Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64829

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University, 2Department of Biomedical Engineering, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokoły wysokoprzepustowej produkcji mikrożelu żelowego z żelatyny metakryloylowej za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, przekształcania mikrożeli w proszek do resuspensable (mikroaerożele), chemicznego łączenia mikrożeli w celu utworzenia granulowanych rusztowań hydrożelowych oraz opracowywania granulowanych biotuszy hydrożelowych o zachowanej mikroporowatości do biodruku 3D.

Streszczenie

Pojawienie się granulowanych rusztowań hydrożelowych (GHS), wytwarzanych za pomocą montażu mikrocząsteczek hydrożelu (HMP), umożliwiło tworzenie mikroporowatych rusztowań in situ. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hydrożeli luzem, połączone ze sobą pory w mikroskali w GHS ułatwiają niezależną od degradacji infiltrację komórek, a także transfer tlenu, składników odżywczych i komórkowych produktów ubocznych. Żelatyna modyfikowana metakryloilem (GelMA), (foto)chemicznie sieciowany biopolimer na bazie białek zawierający klej komórkowy i biodegradowalne ugrupowania, jest szeroko stosowany jako biomateriał reagujący na komórki/instruktażowy. Konwersja masowego GelMA do GHS może otworzyć mnóstwo możliwości w zakresie inżynierii tkankowej i regeneracji. W tym artykule przedstawiamy procedury wysokoprzepustowego wytwarzania mikrożeli GelMA, konwersji do suchych mikrożeli wielokrotnego użytku (mikroaerożeli), tworzenia GHS poprzez chemiczne składanie mikrożeli oraz wytwarzania granulowanego biotuszu do biodruku przez wytłaczanie. Pokazujemy, w jaki sposób sekwencyjna obróbka fizykochemiczna poprzez chłodzenie i fotosieciowanie umożliwia tworzenie mechanicznie wytrzymałego GHS. Gdy światło jest niedostępne (np. podczas głębokiej iniekcji tkankowej), indywidualnie usieciowane HMP GelMA mogą być bioortogonalnie składane poprzez sieciowanie enzymatyczne przy użyciu transglutamin. Wreszcie, trójwymiarowy (3D) biodruk mikroporowatego GHS przy niskiej gęstości upakowania HMP został zademonstrowany poprzez międzyfazową samoorganizację heterogenicznie naładowanych nanocząstek.

Wprowadzenie

Składanie bloków HMP do tworzenia rusztowań inżynierii tkankowej zyskało ogromne zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat1. GHS, wytwarzane za pomocą montażu HMP, mają unikalne właściwości w porównaniu z ich masowymi odpowiednikami, w tym mikroporowatość w skali komórkowej pochodzącą z pustych przestrzeni między dyskretnymi blokami budulcowymi. Dodatkowe właściwości, takie jak wstrzykiwalność, modułowość i oddzielenie sztywności od porowatości, sprawiają, że GHS jest obiecującą platformą usprawniającą naprawę i regenerację tkanek2. Do produkcji GHS wykorzystano różne biomateriały, w tym syntetyczne polimery na bazie PEG3,4 oraz polisacharydy, takie jak alginian5 i kwas hialuronowy6,7. Wśród polimerów pochodzenia naturalnego najpowszechniejszym biopolimerem na bazie białek do produkcji GHS jest GelMA8,9,10,11, sieciowany, biokompatybilny, bioadhezyjny i biodegradowalny biomateriał12,13.

HMP mogą być wytwarzane za pomocą emulgacji wsadowej8, flow-focusing14,15 lub step-emulsification9,11 urządzenia mikroprzepływowe, blending16, lub złożone koacerwacja17,18. Zwykle istnieje kompromis między przepustowością produkcji a monodyspersyjnością HMP. Na przykład, technika mieszania daje HMP o nieregularnych kształtach i silnie polidyspersyjnych. Emulgacja wsadowa lub złożona koacerwacja umożliwia wytwarzanie dużych ilości polirozproszonych sferycznych HMP. Urządzenia mikroprzepływowe skupiające przepływ zostały wykorzystane do wytwarzania wysoce monorozproszonych kropel o współczynniku zmienności <5%, jednak przepustowość jest znacznie niska. W urządzeniach mikroprzepływowych emulgujących krokowo, wysoce zrównoleglone kroki umożliwiają wysokowydajne wytwarzanie monorozproszonych HMPs19.

Bloki budulcowe HMP z żelatyny modyfikowanej metakryloylem (GelMA) są termoresponsywne i (foto)chemicznie sieciowalne, co umożliwia łatwą produkcję GHS20. Po schłodzeniu poniżej górnej temperatury roztworu krytycznego (UCST)21 (np. w temperaturze 4 °C), kropelki zawierające roztwór GelMA są przekształcane w fizycznie usieciowane HMP. Te bloki budulcowe HMP są następnie pakowane przy użyciu sił zewnętrznych (np. poprzez wirowanie) w celu uzyskania zakleszczonych zawiesin mikrożelu. Wiązania międzycząsteczkowe są ustanawiane między sąsiednimi HMP poprzez (foto)chemiczne sieciowanie, tworząc mechanicznie wytrzymały GHS14. Jedną z najważniejszych właściwości GHS jest mikroporowatość, umożliwiająca łatwą penetrację komórek in vitro11 i zwiększone wrastanie tkanek in vivo22. Trójwymiarowe (3D) biodrukowanie HMP jest konwencjonalnie wykonywane przy użyciu ciasno upakowanych zawiesin mikrożelowych, co pogarsza mikroporowatość23.

Niedawno opracowaliśmy nową klasę granulowanych biotuszy opartych na międzyfazowej nanoinżynierii mikrożeli GelMA poprzez adsorpcję heterogenicznie naładowanych nanocząstek, a następnie odwracalną samoorganizację nanocząstek. Ta strategia sprawia, że luźno upakowane mikrożele uzyskujące ścinanie i wytłaczanie 3D są biodrukowalne w mikroskali, co zachowuje porowatość w mikroskali wytwarzanych addytywnie GHS11. W artykule przedstawiono metody wysokoprzepustowego wytwarzania kropelek GelMA, przekształcania tych kropelek w fizycznie usieciowane HMP, wytwarzania GelMA HMP przy użyciu proszku wielokrotnego zawieszania, tworzenia GelMA GHS, przygotowania nanoinżynieryjnego granulowanego biotuszu GelMA (NGB) oraz biodruku 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, instrumentów i odczynników użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Synteza GelMA

UWAGA: Syntezę GelMA należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, przez cały czas używając odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).

  1. Do kolby Erlenmeyera wlać 200 ml fosforanowego buforu solnego Dulbecco (DPBS, 1x) i podgrzewać roztwór, aż osiągnie 50 °CPrzykryć kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
  2. Do roztworu DPBS dodać 20 g żelatyny w proszku w temperaturze 50 °C przy mieszaniu z prędkością 240 obr./min do całkowitego rozpuszczenia proszku.
  3. Do roztworu żelatyny dodawaj kroplami 16, 2,5 lub 0,5 ml bezwodnika metakrylowego (MA) poprzez szklaną pipetę Pasteura w celu syntezy GelMA z odpowiednio wysokim, średnim lub niskim stopniem podstawienia metakryloylowego.
    UWAGA: MA jest substancją niebezpieczną. Podczas pracy z MA należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej. MA jest również światłoczułe, dlatego należy chronić reakcję przed światłem, owijając kolbę folią aluminiową.
  4. Po 2 h dodać 400 mL DPBS w 50 °C aby zatrzymać reakcję. Kontynuować mieszanie przy 50 °C przez 10 min.
  5. Przelej roztwór do rurki z membrany dializacyjnej o progu odcięcia masy cząsteczkowej 12–14 kDa, a następnie umieść rurkę w zlewce o pojemności 5 l wypełnionej 40 °C wodę ultrazczystą. Mieszać wodę z prędkością 240 obr./min i 40 °C.
  6. Dializować roztwór przeciwko wodzie ultrapurej przez 10 dni, wymieniając wodę 2 razy dziennie, w celu usunięcia nieprzereagowanego bezwodnika metakrylowego, produktów ubocznych oraz innych zanieczyszczeń.
  7. Po 10 dniach dodać 400 ml wody ultrapurej w temperaturze 40 °C do roztworu GelMA. Mieszać roztwór z prędkością 240 obr./min przez 15 min.
  8. Przefiltrować roztwór dwukrotnie za pomocą filtrów do kawy, a następnie przeprowadzić filtrację próżniową poprzez a 0.2 µm układ filtracji próżniowej
  9. Przenieś 25 ml przefiltrowanego roztworu do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zamroź je w temperaturze -80 °Cukładając probówki poziomo.
  10. Po 2 dniach należy zdjąć nakrętki i przykryć probówki do wirowania chłonnymi ręcznikami laboratoryjnymi. Użyć taśmy lub gumki recepturki, aby mocno przymocować ręczniki.
  11. Liofilizować zamrożony roztwór GelMA, aby otrzymać biały stały GelMA.
  12. Aby przeprowadzić protonowy magnetyczny rezonans jądrowy (1spektroskopii H NMR) oddzielnie dodaj 30 mg proszku żelatyny (kontrola) lub liofilizowanego GelMA do 1 ml tlenku deuteru (D2O)2O) i przechowywać próbki w temperaturze 37 °C do momentu całkowitego rozpuszczenia żelatyny w proszku lub GelMA.
  13. Uzyskać 1widma H NMR i określ stopień podstawienia metakryloilo poprzez całkowanie piku protonów kwasów aromatycznych oraz piku protonów metylenowych lizyny przy przesunięciach chemicznych odpowiednio ok. 6,5–7,5 i ok. 3,0 ppm. Użyj piku kwasów aromatycznych jako referencji i wyznacz stopień podstawienia (DS), korzystając z pików metylenowych lizyny na podstawie równania (1):
    DS (%) = [1 - (Pole powierzchni grup metylenowych lizyny w GelMA / Pole powierzchni grup metylenowych lizyny w żelatynie)] × 1001)

Synteza GelMA, równania i wyniki ¹H NMR żelatyny/GelMA; schemat przesunięcia chemicznego do analizy.
Rycina 1: Synteza i charakterystyka GelMA. (A) Reakcja syntezy GelMA. Żelatyna jest modyfikowana bezwodnikiem metakrylowym w temperaturze 50 °C przez 2 h. (B) Widma protonowego rezonansu magnetycznego (1H NMR) żelatyny i GelMA: (a) piki kwasów aromatycznych, wybrany jako punkt odniesienia do kalibracji, (b) piki grup funkcyjnych winylowych po modyfikacji MA żelatyny oraz (c) piki białek lizyny. W tym przykładzie stopień podstawienia MA wyniósł 71% ± 3% (n = 3). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Ataie et al.11 Skróty: GelMA = żelatyna metakryloylan; DPBS = bufor fosforanowy Dulbecco; MA = metakryloylan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Wysokoprzepustowe wytwarzanie mikrogeli GelMA

  1. Mikrofabrykacja formy matki urządzenia
    UWAGA: Formy matrycowe mogą zostać wykonane metodą mikrofabrykacji poprzez miękka litografia z wykorzystaniem serii negatywowych fotorezystów KMPR 100019.
    1. Rozmrozić KMPR 1025 i 1035 przez noc. Unikać ekspozycji na światło.
    2. Aby nałożyć pierwszą warstwę na podłoże krzemowe, nanieś KMPR 1025 bezpośrednio na środek podłoża, tworząc okrąg z fotorezystu o średnicy około 5 cm. Uruchom powlekarkę rotacyjną z prędkością 3000 obr./min przez 30 s.
    3. Wstępne wygrzewanie (soft bake) przez 12 min na 100 °C na płycie grzejnej. Następnie chłodzić na płycie chłodzącej przez 5 min.
    4. Przymocuj maskę pierwszej warstwy do czystego szkła sodowego, a następnie naświetl powleczony wafelek światłem UV za pomocą alignera masek z dawką 645 mJ/cm²2 dawkowania.
    5. Wypiekaj przez kolejne 3 min w 100 °C płyta grzewcza. Schładzać na płycie chłodzącej przez 5 min.
      UWAGA: Nie wywoływać po tym kroku. Wywołać tylko raz na koniec procesu.
    6. Nanieś drugą warstwę KMPR 1035 na wafer metodą spin coatingu. Uruchom powlekarkę rotacyjną z prędkością 1000 obr./min przez 30 s.
    7. Wstępne wygrzewanie (soft bake) przez 30 min na 100 °C płyta grzejna. Chłodzić na płycie chłodzącej przez 5 min.
    8. Przymocuj maskę drugiej warstwy do czystego szkła sodowego i wyrównaj drugą maskę za pomocą wyrównywacza, korzystając ze standardowych znaczników wyrównawczych. Naświetl próbkę światłem UV za pomocą wyrównywacza masek z dawką do 2000 mJ/cm²2.
    9. Wygrzewaj przez 5 min w 100 °C płyta grzejna
    10. Opracować dla >6 min w wywoływaczu do SU-8.
      UWAGA: Jeśli wafelek ma mętny wygląd, proces wywoływania należy kontynuować przez dłuższy czas. Aby uzyskać lepszy rezultat, należy za każdym razem oraz w przerwach stosować świeży wywoływacz.
    11. Spryskaj izopropanolem. Upewnij się, że wafelek jest czysty i nie posiada mlecznych osadów. Dokładnie wysusz wafelek za pomocą azotu (N2gaz.
  2. Wytwarzanie urządzeń mikrofluidycznych
    1. Wlej 50 g bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) do przezroczystego plastikowego kubka. Następnie dodaj do kubka 5 g utwardzacza. Mieszaj intensywnie bazę z utwardzaczem za pomocą szpatułki, aż do uzyskania kremowej konsystencji.
    2. Odgazuj mieszaninę próżniowo w eksykatorze przez 20 min, aż stanie się przejrzysta. Wlej mieszaninę na formę główną, która została umieszczona w szalce Petriego i przymocowana do niej taśmą.
      UWAGA: Należy upewnić się, że grubość (wysokość) wlanego PDMS wynosi ≤8 mm.
    3. Umieść szalkę Petriego w eksykatore i ponownie odgazuj próżniowo mieszaninę PDMS przez 20 min, aż do usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Umieść szalkę Petriego w 70 °C do piekarnika na 2 h, aż PDMS ulegnie sieciowaniu. Wyjąć szalkę Petriego z piekarnika i pozostawić do ostygnięcia.
    4. Wyciąć urządzenia z formy za pomocą skalpela. Powoli odczepić urządzenia od formy matki. Użyć wycinaka do biopsji (o średnicy 1,5 mm), aby wyciąć otwory w wlotach i wylocie.
    5. Usuń wszelki kurz z urządzeń PDMS oraz szkiełek przedmiotowych za pomocą taśmy maskującej, a następnie umieść szkiełka i urządzenia w komorze urządzenia do oczyszczania plazmowego. Przeprowadź obróbkę plazmową przez 45 s (licząc od momentu, gdy komora przybierze fioletowy kolor) przy ciśnieniu powietrza poniżej 400 mTorr. Wyjmij szkiełka i urządzenia z komory, nałóż urządzenie na szkiełka przedmiotowe i lekko dociśnij. Umieść urządzenie w 70 °C do piekarnika na 30 min w celu wzmocnienia wiązania.
    6. Napełnić urządzenia roztworem trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanu (F-silan, 2% v/v) w opracowanym cieczy nośnej, aby nadać powierzchni kanału właściwości fluorofilne. Wprowadzić roztwór F-silanu przez wylot i upewnić się, że wszystkie urządzenia są w kontakcie z odczynnikiem. Odczekać 5–10 min.
      UWAGA: F-silan należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Ponadto F-silan nie powinien być przez dłuższy czas wystawiony na działanie powietrza.
    7. Odssać roztwór F-silanu z urządzenia przez wlot roztworu wodnego. Przemyć urządzenie dwukrotnie, używając płynu technicznego, a następnie ponownie odessać. Umieścić urządzenie w 70 °C do piekarnika na 30 min w celu odparowania pozostałego oleju.
  3. Tworzenie kropel i wytwarzanie mikrogeli GelMA
    1. Do 10 ml DPBS dodać 10 mg fosfinianu litu fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilowego (LAP), aby przygotować roztwór fotoinicjatora (PI) (0,1% m/v). Roztwór należy zabezpieczyć przed światłem, owijając go folią aluminiową.
    2. Rozpuścić odpowiednią ilość GelMA w roztworze PI i umieścić go w 37 °C w piecu przez 1 h do momentu uzyskania klarownego roztworu. Chronić roztwór przed światłem, owijając go folią aluminiową.
    3. Aby przygotować fazę olejową, należy sporządzić 2% v/v roztwór surfaktanta biokompatybilnego w cieczy inżynieryjnej.
    4. Wprowadź rurki Tygon do wlotów i wylotu urządzenia PDMS. W drugim końcu rurek Tygon prowadzących do wlotów wprowadź tępą igłę 25 G. Użyj jak najkrótszych odcinków rurek.
    5. Umieść urządzenie pod mikroskopem. Utrzymuj ciepłe środowisko (~40 °C) przy użyciu suszarki do włosów i/lub grzejnika elektrycznego.
    6. Napełnij osobne strzykawki podłączone do urządzenia roztworem wodnym i roztworem olejowym. Uruchom pompy strzykawkowe, ustawiając przepływy na poziomie 160 i 80 µL/min odpowiednio dla fazy olejowej (ciągłej) i wodnej (dysperzyjnej).
      UWAGA: Najpierw rozpocznij podawanie fazy olejowej; upewnij się, że olej wypełnia kanał, a następnie rozpocznij podawanie fazy wodnej.
    7. Należy zebrać krople do pojemnika, a następnie poddać je ocenie w komorze obrazującej. poprzez obrazowanie w mikroskopii optycznej
    8. Umieść krople w 4 °C przez noc, chroniąc je przed światłem, aby zainicjować fizyczne sieciowanie GelMA HMP i przekształcić kropelki w stabilne mikrożele w 4 °C.

3. Przekształcanie mikrogeli w proszek do resuspensji poprzez mikroinżynieryjną technologię konwersji emulsji w proszek (MEtoP)

UWAGA: Opracowano technologię MEtoP, która pozwala na przekształcenie HMP opartych na emulsji wody w oleju w proszek mikrocząsteczek (mikroaerogele) z zachowaniem takich właściwości jak zdolność do resuspensji, kształt, rozmiar i struktura zespołu.

  1. Aby przeprowadzić MEtoP, zebrać fizycznie sieciowane HMPs z cieczy inżynieryjnej, używając termoodpornych probówek do mikrocentryfugi lub krioprobówek. Otworzyć nakrętki probówek i zabezpieczyć je chusteczką laboratoryjną oraz taśmą.
  2. Głęboko zamrozić fizycznie sieciowane HMPs w ciekłym azocie (-196 °C) przez 10 min.
  3. Przenieść błyskawicznie zamrożone probówki do liofilizatora. Liofilizować zawartość probówek pod niskim ciśnieniem (np. 0,06 mbar) przez co najmniej 6 h, aż do uzyskania proszku.
    UWAGA: Po zakończeniu cyklu liofilizacji powoli wyrównać ciśnienie, aby nie zgubić proszku.
  4. Do proszku dodać 1 mL schłodzonego roztworu PI (0,1% w/v, 4 °C), aby przygotować zawiesiny mikrogelu. Mieszać w vorteksie przez 5 s, a następnie wirować przy 3 000 × g przez 15 s. Odlać nadsącz.
  5. Przenieść osad zawiesiny mikrogelu do formy za pomocą pipety wyporowej, a następnie naświetlać światłem UV o długości fali 400 nm i natężeniu 15 mW/cm2 przez 60 s w celu utworzenia GHS.

Obrazy SEM mikro-aerogeli MEtoP vs. liofilizacja; porównanie mikrostruktury i schemat agregacji.
Rycina 2: Przygotowanie proszku z mikrocząstek GelMA za pomocą technologii MEtoP. (A) Obrazy proszku GelMA otrzymanego za pomocą technologii MEtoP lub konwencjonalnej liofilizacji HMP. W technologii MEtoP lub konwencjonalnej liofilizacji HMP są zawieszone odpowiednio w mediach olejowo-surfaktantowych lub wodnych. Płyn inżynieryjny chroni fazę rozproszoną (HMP) przed agregacją i zachowuje właściwości fizykochemiczne mikrocząstek GelMA podczas liofilizacji. (B) Schematyczne przedstawienie wysuszonych HMP przygotowanych za pomocą MEtoP w porównaniu z konwencjonalnie liofilizowanymi HMP w medium wodnym. (C) Obrazy SEM wysuszonych mikrocząstek GelMA przygotowanych za pomocą MEtoP w porównaniu z konwencjonalną liofilizacją. Paski skali = 2 mm (lewo; A), 500 µm (prawo; A), 10 µm (lewo; C) i 200 µm (prawo; C). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Sheikhi i wsp.26 Skróty: GelMA = żelatyna metakryloylan; DPBS = bufor fosforanowy Dulbecco; MEtoP = mikroinżynieryjna emulsja w proszek; HMP = mikrocząstka hydrożelu; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Formowanie GelMA GHS

UWAGA: Niniejszy protokół służy do przygotowania 400 µL zawiesiny mikrogelu. W przypadku większych ilości wymagane jest zwiększenie skali. Aby utrzymać fizyczne sieciowanie GelMA HMPs, wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze około 4 °C, umieszczając pojemniki z mikrogelem w naczyniu z lodem i wodą.

  1. Dodaj 400 µL roztworu 1H,1H-perfluoro-1-oktanolu (PFO) w cieczy inżynieryjnej (20% v/v) do fizycznie sieciowanych mikrocząstek (HMPs) GelMA. Następnie wymieszać w wstrząsarzu typu vortex przez 5 s i wirować przez 15 s przy 300 × g.
    UWAGA: Roztwór PFO w cieczy inżynieryjnej należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w szczelnym pojemniku, aby zapobiec parowaniu.
  2. Usuń fazę olejową z GelMA HMP poprzez pipetowanie
  3. Dodaj 400 µL roztworu PI (0,1% m/v) przy 4 °C do zawiesiny mikrogelu. Następnie mieszać w wirówce typu vortex przez 5 s i wirować przy 300 × g przez 15 s. Następnie usunąć olej.
  4. Powtórz poprzedni krok, lecz wirowarkuj przy 3 000 × gUsunąć nadsącz z upakowanych mikrocząstek GelMA (HMPs). poprzez pipetowanie
  5. Przenieść upakowane HMP z GelMA do formy za pomocą pipety wypierającej, a następnie poddać działaniu światła UV (długość fali = 400 nm, natężenie = 15 mW/cm²).2, czas ekspozycji = 60 s).

5. Nanoinżynieryjne bioatramenty granularne (NGB) do biodruku 3D GHS z zachowaną mikroporowatością

  1. Do 3 mL ultraczystej wody w temperaturze 4 °C dodać 100 mg proszku nanopłytek, aby utworzyć dyspersję nanocząstek (3,33% w/v). Dyspersję intensywnie mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 min w lodówce (4 °C), aby przeprowadzić eksfoliację zagregowanych nanocząstek. Prawidłowo eksfoliowane nanocząstki tworzą klarowną dyspersję.
  2. Rozpuścić 50 mg LAP w 5 mL ultraczystej wody w temperaturze 4 °C, aby przygotować roztwór zapasowy PI (1% w/v).
  3. Do eksfoliowanej dyspersji nanocząstek dodać 333 µL roztworu PI (1% w/v). Próbkę owinąć folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem otoczenia. Mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 1 min, aby wymieszać dyspersję nanocząstek z PI. Końcowe stężenia glinki i PI wynoszą odpowiednio 3% w/v i 0,1% w/v.
  4. Do fizycznie sieciowanych mikrocząstek GelMA HMPs dodać PFO 20% v/v w płynie inżynieryjnym (4 °C) w stosunku objętościowym 1:1. Dokładnie mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 5 s. Następnie wirować przy 300 × g przez 15 s i usunąć fazę olejową zawierającą surfaktant.
  5. Do wypłukanych GelMA HMPs dodać dyspersję nanocząstek uzupełnioną o LAP (4 °C). Mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 s, wirować przy 3 000 × g przez 15 s, a następnie usunąć pozostały na dnie olej oraz nadsącz z dyspersją.
  6. Zawiesinę przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 dzień, chroniąc ją przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Produktem tego etapu jest GelMA NGB.
  7. Przenieść NGB do strzykawki 3 mL, zamknąć strzykawkę za pomocą zatyczki i parafilmu, a następnie poddać krótkotrwałemu wirowaniu przy 200 × g w celu usunięcia uwięzionego powietrza. Przenieść biotusz do wkładu 3 mL za pomocą złączki Luer-Lok gniazdo-gniazdo. Ponownie krótko wirować wkład przy 200 × g, aby usunąć pęcherzyki powietrza. NGB przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przed użyciem.
  8. Przed przygotowaniem biotuszu z komórkami przygotować skoncentrowaną zawiesinę komórkową (np. mysich fibroblastów NIH/3T3), zawierającą ok. 24 mln komórek w 100 µL pożywki hodowlanej. Przenieść zawiesinę komórkową do strzykawki 3 mL, połączyć strzykawkę z NGB i strzykawkę z komórkami za pomocą złączki Luer-Lok gniazdo-gniazdo, a następnie delikatnie wymieszać komórki z NGB, przesuwając tłok tam i z powrotem 40 razy.
  9. Wydrukować NGB lub NGB z komórkami przy użyciu odpowiedniej biodrukarki ze standardową dyszą stożkową. Zamontować dyszę w głowicy drukującej 3 mL. Temperatura stołu drukującego powinna być niższa niż 10 °C. Przed drukowaniem zoptymalizować parametry druku, takie jak prędkość i ciśnienie wsteczne.
  10. Wybrać podłoże i typ dyszy (pneumatyczna strzykawka 3 mL wyposażona w standardową dyszę stożkową), skalibrować biodrukarkę zgodnie z instrukcją urządzenia, wybrać odpowiedni plik gcode lub STL i rozpocząć drukowanie.
    UWAGA: Podczas biodrukowania z komórkami wszystkie materiały i urządzenia powinny znajdować się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.
  11. Po drukowaniu naświetlić konstrukt światłem UV w celu fotousieciowania (długość fali = 400 nm, natężenie = 15 mW/cm2, czas naświetlania = 60 s).

Schemat tworzenia bioatramentu: nanoinżynieryjny bioatrament, dodanie fotoinicjatora, proces wirowania.
Rysunek 3: Schematy tworzenia mikrogelu GelMA i GHS. (A) Schematy oddzielania mikrogelu GelMA od oleju i przygotowania NGB. PFO (20% v/v w cieczy inżynieryjnej) dodano do emulsji mikrogel GelMA-olej w stosunku objętościowym 1:1, a następnie poddano mieszaniu w wortexie i wirowaniu przy 300 × g przez 15 s. Aby wytworzyć GelMA GHS, do GelMA HMPs dodano roztwór PI (LAP 0,1% w/v w DPBS), a następnie poddano mieszaniu w wortexie i wirowaniu przy 3 000 × g przez 15 s. W celu przygotowania NGB, do zawiesiny GelMA HMP dodano roztwór PI (LAP 0,1% w/v w wodzie ultrapurej) oraz dyspersję nanoplatetek (3% w/v w wodzie ultrapurej), a następnie poddano mieszaniu w wortexie i wirowaniu przy 3 000 × g przez 15 s. Rysunek 3A został zmodyfikowany za zgodą Ataie, Z. et al.11 (B) Naświetlanie upakowanych GelMA HMPs prowadzi do powstania GHS. Rysunek 3B został zmodyfikowany za zgodą Sheikhi et al.15 Skróty: GelMA = żelatyna metakryloylan; GHS = granularny rusztowanie hydrożelowe; NGB = nanoinżynieryjny granularny bioatrament; PFO = 1H,1H-perfluoro-1-oktanol; PI = fotoinicjator; LAP = fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu; HMP = mikrocząstka hydrożelowa; DPBS = sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

GelMA zsyntetyzowano w drodze reakcji żelatyny z MA, co przedstawiono na Rysunku 1A. Poprzez dostosowanie warunków reakcji, takich jak stężenie MA, uzyskano różne stopnie podstawienia MA. Aby ilościowo określić stopień podstawienia MA, GelMA poddano ocenie za pomocą spektroskopii 1H NMR (Rysunek 1B). Grupy funkcyjne winylowe z reprezentatywnymi pikami przy przesunięciach chemicznych ok. 5-6 ppm potwierdziły pomyślną syntezę GelMA z żelatyny. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Żelatyna i jej pochodne są najczęściej stosowanymi biomateriałami na bazie białek do produkcji HMP. Wyzwanie związane z kompromisem między wydajnością a monodyspersją wielkości cząstek można przezwyciężyć za pomocą urządzeń mikroprzepływowych do emulgowania krokowego. Urządzenia te są w stanie uformować ponad 40 milionów kropel na godzinę, przy współczynniku zmienności mniejszym niż 5%27. W tym artykule omówiliśmy mikrowytwarzanie kropelek zawierających roztwory GelMA, a następnie przekształcanie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować T. Pondowi, specjaliście ds. wsparcia badań na Wydziale Inżynierii Chemicznej Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii (Penn State), personelowi Laboratorium Nanofabrykacji w Penn State oraz Dr. J. de Rutte z Partillion Bioscience za pomoc i dyskusję na temat procesów nanowytwarzania. A. Sheikhi dziękuje za wsparcie Instytutu Badań Materiałowych (MRI) i Wyższej Szkoły Inżynierii Materiały Materia na Granty nasienne na poziomie człowieka, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) oraz Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program oraz fundusz startowy z Penn State. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) of the National Institutes of Health (NIH) w ramach nagrody numer R56EB032672.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1H,1H-perfluoro-1-oktanolAlfa Aesar, MA, USAB20156-1898% czystości
Dziurkacz do biopsjiIntegra Miltex, NY, USA33-31A-P/25Dziurkacz do biopsji 1,5 mm z systemem tłokowym
igłaSANANTS30-002-2525 G
Bruker Avance NEO 400 MHz400 MHz Bruker NEO, MA, USAWirówka do urządzenia NMR
Eppendorf, Niemcy5415 C
Probówka wirówkowaCelltreat, MA, USA229423
Filtry do kawyBUNN, IL, USA20104.0006BUNN 8-12 filiżanek Filtry do kawy, 6 każdy, 100 ct
EksykatorThermo Scientific5311-0250Suszyk próżniowy Nalgene, pokrywa i korpus PC, 280 mm OD
Tlenek deuteruSigma, MA, USA151882
Membrana do dializy (12-14 kDa)Spectrum Laboratories, NJ, USA08-667E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS, 1x)Sigma, MA, USA56064C-10Lsuchy proszek, bez wapnia, bez magnezu, odpowiedni do hodowli komórkowych
Kolba ErlenmeyeraCorning, NY, USA4980Corning PYREX 
EtanolVWR, PA, USA89125-188Koptec 200 proof
Fiolki kriogeniczne z gwintem zewnętrznym (cryovials)Corning, NY, USA430659
LiofilizatorLabconco, MO, USA71042000Wyposażony w pompę próżniową (Katalog# 7587000)
Żelatyna w proszkuSigma, MA, USAG1890-5100GTyp A ze skóry wieprzowej, moc żelu ~300 g Bloom
Glass Szkiełka mikroskopoweVWR, PA, USA82027-788
Płyta grzejnaFOUR E'S SCIENTIFIC5-calowe mieszadło magnetyczne z płytą grzejną Maksymalna temperatura 280 & C/536 ° F 
KimwipesFischer scientific, MA, USA06-666
KMPR 1000 ujemna seria fotorezystówKayaku Advanced Materials, MA, USA121619KMPR1025 i KMP1035 są zawarte
LAPONITE XLGBYK USA Inc., CT, USA2344265
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)Sigma, MA, USA900889-1G>95%
Luer-Lok złącze BD, NJ, USABD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-AlignerSÜ SS MicroTeck, niemieckieurządzenie do nanoprodukcji
bezwodnik metacylanowySigma, MA, USA276685-100MLzawiera 2,000  ppm topanol A jako inhibitor, 94%
Milli-Q wodaMillipore Corporation, MA, USAZRQSVR5WWrezystywność elektryczna ≈ 18 MΩ przy 25 & stopniach; C, Direct-Q 5 Zdalny system oczyszczania wody
UV Novec 7500 płyn inżynieryjny3M, MN, USA3M ID 
7100003723 PiekarnikVWR, PA, USAVWR-14101410 Piec próżniowy
ParafilmFischer scientific, MA, USAHS234526C
Pipeta PasteuraVWR, PA, USA14673-010
szalka PetriegoVWR, PA, USA25384-092polistyren
Pico-SurfSphere Fluidics, Wielka BrytaniaC022(5% (w/w) w listopadzie 7500)
PipetaVWR, PA, USA89079-970
Końcówki do pipetVWR, PA, USA87006-060
Komora do czyszczenia plazmowegoHarrick Plasma, NY, USAPDC-001-HP 
PolidimetylosiloksanDow Corning, MI, Stany Zjednoczone&nbsp; 2065623SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Pipeta wyporowaMicroman E M100E, Gilson, OH, USAM100E
Wafle silikonoweUniversityWafer, MA, USA452/11964-calowa
szpatułkaklasy VWR, PA, USA231-0104Jednorazowa
SU-8 Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Pompa strzykawkowaAparatura Harvard, MA, USA70-2001PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanMillipore Sigma, MA, USA448931-10G97%
Rurki TygonSaint-globain, PA, USAAAD04103 
Światło UV QUANSNapięcie: 85 V-265 V AC / Moc: 20 W
Jednostka filtracji próżniowejVWR, PA, USA10040-4600,20 µ m
VortexFischer scientific, USA14-955-151Mini mikser wirowy
MI0102003 mechaniczna

Bibliografia

  1. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  4. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  5. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).
  6. Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115(2022).
  7. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  8. Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122(2022).
  9. Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
  10. Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076(2022).
  11. Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390(2022).
  12. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  13. Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
  14. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).
  15. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  16. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
  17. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).
  18. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  19. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  20. Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
  21. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  22. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).
  23. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).
  24. Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
  25. Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).
  26. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  27. Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
  28. Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. Mechanical reinforcement of granular hydrogels. Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proces liofilizacjibiodruk 3Dmikrocz steczki hydro elufotousieciowaniebioatrament nanopartyku owyinfiltracja kom rkowa
Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.