Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64867

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Streszczenie

Kriokonserwacja i przeszczep tkanek jajnikowych to skuteczna strategia zachowania płodności, ale ma jedną główną wadę, a mianowicie masową utratę pęcherzyków występującą wkrótce po reimplantacji z powodu nieprawidłowej aktywacji i śmierci pęcherzyka. Gryzonie są wzorcowymi modelami do badania aktywacji mieszków włosowych, ale koszty, czas i względy etyczne stają się coraz bardziej zaporowe, co napędza rozwój alternatyw. Model błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ jest niedrogi i utrzymuje naturalny niedobór odporności do 17 dnia po zapłodnieniu, co czyni go idealnym do badania krótkoterminowego ksenoprzeszczepu ludzkiej tkanki jajnika. CAM jest również wysoce unaczyniony i jest szeroko stosowany jako model do badania angiogenezy. Daje mu to niezwykłą przewagę nad modelami in vitro i pozwala na badanie mechanizmów wpływających na wczesny proces utraty mieszków włosowych po przeszczepie. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół ma na celu opisanie rozwoju modelu ksenoprzeszczepu CAM dla ludzkiej tkanki jajnika, ze szczegółowymi wglądami w skuteczność techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w 6-dniowym okresie przeszczepu.

Wprowadzenie

Zapotrzebowanie na zachowanie płodności ze względu na onkologiczne i łagodne wskazania, jak również ze względów społecznych, dramatycznie wzrosło w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Jednak różne metody leczenia chorób złośliwych i niezłośliwych są wysoce toksyczne dla gonad i mogą powodować jatrogenną przedwczesną niewydolność jajników, ostatecznie prowadząc do niepłodności1. Uznane techniki zachowania płodności obejmują krioprezerwację zarodków, witryfikację niedojrzałych lub dojrzałych oocytów oraz kriokonserwację tkanek jajników2,3,4. Zamrożenie tkanki jajnikowej jest jedyną dostępną opcją zachowania płodności u dziewcząt przed okresem dojrzewania lub kobiet, które wymagają natychmiastowej terapii przeciwnowotworowej. Przywrócenie funkcji hormonalnej po przeszczepieniu tkanki jajnika występuje u ponad 95% badanych, a wskaźnik żywych urodzeń waha się od 18% do 42%5,6,7,8,9.

Chociaż przeszczep zamrożonej i rozmrożonej tkanki jajnika okazał się sukcesem, wciąż jest miejsce na poprawę. Rzeczywiście, ponieważ fragmenty kory jajnikowej są przeszczepiane bez zespolenia naczyniowego, doświadczają one okresu niedotlenienia, podczas którego następuje rewaskularyzacja przeszczepu10,11,12. W zdecydowanej większości badań dotyczących przeszczepu ludzkiej tkanki jajnikowej wykorzystano model ksenoprzeszczepu, w którym tkanka jajnika jest przeszczepiana myszom z niedoborem odporności. Całkowita rewaskularyzacja ksenoprzeszczepów trwa około 10 dni, przy czym zarówno naczynia gospodarza, jak i przeszczepu przyczyniają się do tworzenia funkcjonalnych naczyń krwionośnych12,13,14. Około 50%-90% rezerwy pęcherzykowej jest tracone podczas tego okna hipoksyjnego przed zakończeniem rewaskularyzacji przeszczepu10,15,16. Zdecydowanie zasugerowano, że ta masowa utrata pęcherzyków następuje zarówno poprzez bezpośrednią śmierć pęcherzyka, o czym świadczy spadek bezwzględnej liczby pęcherzyków pozostałych po przeszczepie, jak i aktywacja pierwotnego wzrostu pęcherzyka, na co wskazują zmiany proporcji mieszków włosowych w kierunku zwiększonego tempa wzrostu mieszków włosowych17,18.

Interesujące, poprzednie prace badawcze z wykorzystaniem różnych tkanek jajników zwierzęcych przeszczepionych do błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt, której budowa naśladuje typowe miejsce szczepienia otrzewnej, wykazały zahamowanie spontanicznej aktywacji pęcherzyków, przy czym pierwotna rezerwa pęcherzyka pozostaje nienaruszona przez okres do 10 dni19,20,21,22. Nasz zespół wykazał wcześniej, że przeszczepienie zamrożonej i rozmrożonej ludzkiej tkanki jajnikowej do CAM stanowi wiarygodne podejście do badania przeszczepu ludzkiej tkanki jajnika w jego pierwszych stadiach niedokrwiennych23 i ostatnio wykazał, że ta metoda szczepienia była w stanie przeciwdziałać aktywacji pęcherzyków24.

Model CAM jest szczególnie atrakcyjny nie tylko dlatego, że jaja są znacznie tańsze niż myszy, ale także ze względu na wysoce unaczynioną naturę CAM, co pozwala na zbadanie związku między aktywacją pęcherzyków a rewaskularyzacją przeszczepu jajnika. System ptasi jest rzeczywiście jednym z najpowszechniejszych i najbardziej wszechstronnych sposobów badania angiogenezy25. Rozwój zarodka pisklęcia (ED) trwa 21 dni do wyklucia, a CAM powstaje w ciągu pierwszych 4-5 dni w wyniku fuzji allantois i kosmówki26. Warto zauważyć, że zarodek pisklęcia jest naturalnie żywicielem z niedoborem odporności do 17 dnia zaburzeń erekcji, więc eksperymenty ksenoprzeszczepu mogą być przeprowadzane bez ryzyka odrzucenia przeszczepu27,28. Co więcej, podejście oparte na modelu CAM nie budzi żadnych wątpliwości etycznych ani prawnych w świetle prawa europejskiego29, co czyni je atrakcyjną alternatywą dla innych modeli zwierzęcych. Jeśli chodzi o warunki hodowlane, zarodki piskląt wymagają jedynie inkubatora ustawionego na 37 °C przy wilgotności względnej powietrza 40%-60%. Te ograniczone wymagania dotyczące eksperymentów znacznie obniżają koszty badań w porównaniu z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności.

Protokół przedstawiony tutaj ma na celu opisanie rozwoju modelu ksenoprzeszczepu CAM dla ludzkiej tkanki jajnika i dostarczenie szczegółowych informacji na temat skuteczności techniki, ram czasowych rewaskularyzacji przeszczepu i żywotności tkanek w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia. Protokół ten może być bardzo interesujący dla badania mechanizmów stojących za wczesną utratą mieszków włosowych po przeszczepieniu i badania wpływu kilku czynników (czynników wzrostu, hormonów itp.) na to zjawisko.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie ludzkiej tkanki zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Katolickiego Uniwersytetu w Louvain. Pacjentki wyraziły pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich tkanki jajnikowej do celów badawczych.

1. Zamawianie dnia 0 jaj, które z dużym prawdopodobieństwem zostaną zarodkowane

  1. Znajdź certyfikowanego, laboratoryjnego dostawcę białych jaj Leghorn, wybranego przez Lohmana, który zgłasza wysokie wskaźniki zarodków jajowych, co zależy przede wszystkim od wieku piskląt.

2. Przygotowanie jaj do inkubacji

  1. Przed przybyciem jaj należy zmontować i zrównoważyć inkubator do jaj do temperatury 37 °C przy wilgotności względnej powietrza 40%-60%. Monitoruj temperaturę i wilgotność powietrza, wkładając termometr i higrometr do inkubatora. Upewnij się, że pokrywa inkubatora jest wyposażona w szklane okienko, aby umożliwić sprawdzenie wewnętrznych parametrów inkubatora bez konieczności jego otwierania (Rysunek 1).
  2. Po otrzymaniu jaj dnia 0 od wyselekcjonowanych przez Lohmana białych piskląt Leghorn od certyfikowanego dostawcy jaj klasy laboratoryjnej, oczyść powierzchnię skorupek nawilżonym papierem i natychmiast je wysusz.
    UWAGA: Ponieważ membrana skorupki jajka jest porowata, do czyszczenia powierzchni jaj i kontrolowania wilgotności w inkubatorze można używać wody autoklawowanej w celu zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia.
  3. Oznacz jajka za pomocą markera (np. daty i numeru jajka).
  4. Inkubuj jaja spiczastym końcem skierowanym w dół i obracaj je, aby umożliwić rozwój CAM. Ręcznie obracaj jaja o 180° dwa do trzech razy dziennie lub użyj automatycznego rotatora.
    UWAGA: Aby upewnić się, że jaja są rzeczywiście obracane, skorupka jajka może być oznaczona literami "X" i "O" po dwóch przeciwległych bocznych stronach za pomocą ołówka lub markera. Szklane okienko w pokrywie inkubatora pozwala na sprawdzenie rotacji jaj bez otwierania urządzenia.

3. Otwarcie skorupki jajka w 3 dniu ED

UWAGA: Prostokątne okno jest tworzone w skorupce jajka w 3 dniu ED.

  1. Przygotuj okap z przepływem laminarnym do pracy w sterylnych warunkach. Umieść następujące narzędzia pod maską i zdezynfekuj je w 70% etanolu (jeśli nie zostały jeszcze wysterylizowane):
    -Stojak na jajka
    -Świecznik do jajek lub ogniskowe źródło zimnego światła
    -Znacznik
    -Sterylny prosty trzpień
    -Sterylna igła 19 G
    -5 ml sterylnej strzykawki
    -Brzeszczot do przewijania
    -Sterylne kleszcze
    -Taśma klejąca
  2. Przenieś jedno jajo z inkubatora do stojaka na jajka umieszczonego pod maską i wyłącz rotator jaj.
  3. W ciemności zidentyfikuj kieszeń powietrzną jajka, umieszczając świecę do jajka (lub ogniskowe źródło zimnego światła) na skorupce jajka. Kieszeń powietrzna jest zlokalizowana na końcu jaja. Użyj markera, aby wskazać środek kieszeni powietrznej na skorupce jajka.
  4. Włącz światła. Zrób mały otwór w skorupce jajka, w którym jest zaznaczony, delikatnie obracając sterylną prostą szpilkę. Zwykle wystarcza mały otwór o średnicy około 1 mm.
    UWAGA: Uważaj, aby nie wepchnąć szpilki do końca przez jajko. Jeśli tak się stanie, wyrzuć jajko.
  5. Podłączyć sterylną igłę 19 G do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml.
  6. W ciemności zlokalizuj woreczek żółtkowy za pomocą świecznika do jaj (lub ogniskowego źródła zimnego światła) i przebij jajko przez otwór wykonany w kroku 3.4 sterylną igłą 19 G ustawioną pod kątem 45° w kierunku dna jajka; należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć woreczka żółtkowego. Odessać od 1,5 do 2 ml białka, aby odłączyć CAM od skorupy, a następnie zamknąć otwór kawałkiem taśmy klejącej.
    UWAGA: Jeśli woreczek żółtkowy zostanie przerwany podczas aspiracji, zasysany płyn w strzykawce będzie miał kolor żółty, a nie przezroczysty (białko). W takim przypadku należy wymienić igłę i strzykawkę. Jeśli stosunkowo duża ilość żółtka jaja zostanie zassana, może to zagrozić żywotności zarodka.
  7. Włącz światła. Ułóż jajko poziomo i narysuj markerem prostokątne okienko o wymiarach 1 cm x 1,5 cm. Nie rób okna większego niż zwykła szerokość standardowej taśmy klejącej.
  8. Trzymaj jajko w jednej ręce i delikatnie wbij wcześniej narysowane okienko w skorupkę jajka za pomocą brzeszczotu do przewijania. Upewnij się, że skorupa nie pęka i nie przecina się aż do wciśniętej krzywki. regularnie, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z muszli.
  9. Wsuń sterylne kleszcze pod prostokątny kawałek przetartej skorupy i zręcznie chwyć, aby usunąć je czysto, nie uszkadzając CAM. Dodatkowo wyrzuć białą błonę zewnętrznej powłoki, aby móc zobaczyć zarodek i jego CAM.
    UWAGA: Jeśli na CAM spadnie trochę kurzu lub zanieczyszczeń ze skorupek jaj, można je usunąć za pomocą sterylnych kleszczy, bardzo uważając, aby nie rozerwać CAM.
  10. Zidentyfikuj zdolne do życia zarodki jajowe. Można je rozpoznać po przezroczystym białku i pierścieniu naczyniowym wokół zarodka, gdzie czasami można wykryć bijące serce nawet na tym etapie (3. dzień zaburzeń erekcji). Wyrzuć niezapłodnione lub martwe zarodki.
  11. Umieść taśmę klejącą na nowo utworzonym oknie, aby uniknąć odwodnienia. Pamiętaj, aby złożyć jeden koniec na sobie, aby ułatwić usunięcie.
  12. Włóż jajo z powrotem do inkubatora z otwartym oknem skierowanym do góry i taśmą nie dotykającą CAM. Użyj złożonego kawałka papieru lub części stojaka na jajka, aby zapobiec toczeniu się jajka. Upewnij się, że obrotowa taca jest wyłączona.
  13. Powtórz kroki 3.2-3.12, aby otworzyć pozostałe jaja.

4. Przeszczepianie zamrożonej i rozmrożonej ludzkiej tkanki jajnikowej do CAM

UWAGA: Najlepiej byłoby, gdyby przeszczep do CAM rozpoczął się między 7 a 10 dniem zaburzeń erekcji.

  1. Rozmrozić kriokonserwowane paski korowe jajników pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z protokołem opisanym w innym miejscu30.
  2. Pokrój paski korowe na trzy fragmenty o wymiarach 4 mm x 2 mm x 1 mm. Użyj jednego kawałka jako nieszczepionej kontroli, a pozostałych dwóch do ksenoprzeszczepu przez 1 dzień lub 6 dni.
    UWAGA: Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki, pracuj dwukrotnie.
  3. Przenieś jedno jajo z inkubatora do stojaka na jajka umieszczonego pod maską, z oknem skierowanym do góry.
  4. Odklej taśmę od okna i upewnij się, że zarodek jest zdolny do życia. Na tym etapie zdolne do życia zarodki charakteryzują się rozległym unaczynieniem, czystym białkiem, widocznym biciem serca i pewnymi ruchami zarodka.
  5. Przygotuj miejsce szczepienia, delikatnie uszkadzając niewielki obszar CAM, kładąc na powierzchni nabłonka pasek o długości 1cm2 sterylnego bibuły do soczewek ekstrahowanych eterem i natychmiast go usuwając.
    UWAGA: CAM jest barierą nieprzenikalną, chyba że błona została uszkodzona przez usunięcie górnej części okołoskórnej podwójnej warstwy nabłonkowej, pozostawiając nienaruszoną warstwę podstawną. Technika ta usprawnia również proces rewaskularyzacji poprzez aktywację gojenia się ran. Jeśli sterylny papier do soczewek ekstrahowany eterem pozostanie na CAM zbyt długo, membrana może przylgnąć do papieru soczewki i rozerwać się. Jeśli tak się stanie, wyrzuć jajko.
  6. Chwyć jeden zamrożony, rozmrożony pasek kory jajnika (4 mm x 2 mm x 1 mm) za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych i umieść go na uszkodzonej CAM stroną rdzeniową przy CAM. Przeszczep jeden kawałek tkanki na komórkę jajową.
  7. Zakryj okno taśmą klejącą i ostrożnie włóż jajo z powrotem do inkubatora. Upewnij się, że otwór skorupki jajka jest ustawiony pionowo, a jajko jest bezpieczne.
  8. Powtórz kroki 4.1-4.7 dla przeszczepu wszystkich pozostałych tkanek.
    UWAGA: Implanty powinny być sprawdzane w każdym dniu szczepienia w celu oceny żywotności zarodka i monitorowania zmian w układzie naczyniowym.

5. Pobieranie szczepów

UWAGA: Ksenografty powinny być pobrane najpóźniej do 17 dnia ED, ponieważ układ odpornościowy zarodka staje się dojrzały i kompetentny od 18 dnia.

  1. Umieść jajko na stojaku i powiększ okienko w skorupce jajka, aby umożliwić lepszą wizualizację przeszczepu i łatwiejszą manipulację.
  2. Oceń przeszczep makroskopowo i zwróć szczególną uwagę na reakcję naczyniową CAM w kierunku przeszczepu. Rób cyfrowe zdjęcia lub nagrywaj filmy do płyty.
  3. Chwyć tkankę lub otaczającą CAM kleszczami i ostrożnie wyciąć przeszczep z CAM nożyczkami lub skalpelem.
    UWAGA: Przeszczepy pokrywają się drugą warstwą CAM około 3 dnia szczepienia i ostatecznie zostają otorbione. Mogły również przenieść się do wnętrza jaja do 6 dnia, co w niektórych przypadkach utrudnia ich odzyskanie.
  4. Przeanalizować wycięte tkanki dowolną metodą odpowiednią dla danego doświadczenia. W niniejszym badaniu fragmenty tkanek utrwalono w paraformaldehydzie, zatopiono w parafinie i wybarwiono hematoksyliną i eozyną, postępując zgodnie z krokami opisanymi poniżej:
    1. Utrwal fragmenty w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny i zanurz je w parafinie za pomocą automatycznego urządzenia do zatapiania, wykonując czynności wymienione w Tabeli 1.
    2. Pozostaw bloki zatopione w parafinie na noc w temperaturze 4°C, a następnie pokrój je na odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.
    3. Rozprowadzić skrawki tkanek na szkiełku podstawowym umieszczonym na płycie grzejnej (30 °C) i pozostawić do wyschnięcia na 2 godziny, a następnie na 24 godziny w piecu w temperaturze 37 °C.
    4. Następnie wybarwić szkiełka hematoksyliną i eozyną zgodnie z protokołem opisanym w innym miejscu31. Następnie zdigitalizuj próbki za pomocą skanera do slajdów i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wskaźniki przeżywalności zarodków kurzych
Wskaźnik przeżywalności zarodków od momentu wykonania okienka (3. dzień ED) do przeszczepienia tkanki jajnika (7. dzień ED) wyniósł 79% (33/42). Ponieważ odsetek jaj zapłodnionych w dniu 0 był nieznany, zamówiono nadmiarową liczbę jaj w dniu 0 od białych kur rasy Leghorn wyselekcjonowanych przez Lohman, aby zapewnić dostępność wystarczającej liczby zapłodnionych jaj do przeszczepienia. Do przeszczepiania wykorzystano łącznie 23 żywotne jaja w 7. dniu, z który...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najtrudniejszą częścią opisanego tutaj protokołu jest wykonanie małego otworu wymaganego do zassania białka w celu odłączenia CAM od skorupki jajka przed utworzeniem okna. Wywieranie zbyt dużego nacisku może spowodować nadmierną penetrację, a nawet pęknięcie i zniszczenie jaja, powodując nieodwracalne uszkodzenie CAM i jego układu krwionośnego. Aby ograniczyć błędy do minimum podczas początkowych prób oddzielenia CAM, zdecydowanie zaleca się ćwiczenie robienia małych otworów w skorupce niezapłodnionych, kupionych w sklep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Mirze Hryniuk, BA, za przejrzenie angielskiego języka artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła podskórna Agani, 19 GTerumo EuropeAN*1950R119 G igła do aspiracji białka
Strzykawka Terumo, 5 ml koncentryczna Luer lockTerumo EuropeSS*05LE1Sterylna strzykawka 5 ml
Caseviewer v2.23DHISTECHOprogramowanie do analizy obrazu
Eter dietylowyMerck Chemicals603-022-00-4Sterylny eter do traumatyzacji CAM
Eozyna Y roztwór wodny 0,5%Merck1098441000Roztwór barwiący
Formaldehyd 4% roztwór wodny buforowany (formalina 10%)VWR97139010Formaldehyd stosowany do utrwalania tkanek
LodówkaLiebherr7081260Lodówka w temperaturze 4 ° C służy do zatapiania parafiny
Płyta grzewczaSchottSLK2Płyta grzewcza służąca do suszenia szkiełek
InkubatorThermo Forma Scientific 311110365156Piec do inkubacji szkiełek
Mikroskop Leica CLS 150 XE źródło zimnego światłaLeicaCLS 150 XEOgniskowe źródło zimnego światła do świeczenia jaj
Chusteczka do czyszczenia soczewek, klasa 541VWR111-5003Tkanka do namoczenia w sterylnym eterze w celu uszkodzenia CAM
Hematoksylina MayeraMERCK1092491000Roztwór barwiący
MetanolVWR20847307Metanol
Mikrotom ThermoScientific-MICROMHM325-2Mikrotom
Pannoramic P250 Flash III3DHISTECH/Skaner slajdów przy 20-krotnym powiększeniu
Paraformaldehyd Merck1,04,00,51,000Roztwór do zatapiania parafiny
Paraplast Plus RSigmaP3683-1KGParafinowa
szalka Petriego, 60x15 mm, sterylnaGreiner628161Sterylna szalka Petriego
Uchwyt na szpilkęFine Science Tools26016-12Uchwyt na sworzeń
PolyhatchBrinseaCP01FInkubator do jaj z automatycznym rotatorem
Brzeszczot do przewijania, 132 mmSencys/Brzeszczot do tworzenia okna w skorupce jajka
Kołki wkładane ze stali nierdzewnejFine Science Tools26007-02Prosty trzpień do zrobienia otworu w skorupce jajka
Steril-Helios Angelantoni IndustrieST-00275400000Okap z przepływem laminarnym
Superfrost Plus pręt bords i ostry; s 90°VWR631-9483Prowadnice szklane 
Tissue-Tek VIP 6AlSakura60320417-0711 VID6E3-1Automatyczne urządzenie do zatapiania
Kleszcze tytanoweFine Science Tools11602-16Kleszcze do usuwania skorupek jaj i manipulacji tkankami jajnikowymi
Toluen, paVWR28701364Roztwór do zatapiania parafiny

Bibliografia

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247(2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876(2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61(2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986(2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651(2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522(2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411(2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154(2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21(2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model CAM kurczakaaktywacja mieszk wkrio konserwacja tkanekunaczynienie przeszczeputechnika ksenoprzeszczepuprze ywalno mieszk wmodel angiogenezymanipulacja zarodkowym jajemywotno przeszczepu
Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.