Nabłonek nosa jest główną barierą, z którą spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych jako kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) w celu scharakteryzowania interakcji człowieka między koronawirusem a gospodarzem w fizjologicznie istotnym systemie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trzy wysoce zjadliwe ludzkie koronawirusy (HCoV) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) i SARS-CoV-2 (2019) - pojawiły się i spowodowały poważne kryzysy zdrowia publicznego w ciągu ostatnich 20 lat. Cztery dodatkowe HCoV powodują znaczną część przypadków przeziębienia każdego roku (HCoV-NL63, -229E, -OC43 i -HKU1), co podkreśla znaczenie badania tych wirusów w fizjologicznie istotnych systemach. HCoV dostają się do dróg oddechowych i powodują infekcję w nabłonku nosa, głównym miejscu, z którym spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. Używamy pierwotnego systemu hodowli nabłonka nosa, w którym próbki nosa pochodzące od pacjenta są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen w tym ważnym miejscu wartowniczym. Hodowle te podsumowują wiele cech dróg oddechowych in vivo, w tym obecne typy komórek, funkcję rzęsek i produkcję śluzu. Opisujemy metody charakteryzowania replikacji wirusa, tropizmu komórek gospodarza, cytotoksyczności indukowanej wirusem i wrodzonej indukcji immunologicznej w nosowych hodowlach ALI po zakażeniu HCoV, używając ostatnich prac porównujących śmiertelne i sezonowe HCoV jako przykład1. Lepsze zrozumienie interakcji gospodarz-patogen w nosie może potencjalnie dostarczyć nowych celów dla terapii przeciwwirusowych przeciwko HCoV i innym wirusom układu oddechowego, które prawdopodobnie pojawią się w przyszłości.
Wprowadzenie
Do tej pory zidentyfikowano siedem ludzkich koronawirusów (HCoV), które powodują szereg chorób układu oddechowego2. Powszechne lub sezonowe HCoV (HCoV-NL63, -229E, -OC43 i -HKU1) są zwykle związane z patologią górnych dróg oddechowych i powodują około 10%-30% przypadków przeziębienia rocznie. Chociaż jest to typowy fenotyp kliniczny związany z powszechnymi HCoV, wirusy te mogą powodować poważniejsze choroby dolnych dróg oddechowych w populacjach zagrożonych, w tym u dzieci, osób starszych i osób z obniżoną odpornością3,4. W ciągu ostatnich 20 lat pojawiły się trzy patogenne HCoV, które ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wykorzystanie próbek z nosa zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Pensylwanii (protokół nr 800614) oraz Institutional Review Board VA w Filadelfii (protokół nr 00781).
1. Zakażanie kultur ALI z nosa
UWAGA: Pozyskiwanie próbek klinicznych, a także hodowla i różnicowanie kultur nosowych ALI, wykraczają poza zakres niniejszej pracy. Szczegółowe metody hodowli pierwotnych komórek nabłonka nosowego można znaleźć w niedawno opublikowanych pracach wykorzystujących te kultury18,22,23. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne rysunki zostały częściowo zaadaptowane z danych zawartych w manuskrypcie Otter et al.1. Nosowe kultury ALI pochodzące od czterech lub sześciu dawców zainfekowano jednym z czterech HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 oraz HCoV-229E) zgodnie z opisanymi powyżej protokołami, a średnie miana wirusów wydzielanych apikalnie dla każdego wirusa przedstawiono na Rysunku 1A. Choć wszystkie cztery wymienione HCoV replikują się produktywnie w nosowych kulturach .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody opisują pierwotny system hodowli nabłonka, w którym komórki nabłonka nosa pochodzące od pacjenta są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz i stosowane do badania interakcji HCoV-gospodarz. Po różnicowaniu, te nosowe hodowle ALI podsumowują wiele cech nabłonka nosa in vivo , w tym heterogeniczną populację komórkową z reprezentowanymi komórkami rzęskowymi, kielichowymi i podstawnymi, a także nienaruszoną funkcją śluzowo-rzęskową z silnie bijącymi rzęskami i wydzielaniem śluzu. Ta heterogenicz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Susan Weiss jest członkiem Naukowych Rad Doradczych firmy Ocugen. Noam A. Cohen jest konsultantem GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron i Oyster Point Pharmaceuticals oraz posiada amerykański patent "Terapia i diagnostyka infekcji dróg oddechowych" (10 881 698 B2, WO20913112865) oraz umowę licencyjną z GeneOne Life Sciences.
Podziękowania
To badanie ma następujące źródła finansowania: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. i N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. i N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. i N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor (488, 594, 647) | Invitrogen | Różne | |
| BSA (albumina surowicy bydlęcej) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini inhibitor proteazy wolny od EDTA | Roche | 11836170001 | |
| Zestaw do wykrywania cytotoksyczności | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + wapń + magnez | Gibco | 14040-117 | |
| Komora pomiarowa Endohm-6G | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Marker adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Nabłonkowy miernik napięcia/oma (TEER) (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (płodowa surowica bydlęca) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW oprogramowanie do obrazowania | Olympus | w wersji 4.02 | |
| HCoV-NL63 (ludzki koronawirus, NL63) | Zasoby BEI | NR-470 | |
| HCoV-NL63 przeciwciało nukleokapsydowe | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Barwienie Hoeschta | Thermo Fisher | H3570 | |
| Bufor do próbek Laemmli (4x) | Komórki BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 | ATCC | CCL-7 | Do miareczkowania HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (ludzki koronawirus, koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV), EMC/2012) | Zasoby BEI | NR-44260 | |
| Przeciwciało nukleokapsydu MERS-CoV | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| Przeciwciało MUC5AC | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Mikroskop konfokalny Olympus Fluoview | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 barwnik | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (inhibitory fosfatazy) | Roche | PHOSS-RO | |
| Czytnik płytek | Perkin Elmer | HH34000000 | Wystarczy dowolny czytnik płytek lub czytnik ELISA; musi być w stanie odczytać absorbancję przy buforze RIPA 492 nm |
| (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% deoksycholanu; 0,1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Można przygotować we własnym zakresie lub kupić |
| zestaw RNeasy Plus | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (koronawirus związany z SARS 2, izolat USA-WA1/2020) | Zasoby BEI | NR-52281 | |
| Przeciwciało nukleokapsydu SARS-CoV-2 | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific BP151100 | ||
| Przeciwciało &beta-tubulinowe typu IV Abcam | ab11315 | ||
| Komórki VeroCCL81 | ATCC | CCL-81 | Do miareczkowania komórek MERS-CoV |
| VeroE6 | ATCC | CRL-1586 | Do miareczkowania SARS-CoV-2 |
Bibliografia
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).
- Fehr, A., Perlman, S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
