Artykuł metodologiczny

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

DOI:

10.3791/64838

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Roger Williams Institute of Hepatology London, Foundation for Liver Research, 2Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Department of Physiology, Medical School, National and Kapodistrian University of Athens, 4BIOEMTECH, Lefkippos Attica Technology Park NCSR "Demokritos"

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest rosnącym globalnym problemem zdrowotnym, a wpływ NAFLD jest potęgowany przez obecny brak skutecznych metod leczenia. Istotnymi czynnikami ograniczającymi terminową i trafną diagnozę (w tym klasyfikację) i monitorowanie NAFLD, a także opracowywanie potencjalnych terapii, są obecne braki w charakterystyce struktury mikrośrodowiska wątroby oraz punktacji stopnia zaawansowania choroby w sposób czasoprzestrzenny i nieinwazyjny. Korzystając z mysiego modelu NAFLD indukowanego dietą, zbadaliśmy zastosowanie technik obrazowania mikrotomografii komputerowej (CT) in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD. Ta metodologia obrazowania pozwala na podłużną analizę stłuszczenia wątroby i funkcjonalnego wychwytu tkankowego, a także ocenę względnej objętości krwi, średnicy żyły wrotnej i gęstości sieci naczyniowej. Zrozumienie adaptacji sieci naczyniowej wątroby podczas progresji NAFLD i skorelowanie tego z innymi sposobami charakteryzowania postępu choroby (stłuszczenie, zapalenie, zwłóknienie) przy użyciu proponowanej metody może utorować drogę do ustanowienia nowych, bardziej wydajnych i powtarzalnych podejść do badań NAFLD u myszy. Oczekuje się również, że protokół ten zwiększy wartość przedklinicznych modeli zwierzęcych w badaniach nad rozwojem nowych terapii zapobiegających postępowi choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest chorobą metaboliczną, która dotyka około 25% populacji i >80% osób chorobliwie otyłych1. Szacuje się, że jedna trzecia tych osób rozwija się w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), które charakteryzuje się stłuszczeniem wątroby, stanem zapalnym i zwłóknieniem2. NASH jest stadium choroby o znacznie wyższym ryzyku rozwoju marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)3,4. Z tego powodu NASH jest obecnie drugą najczęstszą przyczyną przeszczepu wątroby i oczekuje się, że wkrótce stanie się najważniejszym predyktorem przeszczepu wątroby5,6,7. Pomimo rozpowszechnienia i nasilenia choroby, żadna terapia specyficzna dla choroby nie jest dostępna dla NAFLD, a istniejące metody leczenia mają na celu jedynie zwalczanie patologii związanych z chorobą, takich jak insulinooporność i hiperlipidemia5,6.

W ostatnich latach patofizjologiczna rola i adaptacje śródbłonka i ogólnie sieci naczyniowej tkanek metabolicznych, takich jak tkanka tłuszczowa i wątroba, zyskują coraz większe znaczenie w badaniach, zwłaszcza podczas otyłości i rozregulowania metabolizmu7,8. Śródbłonek jest monowarstwą komórkową, która wewnętrznie wyściela sieć naczyniową, działając jako bariera funkcjonalna i strukturalna. Przyczynia się również do różnych procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak zakrzepica, transport metabolitów, stan zapalny i angiogeneza9,10. W przypadku wątroby sieć naczyniowa charakteryzuje się między innymi obecnością wysoce wyspecjalizowanych komórek, określanych jako sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby (LSEC). Komórki te nie mają błony podstawnej i mają wiele okien, co pozwala na łatwiejsze przenoszenie substratów między krwią a miąższem wątroby. Ze względu na ich charakterystyczne położenie anatomiczne i charakterystykę, LSEC prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w procesach patofizjologicznych wątroby, w tym w rozwoju zapalenia wątroby i zwłóknienia podczas NAFLD/NASH. Rzeczywiście, patologiczne, molekularne i komórkowe adaptacje, którym podlegają LSEC w przebiegu NAFLD, przyczyniają się do progresji choroby11. W szczególności zależna od LSEC angiogeneza wątrobowa, która ma miejsce podczas NAFLD, jest istotnie związana z rozwojem stanu zapalnego i progresją choroby do NASH lub nawet HCC12. Poza tym wczesna NAFLD związana z otyłością charakteryzuje się rozwojem insulinooporności w LSEC, co poprzedza rozwój zapalenia wątroby lub innych zaawansowanych objawów NAFLD13.

Dodatkowo, LSEC pojawiły się ostatnio jako centralne regulatory przepływu krwi w wątrobie i adaptacji sieci naczyniowej podczas chorób wątroby o różnych etiologiach14,15. Rzeczywiście, przewlekła choroba wątroby charakteryzuje się wyraźnym zwężeniem naczyń krwionośnych wewnątrz wątroby i zwiększonym oporem przepływu krwi, co przyczynia się do rozwoju nadciśnienia wrotnego16. W przypadku NAFLD do tego zjawiska przyczynia się kilka mechanizmów związanych z LSEC. Na przykład, insulinooporność specyficzna dla LSEC, jak wspomniano powyżej, jest związana ze zmniejszonym insulinozależnym rozszerzeniem naczyń krwionośnych wątroby13. Poza tym w trakcie choroby unaczynienie wątroby staje się bardziej wrażliwe na czynniki zwężające naczynia krwionośne, co dodatkowo przyczynia się do upośledzenia przepływu krwi w wątrobie i prowadzi do pojawienia się stresu ścinającego, co skutkuje zaburzeniem mikrokrążenia sinusoidalnego17. Fakty te sugerują, że układ naczyniowy jest kluczowym celem w chorobach wątroby. Niemniej jednak czynnikami ograniczającymi terminową diagnozę i monitorowanie NAFLD/NASH, a także opracowywanie potencjalnych terapii, są braki w spójnej charakterystyce mikrośrodowiska wątroby i struktury (mikro)naczyniowej, a także punktacji stopnia zaawansowania choroby w sposób czasoprzestrzenny i nieinwazyjny.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej (CT) jest obecnie złotym standardem nieinwazyjnej metody obrazowania do dokładnego przedstawiania informacji anatomicznych w żywym organizmie. Mikrotomografia komputerowa i rezonans magnetyczny to dwie uzupełniające się metody obrazowania, które mogą obejmować szeroki zakres patologii i zapewniają wyjątkową rozdzielczość i szczegółowość obrazowanych struktur i tkanek. Mikrotomografia komputerowa, w szczególności, jest bardzo szybkim i dokładnym narzędziem, które jest często używane do badania patologii, takich jak choroby kości i związane z nimi zmiany powierzchni kości18, oceny postępu zwłóknienia płuc w czasie19, diagnozowania raka płuc i jego stopnia zaawansowania20, a nawet badania patologii stomatologicznych21, bez specjalnego przygotowania (lub niszczenia) obrazowanych próbek.

Technologia obrazowania mikro-CT opiera się na różnych właściwościach tłumienia różnych organów pod względem interakcji promieniowania rentgenowskiego z materią. Narządy wykazujące duże różnice w tłumieniu promieniowania rentgenowskiego są przedstawiane na obrazach TK z wysokim kontrastem (tj. płuca wydają się ciemne, a kości jasne). Narządy o bardzo podobnych właściwościach tłumienia (różne tkanki miękkie) są trudne do odróżnienia na obrazach CT22. Aby rozwiązać to ograniczenie, specjalistyczne środki kontrastowe na bazie jodu, złota i bizmutu zostały szeroko przebadane pod kątem stosowania in vivo. Czynniki te zmieniają właściwości tłumiące tkanek, w których się gromadzą, są powoli usuwane z krążenia i umożliwiają równomierne i stabilne zmętnienie całego układu naczyniowego lub wybranych tkanek23.

W diagnostyce ludzi, obrazowanie CT i porównywalne techniki, takie jak frakcja tłuszczu o gęstości protonów pochodząca z MRI, są już używane do określania zawartości tłuszczu w wątrobie24,25. W kontekście NAFLD wysoki kontrast tkanek miękkich jest niezbędny do dokładnego rozróżnienia zmian patologicznych lub małych naczyń. W tym celu stosuje się środki kontrastowe zapewniające zwiększony kontrast charakterystyki tkanki wątroby. Takie narzędzia i materiały pozwalają na badanie wielu cech wątroby i możliwych przejawów patologii, takich jak architektura i gęstość sieci naczyniowej, odkładanie się lipidów/stłuszczenie oraz funkcjonalny wychwyt tkankowy/transfer lipidów (chylomikron) w wątrobie. Dodatkowo można również ocenić względną objętość krwi w wątrobie i średnicę żyły wrotnej. W bardzo krótkim czasie skanowania wszystkie te parametry dostarczają różnych i uzupełniających się informacji na temat oceny i progresji NAFLD, które można wykorzystać do opracowania nieinwazyjnej i szczegółowej diagnozy.

W tym artykule przedstawiamy krok po kroku protokół użycia nowatorskich technik obrazowania in vivo mikro-CT jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD. Korzystając z tego protokołu, można przeprowadzić podłużną analizę stłuszczenia wątroby i wychwytu funkcjonalnego tkanki, a także ocenę względnej objętości krwi, średnicy żyły wrotnej i gęstości sieci naczyniowej, i zastosować ją w mysich modelach choroby wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone przez personel BIOEMTECH zgodnie z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi opieki społecznej i zostały zatwierdzone przez władze krajowe (numer licencji EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Wszystkie eksperymenty zostały zaprojektowane i przedstawione zgodnie z wytycznymi ARRIVE26. Myszy zostały zakupione w Greckim Instytucie Pasteura w Atenach w Grecji.

UWAGA: Zwierzęta były trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach wzbogaconych szynami i tekturowymi rurkami w pomieszczeniu o temperaturze 20-22 °C, wilgotności względnej 50%-60% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło 07:00-19:00). Połączenie diety wysokotłuszczowej (HFD) i syropu kukurydzianego o wysokiej zawartości fruktozy (HFCS), słodzika zawierającego fruktozę i glukozę, szeroko stosowanego w nowoczesnych typach diet wzbogaconych w tłuszcze, zostało wykorzystane do wywołania NAFLD jako uznanego wiarygodnego modelu27,28,29,30. W wieku 7-8 tygodni samce myszy C57BL/6 miały dostęp ad libitum do normalnej diety (n = 2) z 10% kilokalorii z tłuszczu lub HFD (n = 2) zawierającej 60% kilokalorii z tłuszczu uzupełnionego 5% HFCS w wodzie przez 22 tygodnie. Masę ciała uzyskiwano co tydzień za pomocą wagi cyfrowej, a w okresie eksperymentalnym dobrostan zwierząt monitorowano co drugi dzień za pomocą arkusza wyników. Pod koniec protokołu obrazowania myszy zostały poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Protokół obrazowania jest podsumowany w Rysunek 1.

  1. Znieczulij mysz za pomocą 3%-4% izofluranu (w powietrzu w pomieszczeniu) i utrzymuj temperaturę ciała za pomocą dedykowanej poduszki grzewczej.
    UWAGA: Brak odruchu wycofania pedału musi być wykorzystany do potwierdzenia wystarczającej głębokości znieczulenia przed rozpoczęciem skanowania.
  2. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia przed eksperymentem.
  3. Umieść zwierzę w kołysce tomografu komputerowego, zabezpiecz stożek nosowy i przełącz na 1,5%-3% izofluranu (w powietrzu w pomieszczeniu) w celu konserwacji.
    UWAGA: Brak odruchu odstawienia pedału musi być wykorzystany do potwierdzenia odpowiedniej zawartości procentowej izofluranu do podtrzymania znieczulenia.
  4. Monitoruj mysz w sposób ciągły.

2. Przygotowanie do skanowania wstępnego

UWAGA: Obrazowanie jest wykonywane w dwóch fazach eksperymentalnych, aby umożliwić odpowiednie usunięcie pierwszego środka kontrastowego z krążenia i tkanek. eXIA (pierwszy środek kontrastowy) jest podawany w pierwszej fazie, a ExiTron (drugi środek kontrastowy) w drugiej fazie, jak opisano w sekcji "Przebieg pracy z obrazowaniem" (sekcja 3) poniżej.

  1. Odczekać, aż środek kontrastowy (eXIA lub ExiTron, w zależności od fazy eksperymentalnej) osiągnie temperaturę pokojową przez 3 godziny.
  2. Ustaw następujące parametry skanowania w tomografie komputerowym: protokół wysokiej rozdzielczości pod napięciem lampy 50 kVp i prądem 460 μA, bez spirali, 720 projekcji/obrót, cztery obroty i czas akwizycji 4 min.

3. Przebieg pracy z obrazowaniem

  1. Faza eksperymentalna 1
    1. Obliczyć i przygotować objętość pierwszego środka kontrastowego, który ma być podany w nierozcieńczonej dawce 6 μl/g masy ciała w celu uzyskania maksymalnego kontrastu.
    2. Przygotować cewnik do żyły ogonowej, napełniając go solą fizjologiczną i podłączając do strzykawki wypełnionej środkiem kontrastowym.
    3. Uzyskaj wstępny kontrastowy skan całego ciała (WB) i wątroby.
    4. Upewnij się, że w strzykawce lub cewniku nie ma pęcherzyków ani zatorów.
    5. Wprowadzić wstępnie napełniony cewnik do żyły ogonowej i podać środek kontrastowy w postaci wstrzyknięcia wykonywanego powoli i ręcznie, przez 1-3 minuty (nie w postaci wstrzyknięcia w bolusie). Można użyć pompy strzykawkowej, jeśli jest ustawiona na odpowiednią szybkość infuzji.
      UWAGA: Ogon zwierzęcia można umieścić w letniej wodzie, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych i pomóc we wprowadzeniu cewnika
    6. Uzyskać skany WB i wątroby w różnych punktach czasowych, jak wskazano w Tabeli 1.
      UWAGA: Jeśli uzyskanie wszystkich punktów nie jest możliwe, należy skupić się na 45 minutach po wstrzyknięciu (PI), które są punktem maksymalnego wychwytu wątrobowego, i 48 godzinach PI, kiedy osiąga się klirens.
  2. Faza eksperymentalna 2
    1. Ponownie przygotować mysz zgodnie z opisem w punkcie 1 do podania drugiego środka kontrastowego 10 dni po ostatnim odczycie z pierwszym środkiem kontrastowym (48 godzin PI).
    2. Wykonaj kroki 2.1-2.2.
    3. Obliczyć i przygotować objętość drugiego środka kontrastowego, który ma być podawany w nierozcieńczonej dawce 8 μl/g masy ciała w celu uzyskania maksymalnego kontrastu.
    4. Przygotować cewnik do żyły ogonowej, napełniając go solą fizjologiczną i podłączając do strzykawki wypełnionej środkiem kontrastowym.
    5. Uzyskaj wstępny kontrast WB i skan wyjściowy wątroby, aby ocenić względną objętość krwi i stłuszczenie wątroby.
    6. Upewnij się, że w skanie nie jest wykrywalny żaden kontrast, który wskazuje na całkowite usunięcie pierwszego środka kontrastowego.
    7. Wprowadzić wstępnie napełniony cewnik do żyły ogonowej i podać środek kontrastowy w postaci wstrzyknięcia dożylnego wykonywanego powoli i ręcznie, przez 1-3 minuty (nie w formie wstrzyknięcia w bolusie). Można użyć pompy strzykawkowej, jeśli jest ustawiona na odpowiednią szybkość infuzji.
    8. Uzyskać skany WB i wątroby w różnych punktach czasowych, jak wskazano w Tabeli 1.
      UWAGA: Skany WB są uzyskiwane po 10 minutach i 4 godzinach PI. Znaczny upływ czasu między nimi pozwala na ocenę biodystrybucji znacznika w organizmie, a także jego względnego klirensu.

4. Ekstrakcja i analiza danych

UWAGA: W tym protokole dostępne są kroki ekstrakcji i analizy danych oparte na konkretnym oprogramowaniu do przetwarzania obrazowania (patrz Tabela materiałów). Opisane kroki mogą wymagać dostosowania w przypadku korzystania z innego oprogramowania.

  1. Ocena odkładania się lipidów/stłuszczenia wątroby.
    UWAGA: Do oceny stłuszczenia wątroby nie stosuje się środka kontrastowego i przeprowadza się porównanie między kontrolą a patologią. Ze względu na stosunkowo duże odchylenia we właściwościach tłumienia tkanek między różnymi myszami, wartości gęstości są normalizowane dla wątroby w stosunku do śledziony (tkanka beztłuszczowa) i tłuszczu (bezwzględne tkanki tłuszczowe) zgodnie z następującym równaniem i zgodnie z wcześniejszym opisem25:
    figure-protocol-1
    1. Aby przeprowadzić analizę, załaduj plik DICOM ze skanem wstępnym z kontrastem i dostosuj pasek/kontrast, aby wyraźnie widzieć wątrobę, śledzionę i białą tkankę tłuszczową (WAT).
    2. Uzyskaj dostęp do narzędzia Modelling Operator za pomocą menu rozwijanego narzędzia na panelu przednim i wybierz opcję 3D ROI Tool.
    3. W obszarze Operator ROI 3D wybierz opcję Dodaj ROI, aby wygenerować wiele ROI (do ośmiu dla każdej tkanki) w celu wykonania próbkowania w obszarach, w których wątroba (najlepiej w obszarach lewego płata przyśrodkowego, prawego płata przyśrodkowego i lewego płata bocznego) i śledziona wydają się czyste, bez widocznych naczyń krwionośnych i tłuszczu.
      UWAGA: W przypadku WAT ROI są wybierane w środku magazynu trzewnej tkanki tłuszczowej. Zalecane obszary są pokazane w Rysunek 2. Metody normalizacji wykorzystujące stosunek wątroba do śledziony i bez uwzględniania WAT mogą być również stosowane zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami31.
    4. W obszarze 3D Paint Mode (Tryb malowania 3D) i funkcja Erode/Dilate (Erode/Dilate) wybierz opcję 2D i użyj wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
    5. Użyj narzędzia Kula farba ROI o średnicy 8 pikseli, aby ręcznie narysować ROI 2D.
    6. Wykonaj próbkowanie, segmentując ROI 2D w obszarach zainteresowania za pomocą narzędzia Krzyżyk na płaszczyźnie poprzecznej, jak pokazano na Rysunek 3A.
    7. Kliknij wybrany punkt w płaszczyźnie strzałkowej i koronalnej, aby zakończyć segmentację ROI 2D, jak pokazano na Rysunek 3B.
    8. Powtórz proces definiowania pozostałych ROIs.
      UWAGA: Podczas pobierania próbek należy unikać obszarów granicznych narządów, ponieważ może to powodować szumy i wpływać na wiarygodność obliczonej wartości jednostki Hounsfielda (HU) dla każdego ROI.
    9. Po uzyskaniu posegmentowanych zwrotów z inwestycji przejdź do sekcji Nawigacja i wybierz opcję Pokaż tabelę, aby wyświetlić tabelę kwantyfikacyjną zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Wartości będące przedmiotem zainteresowania są wymienione w kolumnie "Średnia", która zawiera liczbowe średnie wartości wokseli (HU) zawarte w ROI dla narządów będących przedmiotem zainteresowania. Zanotuj interesujące Cię wartości lub zapisz całą tabelę, wybierając pozycję Eksportuj tabelę.
    10. Oblicz średnią HU dla wątroby, śledziony i WAT i wprowadź wartości do powyższego równania, aby obliczyć procentową zawartość tłuszczu w wątrobie.
  2. Funkcjonalny wychwyt tkankowy/transfer lipidów (chylomikron) w wątrobie
    UWAGA: Wychwyt funkcjonalny tkanki/transfer lipidów (chylomikron) jest analizowany na podstawie uzyskanych skanów po 45 minutach i 48 godzinach od pierwszej infuzji środka kontrastowego, w oparciu o wcześniej opublikowaną metodę32. Kontrast oblicza się dla różnych tkanek i punktów czasowych za pomocą poniższego równania:
    figure-protocol-2
    Narząd PVt i jest średnią wartością piksela w narządzie w czasie ti (w zakresie od 0 h do 48 h), a narząd PV t0 jest średnią wartością piksela w narządzie na obrazie bez kontrastu.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, załaduj plik DICOM eXIA scan i dostosuj pasek/kontrast, aby wyraźnie widzieć wątrobę, śledzionę i lewą komorę.
    2. Uzyskaj dostęp do operatora modelowania za pomocą menu rozwijanego narzędzia na panelu przednim i wybierz narzędzie 3D ROI Tool.
    3. W obszarze Operator ROI 3D wybierz opcję Dodaj ROI, aby podzielić wiele ROI dla wątroby.
    4. W trybie malowania 3D i funkcji Erode/Dilate użyj narzędzia ROI do malowania kuli o średnicy 8 pikseli i −1 erode.
      UWAGA: Wybierz wiele ROI na plasterkach, w których każdy narząd jest wyraźnie widoczny. Unikaj regionów przygranicznych, ponieważ może to powodować szumy i wpływać na wiarygodność obliczonej wartości HU dla każdego zwrotu z inwestycji. Spowoduje to próbkowanie wielu ROI 3D, które odpowiadają objętościom małych narządów.
    5. Użyj wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
    6. Gdy jesteś zadowolony z zaprojektowanych ROI, przejdź do Nawigacji i wybierz opcję Pokaż tabelę, aby wyświetlić tabelę kwantyfikacyjną zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Interesujące nas wartości są wymienione w kolumnie "Średnia", która wyświetla liczbowe średnie wartości wokseli (HU) uwzględnione w ROI. Średnia wartość HU zwrotu z inwestycji każdego narządu odpowiada ti i t. Zanotuj interesujące Cię wartości lub zapisz całą tabelę, wybierając pozycję Eksportuj tabelę.
    7. Aby uzyskać narząd PV t0, powtórz wszystkie powyższe kroki, korzystając z pliku DICOM przed kontrastem, aby obliczyć średnią jasność wątroby, śledziony i lewej komory przed wstrzyknięciem środka kontrastowego.
    8. Wstawić wartości do powyższego równania, aby wyodrębnić kontrast procentowy odpowiadający funkcjonalnemu wychwytowi tkankowemu/transferowi lipidów (chylomikronu).
  3. Architektura i gęstość wątrobowej sieci naczyniowej
    UWAGA: Analiza architektury i gęstości sieci naczyniowej wątroby opiera się na wcześniej opublikowanej metodologii33 i jest wykonywana na skanach wątroby uzyskanych 10 min PI drugiego środka kontrastowego.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, załaduj plik DICOM skanowania ExiTron i dostosuj pasek/kontrast, aby wyraźnie zobaczyć sieć naczyniową wątroby.
    2. Uzyskaj dostęp do operatora modelowania za pomocą menu rozwijanego narzędzia na panelu przednim i wybierz narzędzie 3D ROI Tool.
    3. W obszarze Operator ROI 3D wybierz pozycję Dodaj ROI, aby wygenerować ROI 3D dla wątroby.
    4. W obszarze 3D Paint Mode (Tryb malowania 3D) i Erode/Dilate (Erode/Dilate) wybierz opcję 3D.
      UWAGA: Użyj narzędzia ROI farby sferycznej z erozją -1, aby zdefiniować warstwy segmentacji w płaszczyźnie koronalnej. Średnica narzędzia do malowania ROI musi być dostosowana do każdej warstwy (w celu dodania/usunięcia pożądanych/niechcianych wyborów wokseli). Zaleca się, aby objętość wątroby została początkowo zdefiniowana w poprzek płaszczyzny czołowej, a następnie można użyć płaszczyzny poprzecznej i strzałkowej do skorygowania ROI. Ten proces wymaga precyzji. Użytkownik musi być bardzo ostrożny, aby nie uwzględniać innych tkanek, naczyń i kości podczas segmentacji każdej warstwy ROI, upewniając się, że wszystkie obszary wątroby są uwzględnione w zdefiniowanym ROI. Z tego powodu kluczowe jest zapoznanie się z anatomicznymi granicami wątroby.
    5. Po uzyskaniu satysfakcjonującego zwrotu z inwestycji w wątrobę wykonaj cięcie, aby usunąć wszystkie woksele z danych obrazu, które nie należą do początkowo podzielonego zwrotu z inwestycji wątroby. W tym celu wybierz zwrot z inwestycji w wątrobę z selektora ROI i kliknij ikonę Wykonaj cięcie. Ta operacja usuwa tło i pozostawia zwrot z inwestycji w wątrobę bez zmian.
      UWAGA: Chociaż funkcje cofania/ponawiania mają zastosowanie do wszystkich operacji wykonywanych za pomocą narzędzia 3D ROI, operacji wycinania ROI nie można cofnąć. Tak więc przed tą akcją użytkownik może rozważyć zapisanie początkowego zwrotu z inwestycji w wątrobę w formacie DICOM.
    6. Wynikowy zwrot z inwestycji wątroby obejmuje sieć naczyniową i otaczającą tkankę, które należy usunąć. W tym celu zresetuj zwrot z inwestycji w wątrobę, klikając przycisk Resetuj ROI miotła.
    7. Użyj interfejsu, który się pojawi, aby przenieść wszystkie piksele ROI wątroby na tło.
      UWAGA: Zwrot z inwestycji w wątrobę będzie nadal istniał po tej operacji, ale nie będzie już zawierał żadnych wokseli.
    8. Aby ponownie podzielić zwrot z inwestycji wątroby tak, aby zawierał tylko piksele związane z naczyniami krwionośnymi, przejdź do pozycji Algorytmy segmentacji oznaczone ikoną magicznej różdżki i wybierz opcję Połączone progowanie.
    9. Zdefiniuj ROI jako wyjście, a tło jako dane wejściowe z menu rozwijanego danych wejściowych przed zastosowaniem progu.
    10. Ustaw progi, klikając ikony Min i Max po lewej stronie każdego pola progu, aby wypełnić wartości maksymalne i minimalne oraz uzyskać sieć naczyniową.
      UWAGA: Tylko piksele z wybranego zakresu zostaną uwzględnione w wynikowym ROI. Dostosowanie wartości progowych między różnymi zwierzętami zapewnia, że te same obszary anatomiczne są brane pod uwagę w odniesieniu do dokładnej ilości środka kontrastowego wstrzykiwanego każdemu zwierzęciu. Jest to stałe wśród wybranych tkanek, nawet jeśli wartości liczbowe nie są identyczne.
    11. Użyj narzędzia Krzyżyk, aby kliknąć punkt, w którym sieć naczyniowa wydaje się czysta, a następnie kliknij Zastosuj, aby przeprowadzić segmentację.
    12. Aktywuj przeglądarkę projekcji maksymalnej intensywności (MIP).
    13. Oceń wynikowy zwrot z inwestycji w wątrobę pod kątem tego, jak przejrzysta wydaje się sieć naczyniowa w widoku MIP.
    14. Jeśli tkanka pozostaje w częściach ROI wątroby, powtórz kroki 4.3.5-4.3.11, dostosowując wartość progu min, aż podzielony na segmenty ROI wątroby wyraźnie będzie reprezentował sieć naczyniową.
    15. Po uzyskaniu uzyskanego zwrotu z inwestycji w wątrobę wygeneruj tabelę kwantyfikacyjną zawierającą obliczoną objętość zwrotu z inwestycji w wątrobę w milimetrach sześciennych.
      UWAGA: Interesujące wartości są wymienione w kolumnie "mm3", która zawiera liczbową wartość objętości wokseli (HU) zawartych w ROI wątroby. Zanotuj interesujące Cię wartości lub zapisz całą tabelę, wybierając pozycję Eksportuj tabelę.
  4. Względna objętość krwi w wątrobie
    UWAGA: Do pomiaru względnej objętości krwi w wątrobie (rBV), która jest istotnie skorelowana z ilością nowo powstałych naczyń krwionośnych podczas progresji zwłóknienia, stosuje się skany przed kontrastem i skany po 4 godzinach od drugiego wstrzyknięcia środka kontrastowego. Analiza jest wykonywana zgodnie z wcześniejszym opisem34.
    1. Aby przeprowadzić tę analizę, załaduj plik DICOM skanowania ExiTron i dostosuj bar/contrast.
      UWAGA: Wyłącz przeglądarkę MIP: w obszarze Preferencje zaznacz pole wyboru, aby wyłączyć przeglądarkę MIP po załadowaniu. W przypadku dużych zestawów danych może to poprawić szybkość ładowania.
    2. Uzyskaj dostęp do operatora modelowania za pomocą menu rozwijanego narzędzia na panelu przednim i wybierz narzędzie 3D ROI Tool. To narzędzie zapewnia zaawansowane opcje rysowania, wizualizacji, zapisywania i kwantyfikowania regionów 2D i 3D.
    3. W obszarze Operator ROI 3D wybierz opcję Dodaj ROI i podziel na segmenty dwie wartości ROI: jedną dla wątroby i jedną dla dużego naczynia krwionośnego.
    4. W obszarze 3D Paint Mode (Tryb malowania 3D) i funkcja Erozja/Dylatacja (Erode/Dilate) wybierz opcję 2D.
      UWAGA: Zaleca się użycie narzędzia ROI do farby kulowej o średnicy 8-10 pikseli dla wątroby i 4-6 pikseli dla naczynia krwionośnego. Jednak średnicę narzędzia do malowania można dostosować w zależności od tego, jak mały jest wybrany obszar.
    5. Użyj wyświetlonego interfejsu, aby określić nazwę i kolor dla każdego ROI.
      UWAGA: Wybierz od dwóch do pięciu wycinków centralnych części tkanek będących przedmiotem zainteresowania i zdefiniuj warstwy segmentacji, aby wygenerować zwrot z inwestycji 2D dla każdej tkanki. Wybierając obszary na każdym wycinku, unikaj obszarów granicznych narządów, jak pokazano na Rysunek 4, ponieważ może to wprowadzać szumy i wpływać na wiarygodność obliczonej wartości HU dla każdego ROI.
    6. Gdy jesteś zadowolony z zaprojektowanych ROI, przejdź do Nawigacji i wybierz opcję Pokaż tabelę, aby wyświetlić tabelę kwantyfikacyjną zawierającą obliczone wartości HU dla każdego ROI.
      UWAGA: Interesujące nas wartości są wymienione w kolumnie "Średnia", która wyświetla liczbowe średnie wartości wokseli (HU) uwzględnione w ROI. Zanotuj interesujące Cię wartości lub zapisz całą tabelę, wybierając pozycję Eksportuj tabelę.
    7. Powtórz wszystkie kroki dla pliku DICOM przed kontrastem, aby uzyskać średnią jasność wątroby przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. W tym celu należy wykonać kroki 4.4.2-4.4.5 tylko dla wątroby.
    8. Oblicz średnie wartości HU dla każdej tkanki w równoważnych punktach czasowych i wprowadź uzyskane wartości do poniższego równania:
      figure-protocol-3
      UWAGA: Duże naczynie krwionośne po wstrzyknięciu środka kontrastowego uważa się za 100% rBV, a wątroba, przed podaniem środka kontrastowego, jest uważana za 0% rBV.
  5. Średnica żyły wrotnej
    UWAGA: W przypadku pomiarów średnicy żyły wrotnej analizowane są te same skany, które są używane do pomiarów rBV w wątrobie, jak opisano wcześniej35.
    1. Załaduj plik DICOM skanowania ExiTron i dostosuj pasek/kontrast.
    2. Zlokalizuj płaszczyzny poprzeczne trzech do czterech warstw powyżej połączenia żył krezkowych górnych i śledziony (Rysunek 5).
    3. Użyj narzędzia Linijka, aby zmierzyć dokładną odległość między dwoma punktami (tj. średnicę obszaru żyły kołowej).
      UWAGA: Odległość jest wyodrębniana na obrazie, ale można również przejść do Nawigacji i wybrać opcję Pokaż tabelę, aby wyświetlić tabelę kwantyfikacyjną zawierającą obliczoną odległość lub wybrać opcję Eksportuj tabelę, aby zapisać wynik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym reprezentatywnym badaniu, obrazowanie mikro-CT bez żadnego środka kontrastowego wykazało wyższy procent tłuszczu w wątrobie u myszy z NAFLD w porównaniu do kontrolnych (Tabela 2), potwierdzając patologię. Stosując środek kontrastowy ExiTron oraz opisaną powyżej architekturę sieci naczyniowej wątroby i analizę gęstości, stwierdzono, że całkowita gęstość objętościowa sieci naczyniowej wątroby jest wyższa u myszy z NAFLD w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (Figura 6, Tabela...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie zalecaną metodą diagnozowania i oceny stopnia zaawansowania NAFLD u ludzi jest biopsja wątroby, która niesie ze sobą ryzyko złożoności krwawienia, a także niedokładności pobierania próbek40. Wręcz przeciwnie, w modelach zwierzęcych taka diagnoza jest przeprowadzana za pomocą histologii post mortem, chociaż protokoły biopsji wątroby, która daje się przeżyć, są obecnie dostępne i zalecane, gdy pozwala na to projekt badania41. Zastosowanie histologii pośmiertnej oznacz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Prace te były wspierane przez Grecką Fundację Badań i Innowacji (#3222 do A.C.). Anna Hadjihambi jest finansowana przez Instytut Hepatologii Rogera Williamsa, Fundację Badań nad Wątrobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
eXIA160Binitio Biomedyczne, Inc.https://www.binitio.com/?Page=Products
Dieta wysokotłuszczowa zawierająca 60% kilokalorii z tłuszczuResearch Diets, Nowy Brunszwik, NJ, USAD12492
Syrop kukurydziany o wysokiej zawartości fruktozy Najlepsze smaki, maśćokulistyczna CA hfcs-1gallon
Lacrinorm Bausch & Lomb
Normalna dieta z 10% kilokalorii z tłuszczu Research Diets, Nowy Brunszwik, NJ, USAD12450
Viscover ExiTron nano 12000 Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-095-698
VivoQuantInvicro
X-CUBE Molecubes, Belgiahttps://www.molecubes.com/systems/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
  2. Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
  3. Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
  4. Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467(2021).
  5. Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
  6. Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
  7. Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51(2017).
  8. Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
  9. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  10. Koyama, Y., Brenner, D. A. Liver inflammation and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 55-64 (2017).
  11. Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511(2022).
  12. Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
  13. Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
  14. Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
  15. Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
  16. Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
  17. Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
  18. Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
  19. Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181(2010).
  20. Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
  21. Feng, J., et al. Abnormalities in the enamel in bmp2-deficient mice. Cells, Tissues, Organs. 194 (2-4), 216-221 (2011).
  22. Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
  23. Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178(2015).
  24. Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
  25. Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026(2012).
  26. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410(2020).
  27. Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
  28. Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991(2015).
  29. Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
  30. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  31. De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
  32. Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
  33. Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085(2016).
  34. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
  35. Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626(2013).
  36. Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68(2022).
  37. Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6(2010).
  38. Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
  39. Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751(2022).
  40. Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
  41. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130(2019).
  42. Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
  43. Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256(2015).
  44. Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
  45. Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
  46. Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie mikro CTprogresja choroby w trobynaczyniowa sie w trobowarednica y y wrotnejwzgl dna obj to krwiocena st uszczenia w trobyfunkcjonalny wychwyt tkankowyprzedkliniczny model mysiwstrzykni cie rodka kontrastowego

Powiązane artykuły