Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organoidy to dynamiczne modele nowotworów 3D, które mogą być z powodzeniem wyhodowane z tkanki guza jajnika pochodzącej od pacjenta, wodobrzusza lub płynu opłucnowego i pomagają w odkrywaniu nowych terapii i biomarkerów predykcyjnych dla raka jajnika. Modele te podsumowują heterogeniczność klonalną, mikrośrodowisko guza oraz interakcje komórka-komórka i komórka-macierz. Ponadto wykazano, że pasują do guza pierwotnego morfologicznie, cytologicznie, immunohistochemicznie i genetycznie. W ten sposób organoidy ułatwiają badania nad komórkami nowotworowymi i mikrośrodowiskiem guza oraz są lepsze od linii komórkowych. Niniejszy protokół opisuje różne metody generowania organoidów raka jajnika pochodzących od pacjentki z guzów, wodobrzusza i próbek płynu opłucnowego z wyższym niż 97% wskaźnikiem sukcesu. Próbki od pacjentów są rozdzielane do zawiesin komórkowych zarówno przez trawienie mechaniczne, jak i enzymatyczne. Komórki są następnie posiane przy użyciu ekstraktu z błony podstawnej (BME) i wspierane zoptymalizowanymi pożywkami wzrostowymi zawierającymi suplementy specyficzne dla hodowli surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC). Po utworzeniu początkowych organoidów, ChNP mogą utrzymywać długotrwałą hodowlę, w tym pasażowanie w celu ekspansji do kolejnych eksperymentów.
Wprowadzenie
W 2021 roku u około 21 410 kobiet w Stanach Zjednoczonych zdiagnozowano nowego raka nabłonka jajnika, a 12 940 kobiet zmarło z powodu tej choroby1. Chociaż poczyniono wystarczające postępy w chirurgii i chemioterapii, u ponad 70% pacjentów z zaawansowaną chorobą rozwija się oporność na chemioterapię i umiera w ciągu 5 lat od diagnozy2,3. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe strategie leczenia tej śmiertelnej choroby oraz reprezentatywne, wiarygodne modele badań przedklinicznych.
Linie komórkowe raka i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stworzone z pierwotnych guzów jajnika są głównymi instrumentami używanymi w badaniach nad rakiem jajnika. Główną zaletą linii komórek nowotworowych jest ich szybka ekspansja. Jednak ich ciągła hodowla powoduje zmiany fenotypowe i genotypowe, które powodują, że linie komórek rakowych odbiegają od pierwotnej próbki pierwotnego guza nowotworowego. Ze względu na istniejące różnice między linią komórkową raka a guzem pierwotnym, testy leków, które mają pozytywny wpływ na linie komórkowe, nie dają tych samych efektów w badaniach klinicznych2. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stosuje się modele PDX. Modele te są tworzone poprzez wszczepienie świeżej tkanki raka jajnika myszom z niedoborem odporności. Ponieważ są to modele in vivo, dokładniej przypominają ludzkie cechy biologiczne, a co za tym idzie, są bardziej predykcyjne dla wyników leczenia lekami. Jednak modele te mają również istotne ograniczenia, w tym koszt, czas i zasoby potrzebne do ich wygenerowania4.
PDO oferują alternatywny model dla badań przedklinicznych, który pokonuje ograniczenia zarówno linii komórek rakowych, jak i modeli PDX. PDO podsumowują guz pacjenta i mikrośrodowisko guza, a tym samym zapewniają wykonalny model in vitro, idealny do badań przedklinicznych2,3,5. Te modele 3D mają zdolności samoorganizacji, które modelują guz pierwotny, co jest cechą, której nie posiadają ich dwuwymiarowe (2D) odpowiedniki linii komórkowych. Co więcej, wykazano, że modele te reprezentują genetycznie i funkcjonalnie swoje nowotwory macierzyste, a zatem są wiarygodnymi modelami do badania nowych terapii i procesów biologicznych. Krótko mówiąc, oferują one długoterminowe możliwości rozbudowy i przechowywania, podobne do linii komórkowych, ale obejmują również mikrośrodowisko i interakcje komórka-komórka nieodłącznie związane z modelami myszymi4,6.
Obecny protokół opisuje tworzenie PDO z próbek guzów, wodobrzusza i płynu opłucnowego pochodzących od pacjentów z wyższym niż 97% wskaźnikiem sukcesu. Hodowle ChNP mogą być następnie rozszerzane na wiele pokoleń i wykorzystywane do testowania wrażliwości terapii lekowej i biomarkerów predykcyjnych. Metoda ta stanowi technikę, którą można wykorzystać do personalizacji leczenia w oparciu o odpowiedzi terapeutyczne PDO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie ludzkie próbki tkanek pobrane do celów badawczych pozyskano zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną (IRB). Poniżej opisane protokoły przeprowadzono w sterylnym środowisku do hodowli ludzkich tkanek. Od uczestników badania uzyskano pisemną świadomą zgodę. Pacjenci kwalifikujący się do badania musieli mieć rozpoznanie lub przypuszczalne rozpoznanie raka jajnika, wyrazić zgodę i być w stanie podpisać formularz świadomej zgody oraz mieć co najmniej 18 lat. Tkankę nowotworową (złośliwy guz pierwotny lub miejsca przerzutów), wodę z jamy brzusznej oraz płyn opłucnowy pobrano od pacjentów wyrażających zgodę w czasie zabiegu. Próbki te przetransportowano niezwłocznie do laboratorium i poddano obróbce w celu generowania organoidów zgodnie z poniższymi metodami.
1. Przygotowanie pożywek
- Przygotowanie kompletnej pożywki do organoidów
- Przygotować medium warunkowane R-spondin 1/Noggin zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
UWAGA: Medium warunkowane R-spondin-1/Noggin stanowi bardziej przystępną cenowo alternatywę dla komercyjnie dostępnych białek rekombinowanych. Komórki HEK293T stabilnie wydzielające R-spondin-1 i Noggin poprzez transdukcję za pomocą lentiwirusa były hojnym darem od Rona Bose’a z Washington University School of Medicine w St. Louis oraz Anila Rustgi z New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center8,9,10. Jako zamiennik można zastosować komercyjne medium warunkowane (patrz Tabela materiałów).
- Przygotować medium warunkowane R-spondin 1/Noggin zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7.
- Aby przygotować kompletną pożywkę do organoidów, połączyć 10% medium warunkowane R-spondin 1/Noggin, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nikotynamidu, 1,25 mmol/L N-acetylcysteiny, 1 µmol/L prostaglandyny E2, 10 µmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 oraz 10 µM inhibitora ROCK (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Pożywkę można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy. Pożywka ta została zaadaptowana z pracy Hill i in.11. Stężenia i składniki pożywki są identyczne, z dodatkiem inhibitora ROCK. - Przygotować bazową pożywkę do organoidów, łącząc 500 mL zaawansowanej formulacji DMEM/F12 z 1% penicyliną-streptomycyną, 1x dipeptydem L-alanylo-L-glutaminą oraz 1x HEPES (10 mM) (patrz Tabela materiałów).
2. Izolowanie organoidów z płynu w jamie brzusznej i płynu opłucnowego
UWAGA: W celu uzyskania najwyższej wydajności organoidów, płyn z jamy brzusznej oraz płyn opłucnowy należy przetworzyć jak najszybciej. Odmrozić wcześniej przygotowane alikwoty BME, DNazy I oraz buforu do reakcji DNazy I (patrz Tabela materiałów), umieszczając je na lodzie do czasu upłynnienia zawartości.
- Pozyskać wodę z jamy brzusznej (ascites) oraz płyn z jamy opłucnej od pacjentów, którzy wyrazili zgodę, podczas standardowych zabiegów chirurgicznych lub procedur, a następnie przetransportować je w temperaturze pokojowej w pojemniku transportowym do laboratorium.
UWAGA: Cały proces przetwarzania wody z jamy brzusznej lub płynu z jamy opłucnej należy przeprowadzać w środowisku sterylnym. - Przenieść 50 mL wody z jamy brzusznej lub płynu z jamy opłucnej do probówek stożkowych o pojemności 50 mL (liczba probówek zależy od objętości pozyskanej wody z jamy brzusznej). Wirować przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Kontynuować, dodając kolejne 50 mL wody z jamy brzusznej lub płynu z jamy opłucnej do wcześniej odwirowanego osadu i ponownie wirować przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Powtarzać ten krok, aż do przetworzenia całej wody z jamy brzusznej lub płynu z jamy opłucnej.
- Przygotować roztwór DNase I o stężeniu 100 µg/mL, łącząc 1,000 µL wody wolnej od nukleaz, 100 µL buforu reakcyjnego DNase I oraz 10 µL DNase I.
UWAGA: Zastosowana obróbka DNase I jest wystarczająca do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, niezależnie od obecności agregatów komórkowych w niektórych próbkach pacjentów12. - Resuspendować każdy osad komórkowy w 1 mL roztworu DNase I (100 µg/mL). Delikatnie dodawać roztwór DNase I kroplami i inkubować probówkę przez 15 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Dodać minimum 1 mL roztworu DNase I. Jeśli 1 mL nie wystarczy do rozbicia osadu, dodać dodatkowy 1 mL. - Po inkubacji dodać do komórek 25 mL podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) i delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać. Następnie wirować przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Resuspendować nowo powstałe osady komórkowe w uprzednio ogrzanych 5 mL 1x buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) (patrz Tabela materiałów). Ustawić wortex na 458 x g i wymieszać roztwory w każdej probówce stożkowej. Po uzyskaniu homogenicznych roztworów, za pomocą pipety serologicznej połączyć zawartość wszystkich probówek stożkowych w jednej probówce stożkowej o pojemności 50 mL.
- Inkubować probówkę stożkową z wymieszanym roztworem w temperaturze pokojowej przez 5 min. Po zakończeniu inkubacji wirować przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Zbadać osad. Różowy/czerwony osad wskazuje na obecność RBC, co wymaga powtórzenia etapu lizy czerwonych krwinek aż do momentu, gdy osad przestanie być czerwony. - Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie przemyć osad 10 mL PBS, wymieszać roztwór w wortexie przy 458 x g i wirować przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Jeśli utworzy się duży osad komórkowy, odessać PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 1 mL podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) na wierzch osadu. Wymieszać roztwór w wortexie przy 458 x g i przenieść 300-400 µL do probówki do mikrocentryfugi. Wirować probówkę w mikrocentryfudze przy 1,650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Część osadu komórkowego, która nie została przeniesiona do probówki do mikrocentryfugi, może zostać zamrożona do późniejszego użycia (500 µL komórek do 1 mL 10% DMSO w FBS). Zamrożony osad komórkowy można przechowywać przez wiele tygodni w temperaturze −80 °C oraz przez lata w ciekłym azocie13. - Ostrożnie odessać podstawowe medium do organoidów (krok 1.3) za pomocą szklanej pipety Pasteura i resuspendować w BME (patrz Tabela materiałów) przy użyciu zimnych końcówek.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości osadu. Zaleca się stosowanie proporcji 25% podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) do resuspendowanych komórek oraz 75% BME. - Wyłożyć alikwoty 40 µL resuspendowanego roztworu komórek na płytkę 6-dołkową. Wyłożyć do pięciu alikwotów na dołek (Rycina 1).
- Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 min, aby BME mogło zastygnąć. Po inkubacji delikatnie dodać 2 mL kompletnego medium do organoidów (krok 1.2) do każdego dołka.
Rycina 1: Wysiew organoidów raka jajnika pochodzących od pacjentów. Reprezentatywne zdjęcie wysiewu organoidów. Alikwoty mieszaniny organoidów są ostrożnie wysiewane, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
3. Pozyskiwanie organoidów z tkanki
UWAGA: Tkankę należy przetworzyć tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać najlepszą wydajność organoidów.
- Pobrać i transportować guz w lodzie, w pojemniku transportowym zawierającym PBS.
- Umieścić próbkę na 10 cm szalce do hodowli tkanek (Rycina 2). Za pomocą jednorazowego skalpela posiekać tkankę. Następnie, używając tępego końca jednorazowej strzykawki, rozgnieść tkankę aż do uzyskania homogenicznej mieszaniny.
- Za pomocą pęsety przenieść homogeniczną mieszaninę tkanki do probówki do dysocjacji. Na każde 1-2 mL zhomogenizowanej tkanki dodać 7-8 mL roztworu kolagenazy typu II o stężeniu 1 mg/mL (patrz Tabela materiałów) w podstawowym medium do organoidów (krok 1.3) oraz 1 mL roztworu DNazy I. Wymieszać roztwór na wortexie przy 458 x g.
UWAGA: Ilość tkanki determinuje ilość roztworu kolagenazy oraz liczbę potrzebnych probówek. - Użyć maszyny do dysocjacji (patrz Tabela materiałów), aby upłynnić tkankę w roztworze kolagenazy. Uruchomić program 37C_h_TDK3 (1 h) aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
UWAGA: Program należy uruchomić ponownie, jeśli otrzymana mieszanina nie jest homogeniczna (t.j. w mieszaninie nadal znajdują się fragmenty tkanki). Jeśli tkanka została strawiona, ale roztwór jest lepki, rozcieńczyć go podstawowym medium do organoidów (krok 1.3). - Przenieść zhomogenizowaną mieszaninę do nowej probówki stożkowej 50 mL i dodać 20-40 mL podstawowego medium do organoidów (krok 1.3). Następnie przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 100 µm do nowo oznakowanej probówki stożkowej 50 mL.
- Odwirować przefiltrowaną mieszaninę przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Przygotować roztwór DNazy I o stężeniu 100 µg/mL, łącząc 1 000 µL wody wolnej od nukleaz, 100 µL buforu reakcyjnego DNazy I oraz 10 µL DNazy I.
UWAGA: Zastosowana obróbka DNazą I jest wystarczająca do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, niezależnie od obecności agregatów komórkowych w niektórych próbkach pacjentów12. - Resuspendować komórki w 1 mL roztworu DNazy I o stężeniu 100 ug/mL. Powoli dodawać roztwór DNazy I kroplami i inkubować probówkę przez 15 min w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji dodać do komórek 25 mL podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) i delikatnie odwrócić probówkę w celu wymieszania. Następnie odwirować przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Resuspendować nowo powstały osad komórkowy w 5 mL podgrzanego buforu do lizy RBC (1x). Wymieszać roztwory w każdej probówce stożkowej na wortexie przy 458 x g.
- Inkubować probówkę stożkową zawierającą osad komórkowy resuspendowany w buforze do lizy RBC przez 5 min. Po zakończeniu inkubacji odwirować przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Zbadać osad. Różowy/czerwony osad wskazuje na obecność RBC, co wymaga powtórzenia etapu lizy RBC aż do momentu, gdy osad stanie się biały. - Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie przemyć osad 10 mL PBS, wymieszać roztwór na wortexie przy 458 x g i odwirować przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Jeśli powstanie duży osad komórkowy, odessać PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 1 mL podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) na wierzch osadu. Wymieszać roztwór na wortexie przy 458 x g i przenieść 300-400 µL do probówki do mikrowirowania. Odwirować przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Część osadu komórkowego, której nie przeniesiono do probówki do mikrowirowania, można zamrozić do późniejszego użycia (500 µL komórek do 1 mL 10% DMSO w FBS) (krok 5.1). Zamrożony osad komórkowy można przechowywać przez tygodnie w temperaturze −80 °C oraz przez lata w ciekłym azocie13. - Ostrożnie odessać podstawowe medium do organoidów za pomocą szklanej pipety Pasteura i resuspendować w BME, używając zimnych końcówek.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości osadu. Zaleca się dodanie 25% podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) z resuspendowanymi komórkami do 75% BME. - Wyposiać resuspendowany roztwór komórek na płytkę 6-dołkową w alikwotach po 40 µL. W każdym dołku można umieścić do pięciu alikwotów.
- Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze na 20 min. Po inkubacji delikatnie dodać 2 mL kompletnego medium do organoidów (krok 1.2) do każdego dołka.
Rycina 2: Tkanka guza przed sekcją. Reprezentatywne zdjęcie tkanki guza pobranej do generowania organoidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
4. Pasażowanie organoidów
UWAGA: Jeśli próbka jest konfluentna, każdą studzienkę z organoidami można pasażować co tydzień do dwóch nowych studzienek.
- Za pomocą pipety 1 mL dodać 1 mL podstawowego pożywki do organoidów (krok 1.3) do każdego dołka, a następnie pipetować pożywkę w górę i w dół bezpośrednio na wypustki z organoidami w celu ich rozdzielenia. Zebrać całą pożywkę zawierającą resuspenderowane osady do probówki stożkowej 15 mL.
- Wirować probówkę stożkową 15 mL zawierającą mieszaninę z prędkością 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Dodać 1 mL rekombinowanego enzymu bez komponentów pochodzenia zwierzęcego (patrz Tabela materiałów) do osadu komórkowego, wymieszać roztwór na wortexie przy 458 x g i przenieść do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Inkubować probówkę przez 15 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji wirować z prędkością 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Resuspender osad w BME.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości osadu. Zaleca się dodanie 25% podstawowej pożywki do organoidów (krok 1.3) z resuspenderowanymi komórkami do 75% BME. - Nanieść resuspenderowany roztwór komórek na płytkę 6-dołkową w aliquotach po 40 µL. Nanieść do pięciu aliquotów na dołek. Po naniesieniu wszystkich aliquotów natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze na 20 min. Po inkubacji ostrożnie dodać 2 mL kompletnej pożywki do organoidów (krok 1.2) do każdego dołka.
5. Zamrażanie i rozmrażanie organoidów
- Zamrażanie organoidów
- Należy rozpocząć od kroków 4.1-4.4.
- Osad komórkowy resuspender w 0,5-1 mL medium do zamrażania komórek w fazie regeneracji (patrz Tabela materiałów), a następnie przenieść 1 mL do każdej kryfiolki.
- Następnie kryfiolki umieścić w pojemniku wypełnionym izopropanolem w temperaturze −80 °C na maksymalnie 2 tygodnie przed przeniesieniem ich do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania13.
- rozmrażanie organoidów
- Wyjąć próbki ze zbiornika z ciekłym azotem i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Po rozmrożeniu przenieść do probówki stożkowej 15 mL i wirować przy 1 650 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessać nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura.
- Osad resuspender w BME.
UWAGA: Ilość BME zależy od wielkości osadu. Zaleca się dodanie resuspenderowanych komórek w 25% podstawowego medium do organoidów (krok 1.3) do 75% BME. - Wyjałowaną zawiesinę komórkową nanieść na płytkę 6-dołkową w aliquotach po 40 µL. W każdym dołku można umieścić do pięciu aliquotów.
- Natychmiast umieścić płytkę w inkubatorze na 20 min. Po inkubacji ostrożnie dodać do dołków 2 mL kompletnego medium do organoidów (krok 1.2).
6. Zatapianie i przygotowywanie preparatów w formalinie i parafinie (FFPE) w celu oceny składu organoidów
- Po hodowli organoidów przez co najmniej 10 dni w celu zapewnienia odpowiedniego rozmiaru, usunąć z dołków kompletną pożywkę do organoidów i dodać 1 mL 2% utrwalacza paraformaldehydowego (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 min.
- Po inkubacji przemyć alikwoty hodowlanych organoidów 3x po 5 min za każdym razem, używając 1 mL PBS.
- Usunąć PBS z każdego dołka i dodać do każdego z nich 1 mL ciepłego 2% agaru w dejonizowanej wodzie H2O. Podczas dodawania agaru należy unieść alikwoty hodowlanych organoidów z płytki za pomocą szpatułki.
UWAGA: Ważne jest, aby agar nie stężał przed uniesieniem alikwotów hodowlanych organoidów.- Pozostawić agar do stężenia w dołku w temperaturze pokojowej.
- Używając małej szpatułki, wydobyć stężały agar z dołka i przechowywać go w kasecie do 48 h (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C w 70% etanolu do czasu przetworzenia14.
- Zatopić próbki w parafinie15, wykonać skrawki o grubości 5 µm i zabarwić preparaty hematoksyliną i eozyną (H&E, patrz Tabela materiałów) zgodnie ze standardowym protokołem15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu wygenerowania PDO próbki poddano trawieniu mechanicznemu i enzymatycznemu do uzyskania zawiesin jednokomórkowych. Następnie komórki zawieszono w BME i uzupełniono specjalnie opracowaną pożywką (Rysunek 3). Organoidy są zazwyczaj hodowane przez okres 10 dni, po czym w kulturze pojawiają się wyraźne organoidy (Rysunek 4).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rak jajnika jest niezwykle śmiertelny ze względu na jego zaawansowane stadium w momencie diagnozy, a także powszechny rozwój oporności na chemioterapię. Wiele postępów w badaniach nad rakiem jajnika osiągnięto dzięki wykorzystaniu linii komórek nowotworowych i modeli PDX; Istnieje jednak wyraźna potrzeba bardziej reprezentatywnego i przystępnego cenowo modelu in vitro . Udowodniono, że PDO dokładnie reprezentują niejednorodność guza, mikrośrodowisko guza oraz cechy genomiczne i transkryptomiczne ich pierwotnych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wskazówki Rona Bose, doktora nauk medycznych, oraz pomoc dr Barbary Błachut w ustanowieniu tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować Szkole Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology and Division of Gynecologic Oncology, Programowi Stypendialnemu Dziekana Uniwersytetu Waszyngtońskiego oraz Programowi Rozwoju Naukowca Zajmującego się Rozrodczością za wsparcie tego projektu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% penicylina-streptomycyna | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1,5 ml probówki Eppendorfa | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Naczynie do hodowli tkankowych | TPP | 93100 | |
| 10 ml Pipeta | |||
| 100 µ m Filtr komórkowy | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL probówki wirówkowe | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% utrwalacz paraformaldehydu | Sigma-Aldrich | ||
| 37 ° C kąpiel wodna | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Kondycjonowany suplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6-dołkowe płytki | TPP | 92006 | |
| 70% etanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Wirówka 17504044 | |||
| B-27 | Life Technologies | ||
| Cultrex Typ 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | z błony podstawnej |
| DNaza I | Nowa Anglia Bio Labs | M0303S | |
| Bufor reakcyjny DNazy I | Anglia Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Rurki | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Disocjator z grzałkami | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | Korzystamy z protokołu producenta. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | zestaw do barwienia dipeptydu, L-alanylo-L-glutaminy |
| Hematoksyliny i eozyny | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Wosk parafinowy | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Mikrowirówka | |||
| Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylocysteina | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nikotynamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipeta z końcówkami | |||
| p200 Pipeta z końcówkami | |||
| Pipety Pasteura 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific MT21031CM | ||
| Kontroler | |||
| Prostaglandyna E2 | R& D Systems | 2296 | |
| Puromycyna | ThermoFisher | A1113802 | |
| Rekombinowany mysi Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Regeneracyjne podłoże do zamrażania kultur komórkowych | Invitrogen | 12648010 | |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek | BioLegend | 420301 | |
| Inhibitor ROCK (Y-27632) | R& D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Kolba | MidSci | TP90076 | |
| Kaptur do hodowli tkankowych | |||
| Kaseta | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | niepochodzący, rekombinowany enzym |
| typu II Kolagenaza Life | Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
Bibliografia
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429(2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408(2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581(2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
