odczuwające ból, a neurony o większej średnicy zazwyczaj reagują na niebolesne bodźce mechaniczne^5,6. Zaburzenia w pierwotnych neuronach czuciowych, takie jak urazy, przewlekłe stany zapalne i neuropatie obwodowe, mogą uwrażliwiać te neurony na różne bodźce i przyczyniać się do przewlekłego bólu, allodynii i nadwrażliwości na ból^7,8. Dlatego badanie neuronów DRG jest ważne dla zrozumienia zarówno somatosensacji ogólnie, jak i wielu zaburzeń związanych z bólem i swędzeniem.

Neurony uruchamiane in vivo są niezbędne do somatosensacji, ale do niedawna narzędzia do badania nienaruszonych zwojów in vivo były ograniczone do stosunkowo małej liczby komórek⁹. W tym miejscu opisujemy potężną metodę badania potencjałów czynnościowych lub aktywności neuronów na poziomie populacji in vivo jako zespołu. Metoda wykorzystuje obrazowanie w oparciu o cytoplazmatyczną dynamikę Ca²⁺. Wskaźniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca^{2 +} są dobrymi wskaźnikami zastępczymi do pomiaru aktywności komórkowej ze względu na zwykle niskie stężenie cytoplazmatycznego Ca^{2 +}. Wskaźniki te umożliwiły jednoczesne monitorowanie setek do kilku tysięcy pierwotnych neuronów czuciowych u myszy^{9,10,11,12,13,14,15,16} i rats¹⁷. Opisana w tym badaniu metoda obrazowania Ca²⁺ in vivo może być wykorzystana do bezpośredniej obserwacji reakcji na poziomie populacji na bodźce mechaniczne, zimne, termiczne i chemiczne.

Białko błonowe wiążące fosfoinozytyd, Pirt, ulega ekspresji na wysokim poziomie w prawie wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych^18,19 i może być używane do sterowania ekspresją czujnika Ca²⁺, GCaMP3, do monitorowania aktywności neuronów in vivo²⁰. W tym protokole opisano techniki wykonywania operacji DRG in vivo, obrazowania Ca^{2 +} i analizy w prawym odcinku lędźwiowym 5 (L5) DRG myszy Pirt-GCaMP3 ¹⁴ przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.

UWAGA: Raz rozpoczęta, chirurgia zwierząt (krok 1) i obrazowanie (krok 2) muszą być zakończone w sposób ciągły. Analiza danych (krok 3) może zostać przeprowadzona później.

1. Operacja i zabezpieczenie zwierzęcia do obrazowania L5 DRG prawej strony

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J w wieku 8 tygodni lub starsze. Chociaż obie płcie można zobrazować równie dobrze, myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję Pirt u młodszych myszy. Myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J zostały wygenerowane na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa¹⁴. DRG po obu stronach może być obrazowany, a inne DRG odcinka lędźwiowego (np. lędźwiowy 4) mogą być obrazowane. Podane czasy są szacunkowe dla doświadczonego chirurga. Sporadyczne problemy techniczne, takie jak zwiększone krwawienie, mogą wydłużyć wymagany czas.

1. Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej zawierający 40 mg/ml ketaminy i 6 mg/ml ksylazyny. Całkowita objętość powinna wynosić co najmniej 9 μl/g masy ciała zarówno w przypadku zabiegu chirurgicznego, jak i eutanazji po obrazowaniu.
   UWAGA: Ketamina jest szkodliwa w przypadku wstrzyknięcia, połknięcia lub w kontakcie z okiem. Obchodź się ostrożnie.
2. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są czyste i wysterylizowane w autoklawie lub innym przewodniku NIH dotyczącym pielęgnacji i użytkowania zwierząt laboratoryjnych zatwierdzonej przez NIH.
3. Między 15 a 25 minutą przed zabiegiem wstrzyknąć myszowi Pirt-GCaMP3 dootrzewnowo (i.p.) ~2,25 μl ketaminy/ksylazyny na każdy gram masy ciała (90 mg/kg ketaminy, 13,5 mg/kg ksylazyny). Nie przekraczać dawki 120 mg/kg ketaminy.
4. W ciągu 15 do 25 minut po wstrzyknięciu znieczulenia (krok 1.3) sprawdź, czy mysz osiągnęła chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, ściskając przeciwległą tylną łapę (nie ipsilateralną/prawą tylną łapę). Brak odruchu wycofania kończyn tylnych zapewnia osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia.
   UWAGA: Odruch wycofania kończyn tylnych jest używany przez cały eksperyment do monitorowania znieczulenia. Zawsze używaj przeciwległej tylnej łapy.
5. Umieść mysz na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
   UWAGA: Pomocne może być trzymanie głowy myszy w miejscu za pomocą ramki stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów) lub innej ramki w zależności od preferencji badacza.
6. Zlokalizuj powiększenie odcinka lędźwiowego, wyczuwając kość miednicy myszy. Ogol tył myszy powyżej obszaru powiększenia odcinka lędźwiowego. Ten krok powinien zająć ~90 s.
   UWAGA: Mysz można na chwilę wyjąć z podgrzewanej podkładki w celu golenia.
7. Wykonaj trójstronne prostokątne nacięcie (8 mm x 20 mm) nad powiększeniem odcinka lędźwiowego za pomocą nożyczek i odgiń skórę kleszczami (Rysunek 1A). Ten krok trwa ~2 min.
   UWAGA: Badacze mogą również użyć kleszczy hemostatycznych lub retraktora, aby utrzymać nacięcie otwarte. Nie jest to operacja przeżycia, więc dodatkowe czyszczenie obszaru operacyjnego nie jest konieczne; Można to jednak zrobić za pomocą jodu powidonu. Największy dopuszczalny rozmiar nacięcia jest podany tutaj. Mniejsze nacięcie jest lepsze niż większe nacięcie.
8. Za pomocą nożyczek do preparowania ze sprężyną 13 mm wykonaj nacięcia 3-4 mm po prawej stronie kręgosłupa. Użyj nożyczek, aby odciąć skórę i mięśnie na boki, aby odsłonić kręgosłup (Rysunek 1B). Ten krok zajmuje ~3 min.
9. Użyj nożyczek 8 mm, aby oczyścić wyrostek poprzeczny po prawej stronie L5 DRG, odcinając mięsień i tkankę łączną, starając się zminimalizować krwawienie. Użyj bawełny i/lub pianki żelowej, aby wchłonąć krew. Kręg L5 jest pierwszym kręgiem rostralnym do kości miednicy.
   UWAGA: Ten krok zajmuje ~ 3 minuty i może zająć więcej czasu, jeśli zwierzę krwawi bardziej niż normalnie.
10. Rozetnij prawy wyrostek poprzeczny L5 za pomocą rongeurów Friedmana-Pearsona lub mocnych cienkich kleszczy. Uważaj, aby nie dotknąć DRG (Rysunek 1C).
    UWAGA: Ten krok zajmuje ~ 2 minuty, ale może zająć więcej czasu, jeśli zwierzę krwawi bardziej niż normalnie.
11. Nie należy kontynuować, dopóki krwawienie nie ustanie całkowicie. Zapobiegaj wyciekaniu na powierzchnię DRG za pomocą pianki żelowej lub bawełny. Ten krok trwa 1-4 minuty.
12. Przesuń mysz i podkładkę grzewczą na niestandardową scenę (Rysunek 2A,B). Użyj taśmy scenicznej, aby zabezpieczyć zwierzę i poduszkę grzewczą na miejscu. Umieść nos zwierzęcia w stożku nosowym, aby zwierzę mogło otrzymywać ciągłe znieczulenie izofluranem. Zabezpiecz prawą tylną łapę wystającą poza scenę, aby bodźce można było łatwo zastosować do łapy. Ten krok trwa 3 minuty.
13. Zabezpiecz kręgosłup na miejscu za pomocą stage clamps na skórze kręgów i/lub kości miednicy tylko rostralnie i ogonowo do L5 DRG. Wyreguluj zaciski i stolik, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej równa ( Rysunek 2B, C).
    UWAGA: Może być konieczne przycięcie tkanki leżącej między DRG a obiektywem.
14. Umieść stolik pod mikroskopem tak, aby obiektyw znajdował się 8 mm bezpośrednio nad DRG po opuszczeniu (Rysunek 3A,B). Włóż termometr doodbytniczy.
    UWAGA: Odległość od DRG do obiektywu może się różnić w zależności od obiektywu, mikroskopu i zwierzęcia.
15. Podłącz przewody zasilające do poduszki grzewczej i termometru doodbytniczego. Podłączyć stożek nosowy do przewodów gazowych izofluranu.

Rysunek 1: Przykład operacji ekspozycji DRG. (A) Mały obszar został ogolony, a skóra została odcięta i odwinięta. Nacięcie wynosi ~10 mm na osi rostralno-ogonowej. (B) Wykonano nacięcie po prawej stronie kręgosłupa i odcięto mięśnie i tkankę łączną, odsłaniając wyrostek poprzeczny po prawej stronie L5. Krew została wchłonięta pianką żelową. (C) Wyrostek poprzeczny został oczyszczony, a kość nad DRG została usunięta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Montaż myszy na niestandardowym etapie do obrazowania DRG. (A) Pokazany jest niestandardowy etap. Składa się z płyty podstawy i tabliczki dla zwierzęcia. Płyta montażowa zwierzęcia znajduje się na przegubie obrotowym z kulą blokującą i gniazdem. Stożek nosowy z przewodami do dostarczania mieszaniny tlenu / izofluranu oraz przewód gazów odlotowych wraz z poduszką grzewczą owiniętą folią aluminiową są przyklejone do płyty montażowej zwierzęcia. Dwa ramiona, każde wykonane z trzech blokujących przegubów kulowych i kielichowych, są przykręcone do płyty podstawy. Każde ramię posiada zacisk wykonany z kleszczyków ze śrubą do dokręcania i odkręcania. (B) Zwierzę jest zamontowane na płycie montażowej zwierzęcia. Jego nos jest umieszczony w stożku nosowym. Klamry umieszcza się na skórze, przytrzymując kręgosłup i kość miednicy. Prawa (ipsilateralna) tylna łapa jest przyklejona taśmą, aby zapewnić łatwy dostęp do aplikacji bodźców. (C) Zbliżenie zaciśniętego kręgosłupa i kości miednicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zwierzę na niestandardowym stoliku jest umieszczone poniżej obiektywu mikroskopu. (A) Szeroki kąt widzenia sceny, zwierzęcia i mikroskopu. Po lewej stronie widoczne są przewody do regulatora temperatury prądu stałego oraz przewody do przewodu dolotowego i odlotowego tlenu / izofluranu. (B) Zbliżenie zwierzęcia poniżej obiektywu mikroskopu. DRG znajduje się ~8 mm poniżej celu. Termometr doodbytniczy jest wkładany, a nos znajduje się wewnątrz stożka nosowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Obrazowanie DRG

1. Do obrazowania należy używać pionowego mikroskopu konfokalnego 10x/0,4 DIC i odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Użyj ustawień zielonego filtra (FITC): wzbudzenie 495 nm, emisja 519 nm, długość fali detekcji 500-580 nm, urządzenie do obrazowania GaAsP-Pmt1, detektor GaAsP-PMT.
   UWAGA: W przypadku innych mikroskopów należy stosować ustawienia zalecane przez producenta.
2. Znajdź powierzchnię DRG za pomocą mikroskopu. Wyreguluj clamps na stoliku tak, aby powierzchnia DRG była jak najbardziej płaska, a maksymalna powierzchnia była wizualizowana w płaszczyźnie ogniskowej.
   UWAGA: Wybór obiektywu może się różnić w zależności od używanego mikroskopu i preferencji użytkownika. Wybór oprogramowania zależy od mikroskopu. Poziom DRG zapewnia wyraźniejsze obrazy, pozwala oprogramowaniu tworzyć wyraźniejsze filmy, umożliwia obrazowanie większej liczby neuronów oraz sprawia, że analiza jest łatwiejsza i dokładniejsza.
3. Dostarcz 1%-1,5% izofluranu w przepływie tlenu do stożka nosowego, aby upewnić się, że mysz pozostaje znieczulona. Należy uważnie obserwować zwierzę przez cały czas trwania zabiegu, aby utrzymać znieczulenie izofluranem bez przedawkowania.
   UWAGA: Ilość izofluranu niezbędna do utrzymania znieczulenia może się różnić w zależności od zwierzęcia i bodźca. Zwykle wystarczy 1,5%. Jeśli zwierzę porusza się podczas bodźca, należy zwiększyć dawkę izofluranu. Jeśli oddech staje się płytki, izofluran należy zmniejszyć. Przed każdym bodźcem należy przetestować odruch wycofania kończyny tylnej na przeciwległej tylnej łapie.
   UWAGA: Izofluran może być szkodliwy lub powodować zawroty głowy lub senność w przypadku wdychania. Unikaj inhalacji i używaj tylko w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
4. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu.
   1. Użyj typowych ustawień do szybkiego skanowania: rozmiar woksela 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 pikseli, 10 warstw optycznych Z-stack, 1 jednostka przewiewna (AU)/32 μm, moc lasera 1% 488 nm 5 mW, czas piksela 1,52 μs, czas linii 0,91 ms, czas klatki 465 ms, prędkość skanowania LSM 8, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 650 V, wzmocnienie cyfrowe 1. Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierzęcia.
   2. Aby skonfigurować protokół szybkiego skanowania, kliknij kartę Akwizycja. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Ramki. Kliknij Ustawienia wstępne > 512 x 512, aby ustawić mikroskop tak, aby rejestrował obraz o rozdzielczości 512 x 512 pikseli. To z kolei ustawi wartości X i Y rozmiaru woksela na podstawie rozmiaru obrazu, który jest określany przez oprogramowanie mikroskopu.
   3. W obszarze Parametry pozyskiwania kliknij kartę Kanały. Kliknij pole Ścieżka2. Użyj menu rozwijanego obok pola Ścieżka2, aby wybrać opcję Zielony (FITC). Pod ścieżką 2 otworzy się nowa karta.
   4. Obok opcji Lasery kliknij pole 488. Spowoduje to ustawienie długości fal wzbudzenia i emisji.
   5. Obok suwaka 488 nm ustaw moc lasera na 1%. Kliknij przycisk 1 AU, aby ustawić przysłonę dla 1 jednostki Airy. W obszarze FITC ustaw Master Gain na 650 V, Digital Offset na 0, a Digital Gain na 1.
   6. Na karcie Pozyskiwanie zaznacz pole Z-Stack. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić obraz ganglionu na żywo. Przekręć pokrętło płaszczyzny ogniskowej do góry, aż widoczny będzie tylko mały łuk neuronów.
   7. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Z-Stack > przycisk Ustaw ostatni. Przekręć pokrętło płaszczyzny ogniskowej w dół, aż widoczny będzie tylko mały łuk neuronów. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Z-Stack > przycisk Ustaw pierwszy. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyłączyć obraz na żywo.
   8. W obszarze Parametry pozyskiwania kliknij kartę Z-Stack (Stos z). Wypełnij pole Slices (Wycinki) wartością 10. Spowoduje to ustawienie 10 warstw optycznych i automatyczne określenie głębokości wokseli.
   9. Na karcie Pozyskiwanie kliknij pole Szeregi czasowe. W obszarze Parametry pozyskiwania pojawi się nowa karta Szeregi czasowe. Kliknij kartę Szeregi czasowe > pole Cykle z liczbą cykli, które chcesz wykonać w następnej kolejności. W tym przypadku jest to 8.
   10. Ustaw szybkość i kierunek skanowania. W obszarze Parametry akwizycji karta Tryb akwizycji > > Kierunek > Strzałka z podwójnym grotem do skanowania dwukierunkowego. Wybierz kartę Tryb akwizycji > suwaka prędkości skanowania klatki > > 8.
       UWAGA: Zwykle można załadować ustawienia z poprzedniego eksperymentu i dostosować moc lasera tylko wtedy, gdy obraz jest zbyt jasny lub zbyt ciemny, a następnie dostosować Z-Stack Set Last i Set First.
5. Wykonaj krótki 8-cyklowy skan DRG, klikając przycisk Start Experiment (Rozpocznij eksperyment) w zakładce Acquisition (Akwizycja). Utwórz film, wykonując ortogonalną projekcję skanów (jeden skan na klatkę) w czasie i ręcznie sprawdź klarowność obrazu i artefakty obrazowania, takie jak "fale" jasności przecinające DRG. Dostosuj pozycję zacisku i grubość przekroju optycznego i powtarzaj ten krok, aż do uzyskania wyraźnego filmu o wysokiej jakości.
   UWAGA: Ten krok należy powtórzyć, jeśli zwierzę porusza się lub jest przenoszone przez badacza. Problemy, na które należy zwrócić uwagę, obejmują obszary ganglionu (nie tylko pojedyncze neurony), które wydają się stawać jaśniejsze i ciemniejsze w trakcie eksperymentu, tworząc falisty wygląd lub powodując, że obszary znikają lub stają się jaśniejsze. Ruch większy niż około połowy średnicy małego neuronu (<20 μm) jest kolejnym poważnym problemem. Falistość można często naprawić, zbliżając do siebie pierwszą i ostatnią pozycję stosu Z (patrz krok 2.4.4 powyżej) i zmniejszając grubość warstwy optycznej. Film 1 przedstawia przykład falistych zwojów przed wyrównaniem i ustawieniem prawidłowej grubości warstwy optycznej. Film 2 jest po korekcie poziomowania i grubości warstwy optycznej. Różnica jest subtelna, ale ma ogromny wpływ na analizę.
6. Załaduj protokół skanowania w wysokiej rozdzielczości mikroskopu.
   1. Użyj typowych ustawień do skanowania w wysokiej rozdzielczości: rozmiar woksela 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 pikseli, 6 warstw optycznych Z-stack, 1,2 jednostki przewiewnej (AU)/39 μm, 5% mocy lasera 488 nm/25 mW, czas piksela 2,06 μs, czas linii 4,95 ms, czas klatek 5,06 s, Prędkość skanowania LSM 6, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 650 V, wzmocnienie cyfrowe 1. Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierzęcia.
   2. Aby skonfigurować protokół skanowania w wysokiej rozdzielczości, kliknij kartę Akwizycja. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Ramki. Kliknij Ustawienia wstępne > 1024 x 1024, aby ustawić mikroskop tak, aby rejestrował obraz o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. To z kolei ustawi wartości X i Y rozmiaru woksela na podstawie rozmiaru obrazu, który jest określany przez oprogramowanie mikroskopu.
   3. W obszarze Parametry pozyskiwania kliknij kartę Kanały. Kliknij pole Ścieżka2. Użyj menu rozwijanego obok pola Ścieżka2, aby wybrać opcję Zielony (FITC). Pod ścieżką 2 otworzy się nowa karta.
   4. Obok opcji Lasery kliknij pole 488. Spowoduje to ustawienie długości fal wzbudzenia i emisji. Kliknij pole Zasięg lasera o wysokiej intensywności.
   5. Obok suwaka 488 nm ustaw moc lasera na 5%. Kliknij przycisk 1 AU, aby ustawić przysłonę dla 1 jednostki Airy. W ramach FITC ustaw wzmocnienie główne na 650 V, przesunięcie cyfrowe na 0, a wzmocnienie cyfrowe na 1.
   6. Na karcie Pozyskiwanie zaznacz pole Z-Stack. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić obraz ganglionu na żywo. Przekręć pokrętło płaszczyzny ogniskowej do góry, aż widoczny będzie tylko mały łuk neuronów.
   7. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Z-Stack > przycisk Ustaw ostatni. Przekręć pokrętło płaszczyzny ogniskowej w dół, aż widoczny będzie tylko mały łuk neuronów. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Z-Stack > przycisk Ustaw pierwszy. Kliknij przycisk Na żywo, aby wyłączyć obraz na żywo.
   8. W obszarze Parametry pozyskiwania kliknij kartę Z-Stack. Wypełnij pole Slices wartością 6. Spowoduje to ustawienie 6 warstw optycznych i automatyczne określenie głębokości wokseli.
   9. Na karcie Pozyskiwanie upewnij się, że pole Szeregi czasowe nie jest zaznaczone (brak szeregów czasowych).
   10. Ustaw szybkość i kierunek skanowania. W obszarze Parametry akwizycji kliknij kartę Tryb akwizycji > Frame > Presets > 1024 x 1024. Wybierz kartę Tryb akwizycji > Kierunek > ramki > strzałkę z podwójnym grotem, aby skanować dwukierunkowo. Wybierz kartę Tryb akwizycji > suwaka Szybkość skanowania klatki > > 6.
   11. Jeśli komórki są oznaczone td-Tomato, ustaw mikroskop tak, aby skanował czerwony kanał 592 nm wzbudzenie / emisja 614 nm, długość fali wykrywania 600-700 nm oprócz zielonego kanału. Ustaw to, przechodząc do Parametrów pozyskiwania i kliknij kartę Kanały > polu Ścieżka1. Użyj menu rozwijanego obok pola Ścieżka1, aby wybrać opcję Czerwony (Texas Red). Postępuj zgodnie z tym samym procesem, co w kroku 2.6.3, z wyjątkiem kliknięcia pola 561 zamiast pola 488. Ustaw moc lasera na 1%. Td-Tomato jest znacznie jaśniejszy niż GCaMP3 i wymaga mniejszej mocy lasera.
7. Utwórz obraz DRG w wysokiej rozdzielczości, klikając przycisk Rozpocznij eksperyment w zakładce Akwizycja.
8. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu (patrz krok 2.4). Rejestruj spontaniczną aktywność w DRG przez 80 cykli (około 10 minut). Wygeneruj film z projekcją ortogonalną i sprawdź, czy obraz jest wystarczającej jakości do analizy.
   UWAGA: Kwestie związane z jakością są takie same jak w kroku 2.5.
9. Aby zastosować bodźce, ustaw mikroskop na wykonanie 15-20 skanów. Poczekaj na zakończenie skanów 1-5, aby utworzyć linię bazową. Zastosuj bodziec podczas skanów 6-10. Odczekaj co najmniej 5 minut po każdym bodźcu przed zastosowaniem następnego bodźca, aby zapobiec odczulaniu.
   UWAGA: W pierwszej kolejności należy zastosować bodźce mechaniczne, a następnie bodźce zimne, termiczne i chemiczne. Słabsze bodźce (np. mała siła mechaniczna, temperatury bliższe temperaturze pokojowej) powinny być stosowane przed silniejszymi bodźcami (np. większa siła mechaniczna, temperatury dalej od temperatury pokojowej). Podczas stosowania bodźców należy uważać, aby nie powodować żadnego ruchu DRG. Szczególnie w przypadku silnych bodźców termicznych często konieczne jest zastosowanie 2% izofluranu przez 1-2 minuty przed rozpoczęciem bodźca. Na mikroskopie użytym w tym badaniu każdy skan może być wyraźnie słyszalny, dzięki czemu badacz może łatwo zidentyfikować koniec skanu, co pozwala na zastosowanie bodźca natychmiast po skanie 5. Jednak każda metoda, która ułatwia aplikację bodźców w stałym punkcie czasowym, będzie działać.
10. W przypadku prasy mechanicznej przytrzymaj szczypiec algometru łapą między łopatkami, nie dotykając łapy, i ściskaj, zaczynając natychmiast po zakończeniu skanowania 5 i zatrzymując natychmiast po skanie 10. Monitoruj siłę nacisku za pomocą algometru (patrz tabela materiałów). Utrzymuj siłę nacisku jak najbliżej pożądanej siły (tutaj używamy bodźca dociskającego 100 g) i upewnij się, że nie przekracza 10 g powyżej żądanej siły.
    UWAGA: Bodźce można wykryć już przy użyciu włókien von Freya o wadze zaledwie 0,07 g i sile nacisku aż 600 g.
11. W przypadku bodźców zimnych i termicznych ostudź lub podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco poniżej (w przypadku zimna) lub powyżej (w przypadku termicznej) żądanej temperatury i rozpocznij skanowanie. W tym przypadku użyj bodźca o temperaturze 45 °C. Gdy woda osiągnie odpowiednią temperaturę, zastosuj bodziec natychmiast po skanowaniu 5, zanurzając łapę w wodzie. Wyciągnij zlewkę natychmiast po zeskanowaniu 10.
    UWAGA: Temperatura powinna mieścić się w granicach 1 °C od żądanej temperatury na skanie 5. Jeśli temperatura zlewki jest nieprawidłowa, nie stosuj bodźca, ponieważ może to znieczulić neurony. Zamiast tego ponownie schłodzić lub podgrzać wodę i spróbować ponownie. Zmierzyliśmy temperatury od 0 °C (woda lodowata) do 95 °C. Pamiętaj jednak, że temperatury powyżej 50 °C mogą uszkodzić tkanki i zakłócić późniejsze eksperymenty. Podobnie, niektóre substancje chemiczne (np. tetrodotoksyna, kapsaicyna) są nieodwracalne lub nie mogą być wypłukane i mogą uniemożliwić dalsze eksperymenty na zwierzęciu.
12. Po zastosowaniu i zarejestrowaniu wszystkich bodźców, należy poddać zwierzę eutanazji poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny (200 mg/kg ketaminy, 30 mg/kg ksylazyny lub 5 μl na gram masy ciała roztworu przygotowanego w kroku 1.1), a następnie ścięcie.

3. Analiza danych

1. Otwórz pliki obrazów, przeciągając i upuszczając do ImageJ. Po otwarciu pliku wybierz typ obrazu w obszarze Typ > obrazu > RGB color.
   UWAGA: Wtyczka StackReg²¹ w sekcji Plugins > StackReg jest przydatna do korygowania i wyrównywania artefaktów ruchu. ImageJ może odczytywać większość formatów plików oprogramowania mikroskopowego. Wybór typu obrazu zależy od preferencji użytkownika. RGB upraszcza tworzenie kolorowych obrazów do publikacji. Pakiety oprogramowania od producenta mikroskopu lub cytoNet²² mogą również pomóc w analizie. Nie jest konieczne pobieranie, instalowanie i używanie StackReg, ale jest to zalecane.
2. Użyj narzędzia obszaru zainteresowania (ROI), aby wybrać aktywne neurony w obszarze Analizuj > Narzędzie > Menedżer zwrotu z inwestycji. Narysuj ROI za pomocą narzędzi elipsy lub prostokąta na pasku narzędzi i umieść je w pliku ROI, naciskając przycisk Dodaj w obszarze Dodaj w oknie menedżera ROI lub naciskając "t".
   UWAGA: Pamiętaj, aby często zapisywać plik ROI. Użytkownicy zawsze mogą przywrócić ROI, przeciągając i upuszczając plik ROI do ImageJ i klikając pole Pokaż wszystko u dołu okna Menedżera ROI. Zapisywanie jako nakładki nie jest zalecane. Z doświadczenia wynika, że zapisywanie jako plik ROI.zip upraszcza analizę.
3. Upewnij się, że w obszarze Analizuj > ustaw pomiary jest zaznaczona opcja średniej wartości szarości; odznacz wszystkie inne pola w obszarze Ustaw miary. Użyj narzędzia do pomiaru wielu miar w menu menedżera ROI, aby obliczyć intensywność w ramach ROIs. Zmierz intensywność za pomocą okna ROI w obszarze Więcej > Multimeasure.
   UWAGA: Czasami sąsiednie neurony będą zbyt blisko siebie, aby uzyskać oddzielne ROI. Neurony te nie mogą być używane do pomiaru intensywności przejściowej, ale mogą być uwzględnione w liczbie neuronów aktywujących.
4. Zapisz plik CSV wygenerowany przez funkcję Multimeasure i otwórz plik CSV za pomocą dowolnego arkusza kalkulacyjnego.
   UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładowym szablonem arkusza kalkulacyjnego ułatwiającym analizę.
5. Obliczać Ca²⁺ intensywność przejściowa jako ΔF / F₀ = (F_t- F₀) / F₀, gdzie F_t to intensywność pikseli w ROI w punkcie zainteresowania w czasie, a F₀ to intensywność bazowa określona przez uśrednienie intensywności 2-4 klatek przed stanem przejściowym Ca²⁺ dla spontanicznej aktywności lub pierwszych 1-5 klatek ROI dla Ca²⁺ stany przejściowe występujące podczas stymulacji. Wyklucz wszystkie neurony wytwarzające piki Ca²⁺ przed bodźcem i nie analizuj aktywności po zakończeniu bodźca.
6. W przypadku analizy intensywności przejściowej Ca²⁺ losowo pobieraj próbki w przybliżeniu równej liczby neuronów z każdego zwoju, aby uniknąć zniekształcania danych w kierunku zwojów, które wytworzyły największą liczbę reagujących neuronów. Z wyłączeniem pików, w których ΔF / F₀ < 0,15,
   UWAGA: Istnieją alternatywne opublikowane metody analizy i włączania/wykluczania neuronów^{11,12,23,24,25,26,27,28}.
7. Zmierz średnice neuronów za pomocą narzędzia linii na pasku narzędzi w ImageJ. Oblicz średnią średnicę z linii narysowanych wzdłuż najdłuższej i najkrótszej średnicy.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy zwojów korzenia grzbietowego L5 myszy Pirt-GCaMP3. (A,D) Pokazane są pojedyncze skany w wysokiej rozdzielczości zwojów korzenia grzbietowego L5 myszy Pirt-GCaMP3. (B,E). Projekcje średniej intensywności 15 klatek zwojów Pirt-GCaMP3 L5 DRG odpowiednio z panelu A i panelu D, przy braku bodźców. Niektóre neurony, które wytworzyły spontaniczne stany przejściowe Ca2+, są wywoływane żółtymi strzałkami. (C) Projekcja średniej intensywności dwóch klatek przed bodźcem i wszystkich pięciu klatek bodźca ganglionu Pirt-GCaMP3 z panelu A podczas 100 g wyciskania tylnej łapy. Niektóre neurony, które wytworzyły stany przejściowe Ca2+ podczas bodźca, są wywoływane żółtymi strzałkami. (F-I) Projekcje średniej intensywności klatek 4 i 5 (przed bodźcem) (panele A i D) oraz ramek 6-9 (podczas bodźca wyciskającego 100 g) ganglionu z panelu D z ramkami 4-6, ramką 4 + 5 + 7, ramkami 4 + 5 + 8 i ramkami 4 + 5 + 9 wyciskania tylnej łapy o wadze 100 g. (J) Ślady intensywności fluorescencji trzech spontanicznie aktywnych neuronów z panelu B () odpowiadający zwojowi panelu A i panelu E (czerwony) odpowiadającego zwojowi panelu D. Ślad każdego neuronu jest znormalizowany do jego mediany intensywności (pokazanej przez linię w Y = 0). (K) ΔF / F0 ślady trzech neuronów aktywujących się w odpowiedzi na naciśnięcie 100 g z panelu C () odpowiadający zwojowi panelu A i paneli F-I (czerwony) odpowiadający zwojowi panelu D. Zwróć uwagę, że osie X i Y są inne niż w panelu J. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie dużej liczby neuronów za pomocą skanowania konfokalnego Pirt-GCaMP L5 DRG
Chirurgiczna ekspozycja L5 DRG, a następnie mikroskopia konfokalna pozwoliła na jednoczesne zobrazowanie do 1800 neuronów przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 (Ryc. 4). Stwarza to potężną zaletę polegającą na możliwości jednoczesnej obserwacji tysięcy pierwotnych neuronów czuciowych w zespole na poziomie populacji w ich normalnym kontekście fizjologicznym, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i nienormalnych. Można monitorować spontaniczne stany przejściowe Ca2+ przy braku bodźców (Rysunek 4B, E i Film 2) oraz stany przejściowe Ca2+ w odpowiedzi na bodźce (Rysunek 4C, F-I, Film 3 i Film 4). Średnice neuronów aktywujących są silnie skorelowane z różnymi grupami włókien nerwowych.

Rysunek 5: Zwiększenie intensywności bodźców wzmacnia reakcje Ca2+ w zwojach myszy Pirt-GCaMP3. (A) Pokazano wykresy liczby neuronów w zwojach L5 DRG pokazujących stany przejściowe Ca2+ w odpowiedzi na bodźce o dwóch różnych intensywnościach ucisku: 100 g, n = 8 zwojów; 300 g, n = 5. (B) Pokazano wykresy obszarów ΔF / F0 pod krzywą próbek stanów nieustalonych Ca2+ z dwóch różnych intensywności nacisku: 100 g, n = 88 neuronów; 300 g, n = 104. (C) Wykresy śladów ΔF / F0 bodźców prasowych 100 g i 300 g. Ślad barwy czerwonej oznacza średnią ΔF / F0; 100 g, n = 60 neuronów; 300 g, n = 57 neuronów. (D) Przedstawiono wykresy liczby neuronów w zwojach L5 DRG pokazujące stany przejściowe Ca2+ w odpowiedzi na trzy różne nieszkodliwe i jedną szkodliwą temperaturę: 21 °C, n = 4 zwoje; 10 °C, n = 6; 45 °C, n = 7; 57 °C, n = 3. (E) Pokazano wykresy obszarów ΔF / F0 pod krzywą próbek stanów przejściowych Ca2+ z trzech różnych intensywności nieszkodliwych i jednego szkodliwego bodźca temperaturowego: 21 °C, n = 40 neuronów; 10 °C, n = 60; 45 °C, n = 61; 57 °C, n = 118. (F) Wykresy śladów ΔF / F0 bodźców o temperaturze 10 °C i 57 °C. Ślad barwy czerwonej oznacza średnią ΔF / F0; 10 °C, n = 60 neuronów; 57 °C, n = 118. (G) Wykres procentowy neuronów o różnych średnicach (<20 μm, 20-25 μm, >25 μm) wytwarzających stany przejściowe Ca2+ spontanicznie oraz za pomocą bodźców termicznych i mechanicznych. Aktywność spontaniczna (Spon), n = 5 zwojów; 45 °C, n = 3; 300 g, n = 3. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Wykresy słupkowe pokazują średnie i SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Liczba komórek wytwarzających Ca2+ stany przejściowe i Ca2+ obszar przejściowy pod krzywą (AUC) w obecności bodźców
Silne bodźce lub szkodliwe ciepło zwiększały odpowiedzi Ca2+. W porównaniu z uciskaniem z użyciem 100 g, pressing z naciskiem 300 g zwiększył liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe Ca2+ (Rysunek 5A, test t-Studenta: t = 2,398, df = 11, p = 0,0354) i obszar ΔF / F0 pod krzywą stanów przejściowych Ca2+ (Rysunek 5B, t Welcha-test: t = 3,243, df = 187,4, p = 0,0014). Podobnie, ciepłe ciepło w nieszkodliwym zakresie temperatur (21 °C i 45 °C) zwiększyło liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe Ca2+ (Rysunek 5C, jednokierunkowa ANOVA F2,14 = 4,853, p = 0,0251, a następnie q Tukeya = 4,380, df = 14, p = 0,0202) i obszar ΔF / F0 pod krzywą stanów nieustalonych Ca2+ (Rysunek 5D, ANOVA Browna-Forsythe'a F2 151,6 = 60,76, p = 0,0029, a następnie test t Welcha: t = 3,333, df = 96,72, p = 0,0036). W porównaniu ze szkodliwym bodźcem cieplnym (57 °C), nieszkodliwe temperatury (21 °C, 10 °C i 45 °C) aktywowały mniejszą liczbę neuronów wytwarzających stany przejściowe Ca2+ (Rysunek 5E, jednokierunkowa ANOVA F2,16 = 2,513, p < 0,001, test Dunnetta, 21°C: q = 9,594, df = 16, p < 0,001; 10 °C: q = 9,583, df = 16, p < 0,001; 45 °C: q = 9,160, df = 16, p < 0,001) i obszar ΔF / F0 pod krzywą stanów nieustalonych Ca2+ w temperaturze 21 °C i 10 °C (Rysunek 5D, ANOVA Browna-Forsythe'a F3,268,4 = 12,98, p < 0,001, test T3 Dunnetta, 21 °C: t = 5,415, df = 128, p < 0,001; 10 °C: t = 4,398, df = 174,5, p < 0,001; 45 °C: t = 2,079, df = 161,9, p = 0,1127). W tym eksperymencie neurony o mniejszej i średniej średnicy wytwarzały stany przejściowe Ca2+ spontanicznie i pod wpływem wszystkich bodźców, ale neurony o większej średnicy wytwarzały tylko stany przejściowe Ca2+ w odpowiedzi na bodziec prasowy o sile 300 g (Rysunek 5G).

Oznaczanie neuronów wyrażających specyficzne receptory za pomocą td-Tomato u myszy Pirt-GCaMP3
Indukowany przez cre reporter td-Tomato można zaobserwować podczas obrazowania Pirt-GCaMP3. Pirt-GCaMP3, myszy td-Tomato, które wykazywały ekspresję Cre pod kontrolą promotora TrpV1, wykazały szerokozakresowe, ale nie uniwersalne znakowanie pierwotnych neuronów czuciowych (Figura 6A,B). Spontaniczne stany przejściowe Ca2 + zaobserwowano zarówno w neuronach znakowanych td-pomidorem, jak i w neuronach, które nie są znakowane (Figura 6C). Szkodliwe ciepło nie zostało przetestowane w tym eksperymencie, ale zostanie przetestowane w przyszłych eksperymentach.

Rysunek 6: Znakowanie neuronów TrpV1-dodatnich za pomocą td-Tomato u myszy Pirt-GCaMP3. (A) Projekcja maksymalnej intensywności spontanicznej aktywności pierwotnych neuronów czuciowych myszy TrpV1-Cre, td-Tomato, Pirt-GCaMP3 zobrazowana tylko na kanale 495 nm wzbudzenia/emisji 519 nm (FITC, zielony). Niektóre neurony wytwarzające stany przejściowe Ca2+ są wywoływane żółtymi strzałkami (nie oznaczonymi td-Tomato) lub czerwonymi strzałkami (oznaczonymi td-Tomato). (B) Projekcja średniej intensywności tych samych pierwszorzędowych neuronów czuciowych co panel A tylko na czerwonym kanale wzbudzenia 592 nm/emisji 614 nm. (C) Pokazana jest projekcja maksymalnej intensywności jednoczesnych kanałów czerwonych i zielonych tych samych pierwotnych neuronów czuciowych, co w panelu A. Niektóre neurony wyrażające GCaMP3, ale nie td-Tomato, są wywoływane żółtymi strzałkami. Białe strzałki wskazują GCaMP dodatni bez stanów nieustalonych Ca2+ i nie dodatni td-Tomato. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Spontaniczna aktywność ganglionu Pirt-GCaMP3, który nie został odpowiednio wyrównany lub zoptymalizowany pod kątem grubości warstwy optycznej, powodując falistość. 70 klatek na sekundę AVI. Grubość warstwy optycznej = 16 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Spontaniczna aktywność tego samego ganglionu z filmu 1, który został odpowiednio wyrównany i zoptymalizowany pod kątem grubości warstwy optycznej z mniejszą falistością. 70 klatek na sekundę AVI. Grubość warstwy optycznej = 13 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: 100 g wyciskanie tylnej łapy ganglionu Pirt-GCaMP3. 3 klatki na sekundę AVI. Bodziec zastosowano w klatkach 6-10. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 4: 45 °C bodziec termiczny do tylnej łapy ganglionu Pirt-GCaMP3. 3 klatki na sekundę AVI. Bodziec zastosowano w klatkach 6-10. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy arkusz kalkulacyjny analizy Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.