Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organoidy to dynamiczne modele nowotworów 3D, które mogą być z powodzeniem wyhodowane z tkanki guza jajnika pochodzącej od pacjenta, wodobrzusza lub płynu opłucnowego i pomagają w odkrywaniu nowych terapii i biomarkerów predykcyjnych dla raka jajnika. Modele te podsumowują heterogeniczność klonalną, mikrośrodowisko guza oraz interakcje komórka-komórka i komórka-macierz. Ponadto wykazano, że pasują do guza pierwotnego morfologicznie, cytologicznie, immunohistochemicznie i genetycznie. W ten sposób organoidy ułatwiają badania nad komórkami nowotworowymi i mikrośrodowiskiem guza oraz są lepsze od linii komórkowych. Niniejszy protokół opisuje różne metody generowania organoidów raka jajnika pochodzących od pacjentki z guzów, wodobrzusza i próbek płynu opłucnowego z wyższym niż 97% wskaźnikiem sukcesu. Próbki od pacjentów są rozdzielane do zawiesin komórkowych zarówno przez trawienie mechaniczne, jak i enzymatyczne. Komórki są następnie posiane przy użyciu ekstraktu z błony podstawnej (BME) i wspierane zoptymalizowanymi pożywkami wzrostowymi zawierającymi suplementy specyficzne dla hodowli surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC). Po utworzeniu początkowych organoidów, ChNP mogą utrzymywać długotrwałą hodowlę, w tym pasażowanie w celu ekspansji do kolejnych eksperymentów.
Wprowadzenie
W 2021 roku u około 21 410 kobiet w Stanach Zjednoczonych zdiagnozowano nowego raka nabłonka jajnika, a 12 940 kobiet zmarło z powodu tej choroby1. Chociaż poczyniono wystarczające postępy w chirurgii i chemioterapii, u ponad 70% pacjentów z zaawansowaną chorobą rozwija się oporność na chemioterapię i umiera w ciągu 5 lat od diagnozy2,3. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe strategie leczenia tej śmiertelnej choroby oraz reprezentatywne, wiarygodne modele badań przedklinicznych.
Linie komórkowe raka i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stworzone z pierwotnych guzów jajnika są głównymi instrumentami używanymi w badaniach nad rakiem jajnika. Główną zaletą linii komórek nowotworowych jest ich szybka ekspansja. Jednak ich ciągła hodowla powoduje zmiany fenotypowe i genotypowe, które powodują, że linie komórek rakowych odbiegają od pierwotnej próbki pierwotnego guza nowotworowego. Ze względu na istniejące różnice między linią komórkową raka a guzem pierwotnym, testy leków, które mają pozytywny wpływ na linie komórkowe, nie dają tych samych efektów w badaniach klinicznych2. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stosuje się modele PDX. Modele te są tworzone poprzez wszczepienie świeżej tkanki raka jajnika myszom z niedoborem odporności. Ponieważ są to modele in vivo, dokładniej przypominają ludzkie cechy biologiczne, a co za tym idzie, są bardziej predykcyjne dla wyników leczenia lekami. Jednak modele te mają również istotne ograniczenia, w tym koszt, czas i zasoby potrzebne do ich wygenerowania4.
PDO oferują alternatywny model dla badań przedklinicznych, który pokonuje ograniczenia zarówno linii komórek rakowych, jak i modeli PDX. PDO podsumowują guz pacjenta i mikrośrodowisko guza, a tym samym zapewniają wykonalny model in vitro, idealny do badań przedklinicznych2,3,5. Te modele 3D mają zdolności samoorganizacji, które modelują guz pierwotny, co jest cechą, której nie posiadają ich dwuwymiarowe (2D) odpowiedniki linii komórkowych. Co więcej, wykazano, że modele te reprezentują genetycznie i funkcjonalnie swoje nowotwory macierzyste, a zatem są wiarygodnymi modelami do badania nowych terapii i procesów biologicznych. Krótko mówiąc, oferują one długoterminowe możliwości rozbudowy i przechowywania, podobne do linii komórkowych, ale obejmują również mikrośrodowisko i interakcje komórka-komórka nieodłącznie związane z modelami myszymi4,6.
Obecny protokół opisuje tworzenie PDO z próbek guzów, wodobrzusza i płynu opłucnowego pochodzących od pacjentów z wyższym niż 97% wskaźnikiem sukcesu. Hodowle ChNP mogą być następnie rozszerzane na wiele pokoleń i wykorzystywane do testowania wrażliwości terapii lekowej i biomarkerów predykcyjnych. Metoda ta stanowi technikę, którą można wykorzystać do personalizacji leczenia w oparciu o odpowiedzi terapeutyczne PDO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie próbki tkanek ludzkich pobrane do badań zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board (IRB). Przedstawione poniżej protokoły zostały przeprowadzone w sterylnym środowisku hodowli tkanek ludzkich. Uzyskano świadomą pisemną zgodę od ludzi. Kwalifikujące się pacjentki musiały mieć zdiagnozowaną lub przypuszczalną diagnozę raka jajnika, być chętne i zdolne do podpisania świadomej zgody oraz mieć ukończone 18 lat. Tkanka nowotworowa (złośliwy guz pierwotny lub miejsca przerzutów), wodobrzusze i płyn opłucnowy uzyskano od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę w czasie zabiegu. Próbki te zostały natychmiast przetransportowane do laboratorium i przetworzone w celu wytworzenia organoidów przy użyciu metod opisanych poniżej.
1. Przygotowanie mediów
- Kompletne przygotowanie pożywki organoidowej
- Przygotuj pożywkę kondycjonowaną R-spondyną 1/Noggin zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
UWAGA: Pożywka kondycjonowana R-spondyną-1/Noggin jest tańszą alternatywą dla dostępnych na rynku białek rekombinowanych. HEK293T komórki stabilnie wydzielające R-spondynę-1 i Noggin poprzez transdukcję za pośrednictwem lentiwirusa były hojnym darem od Rona Bose z Washington University School of Medicine w St. Louis i Anila Rustgi, New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center8,9,10. Jako substytut można użyć komercyjnego kondycjonowanego podłoża (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj pożywkę kondycjonowaną R-spondyną 1/Noggin zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
- Aby uzyskać kompletną pożywkę organoidową, połącz 10% pożywki kondycjonowanej R-spondyną 1/Noggin, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nikotynamidu, 1,25 mmol/L N-acetylocysteiny, 1 μmol/L prostaglandyny E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 i 10 μM inhibitora ROCK (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. To medium zostało zaadaptowane z Hill et al.11. Stężenia i składniki pożywki są takie same, z dodatkiem inhibitora ROCK. - Przygotować podłoże bazowe organoidów, łącząc 500 ml zaawansowanego preparatu DMEM/F12 z 1% penicyliną-streptomycyną, 1x dipeptydem, L-alanylo-L-glutaminą i 1x HEPES (10 mM) (patrz Tabela materiałów).
2. Pobieranie organoidów z wodobrzusza i płynu opłucnowego
UWAGA: Wodobrzusze i płyn opłucnowy muszą być przetwarzane tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać najlepszy plon organoidów. Rozmrozić wcześniej podany bufor reakcyjny BME, DNazy I i DNazy I (patrz Tabela materiałów), umieszczając go na lodzie do momentu upłynnienia zawartości.
- Wodobrzusze i płyn opłucnowy należy pobrać od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, w czasie standardowych operacji lub zabiegów medycznych, a następnie przetransportować w temperaturze pokojowej w pojemniku podróżnym do laboratorium.
UWAGA: Wszystkie procesy związane z wodobrzuszem lub płynem opłucnowym powinny być przeprowadzane w sterylnym środowisku. - Przenieś 50 ml wodobrzusza lub płynu opłucnowego do 50 ml stożkowych probówek (liczba probówek zależy od objętości uzyskanego wodobrzusza). Wirować przy 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu należy użyć szklanej pipety Pasteura, aby ostrożnie zassać supernatant.
- Kontynuować dodając 50 ml wodobrzusza lub płynu opłucnowego do uprzednio odwirowanego osadu i ponownie odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Powtarzaj ten krok, aż całe wodobrzusze lub płyn opłucnowy zostaną przetworzone.
- Przygotować 100 μg/ml roztworu DNazy I, łącząc 1 000 μl wody wolnej od nukleaz, 100 μl buforu reakcyjnego DNazy I i 10 μl DNazy I.
UWAGA: Zastosowana metoda DNazy I jest wystarczająca do wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej niezależnie od obecności agregatów komórkowych w niektórych próbkach pobranych przez pacjenta12. - Zawiesić każdą osad komórkowy w 1 ml 100 μg/ml roztworu DNazy I. Delikatnie dodawać kroplami roztwór DNazy I i pozostawić probówkę do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Dodać co najmniej 1 ml roztworu DNazy I. Jeśli 1 ml nie wystarczy, aby zakłócić działanie osadu, dodaj dodatkowy 1 ml. - Po inkubacji dodać 25 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) do komórek i delikatnie odwrócić, aby wymieszać. Następnie odwirować przy 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Ponownie zawiesić nowo utworzone granulki komórek we wstępnie podgrzanych 5 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) (patrz Tabela materiałów). Ustaw wir na 458 x g i wiruj roztwory w każdej stożkowej probówce. Gdy roztwory będą jednorodne, za pomocą pipety serologicznej połączyć zawartość wszystkich stożkowych probówek w jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml.
- Inkubować stożkową probówkę zawierającą wirowany roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po zakończeniu inkubacji odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Sprawdź granulkę. Różowo-czerwona osadka wskazuje na obecność krwinek czerwonych, co wymagałoby powtórzenia etapu buforowania lizy krwinek czerwonych, aż osadek przestanie być czerwony. - Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie przepłukać osad 10 ml PBS, zwirować roztwór przy 458 x g i odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Jeśli tworzy się osad o dużej komórki, należy odessać PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 1 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) na wierzch osadu. Zmieszać roztwór o stężeniu 458 x g i przenieść 300-400 μl do probówki mikrowirówkowej. Odwirować probówkę do mikrowirówki o sile 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Część osadu komórkowego, która nie zostanie umieszczona w probówce mikrowirówki, może zostać zamrożona do wykorzystania w przyszłości (500 μL komórek na 1 ml 10% DMSO w FBS). Zamrożone osady komórkowe mogą być przechowywane przez tygodnie w temperaturze -80 °C i przez lata, jeśli zostaną umieszczone w ciekłym azocie13. - Ostrożnie odessać podłoże bazowe organoidu (krok 1.3) za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić w BME (patrz Tabela Materiałów) za pomocą zimnych końcówek.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości granulki. Zaleca się stosowanie 25% pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) z zawieszonymi komórkami do 75% BME. - Na płytkę 6-dołkową należy umieścić 40 μl podwielokrotności zawieszonego roztworu komórkowego. Płytka do pięciu porcji na studzienkę ( Rysunek 1).
- Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 20 minut, aby umożliwić zastygnięcie BME. Po inkubacji delikatnie dodać 2 ml kompletnego podłoża organoidowego (krok 1.2) do każdej studzienki.
Rysunek 1: Posiewanie organoidów raka jajnika pochodzących od pacjentki. Reprezentatywny obraz posiewu organoidowego. Podwielokrotności mieszaniny organoidów są starannie platerowane, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
3. Pobieranie organoidów z tkanek
UWAGA: Tkanka musi być przetworzona tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać najlepszą wydajność organoidów.
- Zbierz i przetransportuj guz na lodzie w pojemniku podróżnym zawierającym PBS.
- Umieść próbkę na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej (Rysunek 2). Za pomocą jednorazowego skalpela zmiel chusteczkę. Następnie, używając końcówki jednorazowej strzykawki, zmiażdż tkankę, aż powstanie jednorodna mieszanina.
- Za pomocą kleszczy umieść jednorodną mieszaninę tkanek w probówce dysocjującej. Na każde 1-2 ml homogenizowanej tkanki dodać 7-8 ml 1 mg/ml roztworu kolagenazy typu II (patrz tabela materiałów) w pożywce na bazie organoidów (krok 1.3) i 1 ml roztworu DNazy I. Zmieszać roztwór przy 458 x g.
UWAGA: Ilość tkanki określi ilość roztworu kolagenazy i liczbę potrzebnych probówek. - Użyj maszyny dysocjującej (patrz Tabela materiałów), aby upłynnić tkankę, gdy znajduje się ona w roztworze kolagenazy. Uruchom program 37C_h_TDK3 (1 h), aż stanie się zawiesiną jednokomórkową.
UWAGA: Program będzie musiał zostać uruchomiony ponownie, jeśli otrzymana mieszanina nie jest jednorodna (tj. jeśli fragmenty tkanek są nadal obecne w mieszaninie). Jeśli tkanka jest trawiona, ale roztwór jest lepki, rozcieńczyć za pomocą pożywki na bazie organoidów (krok 1.3). - Przenieść homogenizowaną mieszaninę do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 20-40 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3). Następnie przefiltruj roztwór przez sitko do komórek 100 μm do nowo oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Przefiltrowaną mieszaninę odwirować przy sile 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Przygotować 100 μg/ml roztworu DNazy I, łącząc 1 000 μl wody wolnej od nukleaz, 100 μl buforu reakcyjnego DNazy I i 10 μl DNazy I.
UWAGA: Zastosowana metoda DNazy I jest wystarczająca do wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej niezależnie od obecności agregatów komórkowych w niektórych próbkach pobranych przez pacjenta12. - Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu DNazy I o stężeniu 100 ug/mL. Delikatnie dodawać kroplami roztwór DNazy I i pozostawić probówkę do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji dodać 25 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) do komórek i delikatnie odwrócić, aby wymieszać. Następnie odwirować przy 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Ponownie zawiesić nowo utworzony osad komórkowy w 5 ml wstępnie podgrzanego buforu do lizy 1x RBC. Zmieszać roztwory w każdej stożkowej probówce o masie 458 x g.
- Inkubować stożkową probówkę zawierającą osad komórkowy zawieszony ponownie w buforze do lizy RBC przez 5 minut. Po zakończeniu inkubacji odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Sprawdź granulkę. Różowo-czerwona osadka wskazuje na obecność erytrocytów, co wymagałoby powtórzenia etapu buforowania lizy krwinek czerwonych, aż osadek stanie się biały. - Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie przepłukać osad 10 ml PBS, zwirować roztwór przy 458 x g i odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Jeśli tworzy się osad o dużej komórki, należy odessać PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 1 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) na wierzch osadu. Zmieszać roztwór o stężeniu 458 x g i przenieść 300-400 μl do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Część osadu komórkowego, która nie została umieszczona w probówce mikrowirówki, może zostać zamrożona do wykorzystania w przyszłości (500 μL komórek na 1 ml 10% DMSO w FBS) (krok 5.1). Zamrożone osady komórkowe mogą być przechowywane przez tygodnie w temperaturze -80 °C i przez lata, jeśli zostaną umieszczone w ciekłym azocie13. - Ostrożnie odessać podłoże bazowe organoidu za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić w BME za pomocą zimnych końcówek.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości granulki. Zaleca się dodanie 25% pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) z zawieszonymi komórkami do 75% BME. - Zawiesinę zawiesiny roztworu komórkowego należy umieścić na 6-dołkowej płytce w podwielokrotnościach o objętości 40 μl. Płytka do pięciu porcji na studzienkę.
- Natychmiast umieścić płytkę studzienki w inkubatorze na 20 minut. Po inkubacji delikatnie dodać 2 ml kompletnego podłoża organoidowego (krok 1.2) do każdej studzienki.
Rysunek 2: Tkanka nowotworowa przed sekcją. Reprezentatywny obraz tkanki nowotworowej uzyskany do generowania organoidów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
4. Pasażowanie organoidów
UWAGA: Jeśli próbka jest zlewana, każda studnia organoidowa może być co tydzień przenoszona do dwóch nowych dołków.
- Używając pipety o pojemności 1 ml, dodaj 1 ml pożywki na bazie organoidów (krok 1.3) do każdej studzienki i pipetuj pożywkę w górę iw dół bezpośrednio na zakładki organoidów, aby je oddzielić. Zebrać całe podłoże zawierające zawieszone granulki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
- Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą mieszaninę o sile 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Dodać 1 ml rekombinowanego enzymu niepochodzenia zwierzęcego (patrz tabela materiałów) do osadu komórkowego, zmieszać roztwór przy 458 x g i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pozostawić probówkę do inkubacji przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji odwirować przy 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Ponownie zawiesić granulat w BME.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości granulki. Zaleca się dodanie 25% pożywki bazowej organoidów (krok 1.3) z zawieszonymi komórkami do 75% BME. - Zawiesinę zawiesiny roztworu komórek należy umieścić na płytce 6-dołkowej w podwielokrotnościach o objętości 40 μl. Płytka do pięciu porcji na studzienkę. Po pokryciu wszystkich podwielokrotności należy natychmiast umieścić płytkę studzienki w inkubatorze na 20 minut. Po inkubacji delikatnie dodać 2 ml kompletnego podłoża organoidowego (krok 1.2) do każdej studzienki.
5. Zamrażanie i rozmrażanie organoidów
- Zamrażanie organoidów
- Zacznij od kroków 4.1-4.4.
- Zawiesić osad komórkowy w 0,5-1 ml pożywki do zamrażania kultur komórkowych (patrz tabela materiałów) i przenieść 1 ml do każdego kriowialu.
- Następnie umieść kriowiale w pojemniku wypełnionym izopropanolem w temperaturze -80 °C na okres do 2 tygodni przed przeniesieniem ich do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania13.
- Rozmrażanie organoidów
- Wyjąć próbki ze zbiornika z ciekłym azotem i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po rozmrożeniu przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Ponownie zawiesić granulat w BME.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości granulki. Zaleca się dodanie 25% pożywki bazowej organoidów (krok 1.3) z zawieszonymi komórkami do 75% BME. - Zawiesinę zawiesiny roztworu komórkowego należy umieścić na 6-dołkowej płytce w podwielokrotnościach o objętości 40 μl. Umieść do pięciu porcji na studzienkę.
- Natychmiast umieść płytkę w inkubatorze na 20 minut. Po inkubacji delikatnie dodać 2 ml kompletnej pożywki organoidowej (krok 1.2) do studzienek.
6. Osadzanie i generowanie preparatów z zatopioną parafiną (FFPE) w formalinie w celu oceny składu organoidów
- Po hodowli organoidów przez co najmniej 10 dni w celu zapewnienia odpowiedniej wielkości, usuń całe podłoże organoidowe z dołków i dodaj 1 ml 2% utrwalacza paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 min.
- Po inkubacji przemyć podwielokrotności organoidów z kulturą 3x przez 5 minut za każdym razem 1 ml PBS.
- Usuń PBS z każdej studzienki i dodaj 1 ml ciepłego 2% agaru w dejonizowanymH2Odo każdej studzienki. Dodając agar, należy podnieść wyhodowane porcje organoidów z płytki za pomocą szpatułki.
UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do stwardnienia agaru przed podniesieniem hodowanych porcji organoidów.- Pozwól agarowi zestalić się w studzience w temperaturze pokojowej.
- Za pomocą małej szpatułki uwolnij zestalony agar z dołka i przechowuj go w kasecie do 48 godzin (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 4 °C w 70% etanolu do czasu przetworzenia14.
- Osadź próbki w parafinie15, przytnij szkiełka do grubości 5 μm i wybarwij szkiełka hematoksyliną i eozyną (H&E, patrz Tabela materiałów) przy użyciu standardowego protokołu15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wygenerować PDO, próbki były trawione mechanicznie i enzymatycznie do jednokomórkowych zawiesin. Komórki zostały następnie ponownie zawieszone w BME i uzupełnione specjalnie zaprojektowanymi pożywkami (Rysunek 3). Organoidy są zwykle zakładane w ciągu 10 dni, po czym wykazują dyskretne organoidy w kulturze (Ryc. 4).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rak jajnika jest niezwykle śmiertelny ze względu na jego zaawansowane stadium w momencie diagnozy, a także powszechny rozwój oporności na chemioterapię. Wiele postępów w badaniach nad rakiem jajnika osiągnięto dzięki wykorzystaniu linii komórek nowotworowych i modeli PDX; Istnieje jednak wyraźna potrzeba bardziej reprezentatywnego i przystępnego cenowo modelu in vitro . Udowodniono, że PDO dokładnie reprezentują niejednorodność guza, mikrośrodowisko guza oraz cechy genomiczne i transkryptomiczne ich pierwotnych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wskazówki Rona Bose, doktora nauk medycznych, oraz pomoc dr Barbary Błachut w ustanowieniu tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować Szkole Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology and Division of Gynecologic Oncology, Programowi Stypendialnemu Dziekana Uniwersytetu Waszyngtońskiego oraz Programowi Rozwoju Naukowca Zajmującego się Rozrodczością za wsparcie tego projektu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% penicylina-streptomycyna | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1,5 ml probówki Eppendorfa | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Naczynie do hodowli tkankowych | TPP | 93100 | |
| 10 ml Pipeta | |||
| 100 µ m Filtr komórkowy | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL probówki wirówkowe | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% utrwalacz paraformaldehydu | Sigma-Aldrich | ||
| 37 ° C kąpiel wodna | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Kondycjonowany suplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6-dołkowe płytki | TPP | 92006 | |
| 70% etanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Wirówka 17504044 | |||
| B-27 | Life Technologies | ||
| Cultrex Typ 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | z błony podstawnej |
| DNaza I | Nowa Anglia Bio Labs | M0303S | |
| Bufor reakcyjny DNazy I | Anglia Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Rurki | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Disocjator z grzałkami | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | Korzystamy z protokołu producenta. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | zestaw do barwienia dipeptydu, L-alanylo-L-glutaminy |
| Hematoksyliny i eozyny | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Wosk parafinowy | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Mikrowirówka | |||
| Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylocysteina | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nikotynamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipeta z końcówkami | |||
| p200 Pipeta z końcówkami | |||
| Pipety Pasteura 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific MT21031CM | ||
| Kontroler | |||
| Prostaglandyna E2 | R& D Systems | 2296 | |
| Puromycyna | ThermoFisher | A1113802 | |
| Rekombinowany mysi Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Regeneracyjne podłoże do zamrażania kultur komórkowych | Invitrogen | 12648010 | |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek | BioLegend | 420301 | |
| Inhibitor ROCK (Y-27632) | R& D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Kolba | MidSci | TP90076 | |
| Kaptur do hodowli tkankowych | |||
| Kaseta | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | niepochodzący, rekombinowany enzym |
| typu II Kolagenaza Life | Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
Bibliografia
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429(2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408(2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581(2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
