Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokoły wysokoprzepustowej produkcji mikrożelu żelowego z żelatyny metakryloylowej za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, przekształcania mikrożeli w proszek do resuspensable (mikroaerożele), chemicznego łączenia mikrożeli w celu utworzenia granulowanych rusztowań hydrożelowych oraz opracowywania granulowanych biotuszy hydrożelowych o zachowanej mikroporowatości do biodruku 3D.

Streszczenie

Pojawienie się granulowanych rusztowań hydrożelowych (GHS), wytwarzanych za pomocą montażu mikrocząsteczek hydrożelu (HMP), umożliwiło tworzenie mikroporowatych rusztowań in situ. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hydrożeli luzem, połączone ze sobą pory w mikroskali w GHS ułatwiają niezależną od degradacji infiltrację komórek, a także transfer tlenu, składników odżywczych i komórkowych produktów ubocznych. Żelatyna modyfikowana metakryloilem (GelMA), (foto)chemicznie sieciowany biopolimer na bazie białek zawierający klej komórkowy i biodegradowalne ugrupowania, jest szeroko stosowany jako biomateriał reagujący na komórki/instruktażowy. Konwersja masowego GelMA do GHS może otworzyć mnóstwo możliwości w zakresie inżynierii tkankowej i regeneracji. W tym artykule przedstawiamy procedury wysokoprzepustowego wytwarzania mikrożeli GelMA, konwersji do suchych mikrożeli wielokrotnego użytku (mikroaerożeli), tworzenia GHS poprzez chemiczne składanie mikrożeli oraz wytwarzania granulowanego biotuszu do biodruku przez wytłaczanie. Pokazujemy, w jaki sposób sekwencyjna obróbka fizykochemiczna poprzez chłodzenie i fotosieciowanie umożliwia tworzenie mechanicznie wytrzymałego GHS. Gdy światło jest niedostępne (np. podczas głębokiej iniekcji tkankowej), indywidualnie usieciowane HMP GelMA mogą być bioortogonalnie składane poprzez sieciowanie enzymatyczne przy użyciu transglutamin. Wreszcie, trójwymiarowy (3D) biodruk mikroporowatego GHS przy niskiej gęstości upakowania HMP został zademonstrowany poprzez międzyfazową samoorganizację heterogenicznie naładowanych nanocząstek.

Wprowadzenie

Składanie bloków HMP do tworzenia rusztowań inżynierii tkankowej zyskało ogromne zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat¹. GHS, wytwarzane za pomocą montażu HMP, mają unikalne właściwości w porównaniu z ich masowymi odpowiednikami, w tym mikroporowatość w skali komórkowej pochodzącą z pustych przestrzeni między dyskretnymi blokami budulcowymi. Dodatkowe właściwości, takie jak wstrzykiwalność, modułowość i oddzielenie sztywności od porowatości, sprawiają, że GHS jest obiecującą platformą usprawniającą naprawę i regenerację tkanek². Do produkcji GHS wykorzystano różne biomateriały, w tym syntetyczne polimery n....

Protokół

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, instrumentów i odczynników użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Synteza GelMA

UWAGA: Syntezę GelMA należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, przez cały czas używając odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).

1. Do kolby Erlenmeyera wlać 200 ml fosforanowego buforu solnego Dulbecco (DPBS, 1x) i podgrzewać roztwór, aż osiągnie 50 °CPrzykryć kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
2. Do roztworu DPBS dodać 20 g żelatyny w proszku w temperaturze 50 °C przy mieszaniu z prędko....

Wyniki

GelMA zsyntetyzowano w drodze reakcji żelatyny z MA, co przedstawiono na Rysunku 1A. Poprzez dostosowanie warunków reakcji, takich jak stężenie MA, uzyskano różne stopnie podstawienia MA. Aby ilościowo określić stopień podstawienia MA, GelMA poddano ocenie za pomocą spektroskopii ¹H NMR (Rysunek 1B). Grupy funkcyjne winylowe z reprezentatywnymi pikami przy przesunięciach chemicznych ok. 5-6 ppm potwierdziły pomyślną syntezę GelMA z żelatyny. .......

Dyskusja

Żelatyna i jej pochodne są najczęściej stosowanymi biomateriałami na bazie białek do produkcji HMP. Wyzwanie związane z kompromisem między wydajnością a monodyspersją wielkości cząstek można przezwyciężyć za pomocą urządzeń mikroprzepływowych do emulgowania krokowego. Urządzenia te są w stanie uformować ponad 40 milionów kropel na godzinę, przy współczynniku zmienności mniejszym niż 5%²⁷. W tym artykule omówiliśmy mikrowytwarzanie kropelek zawierających roztwory GelMA, a następnie przekształcanie .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1H,1H-perfluoro-1-oktanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	98% czystości
Dziurkacz do biopsji	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	Dziurkacz do biopsji 1,5 mm z systemem tłokowym
igła	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		Wirówka do urządzenia NMR
	Eppendorf, Niemcy	5415 C
Probówka wirówkowa	Celltreat, MA, USA	229423
Filtry do kawy	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 filiżanek Filtry do kawy, 6 każdy, 100 ct
Eksykator	Thermo Scientific	5311-0250	Suszyk próżniowy Nalgene, pokrywa i korpus PC, 280 mm OD
Tlenek deuteru	Sigma, MA, USA	151882
Membrana do dializy (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	suchy proszek, bez wapnia, bez magnezu, odpowiedni do hodowli komórkowych
Kolba Erlenmeyera	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Etanol	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
Fiolki kriogeniczne z gwintem zewnętrznym (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Liofilizator	Labconco, MO, USA	71042000	Wyposażony w pompę próżniową (Katalog# 7587000)
Żelatyna w proszku	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Typ A ze skóry wieprzowej, moc żelu ~300 g Bloom
Glass Szkiełka mikroskopowe	VWR, PA, USA	82027-788
Płyta grzejna	FOUR E'S SCIENTIFIC		5-calowe mieszadło magnetyczne z płytą grzejną Maksymalna temperatura 280 & C/536 ° F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 ujemna seria fotorezystów	Kayaku Advanced Materials, MA, USA	121619	KMPR1025 i KMP1035 są zawarte
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok	złącze BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜ SS MicroTeck, niemieckie		urządzenie do nanoprodukcji
bezwodnik metacylanowy	Sigma, MA, USA	276685-100ML	zawiera 2,000  ppm topanol A jako inhibitor, 94%
Milli-Q woda	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	rezystywność elektryczna ≈ 18 MΩ przy 25 & stopniach; C, Direct-Q 5 Zdalny system oczyszczania wody
UV Novec 7500 płyn inżynieryjny	3M, MN, USA		3M ID
7100003723 Piekarnik	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Piec próżniowy
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pipeta Pasteura	VWR, PA, USA	14673-010
szalka Petriego	VWR, PA, USA	25384-092	polistyren
Pico-Surf	Sphere Fluidics, Wielka Brytania	C022	(5% (w/w) w listopadzie 7500)
Pipeta	VWR, PA, USA	89079-970
Końcówki do pipet	VWR, PA, USA	87006-060
Komora do czyszczenia plazmowego	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polidimetylosiloksan	Dow Corning, MI, Stany Zjednoczone&	nbsp; 2065623	SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Pipeta wyporowa	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Wafle silikonowe	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	4-calowa
szpatułka	klasy VWR, PA, USA	231-0104	Jednorazowa
SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Pompa strzykawkowa	Aparatura Harvard, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Rurki Tygon	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
Światło UV	QUANS		Napięcie: 85 V-265 V AC / Moc: 20 W
Jednostka filtracji próżniowej	VWR, PA, USA	10040-460	0,20 µ m
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini mikser wirowy

MI0102003 mechaniczna