Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64881

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.

Streszczenie

Immunofluorescencja jest jedną z najczęściej używanych technik wizualizacji docelowych antygenów o wysokiej czułości i specyficzności, pozwalającej na dokładną identyfikację i lokalizację białek, glikanów i małych cząsteczek. Chociaż technika ta jest dobrze znana w dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych, mniej wiadomo na temat jej zastosowania w trójwymiarowych (3D) modelach komórek. Organoidy raka jajnika to modele guzów 3D, które podsumowują heterogeniczność klonalną komórek nowotworowych, mikrośrodowisko guza oraz interakcje komórka-komórka i komórka-macierz. W związku z tym są lepsze od linii komórkowych w ocenie wrażliwości leków i biomarkerów funkcjonalnych. Dlatego możliwość wykorzystania immunofluorescencji na organoidach pierwotnego raka jajnika jest niezwykle korzystna w zrozumieniu biologii tego nowotworu. Obecne badanie opisuje technikę immunofluorescencji do wykrywania białek naprawy uszkodzeń DNA w organoidach raka jajnika (PDO) o wysokim stopniu złośliwości. Po wystawieniu PDO na działanie promieniowania jonizującego, na nienaruszonych organoidach przeprowadza się immunofluorescencję w celu oceny białek jądrowych jako ognisk. Obrazy są zbierane za pomocą obrazowania z-stack w mikroskopii konfokalnej i analizowane za pomocą oprogramowania do automatycznego liczenia ognisk. Opisane metody pozwalają na analizę czasowej i specjalnej rekrutacji białek naprawczych uszkodzeń DNA oraz kolokalizacji tych białek z markerami cyklu komórkowego.

Wprowadzenie

Rak jajnika jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych. Większość pacjentów jest leczona lekami uszkadzającymi DNA, takimi jak karboplatyna, a osobom z guzami z niedoborem naprawy rekombinacji homologicznej (HRR) można podawać inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)1,2. Jednak większość pacjentów rozwija oporność na te terapie i umiera w ciągu 5 lat od diagnozy. Rozregulowanie odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) jest związane z rozwojem raka jajnika oraz zarówno chemioterapią, jak i opornością na inhibitory PARP3. W związku z tym badanie DDR jest niezbędne do zrozumienia patofizjologii raka jajnika, potencjalnych biomarkerów i nowatorskich terapii celowanych.

Obecne metody oceny DDR wykorzystują immunofluorescencję (IF), ponieważ pozwala to na dokładną identyfikację i lokalizację białek uszkadzających DNA oraz analogów nukleotydów. Gdy w DNA dojdzie do dwuniciowego pęknięcia (DSB), białko histonowe H2AX jest szybko fosforylowane, tworząc ognisko, w którym gromadzą się białka naprawiające uszkodzenia DNA4. Tę fosforylację można łatwo zidentyfikować za pomocą IF; w rzeczywistości test ɣ-H2AX był powszechnie stosowany do potwierdzenia indukcji klasy DSB5,6,7,8,9. Zwiększone uszkodzenia DNA są związane z wrażliwością na platynę i skutecznością czynników uszkadzających DNA10,11,12, a ɣ-H2AX został zaproponowany jako biomarker związany z odpowiedzią na chemioterapię w innych terapiach przeciwnowotworowych13. Po DSB komórka biegła w HRR wykonuje serię zdarzeń, które prowadzą do rekrutacji BRCA1 i BRCA2 RAD51 w celu zastąpienia białka replikacyjnego A (RPA) i związania się z DNA. Naprawa HRR wykorzystuje matrycę DNA do wiernej naprawy DSB. Jednak, gdy nowotwory mają niedobór HRR, polegają na alternatywnych ścieżkach naprawy, takich jak niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Wiadomo, że NHEJ jest podatny na błędy i powoduje duże obciążenie mutacyjne w komórce, która wykorzystuje 53BP1 jako pozytywny regulator14. Wszystkie te białka uszkadzające DNA można dokładnie zidentyfikować jako ogniska za pomocą IF. Oprócz barwienia białek, IF może być stosowany do badania ochrony widełek i tworzenia jednoniciowych luk DNA. Zdolność do posiadania stabilnych widełek została skorelowana z odpowiedzią platyny, a ostatnio testy luk wykazały potencjał do przewidywania odpowiedzi na inhibitory PARP6,15,16,17. Dlatego barwienie analogów nukleotydów po wprowadzeniu do genomu jest kolejnym sposobem badania DDR.

Do tej pory ocena DDR w raku jajnika była w dużej mierze ograniczona do jednorodnych linii komórkowych 2D, które nie odzwierciedlają klonalnej heterogeniczności, mikrośrodowiska ani architektury nowotworów in vivo18,19. Ostatnie badania sugerują, że organoidy są lepsze od linii komórkowych 2D w badaniu złożonych procesów biologicznych, takich jak mechanizmy DDR6. Niniejsza metodologia ocenia RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA i gemininę w PDO. Metody te oceniają nienaruszony organoid i pozwalają na badanie mechanizmów DDR w warunkach bardziej zbliżonych do mikrośrodowiska guza in vivo. Wraz z mikroskopią konfokalną i automatycznym zliczaniem ognisk, metodologia ta może pomóc w zrozumieniu szlaku DDR w raku jajnika i spersonalizowaniu planów leczenia pacjentek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Tkanka nowotworowa i wodobrzusze zostały uzyskane po uzyskaniu zgody pacjenta jako część biorepozytorium ginekologii onkologicznej, które zostało zatwierdzone przez Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Do badania włączono pacjentki, u których występował surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości w zaawansowanym stadium (ang. advanced grade surowiczy rak jajnika – HGSOC). Wszystkie zabiegi były wykonywane w temperaturze pokojowej na stole, chyba że określono inaczej. Wszystkie odczynniki przygotowywano w temperaturze pokojowej (o ile nie wskazano inaczej) i przechowywano w temperaturze 4 °C.

1. Generowanie organoidów

  1. Wygeneruj organoidy zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem20.

2. Posiewanie i napromienianie organoidów

  1. Używając organoidów w hodowli, usuń wypustki organoidów z naczynia hodowlanego poprzez ręczną manipulację końcówką pipety. Zebrać organoidy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety.
  3. Dodać 1 000 μl rekombinowanego enzymu niepochodzenia zwierzęcego do granulki (patrz tabela materiałów). Wymieszać roztwór i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Odwirować roztwór o stężeniu 1,650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety ostrożnie odessać sklarowany nad osadem.
  5. Po odwirowaniu i aspiracji ponownie zawiesić granulat w 1 000 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
  6. Przenieść 10 μl roztworu do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego.
  7. Pobrać 10 μl roztworu niebieskich krwinek trypanowych do szkiełka w komorze do liczenia komórek i włożyć je do maszyny do liczenia komórek (patrz tabela materiałów).
  8. Umieść 40 000 komórek na 20 μl ekstraktu z błony podstawnej (BME) w 8-dołkowym szkiełku podstawowym (patrz tabela materiałów). Utrzymuje to organoidy przez 3-5 dni, aby komórki mogły tworzyć organoidy i rosnąć do odpowiednich rozmiarów.
  9. Aby wywołać pęknięcia dwuniciowego DNA, należy napromieniować platerowane organoidy 10 szarymi (Gy) promieniowaniem ɣ (szczegóły dotyczące promiennika znajdują się w Tabeli materiałów).
    UWAGA: Może to potrwać do 5-10 minut.
  10. Inkubować organoidy w ich pożywkach hodowlanych w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Objętości odnoszą się do ilości na studzienkę szkiełka 8-dołkowego (~300 μL).

  1. Po napromieniowaniu i inkubacji organoidów należy ostrożnie odessać pożywkę pipetą, aby nie zakłócić pracy matrycy 3D. Przemyć 300 μl PBS.
  2. Utrwal organoidy w 300 μl 2% paraformaldehydu (PFA) przez 10 min.
    UWAGI: Nie pozostawiaj na zbyt długo, ponieważ BME ulegnie depolimeryzacji i może zostać odessany.
  3. Przemyć organoidy 300 μl buforu barwiącego (patrz tabela materiałów). Umieść na shakerze na 5 minut.
  4. W celu przepuszczalności delikatnie dodać 300 μl buforu do permeabilizacji (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 20 minut. Przemyć 300 μL buforu barwiącego. Umieść na shakerze na 5 minut.
  5. Dodać 300 μl buforu barwiącego, aby zablokować etap przepuszczalności. Umieść na shakerze na 30 minut. Odessać bufor barwiący za pomocą pipety.
  6. Dodać 300 μl przeciwciał pierwszorzędowych (króliczy anty-RAD51, mysi anty-Geminin, króliczy anty-RPA, mysi anty-ɣH2AX, króliczy anty-Bliminin, mysi anty-53BP1; patrz tabela materiałów) rozcieńczonych w buforze barwiącym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 h.
    UWAGA: Unikaj wspólnego barwienia z tym samym zwierzęciem gospodarzem. Pozostaw pokrywkę zdjętą, aby uniknąć mieszania się przeciwciał z sąsiednimi studzienkami.
  7. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Wykonaj trzy płukania 300 μl buforu barwiącego przez 5 minut każde na wytrząsarce.
  8. Dodać 300 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego (koziego anty-mysiego Alexa fluor 488 i koziego anty-królika Alexa fluor 647; patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonego w buforze barwiącym i inkubować przez 1 godzinę w ciemności.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w ciemności.
  9. Odessać wtórny roztwór przeciwciała. Dodać 300 μl rozcieńczonego DAPI. Umieść na shakerze na 5 minut.
  10. Wykonaj trzy płukania 300 μl buforu barwiącego przez 5 minut każde na wytrząsarce. Usuń bufor barwiący i odłącz komory za pomocą zestawu do wyjmowania dołączonego do szkiełek komory (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Upewnij się, że nie pchasz zbyt daleko do przodu, aby zakłócić matrycę 3D.
  11. Używając końcówki do pipety p200 z odciętą końcówką, dodaj podłoże montażowe (patrz Tabela materiałów), aby pokryć każdą studzienkę zakładką organoidową (np. 20-30 μl dla każdej zakładki organoidowej).
  12. Umieść szkiełko nakrywkowe na próbce, unikając pęcherzyków.
  13. Weź przezroczysty lakier do paznokci i pomaluj go po bokach szkła nakrywkowego, aby uszczelnić szkiełko. Pozostaw do stwardnienia na 1 godzinę i umieść w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Po zobrazowaniu szkiełko można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy przy minimalnej utracie fluorescencji.

4. Obrazowanie

  1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) przy obiektywie 63x z olejkiem immersyjnym.
    UWAGA: W przypadku obrazowania białek jądrowych 63x jest korzystne, ale 40x jest również dopuszczalne.
  2. Użyj DAPI, aby zlokalizować organoidy przez okular. Wybierz odpowiednie filtry do mikroskopii w oparciu o użyte fluorofory. Ustaw parametry przechwytywania obrazu z-stack.
    UWAGA: Fluorofory użyte w badaniu to DAPI, 488 i 647. Lasery 405, 488 i 638 zostały włączone w celu wizualizacji barwienia.
    UWAGA: Zalecany stos z zależy od zdolności rozdzielczej obiektywu.
  3. Dostosuj obraz na żywo: ustaw ostrość, intensywność lasera itp.
    UWAGA: Im wyższa intensywność lasera, tym większe prawdopodobieństwo, że próbka zostanie wybielona. Dlatego należy wybrać optymalną intensywność lasera.
  4. Zdobądź z-stack.
    UWAGA: Może to potrwać do 5-10 minut.
  5. Z obrazów zebranych w stosie z wykonaj zrzut ekranu co najmniej trzech obrazów na stos.
    UWAGA: Upewnij się, że masz zrzuty ekranu w całym stosie, aby nie duplikować jąder podczas określania ilościowego.
  6. Zapisz każdy plik jako TIFF i przejdź do analizy (krok 5).

5. Analiza

UWAGA: Użyj JCountPro do analizy obrazu zgodnie z poprzednio opublikowanym raportem21. Aby uzyskać to oprogramowanie, zapoznaj się z powiązaną publikacją.

  1. W panelu analizy obiektów (w górnej części programu) w zakładce wyboru plików (na dole programu) wybierz pliki TIFF.
  2. Kliknij przycisk Dodaj, aby przenieść wybrane pliki do wybranej grupy plików. Wybierz opcję Wyświetlacz.
  3. Na karcie segmentacji wybierz niebieski jako kolor jąder. Wybierz opcję Automatyczna segmentacja, aby zoptymalizować próg jąder.
    UWAGA: Jeśli automatyczna segmentacja nie identyfikuje dokładnie obiektów, użytkownik może dostosować dostrojenie i surowe dostrojenie do obrazu lub zapoznać się z instrukcją obsługi, aby jeszcze bardziej zoptymalizować segmentację.
  4. W panelu obiektów wybierz opcję Automatycznie dziel duże obiekty i optymalizuj rozmiar jąder.
    UWAGA: Jądra mają zazwyczaj bezwarunkowy rozmiar 5000 pikseli, podczas gdy rozmiar warunkowy wynosi 1500 pikseli. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby jeszcze bardziej zoptymalizować rozmiar obiektów.
  5. Wybierz pozycję Identyfikuj obiekty, aby przetestować parametry.
    UWAGA: Jeśli te parametry nie są dokładne, rozmiar i strojenie można dostosować wraz z innymi ustawieniami. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać instrukcje dotyczące dalszej optymalizacji.
  6. Po dostosowaniu parametrów do obrazu wybierz opcję Identyfikuj obiekty na wszystkich obrazach, aby zidentyfikować jądra na wszystkich wybranych obrazach.
  7. Wybierz panel Analiza ognisk (w górnej części programu).
  8. Na karcie wybierz pliki (u dołu programu) wybierz pliki TIFF, które zostały użyte do analizy obiektów, a następnie wybierz przyciski strzałek (>>), aby przenieść obrazy do grupy plików obrazów.
  9. W grupie katalogów pod plikami obrazów, które zostały przeniesione, kliknij dwukrotnie folder Edycja ręczna i wybierz opcję przeniesienia plików ioc do grupy plików kolekcji obiektów.
    UWAGA: Wszystkie wybrane pliki TIFF muszą mieć pasujące pliki ioc.
  10. Naciśnij przycisk Wybierz, aby przenieść pliki do wybranej grupy plików. Wybierz zakładkę Zliczanie ognisk u dołu programu.
  11. Zoptymalizuj parametry, wykonując poniższe czynności.
    1. Indeks ustawień cylindra: 12.
    2. Kanał ostrości: Wybierz kolor ognisk (zielony: ɣ-H2AX; czerwony: RAD51).
    3. Ustawienia kopuły H: wysokość kopuły %: 30; próg %: 28 i 28.
    4. Ustawienie kształtu/rozmiaru: Minimalny rozmiar ostrości, piksele: 5. Wybierz opcję Zastosuj kształt/rozmiar. Maksymalny rozmiar ostrości (warunkowy): 32. Minimalna okrągłość, x100: 96. Maksymalna ostrość, piksele: 60.
    5. Filtr szumów: rozmiar 1,
      UWAGA: W przypadku określania, czy jądro jest dodatnie pod względem barwienia gemininą, pod drugim kanałem wybierz zielony, a w obszarze Analiza wybierz intensywność.
  12. Aby przetestować zestaw parametrów, wybierz poniższe przyciski w kolejności: Cylinder > H-Dome > Foci Count.
    UWAGA: Jeśli te parametry nie działają, rozmiar i strojenie można dostosować wraz z innymi ustawieniami. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby dowiedzieć się więcej o tym, jak można jeszcze bardziej zoptymalizować obraz.
  13. Po zoptymalizowaniu parametrów dla wybranych obrazów wybierz opcję Automatyczne zliczanie, aby policzyć ogniska w każdym obrazie na jądra. Jeśli pożądany jest drugi kanał, program określi intensywność, której można użyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół pozwala na skuteczne barwienie, wizualizację i kwantyfikację białek odpowiedzialnych za naprawę uszkodzeń DNA w jądrach komórkowych organoidów. Technikę tę zastosowano do barwienia i oceny PDO przed oraz po napromieniowaniu. PDO poddano działaniu promieniowania w dawce 10 Gy i oceniono pod kątem następujących biomarkerów: ɣ-H2AX (Rycina 1), markeru uszkodzeń DNA; RAD51 (Rycina 2), markeru HRR; 53BP1, markeru NHEJ; RPA, markeru stresu repli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odpowiedź na uszkodzenie DNA odgrywa integralną rolę zarówno w rozwoju raka jajnika, jak i oporności na chemioterapię. Dlatego konieczne jest dokładne zrozumienie mechanizmów naprawy DNA. W tym miejscu przedstawiono metodologię badania białek naprawiających uszkodzenia DNA w nienaruszonych organoidach 3D. Opracowano powtarzalny, niezawodny protokół wykorzystujący charakterystyczne przeciwciała do oceny uszkodzeń DNA, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców i stresu replikacyjnego. Co ważne, metody t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wskazówki doktora Pawła Łobaczewskiego w ustanowieniu tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować Szkole Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology and Division of Gynecologic Oncology, Programowi Stypendialnemu Dziekana Uniwersytetu Waszyngtońskiego, Fundacji Gynecologic Oncology Group oraz Programowi Rozwoju Naukowca Zajmującego się Rozrodem za wsparcie tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezem (PBS++)Sigma14-040-133
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS)Fisher Scientific 
Przeciwciało Ant-53BP1 Firma BD Biosciences612522rozcieńczona w stosunku 1:500 w buforze barwiącym
Przeciwciało Ant-Geminina Abcamab104306rozcieńczony w stosunku 1:200 w buforze barwiącym Przeciwciało
anty-Geminina ProteinTech10802-1-AProzcieńczony w stosunku 1:400 w buforze barwiącym
Przeciwciało anty-RAD51 Abcamab133534rozcieńczony w stosunku 1:1000 w buforze barwiącym
Przeciwciało anty-yH2AX Millipore-Sigma05-636rozcieńczony w stosunku 1:500 w buforze barwiącym
Przeciwciało Ant-phospho-RPA32 (S4/S8)Bethyl Laboratories A300-245A-Mrozcieńczony do 1:200 w buforze barwiącym
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher Scientific BP1605 100
Wirówka; Wirówka Sorvall St 16RThermo Scientific 
Mikroskop konfokalny, system konfokalny Leica SP5 DMI4000Leica 
Probówki stożkowe, 15 mlCorning 14-959-53A
Automatyczny licznik komórek Countess 3 FL (maszyna do liczenia komórek) Thermo Scientific 
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessThermo Scientific C10228
Szkiełko nakrywkoweLA KoloryKażdy bezbarwny lakier do paznokci wystarczy
Cultrex  Ekstrakt z membrany podstawnej RGF, typ 2  R& D Systems 3533-010-02Prawdopodobnie przydałby się Matrigel lub inny BME Matrix 
DAPI Thermo Scientific   R37606Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes, rozcieńczony w 1x PBS 
Glicyna Fisher Naukowy 
JCountProJCountProAby uzyskać dostęp do oprogramowania, E-mail: jcountpro@gmail.com 
Probówki do mikrowirówek Fisher Naukowy 07-000-243
Lakier do paznokci StatLabSL102450
Parafomalddehyd (PFA), 2% Nauki o mikroskopii elektronowej 157-4Rozcieńczyć do 4% PFA w PBS++ w celu uzyskania 2%
buforu przepuszczalnościWykonany w Lab0,2% X-100 Triton w PBS++ 
PipetyRainin17014382
Końcówki do pipet Deszcz 
ProLong Gold Antiblade MountantThermo Scientific   P36930
Bufor do barwienia Wyprodukowano w laboratorium0,5% BSA, 0,15% glicyny, 0,1% X-100 Triton w PBS++ 
System prowadnic komorowych Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich 
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Scientific 
TrypLE ExpressInvitrogen12604013niepochodzący, rekombinowany enzym
X-RAD 320 Biologiczny napromieniacz chemiczny Precyzyjne naświetlanie promieniowaniem rentgenowskim X-RAD320
ICN186045475004240389584AMQAF2000NC0756056 PFA 170149671133248100115250061

Bibliografia

  1. Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
  2. Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
  3. Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713(2020).
  4. Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
  5. Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
  6. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  7. Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
  8. Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
  9. Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
  10. Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
  11. Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654(2015).
  12. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
  13. Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  14. Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
  15. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  16. Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054(2020).
  17. Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
  18. Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984(2022).
  19. Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
  20. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
  21. Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
  22. Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
  23. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).
  24. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  25. O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732(2016).
  26. Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266(2018).
  27. Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
  28. Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758(2020).
  29. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  30. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  31. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  32. Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza immunofluorescencyjnamikroskopia konfokalnaorganoidy pochodzące od pacjentówtrójwymiarowa hodowla komórkowaodpowiedź na uszkodzenia DNAlokalizacja białekocena biomarkerówGamma H2AX
Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.