Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64838

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Roger Williams Institute of Hepatology London, Foundation for Liver Research, 2Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Department of Physiology, Medical School, National and Kapodistrian University of Athens, 4BIOEMTECH, Lefkippos Attica Technology Park NCSR "Demokritos"

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Streszczenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest rosnącym globalnym problemem zdrowotnym, a wpływ NAFLD jest potęgowany przez obecny brak skutecznych metod leczenia. Istotnymi czynnikami ograniczającymi terminową i trafną diagnozę (w tym klasyfikację) i monitorowanie NAFLD, a także opracowywanie potencjalnych terapii, są obecne braki w charakterystyce struktury mikrośrodowiska wątroby oraz punktacji stopnia zaawansowania choroby w sposób czasoprzestrzenny i nieinwazyjny. Korzystając z mysiego modelu NAFLD indukowanego dietą, zbadaliśmy zastosowanie technik obrazowania mikrotomografii komputerowej (CT) in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD. Ta metodologia obrazowania pozwala na podłużną analizę stłuszczenia wątroby i funkcjonalnego wychwytu tkankowego, a także ocenę względnej objętości krwi, średnicy żyły wrotnej i gęstości sieci naczyniowej. Zrozumienie adaptacji sieci naczyniowej wątroby podczas progresji NAFLD i skorelowanie tego z innymi sposobami charakteryzowania postępu choroby (stłuszczenie, zapalenie, zwłóknienie) przy użyciu proponowanej metody może utorować drogę do ustanowienia nowych, bardziej wydajnych i powtarzalnych podejść do badań NAFLD u myszy. Oczekuje się również, że protokół ten zwiększy wartość przedklinicznych modeli zwierzęcych w badaniach nad rozwojem nowych terapii zapobiegających postępowi choroby.

Wprowadzenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest chorobą metaboliczną, która dotyka około 25% populacji i >80% osób chorobliwie otyłych1. Szacuje się, że jedna trzecia tych osób rozwija się w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), które charakteryzuje się stłuszczeniem wątroby, stanem zapalnym i zwłóknieniem2. NASH jest stadium choroby o znacznie wyższym ryzyku rozwoju marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)3,4. Z tego powodu NASH jest obecnie drugą najczęstszą przyczyną przeszczepu wątroby i oczekuje się, że wkrótce stanie się najważniejszym predyktorem przeszczepu wątroby5,6,7. Pomimo rozpowszechnienia i nasilenia choroby, żadna terapia specyficzna dla choroby nie jest dostępna dla NAFLD, a istniejące metody leczenia mają na celu jedynie zwalczanie patologii związanych z chorobą, takich jak insulinooporność i hiperlipidemia5,6.

W ostatnich latach patofizjologiczna rola i adaptacje śródbłonka i ogólnie sieci naczyniowej tkanek metabolicznych, takich jak tkanka tłuszczowa i wątroba, zyskują coraz większe znaczenie w badaniach, zwłaszcza podczas otyłości i rozregulowania metabolizmu7,8. Śródbłonek jest monowarstwą komórkową, która wewnętrznie wyściela sieć naczyniową, działając jako bariera funkcjonalna i strukturalna. Przyczynia się również do różnych procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak zakrzepica, transport metabolitów, stan zapalny i angiogeneza9,10. W przypadku wątroby sieć naczyniowa charakteryzuje się między innymi obecnością wysoce wyspecjalizowanych komórek, określanych jako sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC). Komórki te nie mają błony podstawnej i mają wiele okien, co pozwala na łatwiejsze przenoszenie substratów między krwią a miąższem wątroby. Ze względu na ich charakterystyczne położenie anatomiczne i charakterystykę, LSEC prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w procesach patofizjologicznych wątroby, w tym w rozwoju zapalenia wątroby i zwłóknienia podczas NAFLD/NASH. Rzeczywiście, patologiczne, molekularne i komórkowe adaptacje, którym podlegają LSEC w przebiegu NAFLD, przyczyniają się do progresji choroby11. W szczególności zależna od LSEC angiogeneza wątrobowa, która ma miejsce podczas NAFLD, jest istotnie związana z rozwojem stanu zapalnego i progresją choroby do NASH lub nawet HCC12. Poza tym wczesna NAFLD związana z otyłością charakteryzuje się rozwojem insulinooporności w LSEC, co poprzedza rozwój zapalenia wątroby lub innych zaawansowanych objawów NAFLD13.

Dodatkowo, LSEC pojawiły się ostatnio jako centralne regulatory przepływu krwi w wątrobie i adaptacji sieci naczyniowej podczas chorób wątroby o różnych etiologiach14,15. Rzeczywiście, przewlekła choroba wątroby charakteryzuje się wyraźnym zwężeniem naczyń krwionośnych wewnątrz wątroby i zwiększonym oporem przepływu krwi, co przyczynia się do rozwoju nadciśnienia wrotnego16. W przypadku NAFLD do tego zjawiska przyczynia się kilka mechanizmów związanych z LSEC. Na przykład, insulinooporność specyficzna dla LSEC, jak wspomniano powyżej, jest związana ze zmniejszonym insulinozależnym rozszerzeniem naczyń krwionośnych wątroby13. Poza tym w trakcie choroby unaczynienie wątroby staje się bardziej wrażliwe na czynniki zwężające naczynia krwionośne, co dodatkowo przyczynia się do upośledzenia przepływu krwi w wątrobie i prowadzi do pojawienia się stresu ścinającego, co skutkuje zaburzeniem mikrokrążenia sinusoidalnego17. Fakty te sugerują, że układ naczyniowy jest kluczowym celem w chorobach wątroby. Niemniej jednak czynnikami ograniczającymi terminową diagnozę i monitorowanie NAFLD/NASH, a także opracowywanie potencjalnych terapii, są braki w spójnej charakterystyce mikrośrodowiska wątroby i struktury (mikro)naczyniowej, a także punktacji stopnia zaawansowania choroby w sposób czasoprzestrzenny i nieinwazyjny.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej (CT) jest obecnie złotym standardem nieinwazyjnej metody obrazowania do dokładnego przedstawiania informacji anatomicznych w żywym organizmie. Mikrotomografia komputerowa i rezonans magnetyczny to dwie uzupełniające się metody obrazowania, które mogą obejmować szeroki zakres patologii i zapewniają wyjątkową rozdzielczość i szczegółowość obrazowanych struktur i tkanek. Mikrotomografia komputerowa, w szczególności, jest bardzo szybkim i dokładnym narzędziem, które jest często używane do badania patologii, takich jak choroby kości i związane z nimi zmiany powierzchni kości18, oceny postępu zwłóknienia płuc w czasie19, diagnozowania raka płuc i jego stopnia zaawansowania20, a nawet badania patologii stomatologicznych21, bez specjalnego przygotowania (lub niszczenia) obrazowanych próbek.

Technologia obrazowania mikro-CT opiera się na różnych właściwościach tłumienia różnych organów pod względem interakcji promieniowania rentgenowskiego z materią. Narządy wykazujące duże różnice w tłumieniu promieniowania rentgenowskiego są przedstawiane na obrazach TK z wysokim kontrastem (tj. płuca wydają się ciemne, a kości jasne). Narządy o bardzo podobnych właściwościach tłumienia (różne tkanki miękkie) są trudne do odróżnienia na obrazach CT22. Aby rozwiązać to ograniczenie, specjalistyczne środki kontrastowe na bazie jodu, złota i bizmutu zostały szeroko przebadane pod kątem stosowania in vivo. Czynniki te zmieniają właściwości tłumiące tkanek, w których się gromadzą, są powoli usuwane z krążenia i umożliwiają równomierne i stabilne zmętnienie całego układu naczyniowego lub wybranych tkanek23.

W diagnostyce ludzi, obrazowanie CT i porównywalne techniki, takie jak frakcja tłuszczu o gęstości protonów pochodząca z MRI, są już używane do określania zawartości tłuszczu w wątrobie24,25. W kontekście NAFLD wysoki kontrast tkanek miękkich jest niezbędny do dokładnego rozróżnienia zmian patologicznych lub małych naczyń. W tym celu stosuje się środki kontrastowe zapewniające zwiększony kontrast charakterystyki tkanki wątroby. Takie narzędzia i materiały pozwalają na badanie wielu cech wątroby i możliwych przejawów patologii, takich jak architektura i gęstość sieci naczyniowej, odkładanie się lipidów/stłuszczenie oraz funkcjonalny wychwyt tkankowy/transfer lipidów (chylomikron) w wątrobie. Dodatkowo można również ocenić względną objętość krwi w wątrobie i średnicę żyły wrotnej. W bardzo krótkim czasie skanowania wszystkie te parametry dostarczają różnych i uzupełniających się informacji na temat oceny i progresji NAFLD, które można wykorzystać do opracowania nieinwazyjnej i szczegółowej diagnozy.

W tym artykule przedstawiamy krok po kroku protokół użycia nowatorskich technik obrazowania in vivo mikro-CT jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD. Korzystając z tego protokołu, można przeprowadzić podłużną analizę stłuszczenia wątroby i wychwytu funkcjonalnego tkanki, a także ocenę względnej objętości krwi, średnicy żyły wrotnej i gęstości sieci naczyniowej, i zastosować ją w mysich modelach choroby wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone przez personel BIOEMTECH zgodnie z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zostały zatwierdzone przez organy krajowe (numer licencji EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Wszystkie eksperymenty zostały zaprojektowane i opisane zgodnie z wytycznymi ARRIVE26. Myszy zakupiono w Hellenic Pasteur Institute w Atenach, Grecja.

UWAGA: Zwierzęta były kwaterowane grupowo w indywidualnie wentylowanych klatkach wzbogaconych o barierki i tuby tekturowe w pomieszczeniu o temperaturze 20-22 °C, wilgotności względnej 50%-60% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło 07:00-19:00). W celu wywołania NAFLD, jako uznanego i wiarygodnego modelu27,28,29,30, zastosowano kombinację diety wysokotłuszczowej (HFD) oraz syropu kukurydzianego wysokofruktozowego (HFCS), który jest słodzikiem zawierającym fruktozę i glukozę, powszechnie stosowanym w nowoczesnych typach diet bogatych w tłuszcze. Samcom myszy szczepu C57BL/6 w wieku 7-8 tygodni zapewniono dostęp ad libitum do diety normalnej (n = 2) z 10% kilokalorii pochodzących z tłuszczów lub diety HFD (n = 2) zawierającej 60% kilokalorii z tłuszczów, suplementowanej 5% HFCS w wodzie, przez okres 22 tygodni. Masę ciała mierzono co tydzień przy użyciu wagi cyfrowej, a dobrostan zwierząt monitorowano co drugi dzień w okresie eksperymentalnym przy użyciu arkusza ocen. Po zakończeniu protokołu obrazowania myszy zostały uśmiercone via zwichnięcie szyi.

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Protokół obrazowania został podsumowany na Rysunku 1.

  1. Zanurz mysz w narkozie, stosując 3%-4% izofluranu (w powietrzu pokojowym), i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą dedykowanej maty grzewczej.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem skanowania należy potwierdzić wystarczającą głębokość znieczulenia poprzez sprawdzenie braku odruchu cofania łapy.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu nanieś maść oftalmiczną na oczy zwierzęcia.
  3. Umieść zwierzę w uchwycie skanera CT, zabezpiecz stożek nosowy i przełącz na 1,5%-3% izofluranu (w powietrzu pokojowym) w celu podtrzymania narkozy.
    UWAGA: Odpowiednie stężenie izofluranu niezbędne do podtrzymania znieczulenia należy potwierdzić poprzez sprawdzenie braku odruchu cofania łapy.
  4. stale monitoruj stan myszy.

2. Przygotowanie przed skanowaniem

UWAGA: Obrazowanie jest przeprowadzane w dwóch fazach eksperymentalnych, aby umożliwić odpowiednie usunięcie pierwszego środka kontrastowego z krwiobiegu i tkanek. eXIA (pierwszy środek kontrastowy) jest podawany w pierwszej fazie, a ExiTron (drugi środek kontrastowy) w drugiej fazie, zgodnie z opisem w sekcji „Przebieg obrazowania” (sekcja 3) poniżej.

  1. Pozostawić środek kontrastowy (eXIA lub ExiTron, w zależności od fazy eksperymentu) w temperaturze pokojowej przez 3 h.
  2. Ustawić następujące parametry skanowania w tomografie komputerowym (CT): protokół wysokiej rozdzielczości przy napięciu lampy 50 kVp i prądzie 460 µA, skanowanie niespiralne, 720 projekcji/rotację, cztery rotacje oraz czas akwizycji 4 min.

3. Procedura obrazowania

  1. Faza eksperymentalna 1
    1. Obliczyć i przygotować objętość pierwszego środka kontrastowego, który ma zostać podany w nierozcieńczonej dawce 6 µL/g masy ciała w celu uzyskania maksymalnego kontrastu.
    2. Przygotować cewnik do żyły ogonowej, wypełniając go solą fizjologiczną i łącząc ze strzykawką wypełnioną środkiem kontrastowym.
    3. Wyonać skan bazowy całego ciała (WB) i wątroby przed podaniem kontrastu.
    4. Upewnić się, że w strzykawce lub cewniku nie ma pęcherzyków powietrza ani zatorów.
    5. Wprowadzić wypełniony cewnik do żyły ogonowej i podać środek kontrastowy poprzez powolny wtrysk ręczny trwający 1-3 min (nie jako wstrzyknięcie bolusowe). Można użyć pompy strzykawkowej ustawionej na odpowiednią prędkość infuzji.
      UWAGA: Ogon zwierzęcia można umieścić w letniej wodzie, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych i ułatwić wprowadzenie cewnika
    6. Wykonać skany WB i wątroby w różnych punktach czasowych, zgodnie z Tabelą 1.
      UWAGA: Jeśli pozyskanie wszystkich punktów nie jest możliwe, należy skupić się na czasie 45 min po wstrzyknięciu (PI), który jest punktem maksymalnego wychwytu przez wątrobę, oraz na 48 h PI, kiedy osiągnięte zostaje całkowite oczyszczenie.
  2. Faza eksperymentalna 2
    1. Ponownie przygotować mysz zgodnie z opisem w sekcji 1 w celu podania drugiego środka kontrastowego 10 dni po ostatnim pomiarze z pierwszym środkiem kontrastowym (48 h PI).
    2. Wykonać kroki 2.1-2.2.
    3. Obliczyć i przygotować objętość drugiego środka kontrastowego, który ma zostać podany w nierozcieńczonej dawce 8 µL/g masy ciała dla maksymalnego kontrastu.
    4. Przygotować cewnik do żyły ogonowej, wypełniając go solą fizjologiczną i łącząc ze strzykawką wypełnioną środkiem kontrastowym.
    5. Wykonać skan bazowy WB i wątroby przed podaniem kontrastu w celu oceny względnej objętości krwi i stłuszczenia wątroby.
    6. Upewnić się, że w skanie nie wykryto kontrastu, co będzie wskaźnikiem całkowitego oczyszczenia z pierwszego środka kontrastowego.
    7. Wprowadzić wypełniony cewnik do żyły ogonowej i podać środek kontrastowy poprzez powolny wtrysk dożylny wykonywany ręcznie, o czasie trwania 1-3 min (nie jako wstrzyknięcie bolusowe). Można użyć pompy strzykawkowej ustawionej na odpowiednią prędkość infuzji.
    8. Wykonać skany WB i wątroby w różnych punktach czasowych, zgodnie z Tabelą 1.
      UWAGA: Skany WB wykonuje się w 10 min i 4 h PI. Znaczna przerwa czasowa między nimi pozwala na ocenę biodystrybucji znacznika w organizmie, a także jego względnego oczyszczania.

4. Ekstrakcja i analiza danych

UWAGA: W niniejszym protokole przedstawiono etapy ekstrakcji i analizy danych oparte na konkretnym oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (patrz Tabela materiałów). Opisane kroki mogą wymagać dostosowania w przypadku korzystania z innego oprogramowania.

  1. Ocena odkładania lipidów/stłuszczenia wątroby.
    UWAGA: W celu oceny stłuszczenia wątroby nie stosuje się środka kontrastowego, a następnie przeprowadza porównanie między grupą kontrolną a patologiczną. Ze względu na stosunkowo duże odchylenia właściwości tłumienia tkanek u poszczególnych myszy, wartości gęstości wątroby są normalizowane względem śledziony (tkanka beztłuszczowa) oraz tłuszczu (tkanki tłuszczowe absolutne) zgodnie z poniższym równaniem i zgodnie z wcześniejszymi opisami25:
    Wzór obliczania zawartości tłuszczu w wątrobie: Śledziona-Wątroba/Śledziona-Tłuszcz; analiza ilościowa, zastosowanie diagnostyczne.
    1. Aby przeprowadzić analizę, należy wczytać plik DICOM skanu przed kontrastem, a następnie dostosować pasek kontrastu, aby wyraźnie widzieć wątrobę, śledzionę i białą tkankę tłuszczową (WAT).
    2. Uzyskaj dostęp do Operator modelowania narzędzie poprzez menu rozwijane narzędzi na panelu przednim, a następnie wybierz Narzędzie 3D ROI.
    3. Pod Operator 3D ROIwybierz Dodaj ROI w celu wygenerowania wielu obszarów zainteresowania (ROI, do ośmiu dla każdej tkanki), aby przeprowadzić próbkowanie w obszarach, w których wątroba (najlepiej w obszarach lewego płata przyśrodkowego, prawego płata przyśrodkowego i lewego płata bocznego) oraz śledziona są wyraźne, bez widocznych naczyń krwionośnych i tłuszczu.
      UWAGA: W przypadku WAT obszary zainteresowania (ROI) wybierane są w środkowej części depozytu trzewnej tkanki tłuszczowej. Zalecane obszary przedstawiono w Rysunek 2Można również zastosować metody normalizacji z wykorzystaniem stosunku wątroby do śledziony i bez uwzględnienia WAT, zgodnie z wcześniej ustalonymi procedurami.31.
    4. Pod Tryb malowania 3D oraz erozja/dylatacja cecha, wybór 2Dnastępnie należy skorzystać z wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
    5. Użyj Sfera użyć narzędzia do malowania ROI o średnicy 8 pikseli, aby ręcznie wyznaczyć dwuwymiarowe obszary zainteresowania (ROI).
    6. Przeprowadź próbkowanie poprzez segmentację 2D ROI w obszarach zainteresowania za pomocą Krzyż celowniczy narzędzie w płaszczyźnie poprzecznej, jak pokazano w Rycina 3A.
    7. Kliknij wybrany punkt w płaszczyźnie strzałkowej i czołowej, aby ukończyć segmentację 2D ROI, jak pokazano w Rycina 3B.
    8. Powtórz ten proces w celu zdefiniowania pozostałych ROI.
      UWAGA: Podczas pobierania próbek należy unikać obszarów brzeżnych narządu, ponieważ może to wprowadzić szum i wpłynąć na wiarygodność obliczonej wartości jednostki Hounsfielda (HU) dla każdego ROI.
    9. Po uzyskaniu satysfakcjonujących wyników segmentacji obszarów ROI, przejdź do Nawigacjai wybierz Pokaż tabelę aby wyświetlić tabelę ilościową zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Wartości będące przedmiotem analizy znajdują się w kolumnie „Mean”, która zawiera numeryczne wartości średnie wokseli (HU) zawartych w obszarach ROI dla analizowanych organów. Należy odnotować interesujące wartości lub zapisać całą tabelę, wybierając Eksportuj tabelę.
    10. Oblicz średnie wartości HU dla wątroby, śledziony i białej tkanki tłuszczowej (WAT), a następnie podstaw uzyskane wartości do powyższego równania, aby obliczyć procentową zawartość tłuszczu w wątrobie.
  2. Funkcjonalne pobieranie przez tkanki/transfer lipidów (chylomikronów) w wątrobie
    UWAGA: Funkcjonalne pobieranie przez tkanki/transfer lipidów (chylomikronów) analizuje się na podstawie skanów uzyskanych w 45. minucie i 48. godzinie po pierwszej infuzji środka kontrastowego, zgodnie z wcześniej opisaną metodą32Kontrast dla różnych tkanek i punktów czasowych oblicza się za pomocą poniższego równania:
    Wzór na obliczanie kontrastu, %Kontrast=((PVt_i-PVt_0)/PVt_0)×100, wyrażenie matematyczne.
    organ PVi czy średnia wartość piksela w narządzie w czasie ti (od 0 h do 48 h) i organ PV0 jest średnia wartość piksela w narządzie na obrazie bez kontrastu.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, należy wczytać plik DICOM ze skanu eXIA, a następnie dostosować poziom jasności/kontrastu, aby wyraźnie widzieć wątrobę, śledzionę i lewą komorę serca.
    2. Uzyskaj dostęp do Operator modelowania poprzez menu rozwijane narzędzi na panelu przednim i wybierz Narzędzie 3D ROI.
    3. Pod Operator 3D ROIwybierz Dodaj obszar zainteresowania (ROI) do segmentacji wielu obszarów zainteresowania (ROI) w wątrobie.
    4. Pod Tryb malowania 3D oraz erozja/dylatacja funkcja, użyj Sfera narzędzie do zaznaczania ROI metodą malowania o średnicy 8 pikseli i erozji −1.
      UWAGA: Wybierz wiele obszarów zainteresowania (ROI) na przekrojach, na których każdy organ jest wyraźnie widoczny. Unikaj obszarów brzeżnych, ponieważ może to wprowadzić szum i wpłynąć na wiarygodność obliczonej wartości HU każdego ROI. Pozwoli to na próbkowanie wielu trójwymiarowych ROI, które odpowiadają małym objętościom organów.
    5. Użyj wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
    6. Po zatwierdzeniu zaprojektowanych obszarów ROI, przejdź do Nawigacja, i wybierz Pokaż tabelę aby wyświetlić tabelę ilościową zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Wartości interesujące znajdują się w kolumnie „Mean”, która wyświetla numeryczne wartości średnie wokseli (HU) zawartych w ROI. Średnia wartość HU dla ROI każdego organu odpowiada organ PViZanotuj interesujące wartości lub zapisz całą tabelę, wybierając Eksportuj tabelę.
    7. Aby uzyskać organ PV0następnie powtórzyć wszystkie powyższe kroki, wykorzystując plik DICOM sprzed podania kontrastu, aby obliczyć średnią jasność wątroby, śledziony i lewej komory przed wstrzyknięciem środka kontrastowego.
    8. Podstaw wartości do powyższego równania, aby wyznaczyć procentowy kontrast odpowiadający wychwytowi tkanki funkcjonalnej/transferowi do lipidów (chyloimikronów).
  3. Architektura i gęstość sieci naczyniowej wątroby
    UWAGA: Analiza architektury i gęstości sieci naczyniowej wątroby opiera się na wcześniej opublikowanej metodologii33 i jest wykonywana na skanach wątroby uzyskanych 10 min po wstrzyknięciu (PI) drugiego środka kontrastowego.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, należy wczytać plik DICOM ze skanu ExiTron i dostosować poziomy jasności/kontrastu, aby wyraźnie widzieć sieć naczyniową wątroby.
    2. Uzyskaj dostęp do Operator modelowania poprzez menu rozwijane narzędzi na panelu przednim i wybrać Narzędzie do wyznaczania 3D ROI.
    3. Pod Operator 3D ROIwybierz Dodaj ROI w celu wygenerowania trójwymiarowego obszaru zainteresowania (ROI) dla wątroby.
    4. Pod Tryb malowania 3D oraz erozja/dylatacja cecha, wybierz 3D.
      UWAGA: Należy użyć Sfera użyj narzędzia paint ROI z parametrem erode −1, aby zdefiniować warstwy segmentacji w płaszczyźnie czołowej. Średnicę narzędzia paint ROI należy dostosować do każdej warstwy (w celu dodawania lub usuwania wybranych wokseli). Zaleca się, aby objętość wątroby została wstępnie zdefiniowana w płaszczyźnie czołowej, a następnie wykorzystać płaszczyzny poprzeczną i strzałkową do korekty ROI. Proces ten wymaga precyzji. Podczas segmentacji każdej warstwy ROI użytkownik musi zachować szczególną ostrożność, aby nie włączyć innych tkanek, naczyń i kości, zapewniając jednocześnie, że wszystkie obszary wątroby zostały ujęte w zdefiniowanym ROI. Z tego powodu kluczowe jest zapoznanie się z granicami anatomicznymi wątroby.
    5. Po uzyskaniu satysfakcjonującego obszaru zainteresowania (ROI) wątroby, wykonaj cięcie, aby usunąć z danych obrazowych wszystkie woksele, które nie należą do początkowo wysegmentowanego ROI wątroby. W tym celu wybierz ROI wątroby z Selektor ROIi kliknij w Wykonaj cięcie ikona. Operacja ta usuwa tło, pozostawiając nienaruszone ROI wątroby.
      UWAGA: Chociaż funkcje cofnij/ponów mają zastosowanie do wszystkich operacji wykonywanych w ramach Narzędzie do wyznaczania 3D ROIoperacja wycinania ROI jest nieodwracalna. Przed wykonaniem tej czynności użytkownik może rozważyć zapisanie początkowego ROI wątroby w formacie DICOM.
    6. W rezultacie uzyskany obszar zainteresowania (ROI) wątroby obejmuje sieć naczyniową oraz otaczające tkanki, które należy usunąć. W tym celu zresetuj ROI wątroby, klikając w Resetuj ROI przycisk miotły
    7. Użyj wyświetlonego interfejsu, aby przenieść wszystkie piksele obszaru zainteresowania (ROI) wątroby do tła.
      UWAGA: ROI wątroby nadal będzie istnieć po tej operacji, ale nie będzie już zawierać żadnych wokseli.
    8. Aby ponownie wyznaczyć segmentację ROI wątroby w taki sposób, aby zawierała ona wyłącznie piksele związane z naczyniami, przejdź do Algorytmy segmentacji oznaczonej ikoną magicznej różdżki, a następnie wybierz Progowanie z analizą spójności.
    9. Zdefiniuj ROI jako Wynik a tło jako Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. z menu rozwijanego wejściowego przed zastosowaniem progowania.
    10. Ustaw Progi poprzez kliknięcie w Min i Maksymalny ikony po lewej stronie każdego pola progu, aby wprowadzić wartości maksymalne i minimalne i uzyskać sieć naczyniową.
      UWAGA: Do wynikowego obszaru zainteresowania (ROI) zostaną włączone tylko piksele mieszczące się w wybranym zakresie. Dostosowanie wartości progowych dla poszczególnych zwierząt zapewnia uwzględnienie tych samych regionów anatomicznych w odniesieniu do dokładnej ilości środka kontrastowego wstrzykniętego każdemu zwierzęciu. Pozostaje to stałe dla wybranych tkanek, nawet jeśli wartości liczbowe nie są identyczne.
    11. Użyj Przeciącie linii celowniczych narzędzie do kliknięcia w punkcie, w którym sieć naczyniowa jest wyraźna, i kliknięcia w Zastosuj w celu przeprowadzenia segmentacji.
    12. Aktywuj podgląd maksymalnej projekcji intensywności (MIP).
    13. Oceń wynikowy obszar zainteresowania (ROI) wątroby pod kątem wyraźności sieci naczyniowej w widoku MIP.
    14. Jeśli tkanka nadal znajduje się w obszarach zainteresowania (ROI) wątroby, należy powtórzyć kroki 4.3.5–4.3.11, dostosowując Min wartość progową, aż segmentowany obszar zainteresowania (ROI) wątroby będzie wyraźnie przedstawiał sieć naczyniową.
    15. Po uzyskaniu satysfakcjonującego obszaru zainteresowania (ROI) wątroby, wygeneruj tabelę ilościową zawierającą obliczoną objętość ROI wątroby w milimetrach sześciennych.
      UWAGA: Interesujące wartości wymieniono w „mm3kolumna zawierająca numeryczne wartości gęstości w jednostkach Hounsfielda (HU) wokseli znajdujących się w ROI wątroby. Należy odnotować interesujące wartości lub zapisać całą tabelę, wybierając Eksportuj tabelę.
  4. Względna objętość krwi w wątrobie
    UWAGA: Do pomiaru względnej objętości krwi w wątrobie (rBV), która koreluje istotnie z liczbą nowo powstałych naczyń krwionośnych podczas postępu włóknienia, wykorzystuje się skany przed kontrastem oraz skany wykonane 4 h po drugim wstrzyknięciu środka kontrastowego. Analizę przeprowadza się zgodnie z wcześniej opisaną metodą.34.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, należy wczytać plik DICOM ze skanu ExiTron, a następnie dostosować poziom jasności i kontrastu.
      UWAGA: Wyłączyć podgląd MIPpod Preferencjezaznacz pole, aby wyłączyć przeglądarkę MIP podczas ładowania. W przypadku dużych zbiorów danych może to przyspieszyć proces ładowania.
    2. Uzyskaj dostęp do Operator modelowania poprzez menu rozwijane narzędzi na panelu przednim i wybierz Narzędzie 3D ROINarzędzie to oferuje zaawansowane opcje rysowania, wizualizacji, zapisywania i kwantyfikacji obszarów 2D i 3D.
    3. Pod Operator 3D ROIwybierz Dodaj ROIi wyznacz dwa obszary zainteresowania (ROI): jeden dla wątroby i jeden dla dużego naczynia krwionośnego.
    4. Pod Tryb malowania 3D oraz erozja/dylatacja cecha, wybierz 2D.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie Sfera użyj narzędzia do zaznaczania ROI (obszaru zainteresowania) z pędzlem o średnicy 8–10 pikseli dla wątroby i 4–6 pikseli dla naczynia krwionośnego. Średnicę pędzla można jednak dostosować w zależności od wielkości obszaru przeznaczonego do zaznaczenia.
    5. Użyj wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
      UWAGA: Należy wybrać od dwóch do pięciu przekrojów centralnych części tkanek będących przedmiotem badania i zdefiniować warstwy segmentacji w celu wygenerowania dwuwymiarowych obszarów zainteresowania (ROI) dla każdej tkanki. Podczas zaznaczania obszarów na każdym przekroju należy unikać regionów brzeżnych narządu, jak pokazano w Rysunek 4ponieważ może to wprowadzić szum i wpłynąć na wiarygodność obliczonej wartości HU dla każdego ROI.
    6. Po zatwierdzeniu zaprojektowanych obszarów ROI, przejdź do Nawigacjai wybierz Pokaż tabelę aby wyświetlić tabelę ilościową zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Wartości interesujące są wymienione w kolumnie „Mean” (Średnia), która wyświetla numeryczne wartości średnie wokseli (HU) zawartych w ROI. Należy zanotować interesujące wartości lub zapisać całą tabelę, wybierając Eksportuj tabelę.
    7. Powtórz wszystkie kroki dla pliku DICOM sprzed podania kontrastu, aby uzyskać średnią jasność wątroby przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. W tym celu wykonaj kroki 4.4.2–4.4.5 wyłącznie dla wątroby.
    8. Oblicz średnie wartości HU dla każdej tkanki w odpowiadających sobie punktach czasowych, a następnie podstaw otrzymane wartości do poniższego równania:
      Obliczanie zmiany objętości krwi w wątrobie, formuła, wyrażenie matematyczne, badania medyczne.
      UWAGA: Duże naczynie krwionośne po wstrzyknięciu środka kontrastowego przyjmuje się za 100% rBV, natomiast wątrobę przed podaniem środka kontrastowego za 0% rBV.
  5. Średnica żyły wrotnej
    UWAGA: W celu pomiaru średnicy żyły wrotnej analizowane są te same skany, które wykorzystano do pomiarów rBV wątroby, zgodnie z wcześniejszym opisem35.
    1. Wczytaj plik DICOM ze skanu ExiTron i dostosuj poziom jasności/kontrastu.
    2. Wyznacz płaszczyzny poprzeczne od trzech do czterech przekrojów powyżej miejsca połączenia żyły krezkowej górnej i żyły śledzionowej (Rysunek 5).
    3. Użyj Linijka narzędzie do pomiaru dokładnej odległości między dwoma punktami (np. średnicy okrągłego obszaru żyły).
      UWAGA: Odległość jest wyodrębniana z obrazu, ale można również przejść do Nawigacja i wybierz Pokaż tabelę aby wyświetlić tabelę ilościową zawierającą obliczoną odległość lub wybrać Eksportuj tabelę aby zapisać wynik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym reprezentatywnym badaniu obrazowanie mikro-CT bez użycia środka kontrastowego wykazało wyższy procent tłuszczu w wątrobie myszy z NAFLD w porównaniu z grupą kontrolną (Tabela 2), co potwierdziło patologię. Przy zastosowaniu środka kontrastowego ExiTron oraz opisanej powyżej analizy architektury i gęstości sieci naczyniowej wątroby stwierdzono, że całkowita gęstość objętościowa sieci naczyniowej wątroby była wyższa u myszy z NAFLD w porównaniu z kontrolą (Rysunek 6,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie zalecaną metodą diagnozowania i oceny stopnia zaawansowania NAFLD u ludzi jest biopsja wątroby, która niesie ze sobą ryzyko złożoności krwawienia, a także niedokładności pobierania próbek40. Wręcz przeciwnie, w modelach zwierzęcych taka diagnoza jest przeprowadzana za pomocą histologii post mortem, chociaż protokoły biopsji wątroby, która daje się przeżyć, są obecnie dostępne i zalecane, gdy pozwala na to projekt badania41. Zastosowanie histologii pośmiertnej oznacz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Prace te były wspierane przez Grecką Fundację Badań i Innowacji (#3222 do A.C.). Anna Hadjihambi jest finansowana przez Instytut Hepatologii Rogera Williamsa, Fundację Badań nad Wątrobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
eXIA160Binitio Biomedyczne, Inc.https://www.binitio.com/?Page=Products
Dieta wysokotłuszczowa zawierająca 60% kilokalorii z tłuszczuResearch Diets, Nowy Brunszwik, NJ, USAD12492
Syrop kukurydziany o wysokiej zawartości fruktozy Najlepsze smaki, maśćokulistyczna CA hfcs-1gallon
Lacrinorm Bausch & Lomb
Normalna dieta z 10% kilokalorii z tłuszczu Research Diets, Nowy Brunszwik, NJ, USAD12450
Viscover ExiTron nano 12000 Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-095-698
VivoQuantInvicro
X-CUBE Molecubes, Belgiahttps://www.molecubes.com/systems/

Bibliografia

  1. Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
  2. Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
  3. Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
  4. Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467(2021).
  5. Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
  6. Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
  7. Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51(2017).
  8. Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
  9. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  10. Koyama, Y., Brenner, D. A. Liver inflammation and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 55-64 (2017).
  11. Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511(2022).
  12. Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
  13. Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
  14. Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
  15. Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
  16. Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
  17. Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
  18. Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
  19. Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181(2010).
  20. Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
  21. Feng, J., et al. Abnormalities in the enamel in bmp2-deficient mice. Cells, Tissues, Organs. 194 (2-4), 216-221 (2011).
  22. Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
  23. Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178(2015).
  24. Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
  25. Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026(2012).
  26. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410(2020).
  27. Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
  28. Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991(2015).
  29. Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
  30. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  31. De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
  32. Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
  33. Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085(2016).
  34. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
  35. Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626(2013).
  36. Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68(2022).
  37. Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6(2010).
  38. Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
  39. Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751(2022).
  40. Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
  41. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130(2019).
  42. Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
  43. Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256(2015).
  44. Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
  45. Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
  46. Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie mikro-CTprogresja choroby wątrobynaczyniowa sieć wątrobowaśrednica żyły wrotnejwzględna objętość krwiocena stłuszczenia wątrobyfunkcjonalny wychwyt tkankowyprzedkliniczny model mysiwstrzyknięcie środka kontrastowego
Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.