Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Immunofluorescencja jest jedną z najczęściej używanych technik wizualizacji docelowych antygenów o wysokiej czułości i specyficzności, pozwalającej na dokładną identyfikację i lokalizację białek, glikanów i małych cząsteczek. Chociaż technika ta jest dobrze znana w dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych, mniej wiadomo na temat jej zastosowania w trójwymiarowych (3D) modelach komórek. Organoidy raka jajnika to modele guzów 3D, które podsumowują heterogeniczność klonalną komórek nowotworowych, mikrośrodowisko guza oraz interakcje komórka-komórka i komórka-macierz. W związku z tym są lepsze od linii komórkowych w ocenie wrażliwości leków i biomarkerów funkcjonalnych. Dlatego możliwość wykorzystania immunofluorescencji na organoidach pierwotnego raka jajnika jest niezwykle korzystna w zrozumieniu biologii tego nowotworu. Obecne badanie opisuje technikę immunofluorescencji do wykrywania białek naprawy uszkodzeń DNA w organoidach raka jajnika (PDO) o wysokim stopniu złośliwości. Po wystawieniu PDO na działanie promieniowania jonizującego, na nienaruszonych organoidach przeprowadza się immunofluorescencję w celu oceny białek jądrowych jako ognisk. Obrazy są zbierane za pomocą obrazowania z-stack w mikroskopii konfokalnej i analizowane za pomocą oprogramowania do automatycznego liczenia ognisk. Opisane metody pozwalają na analizę czasowej i specjalnej rekrutacji białek naprawczych uszkodzeń DNA oraz kolokalizacji tych białek z markerami cyklu komórkowego.
Wprowadzenie
Rak jajnika jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów ginekologicznych. Większość pacjentów jest leczona lekami uszkadzającymi DNA, takimi jak karboplatyna, a osobom z guzami z niedoborem naprawy rekombinacji homologicznej (HRR) można podawać inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)1,2. Jednak większość pacjentów rozwija oporność na te terapie i umiera w ciągu 5 lat od diagnozy. Rozregulowanie odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) jest związane z rozwojem raka jajnika oraz zarówno chemioterapią, jak i opornością na inhibitory PARP3. W związku z tym badanie DDR jest niezbędne d....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Tkanka nowotworowa i wodobrzusze zostały uzyskane po uzyskaniu zgody pacjenta jako część biorepozytorium ginekologii onkologicznej, które zostało zatwierdzone przez Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Do badania włączono pacjentki, u których występował surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości w zaawansowanym stadium (ang. advanced grade surowiczy rak jajnika – HGSOC). Wszystkie zabiegi były wykonywane w temperaturze pokojowej na stole, chyba że określono inaczej. Wszystkie odczynniki przygotowywano w temperaturze pokojowej (o ile nie wskazano inaczej) i przechowywano w temperaturze 4 °C.
1. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiony protokół pozwala na skuteczne barwienie, wizualizację i kwantyfikację białek odpowiedzialnych za naprawę uszkodzeń DNA w jądrach komórkowych organoidów. Technikę tę zastosowano do barwienia i oceny PDO przed oraz po napromieniowaniu. PDO poddano działaniu promieniowania w dawce 10 Gy i oceniono pod kątem następujących biomarkerów: ɣ-H2AX (Rycina 1), markeru uszkodzeń DNA; RAD51 (Rycina 2), markeru HRR; 53BP1, markeru NHEJ; RPA, markeru stresu repli.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odpowiedź na uszkodzenie DNA odgrywa integralną rolę zarówno w rozwoju raka jajnika, jak i oporności na chemioterapię. Dlatego konieczne jest dokładne zrozumienie mechanizmów naprawy DNA. W tym miejscu przedstawiono metodologię badania białek naprawiających uszkodzenia DNA w nienaruszonych organoidach 3D. Opracowano powtarzalny, niezawodny protokół wykorzystujący charakterystyczne przeciwciała do oceny uszkodzeń DNA, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców i stresu replikacyjnego. Co ważne, metody t.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wskazówki doktora Pawła Łobaczewskiego w ustanowieniu tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować Szkole Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology and Division of Gynecologic Oncology, Programowi Stypendialnemu Dziekana Uniwersytetu Waszyngtońskiego, Fundacji Gynecologic Oncology Group oraz Programowi Rozwoju Naukowca Zajmującego się Rozrodem za wsparcie tego projektu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezem (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS) | Fisher Scientific | ||
| Przeciwciało Ant-53BP1 | Firma BD Biosciences | 612522 | rozcieńczona w stosunku 1:500 w buforze barwiącym |
| Przeciwciało Ant-Geminina | Abcam | ab104306 | rozcieńczony w stosunku 1:200 w buforze barwiącym Przeciwciało |
| anty-Geminina | ProteinTech | 10802-1-AP | rozcieńczony w stosunku 1:400 w buforze barwiącym |
| Przeciwciało anty-RAD51 | Abcam | ab133534 | rozcieńczony w stosunku 1:1000 w buforze barwiącym |
| Przeciwciało anty-yH2AX | Millipore-Sigma | 05-636 | rozcieńczony w stosunku 1:500 w buforze barwiącym |
| Przeciwciało Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | rozcieńczony do 1:200 w buforze barwiącym |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Wirówka; Wirówka Sorvall St 16R | Thermo Scientific | ||
| Mikroskop konfokalny, system konfokalny Leica SP5 DMI4000 | Leica | ||
| Probówki stożkowe, 15 ml | Corning | 14-959-53A | |
| Automatyczny licznik komórek Countess 3 FL (maszyna do liczenia komórek) | Thermo Scientific | ||
| Szkiełka komory do liczenia komórek Countess | Thermo Scientific | C10228 | |
| Szkiełko nakrywkowe | LA Kolory | Każdy bezbarwny lakier do paznokci wystarczy | |
| Cultrex Ekstrakt z membrany podstawnej RGF, typ 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | Prawdopodobnie przydałby się Matrigel lub inny BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes, rozcieńczony w 1x PBS |
| Glicyna | Fisher Naukowy | ||
| JCountPro | JCountPro | Aby uzyskać dostęp do oprogramowania, E-mail: jcountpro@gmail.com | |
| Probówki do mikrowirówek | Fisher Naukowy | 07-000-243 | |
| Lakier do paznokci | StatLab | SL102450 | |
| Parafomalddehyd (PFA), 2% | Nauki o mikroskopii elektronowej | 157-4 | Rozcieńczyć do 4% PFA w PBS++ w celu uzyskania 2% |
| buforu przepuszczalności | Wykonany w Lab | 0,2% X-100 Triton w PBS++ | |
| Pipety | Rainin | 17014382 | |
| Końcówki do pipet | Deszcz | ||
| ProLong Gold Antiblade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Bufor do barwienia | Wyprodukowano w laboratorium | 0,5% BSA, 0,15% glicyny, 0,1% X-100 Triton w PBS++ | |
| System prowadnic komorowych Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | ||
| Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | Thermo Scientific | ||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | niepochodzący, rekombinowany enzym |
| X-RAD 320 Biologiczny napromieniacz chemiczny | Precyzyjne naświetlanie promieniowaniem rentgenowskim | X-RAD320 |
Bibliografia
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
