$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dzięki niezwykłemu wzrostowi czułości, szybkości i wszechstronności, nowoczesna spektrometria mas (MS) zapewnia naukowcom większe możliwości charakteryzowania proteomu. Dzięki ulepszonym technologiom naukowcy domagają się większego poziomu rygorystyczności w swoich wynikach. Dlatego równie ważne dla przebiegu proteomiki są innowacyjne strategie przygotowania próbek opracowane w celu izolacji, separacji i przetwarzania złożonych mieszanin proteomicznych przed stwardnieniem rozsianym. Różnorodność chemiczna układów proteomicznych wyklucza uniwersalne podejście do przygotowania próbek. Jednak, jak widać za pomocą tych metod, dostępnych jest wiele protokołów, aby zmaksymalizować jakość i pewność danych MS. Zbiór ten ma na celu dostarczenie naukowcom łatwych do wdrożenia narzędzi i sztuczek zaprojektowanych w celu poprawy oczekiwanych wyników proteomicznych i metabolomicznych przepływów pracy.
Kapilarne kolumny HPLC i UPLC są niemal wszechobecne w kompleksowych przepływach pracy proteomiki. Podczas gdy samopakowane kolumny kapilarne są tanią alternatywą dla kolumn komercyjnych, ci, którzy próbowali upakować własne kolumny, mogą być zaznajomieni z niespójnymi szybkościami upakowania i zmienną jakością kolumn. Kowalczuk i jego koledzy z Rosyjskiej Akademii Nauk demonstrują swoje podejście FlashPack, aby zapewnić wydajne i spójne upakowanie kolumn kapilarnych UPLC1. Kombinacja precyzyjnie sterowanych zmiennych zmniejsza tworzenie się żeliwiaka przy wejściu do kapilary i umożliwia szybkie napełnianie kolumny za pomocą niskociśnieniowej bomby uszczelniającej.
Immunopeptydomika to rozwijająca się subdyscyplina proteomiki, mająca implikacje kliniczne w onkologii i terapiach immunologicznych. Wiarygodna analiza stwardnienia rozsianego wymaga izolacji ligandów peptydowych MHC klasy I/II lub ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA). Aby poprawić odtwarzalność tego protokołu izolacji, Sirois i jego koledzy z Uniwersytetu w Montrealu zademonstrowali przepływ pracy wychwytywania powinowactwa oparty na kulkach na małą skalę, wraz z przewidywanymi wynikami SM odzyskanej immunopeptydome2.
Aby jeszcze bardziej zwiększyć rygorystyczność danych proteomicznych i ułatwić wysokoprzepustowe przetwarzanie dużej liczby próbek, naukowcy coraz częściej sięgają po platformy robotyczne w celu automatyzacji etapów przetwarzania próbek. Dostępna jest tania platforma robologiczna, choć wymaga to od użytkownika zaprogramowania pożądanych kroków manipulacji, co może stanowić barierę w korzystaniu z tego urządzenia. Han i in. z University of Colorado Anschutz Medical Campus opracowali prosty pakiet kodowania typu open source i demonstrują podstawowe kroki związane z trawieniem białek na platformie robotycznej Opentrons OT-23.
Środki powierzchniowo czynne, takie jak SDS, są powszechnie stosowane w celu ułatwienia ekstrakcji komórkowej i solubilizacji proteomu przed stwardnieniem rozsianym. Jednak usunięcie SDS może być niekompletne lub w inny sposób grozić utratą próbki. Nickerson i jego koledzy z Dalhousie University demonstrują jednorazowy wkład, który automatyzuje proces wytrącania białek4. Połączenie soli i rozpuszczalnika organicznego ma kluczowe znaczenie dla maksymalizacji odzysku białka i może być wykonane w minimalnym czasie przy wysokiej wydajności.
Metabolomika podąża śladami analizy proteomów, a rosnąca baza danych referencyjnych widm stwardnienia rozsianego jest wykorzystywana do identyfikacji nieznanych metabolitów w ukierunkowanych i nieukierunkowanych przepływach pracy. Podobnie jak w przypadku analizy proteomicznej, identyfikacje spektralne są podatne na fałszywie dodatnie dopasowania, a zatem statystyczne raportowanie wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) jest niezbędne do filtrowania wyników o niskim poziomie ufności. Li i jego koledzy z Uniwersytetu Jinan nawiązali współpracę z Chi-Biotech Co., aby stworzyć internetowy przepływ pracy oparty na ich programie XY-Meta i wygenerować docelową bazę danych metabolitów5. Demonstrują kroki generowania docelowej bazy danych i filtrowania wyników metabolomicznych w oparciu o pożądany FDR.
Wreszcie, protokół izolacji proteomu pojedynczej komórki został zademonstrowany przez Petelskiego i współpracowników z Northeastern University6. Protokół Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) umożliwia naukowcom ilościowe określenie setek do tysięcy białek w jednym eksperymencie, przy użyciu nośnika izobarycznego w celu zmniejszenia utraty próbki. Kluczem do protokołu jest szybki etap cyklu termicznego w celu lizy komórek, a także wydajne trawienie tryptyczne przy użyciu większej niż zwykle ilości enzymów i znakowania izobarycznego za pomocą znaczników TMT.
Pomimo dziesięcioleci doświadczenia w proteomice, ta dojrzewająca dziedzina po prostu ewoluowała, aby rozwiązywać trudniejsze problemy. Zdolność do przetwarzania większej liczby próbek lub mniejszych ilości materiału, przy większej spójności i pewności danych wyjściowych, nadal napędza innowacje technologiczne. Wymiana pomysłów związanych z manipulacjami chemicznymi, instrumentalnymi i informatycznymi jest niezbędna dla rozwoju tej dziedziny. "Problem" jednego badacza mógł już zostać rozwiązany za pomocą prostej "wskazówki lub sztuczki", aby sprostać wyzwaniu. Jest to zatem pozytywny znak, że dostępnych jest tak wiele unikalnych strategii analizy proteomu. W przypadku tych wyzwań, które pozostały, jest prawdopodobne, że ktoś już pracuje nad możliwym rozwiązaniem.