Artykuł metodologiczny

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64872

⸱

27 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, Gunma University, 2Gunma University Initiative for Advanced Research, Gunma University, 3Department of Veterinary Pathophysiology and Animal Health, Graduate school of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 4Institute for Drug Discovery Innovation, 5AlzMed, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Streszczenie

Hodowla neuronów jest cennym systemem do oceny funkcji synaptycznych i badań przesiewowych leków. W szczególności kultura pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości pozwala na badanie pojedynczych neuronów lub składników subkomórkowych. Wykazaliśmy lokalizację białka subkomórkowego w neuronze za pomocą immunocytochemii, polaryzacji neuronów, morfologii synaptycznej i zmiany rozwojowej przy użyciu pierwotnej hodowli hipokampa o niskiej gęstości. Ostatnio na rynku dostępne stały się gotowe do użycia zamrożone zapasy neuronów. Te zamrożone zasoby neuronów skracają czas potrzebny na przygotowanie eksperymentów na zwierzętach, a także przyczyniają się do zmniejszenia liczby wykorzystywanych zwierząt. Tutaj wprowadzamy powtarzalną metodę hodowli pierwotnej o niskiej gęstości przy użyciu płytki 96-dołkowej. Użyliśmy komercyjnie dostępnego zamrożonego zestawu neuronów z embrionalnego hipokampa szczura. Neurony mogą być stabilnie hodowane przez długi czas bez zmian w pożywce, zmniejszając wzrost komórek glejowych w określonych punktach czasowych. Ten wysokoprzepustowy test wykorzystujący hodowlę o niskiej gęstości umożliwia odtwarzalną ocenę plastyczności synaptycznej opartą na obrazowaniu.

Wprowadzenie

Rozwój eksperymentalnego systemu in vitro, który może oceniać funkcje synaptyczne związane z uczeniem się i pamięcią, jest ważny. Hodowla neuronalna jest cennym systemem oceny funkcji synaptycznych in vitro. Technika hodowli neuronalnej została po raz pierwszy zastosowana w latach 80., a w latach 90. opracowano hodowlę pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości1,2,3 do badania pojedynczych neuronów pod kątem subkomórkowej lokalizacji składników białkowych, transportu białek, polaryzacji neuronów, morfologii kręgosłupa, rozwoju synaps i plastyczności4,5,6,7,8. Jednak technika ta składa się z wielu etapów: krycia zwierząt, preparowania zarodków, przygotowywania naczyń hodowlanych i hodowli komórek przez 3 tygodnie ze zmianami pożywki raz w tygodniu. Ponadto wymaga zaawansowanych technik3.

Opracowaliśmy zamrożone zasoby zdysocjowanych neuronów hipokampa z zarodków szczurów9,10. Zamrożone zasoby neuronów są gotowe do użycia, a do hodowli komórek nie są wymagane żadne zaawansowane techniki11,12. Innymi słowy, hodowla neuronów z zamrożonych zwierząt nie zależy od techniki eksperymentatora. Eliminuje to potrzebę przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach (np. pozwolenie na eksperymenty na zwierzętach, ustawianie zwierząt w ciąży w odpowiednim czasie i preparowanie zarodków szczurów), zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt. Ostatnio na rynku dostępne są wysokiej jakości, gotowe do użycia zamrożone zapasy neuronów. W tym przypadku użyliśmy dostępnych na rynku mrożonych zapasów z embrionalnego dnia (E) 18 szczura hippocampus13,14,15. Hodowla neuronów z zamrożonego stada nie wymaga pożywki kondycjonowanej glejem ani wspólnej hodowli z komórkami glejowymi. Do hodowli komórek można użyć zwykłej pożywki pierwotnej bez dodatkowej surowicy; Dzięki temu możemy pozyskiwać powtarzalne dane. Co więcej, nie ma potrzeby wymiany pożywki przez 3 tygodnie po wysiewie komórek, ponieważ wzrost komórek glejowych jest zmniejszony (Rysunek 1).

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznym przedziałem większości synaps pobudzających. Zawierają białka receptorowe, postsynaptyczne białka rusztowania i aktynowe białka cytoszkieletu. Skupiliśmy się na białku wiążącym aktynę drebrin5,6,7,16,17,18. Drebryna gromadzi się w głowie kręgosłupa w dojrzałych neuronach19, a my podaliśmy drebrynę jako marker stanu synaptycznego15,17,20,21,22,23. Przeprowadzając analizę o wysokiej zawartości przy użyciu drebryny jako odczytu, niedawno opisaliśmy hamujący wpływ analogów fencyklidyny na receptory glutaminianu typu N-metylo-D-asparaginowego (NMDARs)10 oraz zależne od NMDAR wpływ naturalnych związków i surowych leków na stany synaptyczne15.

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak hodować zamrożone zasoby neuronów o niskiej gęstości. Ponadto pokazujemy ocenę stanu synaptycznego opartą na obrazowaniu drebryny przy użyciu 96-dołkowych płytek.

Protokół

1. Powłoka płyty

  1. Pokryć 96-dołkową mikropłytkę poli-L-lizyną (1 mg/ml, rozcieńczony w 0,1 M buforze boranowym [pH: 8,5]; 100 μl/basenik) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Pokryj tylko te studzienki, które muszą być używane. W przeprowadzanych tu eksperymentach wykorzystuje się środkowe 60 studzienek. Bufor boranowy przygotowuje się przez zmieszanie 50 mM kwasu borowego i 12 mM boranu w wysterylizowanej wodzie.
  2. Umyć płytkę dwukrotnie wysterylizowaną wodą (250 μl/studzienkę).
  3. Umyć płytkę raz świeżą pożywką hodowlaną bez dodatków (250 μl/dołek).
  4. Suszyć płytkę na czystej ławce przez 20 minut.
  5. Owiń talerz folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia (ważny przez 1 miesiąc).

2. Sadzenie komórek

  1. Dodać 50 μl/studzienkę pożywki hodowlanej do powlekanej płytki i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut do 1 godziny. Napełnić studzienki obwodowe wysterylizowaną wodą (200 μl/studzienkę).
    UWAGA: Pożywkę hodowlaną przygotowuje się przez dodanie 50x B-27, 400x Glutamax i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny do pożywki neuropodstawowej (szczegóły w Tabeli materiałów).
  2. Usuń kriowial neuronu ze zbiornika ciekłego azotu. Użyte tutaj neurony były neuronami kriokonserwowanymi DMSO11.
  3. Zanurz kriowial w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C na maksymalnie 3 minuty i częściowo rozmrozić zawartość. Nie rozgrzewaj kriowialu zbyt długo. Przenieś zawartość do probówki o pojemności 50 ml zaraz po jej rozmrożeniu.
  4. Powoli przenieś zawartość kriowialną neuronu do sterylnej probówki o pojemności 50 ml kroplami (50 μl/s) za pomocą pipety o pojemności 1 ml z końcówką o szerokich porach.
  5. Przepłukać pusty kriowial 1 ml pożywki hodowlanej (temperatura pokojowa; RT). Przenieść ten 1 ml pożywki hodowlanej z kriowialnego kropli (50 μl/s) do probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórkową.
  6. Dodać kroplami 9 ml pożywki hodowlanej (RT) do probówki o pojemności 50 ml (0,5 ml/s) i uzupełnić objętość do 11 ml. Nie należy powtarzać pipetowania, ale zawiesinę komórek należy mieszać powoli.
  7. Policz liczbę komórek (użyj licznika komórek lub hemocytometru).
  8. Przenieś całą zawiesinę komórek do zbiornika i dozuj zawiesinę komórek do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokich porach (1,0 x 104 komórki/studzienkę). Aby zmniejszyć parowanie pożywki hodowlanej, napełnij studzienki obwodowe wysterylizowaną wodą (krok 2.1).
    UWAGA: To badanie potwierdza, że parowanie pożywki hodowlanej jest małe jak na 3-tygodniową hodowlę bez wymiany pożywki. Szybkość redukcji pożywki wynosi 3,6% (n = 120 dołków). Dzięki temu zmiana osmolalności nie będzie drastyczna podczas 3-tygodniowego okresu inkubacji.
  9. Inkubować neurony przez 1-2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  10. Zastąp pożywkę hodowlaną 100 μl podgrzanej pożywki (37 °C) na studzienkę i umieść ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 (podczas hodowli nie jest wymagana zmiana pożywki).

3. Leczenie Ara-C

  1. Po 4 dniach in vitro (DIV) dodać cytozynę β-D-arabino-furanozyd (Ara-C) do końcowego stężenia 0,2 μM na studzienkę, aby zmniejszyć wzrost komórek glejowych.

4. Leczenie farmakologiczne

  1. Po 21 dniach in vitro potraktuj komórki interesującymi je lekami.
  2. Utrzymywać temperaturę płytki na poziomie 37 °C podczas leczenia farmakologicznego.
  3. W celu kontroli pozytywnej należy potraktować komórki 100 μM glutaminianu (na studzienkę dla końcowego stężenia) przez 10 minut przed utrwaleniem.

5. Fiksacja

  1. Do utrwalenia należy użyć 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (100 μl/studzienkę).
  2. Po ~20 minutach utrwalania przemyć studzienki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 250 μL/studzienkę) 2x po 5 minut każda.

6. Immunocytochemia

  1. Przemyć komórki PBS (250 μL/studzienkę) 1x przez 5 min.
  2. Przepuszczalność komórek 0,1% Triton X-100 (100 μL/studzienkę) w PBS przez 5 minut.
  3. Przemyj komórki PBS (250 μL/studzienkę) 3x przez 5 minut każda.
  4. Do blokowania należy użyć 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (PBSA; 100 μl/basenik) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-drebryny (1:1) i przeciwciałami przeciwko białku 2 (MAP2) (1:000) (60 μl/basenik) w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Przemyj komórki PBS (250 μL/studzienkę) 4x przez 5 minut każda.
  7. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi i dichlorowodorkiem 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; 1:1000) w PBSA (60 μL/basenik) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Przemyj komórki PBS (250 μL/studzienkę) 4x przez 5 minut każda.
  9. Przechowywać komórki w PBS zawierającym 0,1% azydku sodu (150 μl/basenik).

7. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Do uzyskania obrazów należy użyć odpowiedniego mikroskopu.
  2. Aby zidentyfikować ciała komórkowe neuronów, użyj zarówno regionów MAP2-dodatnich, jak i DAPI-dodatnich.
  3. Aby zidentyfikować dendryty neuronów, użyj sygnałów MAP2-dodatnich bez ciał komórkowych.
  4. Aby zidentyfikować klastry drebryny, użyj sygnałów drebrynowo-dodatnich wzdłuż dodatnich dendrytów MAP2.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, neurony hodowano na płytce 96-dołkowej przez 21 dni, a następnie poddano działaniu glutaminianu (Rysunek 1). Neurony rozwijały się prawidłowo przez 3 tygodnie bez wymiany pożywki hodowlanej (Rysunek 2). Komórki traktowano różnymi stężeniami glutaminianu (1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM i 100 µM rozpuszczonego w wodzie sterylnej) przez 10 min, a następnie utrwalono. Wykonano immunocytochemię, a obrazy fluorescencyjne drebriny i MAP2 pozyskano za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego z kamerą sCMOS. Jak pokazano na Rysunku 3, wzdłuż dendrytów wykazujących pozytywną reakcję na MAP2 wyraźnie obserwuje się kolce dendrytyczne wykazujące pozytywną reakcję na drebrinę. Wykazano, że stymulacja glutaminianem wywołuje napływ Ca2+ przez NMDAR, co powoduje odpływ drebriny z kolców dendrytycznych, prowadząc do zmniejszenia gęstości klastrów drebriny5,17. Odpowiednio, zaobserwowano zależną od dawki redukcję gęstości klastrów drebriny pod wpływem stymulacji glutaminianem10 (Rysunek 4). Jak pokazano na Rysunku 5, metoda ta jest wysoce powtarzalna, jeśli drebrina jest wykorzystywana jako marker stanów synaptycznych.

Procedura hodowli neuronów; schemat; zawartość krioprobówki z neuronami; powlekanie; poli-L-lizyna; analiza in vitro.
Rysunek 1: Schemat metody. Neurony hodowano na płytce 96-dołkowej przez 21 dni, a następnie poddano działaniu glutaminianu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kultura komórek neuronalnych, DIV 1-21, progresja wzrostu, mikroskopia kontrastowa, stadia rozwojowe.
Rysunek 2: Obrazy w jasnym polu hodowlanych neuronów w płytce 96-dołkowej. Obrazy w kontraście fazowym uzyskano dla każdego stadium rozwojowego (DIV 1, 7, 14, 21) przy użyciu konfokalnego ilościowego cytometru obrazowego. Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia struktury neuronalnej; białka drebrina i MAP2; obrazy fluorescencyjne; organizacja komórkowa.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy immunobarwionych neuronów hodowlanych. (Lewo) Nałożone obrazy fluorescencyjne drebriny (zielony) i MAP2 (czerwony). Poszczególne obrazy fluorescencyjne drebriny i MAP2 przedstawiono odpowiednio na panelach środkowym i prawym. Białe prostokąty wskazują obszary powiększone poniżej. Paski skali; panele górne: 50 µm, panele dolne: 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie neuronów i wpływ glutaminianu na gęstość drebriny; obrazy mikroskopowe i wykres skrzypcowy danych.
Rysunek 4: Zależne od dawki zmiany odpowiedzi na glutaminian w znormalizowanej gęstości klastrów drebriny. (A) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne po immunobarwieniu na drebrinę (zielony) i MAP2 (czerwony) z dołków traktowanych 0 µM, 10 µM i 100 µM glutaminianu (od lewej do prawej). Pasek skali: 50 µm. (B) Gęstość klastrów drebriny znormalizowano względem średniej z grupy kontrolnej (0 µM). 0 µM, N = 58 dołków; 1 µM, N = 46; 3 µM, N = 54; 10 µM, N = 45; 30 µM, N = 54; 100 µM, N = 55, z 13 eksperymentów z użyciem różnych partii. ** P < 0.01 względem kontroli (0 µM) według testu wielokrotnych porównań Dunnetta po analizie ANOVA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres stężenia glutaminianu w funkcji gęstości drebriny; analiza porównawcza sześciu partii próbek.
Rycina 5: Zależne od dawki glutaminianu zmiany gęstości klastrów drebriny. Surowe dane z sześciu eksperymentów z użyciem różnych partii. N = 4 studzienki dla każdego stężenia (0 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM i 100 µM). Wartości wyrażone jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Przygotowanie powłoki hodowli neuronów, wykres przebiegu sygnału, wielokanałowe rejestracje, badanie elektrofizjologiczne.
Rysunek 6: Zastosowanie zamrożonych zapasów neuronów w eksperymentach elektrofizjologicznych. (A) Protokół eksperymentów elektrofizjologicznych z wykorzystaniem płytek z macierzą mikroelektrod (MEA). Powlekanie: Na dzień przed wysiewem komórek każdą 48-dołkową płytkę MEA pokryto roztworem polietyleniminy (PEI: 0,1%) i inkubowano przez 1 h w 37 °C. Następnie płytkę MEA przemyto 3x sterylną wodą i suszono przez 1 h. Płytkę MEA przechowywano przez noc w 4 °C. Hodowla o wysokiej gęstości: Na 48-dołkowe płytki MEA wysiano neurony w ilości 50 000 komórek/dołek. Etap wysiewu komórek przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 2 powyższego protokołu. Do wysiewu neuronów użyto pożywki hodowlanej z dodatkiem lamininy (20 µg/mL) (do pożywki neurobasal dodano 2 v/v% B-27, 2,5 mM Glutamax oraz 100 µg/mL penicyliny/streptomycyny). Następnie neurony hodowano w 37 °C, 5% CO2 w pożywce hodowlanej. W DIV 1 dokonano całkowitej wymiany pożywki na świeżą pożywkę hodowlaną, powtarzając to do DIV 3. W DIV 4 dodano Ara-C (stężenie końcowe 0,2 µM). Od DIV 5 włącznie, dwa razy w tygodniu, wymieniano 50% pożywki na świeżą pożywkę hodowlaną. Aktywność neuronów w każdym dołku płytki MEA rejestrowano za pomocą systemu MEA. (B) Spontaniczną aktywność neuronów rejestrowano w 37 °C w atmosferze 5% CO2 przy użyciu systemu MEA z częstotliwością próbkowania 12,5 kHz/kanał w DIV 21. Przedstawiono zapisy z 4 kanałów spośród 16 kanałów w jednym dołku. Dla wszystkich rejestracji zastosowano pasmowo-przepuszczający filtr Butterwortha (200-3 000 Hz). Groty strzałek wskazują czas wystąpienia zsynchronizowanych serii wyładowań (burst firing). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Krytycznym krokiem w tej metodzie jest rozmrożenie zawiesiny komórek. Przeniesienie zawiesiny komórkowej, zanim stanie się zbyt ciepła, jest bardzo ważne. Aby jednak uniknąć szybkiej zmiany osmolalności, nie należy jednocześnie przenosić zawiesiny komórek do dużej objętości pożywki. Stopniowe dodawanie pożywki hodowlanej ma również kluczowe znaczenie dla uniknięcia nagłych zmian ciśnienia osmotycznego.

Neurony mogą być hodowane w innych naczyniach hodowlanych: płytkach 24-dołkowych, komorach 8-dołkowych, szalkach 60 mm lub sondach MED. Jednakże w takich przypadkach należy dostosować końcowe stężenie i czas dodania Ara-C. Ponadto gęstość neuronów musi być optymalizowana w różnych typach eksperymentów. Na przykład do eksperymentów elektrofizjologicznych wymagana jest hodowla o dużej gęstości, a w takim przypadku wymiana pożywki jest potrzebna dwa razy w tygodniu (ryc. 6). W związku z tym kultura o niskiej gęstości wymaga mniejszej liczby kroków niż hodowla o dużej gęstości.

Hodowla neuronów o niskiej gęstości często wymaga zaawansowanych technik; Jednak użycie gotowego do użycia mrożonego bulionu rozwiązuje ten problem. Opisana metoda nie zależy od umiejętności eksperymentatora. Jakość zamrożonego wywaru jest stabilna i może być stabilnie hodowany, o ile jest przechowywany w ciekłym azocie i unika zmian temperatury przez okres do 4 lat.

Hodowla komórek przez 3 tygodnie bez wymiany pożywki rodzi pytanie, czy zachodzą znaczące zmiany osmolalności lub parowanie pożywek hodowlanych. Potwierdziliśmy jednak, że parowanie pożywek hodowlanych jest niewielkie (współczynnik redukcji 3,6%). Lokalizacja białek synaptycznych i morfologia neuronów wydają się normalne po 3 tygodniach. Dlatego 3-tygodniowa hodowla bez wymiany pożywki nie powoduje dużych zmian osmolalności wpływających na warunki hodowanych neuronów. Trzymanie płytki w inkubatorze po leczeniu Ara-C jest również ważnym punktem, który minimalizuje parowanie.

Nie ma ograniczeń dotyczących korzystania z zamrożonych neuronów zapasowych. Istnieją jednak pewne ograniczenia metody hodowli o niskiej gęstości. Potwierdziliśmy, że hodowla o niskiej gęstości może być stosowana do obserwacji morfologicznej neuronów, oceny funkcji synaps i transfekcji GFP. Nie badaliśmy jednak obrazowania żywych komórek. Ponadto, jak wspomniano powyżej, do przeprowadzenia elektrofizjologii wymagana jest hodowla o dużej gęstości.

Dojrzewanie synaps trwa zwykle 3 tygodniei nie możemy potwierdzić, że wyhodowane neurony mają prawidłowe synapsy do końca. Jeśli dojrzewanie synaps nie jest dobre po 3 tygodniach, będziemy musieli ponownie przeprowadzić hodowlę. Znając jakość neuronów przed rozpoczęciem eksperymentów, możemy zaoszczędzić te 3 tygodnie. Dlatego, aby efektywnie przeprowadzać eksperymenty, najlepiej wcześniej sprawdzić jakość neuronów. Zamrożone zapasy umożliwiają wcześniejsze sprawdzenie jakości neuronów. Każda partia zamrożonych zapasów jest generowana z jednego miotu szczurów i możemy użyć jednego z zapasów z każdej partii do kontroli jakości. Drebrin jest dobrym markerem do kontroli jakości neuronów. Zgodnie z opisem, drebryna gromadzi się w głowie kręgosłupa w dojrzałych neuronach i reaguje na stymulację synaptyczną. W ten sposób możemy sprawdzić jakość neuronów w zamrożonych stadach, używając drebryny jako markera.

Metodę tę można zastosować do oceny wpływu leków na stan synaptyczny. Exodus drebryny z kolców dendrytycznych występuje w początkowych stadiach plastyczności synaptycznej22. Dlatego wykrycie redukcji klastrów drebryny wywołanej leczeniem farmakologicznym pokazuje, że lek stymuluje synapsę i powoduje plastyczność synaptyczną. Ponadto, aby określić, czy redukcja jest zależna od NMDAR, przydatny jest eksperyment z użyciem kwasu 2-amino-5-fosfonowaleraniowego (APV, antagonista NMDAR). Używając drebryny jako markera, nawet zależność od NMDAR jest wyraźnie określona10,15. Opisana metoda jest przydatna w badaniach przesiewowych leków, badaniach farmakologicznych bezpieczeństwa i ocenie funkcji synaptycznych.

Oświadczenia

Tomoaki Shirao jest dyrektorem generalnym AlzMed, Inc. Badanie zostało sfinansowane przez AlzMed, Inc. (500 000 JPY dla NK na projekt zatytułowany "Wysokoprzepustowa analiza funkcji synaptycznych").

Podziękowania

Dziękujemy Kazumi Kamiyama i Manami Kawada za pomoc w eksperymentach. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI (grant nr 19K08010 dla N.K.) oraz Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) (grant nr JP19bk0104077 i JP22bm0804024 dla T.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowaZeon CorporationPodarowana
96-dołkowa płytkagreiner655986
Przeciwciało anty-drebrynowe (M2F6)MBLD029-3Mysz monoklonalna (rozcieńczenie 1:1)
Przeciwciało anty-MAP2MilliporeAB5622Królik  (rozcieńczenie 1:1000)
Przeciw myszom Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11031Rozcieńczenie 1: 500
Anty-królicze Alexa Fluor Thermo Fisher ScientificA11008Rozcieńczenie 1: 500
B-27Gibco17504-0442 v/v% dla płytek MEA; 50x dla normalnych płyt
BoraksSigmaB-9876Stężenie końcowe 12 mM
Kwas borowyWAKO021-02195Stężenie końcowe 50 mM
Albumina surowicy bydlęcejMilipore12659-100GStężenie końcowe: 3% w PBS
Konfokalny cytometr obrazu ilościowego
CellVoyager CQ1		YOKOGAWAObrazy kontrastu fazowego
Cytozyna β-D-arabino-furanozyd (Ara-C)SigmaC-6645Rozcieńczony w dH2O (stężenie końcowe: 0,2 &mikro; M)
DAPIFUJIFILM340-07971Rozcieńczenie 1:1000
GlutaMAXGibco35050-061  2,5 mM dla płyt MEA; 400x dla normalnych płytek
w analizatorze komórkowym 2200CytivaObrazy fluorescencyjne
LamininSigma114956-81-9Stężenie końcowe: 20 &mikro; g/mL
MaestroAxion BiosystemsNagrania MEA
Płyta MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48W
NeurobasalGibco21103-049
Paraformaldehydnacalai tesque26126-25Stężenie końcowe: 4% w PBS
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122  100 U/ml dla normalnych płytek
Penicylina/Streptomycynanacalai tesque26253-84100 µ g / ml dla płytek MEA
polietylenoiminaSigma9002-98-6Stężenie końcowe: 0,1%
Poli-L-lizynaSigmaP2636Rozcieńczony w buforze boranowym (stężenie końcowe: 1 mg / ml)
SKY NeuronAlzMed , Inc.ARH0011,0 x 106 komórek/probówka
Azydek soduFUJIFILM195-110920,1%
SodiumL(+)-Glutaminian monohydratWAKO194-02032Rozcieńczony w dH2O (stężenia końcowe: 1 &mikro; M, 3 i mikro; M, 10 i mikro; M, 30 i mikro; M, 100 i mikro; M)

Bibliografia

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-density primary hippocampal neuron culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000(2017).
  4. Mizui, T., et al. Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions. Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).
  5. Mizui, T., et al. Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines. PLoS One. 9 (1), 85367(2014).
  6. Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons. Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).
  7. Takahashi, H., et al. Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis. The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).
  8. Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools. Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).
  9. Hanamura, K., et al. High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607(2019).
  10. Mitsuoka, T., et al. Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583(2019).
  11. Ishizuka, Y., Bramham, C. R. A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578(2020).
  12. Pischedda, F., et al. Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81(2018).
  13. Kobayashi, Y., et al. Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).
  14. Kobayashi, Y., et al. Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro. Neurochemistry International. 142, 104902(2021).
  15. Koganezawa, N., et al. NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis. The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).
  16. Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions. Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).
  17. Sekino, Y., et al. Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts. Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).
  18. Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis. Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).
  19. Aoki, C., et al. Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses. The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).
  20. Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. The role of drebrin in dendritic spines. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).
  21. Shirao, T., et al. The role of drebrin in neurons. Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).
  22. Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. Role of drebrin in synaptic plasticity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).
  23. Togo, K., et al. Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro. Molecular Brain. 14 (1), 149(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotna hodowla neuronówhodowla o niskiej gęstościmrożony bank neuronówpłytka 96-dołkowaimmunocytochemiaplastyczność synaptycznaredukcja komórek glejowychprzesiewanie lekówkolce dendrytyczne
Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.