Artykuł metodologiczny

Przewidywanie farmakologii sieciowej i eksperymentalna walidacja mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc

DOI:

10.3791/64847

⸱

3 marca 2023

 ,  ,  , 
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie ujawnia mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc na podstawie farmakologii sieciowej i weryfikacji eksperymentalnej. Badanie wykazało również, że szlak sygnałowy PI3K/AKT odgrywa istotną rolę w działaniu Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naszym celem było zbadanie mechanizmu działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc (LUAD) w oparciu o farmakologię sieciową i weryfikację eksperymentalną. Skuteczne składniki i potencjalne cele Trichosanthis i Fritillaria thunbergii zebrano za pomocą wysokoprzepustowej bazy danych eksperymentów i badań referencyjnych (HERB) tradycyjnej medycyny chińskiej oraz bazy danych podejścia zespołowego podobieństwa (SEA), a cele związane z LUAD zostały odpytane przez bazy danych GeneCards i Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Sieć leków-komponentów-chorób-celów została skonstruowana przez oprogramowanie Cytoscape. Przeprowadzono analizę sieci interakcji białko-białko (PPI), funkcji ontologii genów (GO) oraz analiz wzbogacania szlaków encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG) w celu uzyskania podstawowych celów i kluczowych szlaków. Do późniejszej walidacji eksperymentalnej wykorzystano wodny ekstrakt z komórek Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i A549. Za pomocą bazy danych HERB i przeszukania literatury przebadano 31 skutecznych związków i 157 potencjalnych genów docelowych Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, z których 144 były celami regulatorowymi Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc. Analiza funkcjonalnego wzbogacenia GO wykazała, że mechanizm działania Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc polega głównie na fosforylacji białek. Analiza wzbogacenia szlaku KEGG sugeruje, że leczenie gruczolakoraka płuc przez Trichosanthes-Fritillaria thunbergii obejmuje głównie szlak sygnałowy PI3K/AKT. Walidacja eksperymentalna wykazała, że wodny ekstrakt Trichosanthes-Fritillaria thunbergii może hamować proliferację komórek A549 i fosforylację AKT. Za pomocą farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej zweryfikowano, że szlak sygnałowy PI3K/AKT odgrywa istotną rolę w działaniu Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w leczeniu gruczolakoraka płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc odnosi się do nowotworów złośliwych wywodzących się z błony śluzowej oskrzeli płuc, w tym raka płaskonabłonkowego, gruczolakoraka, raka wielkokomórkowego i raka drobnokomórkowego1. Gruczolakorak płuc (LUAD) jest najczęstszym typem raka płuc, stanowiącym około 40% wszystkich przypadków raka płuc2. Większość pacjentów jest diagnozowana w zaawansowanym stadium lub ma odległe przerzuty, a tym samym traci możliwość operacji3. W obecnym leczeniu klinicznym jednoczesna chemioradioterapia jest najczęstszą strategią leczenia LUAD, ale jej zastosowanie jest ograniczone ze względu na poważne działania niepożądane4.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) może skutecznie łagodzić objawy kliniczne u pacjentów z LUAD i zmniejszać działania niepożądane spowodowane radioterapią i chemioterapią, dzięki czemu stała się hotspotem badawczym5,6,7. W tradycyjnej medycynie chińskiej rak płuc należy do kategorii "nagromadzenia płuc" i "płuc skategory". Niedobór Qi i interakcja flegmy, zastoju i trucizny są ważne w patogenezie raka płuc. Dlatego tonizacja Qi oraz eliminacja flegmy i zastoju krwi są głównymi metodami leczenia klinicznego8 metod raka płuc zgodnie z teorią TCM9. Trichosanthes kirilowii (Trichosanthes kirilowii) Maxim (Gualou) i Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) reprezentują powszechną parę leków w leczeniu raka płuc, a ta kombinacja ma wpływ na usuwanie ciepła i redukcję flegmy10,11,12. Jednak jego mechanizm działania jest nadal niejasny i konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań.

Farmakologia sieciowa to kompleksowa metoda oparta na teorii biologii systemów i farmakologii wielokierunkowej, która ma na celu ujawnienie złożonych relacji sieciowych między wieloma lekami i chorobami13. Tradycyjne chińskie recepty charakteryzują się tym, że są wieloskładnikowe i wielocelowe, co oznacza, że są bardzo odpowiednie do badań farmakologicznych sieci14,15. Ostatnio farmakologia sieciowa stała się potężnym podejściem do badania formuł TCM i stała się hotspotem badawczym16,17.

Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wszystkie badania nad farmakologią sieciową są przedstawione jako tekst. Zaprezentowanie tej technologii za pomocą wideo znacznie obniży próg uczenia się i ułatwi promocję tej technologii, co jest jedną z zalet tego artykułu. W tym badaniu wzięliśmy Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko gruczolakorakowi płuc jako przykład w celu przeprowadzenia przewidywania farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury farmakologii sieciowej zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dla metod oceny farmakologii sieciowej18. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi zarządzania laboratorium Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.

1. Sieciowa prognoza farmakologiczna

  1. Dobór składników aktywnych
    1. Otwórz bazę danych HERB (http://herb.ac.cn)19 i użyj "Gualou" (chińska nazwa Trichosanthes kirilowii Maxim) i "Zhebeimu" (chińska nazwa Bulbus Fritillariae thunbergii) jako słów kluczowych, aby uzyskać składniki tych dwóch leków. Pobierz listę i kanoniczne struktury SMILES powiązanych składników obu leków.
    2. Określ, czy uzyskany składnik jest składnikiem aktywnym.
      1. Uwzględnij jako składniki aktywne te, które mają doustną biodostępność (OB) i wartości podobne do leków (DL) w bazie danych grupy HERB (tj. składniki o OB ≥ 30% i DL ≥ 0,18)20,21.
      2. Jeśli komponent nie ma wartości OB i DL, wprowadź komponent do szwajcarskiej bazy danych ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22, aby uzyskać informacje o każdym komponencie. Jako składniki aktywne należy uwzględnić składniki o "wysokiej" absorpcji IG i co najmniej dwóch wartościach DL "Tak".
  2. Docelowa predykcja składników aktywnych
    1. Otwórz bazę danych HERB (http://herb.ac.cn). Wyszukaj i skopiuj kanoniczne struktury SMILES aktywnych składników.
    2. Otwórz bazę danych SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Wklej kanoniczne struktury SMILES aktywnych komponentów w polu wyszukiwania i kliknij Wypróbuj SEA, aby uzyskać klucz docelowy, nazwę celu, wartość P i MaxTC każdego aktywnego komponentu.
    3. Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego i użyj funkcji filtrowania pliku arkusza kalkulacyjnego, aby przefiltrować obiekty docelowe aktywnych komponentów według klucza docelowego (Człowiek, P < 0,05 i MaxTC > 0,5).
    4. Skopiuj wszystkie cele do arkusza kalkulacyjnego i usuń duplikaty, aby uzyskać cele leków.
  3. Przewidywanie celów chorobowych
    1. Otwórz bazę danych GeneCards (https://www.genecards.org)24 i bazę danych Online Mendl Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 i użyj Lung Adenocarcinoma jako słowa kluczowego, aby uzyskać cele chorobowe gruczolakoraka płuc.
    2. Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami chorobowymi. Usuń powtarzające się obiekty docelowe, aby uzyskać obiekty docelowe LUAD.
  4. Budowa sieci lek-składnik-choroba-cel
    1. Skopiuj cele związane z LUAD i cele leków do tej samej kolumny w nowym arkuszu kalkulacyjnym. Użyj funkcji Dane - Zidentyfikuj duplikaty na pasku narzędzi, aby uzyskać cele przecięć obiektów docelowych związanych z LUAD i celów związanych z aktywnym komponentem Trichosanthes-Fritillaria thunbergii.
    2. Otwórz Cytoscape 3.8.0. Kliknij Plik na pasku menu, a następnie wybierz Importuj sieć > z pliku, aby zaimportować plik arkusza kalkulacyjnego. Zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania.
    3. Użyj funkcji Analizuj sieć do analizy topologii sieci. Kliknij Narzędzia na pasku menu, a następnie wybierz Analizuj sieć. W panelu Tabela kliknij przycisk Stopień na pasku tytułu, aby ułożyć komponenty według stopnia w kolejności malejącej. Weź dziesięć najważniejszych komponentów i celów jako główne aktywne komponenty i główne cele.
  5. Budowa sieci IPP i badania przesiewowe białek rdzeniowych
    1. Otwórz bazę danych STRING (https://cn.string-db.org/)26. Wklej listę potencjalnych celów Trichosanthes-Fritillaria thunbergii przeciwko LUAD w formacie tekstowym do okna dialogowego Lista nazw. Wybierz Homo sapiens w Organizmy i kliknij przyciski SZUKAJ > KONTYNUUJ.
    2. Gdy wyniki będą dostępne, kliknij Ustawienia i zaznacz opcję Wysoki poziom ufności (0,700) w Ustawienia podstawowe > Minimalny wymagany wynik interakcji. Zaznacz opcję Ukryj rozłączone węzły w sieci w ustawieniach zaawansowanych, a następnie kliknij przycisk AKTUALIZUJ.
    3. Kliknij Eksporty na pasku tytułu i pobierz krótki tekst tabelaryczny relacji PPI w formacie TSV.
    4. Otwórz Cytoscape 3.8.0. Kliknij Plik > Importuj >sieć z pliku, aby zaimportować plik w formacie TSV do analizy wizualnej.
    5. Użyj funkcji Network Analyzer, aby przeprowadzić analizę topologiczną. Zoptymalizuj rozmiar i kolor węzłów sieci za pomocą paska stylów w lewym panelu sterowania.
  6. Analiza wzbogacenia firmy KEGG
    1. Otwórz platformę Metascape (https://metascape.org/)27. Wklej listę potencjalnych celów terapeutycznych w formacie tekstowym do okna dialogowego, a następnie kliknij przycisk Prześlij. Zaznacz H. sapiens zarówno w Danych wejściowych jako gatunek, jak i Analiza jako gatunek, a następnie kliknij przycisk Analiza niestandardowa. Wybierz opcję Wzbogacanie, zaznacz tylko ścieżkę KEGG, a następnie kliknij opcję Analiza wzbogacania. Gdy pasek postępu osiągnie 100%, kliknij pomarańczowy przycisk Strona raportu z analizy, aby wyświetlić wyniki wzbogacania.
    2. Kliknij plik zip wszystko w jednym, aby pobrać wynik wzbogacania, a następnie otwórz plik _ FINAL_GO.csv w folderze Enrichment_GO, aby uzyskać wynik.
    3. Otwórz oprogramowanie języka R (https://cran.r-project.org/). Wpisz install.package ("ggplot2") i library (ggplot2) w języku R, aby zainstalować pakiet ggplot2 R. Naciśnij Enter, aby uruchomić program do wizualizacji KEGG.

2. Weryfikacja eksperymentalna

  1. Preparat leku
    UWAGA: Fritillaria thunbergii Miq i Trichosanthes kirilowii Maxim zostały zakupione w szpitalu Dongzhimen, powiązanym z Pekińskim Uniwersytetem Medycyny Chińskiej.
    1. Wymieszaj ze sobą 50 g Fritillaria thunbergii Miq i 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim. Namoczyć mieszaninę w 1 l wody destylowanej przez 20 minut, a następnie odsączać mieszaninę w temperaturze 100 °C pod normalnym ciśnieniem przez 1 godzinę.
    2. Przefiltruj wywar, aby uzyskać filtrat z podwójną warstwą sterylnej gazy medycznej, a następnie użyj bibuły filtracyjnej o grubości 80 μm do dalszego filtrowania ekstraktu. Powtórz powyższą operację trzy razy.
    3. Wymieszać filtrat ze sobą, aby uzyskać około 1,2 l wywaru. Umieścić roztwór w kolbie wyparki obrotowej. Ustawić prędkość obrotową na 50 obr./min przy temperaturze 37 °C. Wymieszać i skondensować wywary w ekstrakt w wyparce obrotowej przez 6 godzin, aby uzyskać lepką ciecz.
    4. Włącz mechanizm liofilizacji próżniowej, aby wstępnie schłodzić temperaturę do -40 °C. Uzyskany ekstrakt umieścić w tacy na materiał i umieścić w wymrażarce w celu zamrożenia.
    5. Gdy temperatura wymrażarki osiągnie -50 °C, a materiał był zamrożony przez 2 godziny, należy przenieść zamrożone materiały na suszarkę umieszczoną w wymrażarce. Włącz pompę próżniową, aby rozpocząć proces liofilizacji. Wyjmij liofilizowany proszek i przechowuj go w lodówce w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Hodowla komórek
    1. Skonfiguruj kompletną pożywkę DMEM z 89% pożywką zasadową DMEM, 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
    2. Po usunięciu komórek A549 z ciekłego azotu, inkubować komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i mieszać, aż pożywka w fiolce się rozpuści.
    3. Dodaj czterokrotną objętość kompletnego podłoża DMEM do stopionych komórek. Odwirować komórki (4 °C, 679 x g, 5 min) i odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić wytrącone komórki w 6 ml kompletnej pożywki DMEM, umieścić je w kolbie hodowlanej T25 i inkubować kolbę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Wykrywanie żywotności komórek
    1. Trawić komórki A549 logarytmicznej fazy wzrostu za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 1 minutę w temperaturze 37°C. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zneutralizować trypsynę i delikatnie ją przedmuchnąć, aby przyspieszyć wydalanie komórek. Odwirować mieszaninę w celu uzyskania osadu komórkowego (4 °C, 192 x g, 5 min). Ponownie zawiesić uzyskane komórki za pomocą kompletnego podłoża DMEM.
    2. Dodaj zawiesinę komórek do hemocytometru i policz za pomocą automatycznego licznika komórek. Rozcieńczyć go do 5 x 104 komórek/ml za pomocą kompletnego podłoża DMEM.
    3. Rozpuść 1 g ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w 10 ml roztworu PBS i przesterylizuj go przez filtr 0,22 μm. Rozcieńczyć mieszaninę do 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/ml i 10 mg/ml za pomocą PBS.
    4. Rozcieńczone komórki należy umieścić na 96-dołkowych płytkach po 100 μl na dołek. Po przyleganiu komórek dodaj 1 μl ekstraktów wodnych Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o różnych stężeniach, aby dostosować stężenie każdej studzienki do 900 μg/ml, 800 μg/mL, 700 μg/ml, 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/mL, 200 μg/ml i 100 μg/ml.
    5. Po 24 godzinach hodowli odrzucić oryginalną pożywkę i dodać 100 μl pożywki zasadowej DMEM do dalszej inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Po powyższej obróbce dodać 20 μl roztworu MTS (tabela materiałów) i inkubować komórki przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    7. Przenieś inkubowaną mieszaninę na inną płytkę. Zmierzyć absorbancję (OD) przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oblicz żywotność komórki, korzystając z następującego wzoru:
      Żywotność (%) = 100 × (OD próbki poddanej działaniu środka − OD pożywki)/(OD próbki kontrolnej − OD pożywki).
      UWAGA: Minimalne stężenie zbliżone do IC50 definiuje się jako wysoką dawkę. Stężenie, przy którym proliferacja komórek zaczyna być hamowana, definiuje się jako stężenie niskiej dawki, a wartość pośrednią definiuje się jako stężenie średniej dawki dla kolejnych badań eksperymentalnych. W tym badaniu 400 μg/ml, 600 μg/ml i 800 μg/ml zastosowano jako niskie, średnie i wysokie dawki.
  4. Interwencja lekowa i pobieranie próbek
    UWAGA: Wzrost komórek wykreślono w funkcji czasu, aby określić fazę logarytmiczną.
    1. Rozcieńczyć logarytmiczne komórki A549 w fazie wzrostu do 5 x 105 komórek/ml. Dodaj 2 ml zawiesiny komórkowej do płytki 6-dołkowej i hoduj przez 12 godzin.
    2. Powtórzyć krok 2.3.3, aby uzyskać rozcieńczenia ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii w stężeniach 80 mg/ml, 60 mg/ml i 40 mg/ml PBS. Dodać 20 μl roztworu PBS, 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o stężeniu 40 mg/ml, 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o sile 60 mg/ml i 20 μl ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii o stężeniu 80 mg/ml do ślepej próby kontrolnej, grupy o niskim stężeniu, grupy o średnim stężeniu, i grupa o wysokim stężeniu. Po 24 godzinach interwencji należy odrzucić supernatant i trzykrotnie oczyścić komórki PBS.
      UWAGA: Stężenia w ślepej próbie kontrolnej, grupie o niskim stężeniu, grupie o średnim stężeniu i grupie o wysokim stężeniu ekstraktu wodnego Trichosanthes-Fritillaria thunbergii wynosiły odpowiednio 0 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml i 800 μg/ml.
    3. Dodać 250 μl buforu RIPA (zawierającego 1% PMSF i 1% inhibitora fosfatazy) do każdej studzienki i poddać komórki lizie przez 30 minut. Zebrać lizat do odwirowania (4 °C, 6,714 x g, 10 min) i otrzymać supernatant.
  5. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Wykryć stężenie białka w próbkach metodą BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj buforu RIPA, aby dostosować stężenie każdej próbki, aby było spójne.
    2. Zmieszać 40 μl próbki białka z 10 μl 5-krotnego buforu ładującego i gotować przez 5 minut w temperaturze 100 °C. Odwirować mieszaninę (4 °C, 6,714 x g, 10 min) w celu otrzymania supernatantu do dalszych doświadczeń.
    3. Wyizolować białka za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu elektroforezy pionowej 120 V.
    4. Przygotuj elektryczną "kanapkę" (gąbka - bibuła filtracyjna - żel - membrana PVDF - bibuła filtracyjna - gąbka). Zanurzyć aparat transferowy w łaźni lodowej i przenieść białko na membrany PVDF pod napięciem 70 V przez 60 minut.
    5. Użyj 100 ml roztworu TBST (0,05% [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) i 5 g odtłuszczonego mleka w proszku, aby skonfigurować 5% mleko. Wstępnie rozcieńczyć przeciwciała AKT i p-AKT rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:1,000.
    6. Zablokuj membranę PVDF w 5% odtłuszczonym mleku w proszku na 1 godzinę z potrząsaniem. Po zablokowaniu wyrzucić mleko blokujące i dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Po usunięciu przeciwciała pierwszorzędowego należy użyć roztworu TBST, aby przemyć membranę PVDF pięć razy przez 5 minut każde.
    8. Wstępnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe rozcieńczalnikiem przeciwciał w stosunku 1:5 000. Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1,5 godziny. Po usunięciu przeciwciała drugorzędowego należy użyć roztworu TBST do przemycia membrany PVDF pięć razy przez 5 minut każde.
    9. Wykryj białko za pomocą systemu detekcji chemiluminescencyjnej.

3. Dokowanie molekularne

  1. Otwórz bazę danych UniProt (https://www.uniprot.org)28. Wpisz symbole docelowe w polu wyszukiwania i kliknij przycisk SZUKAJ. W podtytule Struktura kliknij przycisk Pobierz, aby wyświetlić struktury 3D docelowych białek.
  2. Otwórz bazę danych RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Wpisz nazwę makrocząsteczek białka w polu wyszukiwania. Pobierz struktury makrocząsteczek białek w formacie PDB.
  3. Pobierz pakiet instalacyjny oprogramowania UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) i AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Zainstaluj i otwórz oprogramowanie UCSF Chimera 1.16. Kliknij Plik > Otwórz, aby wyświetlić białko receptorowe.
  4. Kliknij Narzędzia > Edycji struktury > Przygotowanie doku i zaznacz Usuń rozpuszczalnik, Dodaj wodory i Dodaj ładunki w wyskakującym okienku, aby usunąć wodę i dodać ładunki uwodornienia i zrównoważenia. Kliknij Napisz plik Mol2, aby zapisać białko receptorowe w formacie mol2. Wykonaj ten sam krok na ligandzie.
  5. Kliknij Plik > Otwórz, aby wyświetlić ligand w formacie mol2 w oprogramowaniu UCSF Chimera 1.16. W narzędziu Tools > Surface/Binding Analysis > AutoDock Vina ustaw pasek receptora na nazwę białka receptora, a pasek liganda na nazwę liganda. Wprowadź wartość w polu za środkiem i rozmiarem, aby dostosować nowo utworzoną przestrzeń, co umożliwi pełne objęcie liganda i receptora.
  6. Kliknij OK, aby przeprowadzić wirtualne badanie przesiewowe dokowania molekularnego, aby uzyskać optymalną lokalizację do wiązania liganda z receptorem. Zapisz wartość energii wiązania w optymalnym położeniu.

4. Analiza statystyczna

  1. Otwórz oprogramowanie statystyczne SPSS 26.0. Kliknij Plik> Importuj dane w celu załadowania danych.
  2. Przedstawić dane doświadczalne jako średnią ± odchylenie standardowe.
  3. Porównywanie wielu grup przy użyciu jednokierunkowego ANOVA.
    UWAGA: P < 0,05 uznano za statystycznie istotne w tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zidentyfikowano łącznie 31 aktywnych składników związanych z Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, w tym 21 składników Trichosanthes i 10 Fritillaria thunbergia, a także 144 odpowiadające im cele. Ogółem wyekstrahowano odpowiednio 9 049 i 67 genów związanych z LUAD z bazy danych GeneCards i bazy danych OMIM. Po usunięciu zduplikowanych genów zidentyfikowano 9 057 genów związanych z LUAD. Przeprowadzono przecięcie genów związanych z LUAD i celów związanych z aktywnym składnikiem Trichosanthe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, kompletne badanie farmakologiczne sieci obejmuje identyfikację składników aktywnych z baz danych, pozyskiwanie celów odpowiadających aktywnym składnikom i chorobom, budowę sieci lek-składnik-choroba-cel oraz przewidywanie głównych celów i ścieżek. Związek między składnikami aktywnymi a białkami rdzeniowymi (dokowanie molekularne) jest wstępnie przewidywany przez technologię komputerową, a ostateczna weryfikacja jest przeprowadzana za pomocą eksperymentu.

Wybór odpowiednic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Program Szkolenia w zakresie Innowacji Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (Nie: 202110026036).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibcoR001100
A549  linia komórkowaProcellCL-0016
Przeciwciało AKTCST4691S
Zestaw do oznaczania białek BCASolarbioPC0020
System detekcji chemiluminescencjiSzanghaj Qinxiang Fabryka instrumentów naukowychChemiScope 6100
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)Solarbio11995
Zestaw do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) ABclonalRM00021
Płodowa surowica bydlęcaScienCell0025
HRP Koza Anty-Królicza IgG (H+L)ABklonalnyAS014
Zestaw testowy MTSPromegaG3580
p-AKTCST6040S
Penicylina streptomycynaGibcoC14-15070-063
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)SolarbioP0100
Inhibitor fosfatazyBeyotimeP1081
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SolarbioP1020
Membrany z polifluorku winylidenu (PVDF)MiliporeISEQ00010
roztwór do lizy RIPASolarbioR0010
Parownik obrotowyShanghai Yarong Biochemical Instrument FactoryRE52CS-1
Próżniowy mechanizm liofilizacjiNingbo Scientz BiotechnologySCIENTZ-10
i beta;-aktynaprzeciwciało ABclonalAC026
przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708(2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690(2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20(2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252(2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925(2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783(2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462(2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299(2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162(2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717(2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523(2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713(2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300(2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796(2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460(2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843(2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910(2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821(2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923(2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133(2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37(2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szlak PI3K AKTfosforylacja bia ekkom rki A549wzbogacenie KEGGsie oddzia ywa bia kowychhamowanie proliferacji kom rekdokowanie molekularne

Powiązane artykuły