Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kriokonserwacja i przeszczep tkanek jajnikowych to skuteczna strategia zachowania płodności, ale ma jedną główną wadę, a mianowicie masową utratę pęcherzyków występującą wkrótce po reimplantacji z powodu nieprawidłowej aktywacji i śmierci pęcherzyka. Gryzonie są wzorcowymi modelami do badania aktywacji mieszków włosowych, ale koszty, czas i względy etyczne stają się coraz bardziej zaporowe, co napędza rozwój alternatyw. Model błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ jest niedrogi i utrzymuje naturalny niedobór odporności do 17 dnia po zapłodnieniu, co czyni go idealnym do badania krótkoterminowego ksenoprzeszczepu ludzkiej tkanki jajnika. CAM jest również wysoce unaczyniony i jest szeroko stosowany jako model do badania angiogenezy. Daje mu to niezwykłą przewagę nad modelami in vitro i pozwala na badanie mechanizmów wpływających na wczesny proces utraty mieszków włosowych po przeszczepie. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół ma na celu opisanie rozwoju modelu ksenoprzeszczepu CAM dla ludzkiej tkanki jajnika, ze szczegółowymi wglądami w skuteczność techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w 6-dniowym okresie przeszczepu.
Wprowadzenie
Zapotrzebowanie na zachowanie płodności ze względu na onkologiczne i łagodne wskazania, jak również ze względów społecznych, dramatycznie wzrosło w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Jednak różne metody leczenia chorób złośliwych i niezłośliwych są wysoce toksyczne dla gonad i mogą powodować jatrogenną przedwczesną niewydolność jajników, ostatecznie prowadząc do niepłodności1. Uznane techniki zachowania płodności obejmują krioprezerwację zarodków, witryfikację niedojrzałych lub dojrzałych oocytów oraz kriokonserwację tkanek jajników2,3,4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użycie ludzkiej tkanki zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Katolickiego Uniwersytetu w Louvain. Pacjentki wyraziły pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich tkanki jajnikowej do celów badawczych.
1. Zamawianie dnia 0 jaj, które z dużym prawdopodobieństwem zostaną zarodkowane
- Znajdź certyfikowanego, laboratoryjnego dostawcę białych jaj Leghorn, wybranego przez Lohmana, który zgłasza wysokie wskaźniki zarodków jajowych, co zależy przede wszystkim od wieku piskląt.
2. Przygotowanie jaj do inkubacji
- Przed przybyciem jaj należy zmonto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wskaźniki przeżywalności zarodków kurzych
Wskaźnik przeżywalności zarodków od momentu wykonania okienka (3. dzień ED) do przeszczepienia tkanki jajnika (7. dzień ED) wyniósł 79% (33/42). Ponieważ odsetek jaj zapłodnionych w dniu 0 był nieznany, zamówiono nadmiarową liczbę jaj w dniu 0 od białych kur rasy Leghorn wyselekcjonowanych przez Lohman, aby zapewnić dostępność wystarczającej liczby zapłodnionych jaj do przeszczepienia. Do przeszczepiania wykorzystano łącznie 23 żywotne jaja w 7. dniu, z który.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najtrudniejszą częścią opisanego tutaj protokołu jest wykonanie małego otworu wymaganego do zassania białka w celu odłączenia CAM od skorupki jajka przed utworzeniem okna. Wywieranie zbyt dużego nacisku może spowodować nadmierną penetrację, a nawet pęknięcie i zniszczenie jaja, powodując nieodwracalne uszkodzenie CAM i jego układu krwionośnego. Aby ograniczyć błędy do minimum podczas początkowych prób oddzielenia CAM, zdecydowanie zaleca się ćwiczenie robienia małych otworów w skorupce niezapłodnionych, kupionych w sklep.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Mirze Hryniuk, BA, za przejrzenie angielskiego języka artykułu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła podskórna Agani, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | 19 G igła do aspiracji białka |
| Strzykawka Terumo, 5 ml koncentryczna Luer lock | Terumo Europe | SS*05LE1 | Sterylna strzykawka 5 ml |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| Eter dietylowy | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Sterylny eter do traumatyzacji CAM |
| Eozyna Y roztwór wodny 0,5% | Merck | 1098441000 | Roztwór barwiący |
| Formaldehyd 4% roztwór wodny buforowany (formalina 10%) | VWR | 97139010 | Formaldehyd stosowany do utrwalania tkanek |
| Lodówka | Liebherr | 7081260 | Lodówka w temperaturze 4 ° C służy do zatapiania parafiny |
| Płyta grzewcza | Schott | SLK2 | Płyta grzewcza służąca do suszenia szkiełek |
| Inkubator | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Piec do inkubacji szkiełek |
| Mikroskop Leica CLS 150 XE źródło zimnego światła | Leica | CLS 150 XE | Ogniskowe źródło zimnego światła do świeczenia jaj |
| Chusteczka do czyszczenia soczewek, klasa 541 | VWR | 111-5003 | Tkanka do namoczenia w sterylnym eterze w celu uszkodzenia CAM |
| Hematoksylina Mayera | MERCK | 1092491000 | Roztwór barwiący |
| Metanol | VWR | 20847307 | Metanol |
| Mikrotom ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Mikrotom | |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH/ | Skaner slajdów przy 20-krotnym powiększeniu | |
| Paraformaldehyd | Merck | 1,04,00,51,000 | Roztwór do zatapiania parafiny |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Parafinowa |
| szalka Petriego, 60x15 mm, sterylna | Greiner | 628161 | Sterylna szalka Petriego |
| Uchwyt na szpilkę | Fine Science Tools | 26016-12 | Uchwyt na sworzeń |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Inkubator do jaj z automatycznym rotatorem |
| Brzeszczot do przewijania, 132 mm | Sencys | / | Brzeszczot do tworzenia okna w skorupce jajka |
| Kołki wkładane ze stali nierdzewnej | Fine Science Tools | 26007-02 | Prosty trzpień do zrobienia otworu w skorupce jajka |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Okap z przepływem laminarnym |
| Superfrost Plus pręt bords i ostry; s 90° | VWR | 631-9483 | Prowadnice szklane |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Automatyczne urządzenie do zatapiania |
| Kleszcze tytanowe | Fine Science Tools | 11602-16 | Kleszcze do usuwania skorupek jaj i manipulacji tkankami jajnikowymi |
| Toluen, pa | VWR | 28701364 | Roztwór do zatapiania parafiny |
Bibliografia
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
