Artykuł metodologiczny

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

DOI:

10.3791/64885

⸱

3 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępność komórek wyizolowanych ze zdrowych i chorych tkanek i narządów stanowi kluczowy element dla podejścia medycyny spersonalizowanej. Chociaż biobanki mogą zapewnić szeroką kolekcję pierwotnych i unieśmiertelnionych komórek do badań biomedycznych, nie pokrywają one wszystkich potrzeb eksperymentalnych, szczególnie tych związanych z określonymi chorobami lub genotypami. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) są kluczowymi składnikami immunologicznej reakcji zapalnej, a tym samym odgrywają kluczową rolę w patogenezie różnych zaburzeń. Warto zauważyć, że EC z różnych miejsc wykazują różne właściwości biochemiczne i funkcjonalne, co sprawia, że dostępność określonych typów EC (tj. makronaczyniowych, mikronaczyniowych, tętniczych i żylnych) ma zasadnicze znaczenie dla projektowania wiarygodnych eksperymentów. Tutaj szczegółowo zilustrowano proste procedury uzyskiwania wysokowydajnych, praktycznie czystych ludzkich komórek śródbłonka makro- i mikronaczyniowego z tętnicy płucnej i miąższu płuc. Metodologia ta może być łatwo odtworzona przy stosunkowo niskich kosztach przez każde laboratorium w celu osiągnięcia niezależności od źródeł komercyjnych i uzyskania fenotypów/genotypów EC, które nie są jeszcze dostępne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śródbłonek naczyniowy wyściela wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. Odgrywa kluczową rolę w regulacji krzepnięcia krwi, napięcia naczyniowego i odpowiedzi immunologiczno-zapalnych1,2,3,4. Chociaż hodowla komórek śródbłonka (EC) wyizolowanych z próbek ludzkich jest niezbędna do celów badawczych, należy zauważyć, że EC z różnych naczyń krwionośnych (tętnic, żył, naczyń włosowatych) pełnią określone funkcje. Nie mogą one być w pełni podsumowane przez ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które są łatwo dostępne i szeroko stosowane w badaniach nad patofizjologią śródbłonka naczyń krwionośnych5,6. Na przykład ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HLMVECs) odgrywają kluczową rolę w zapaleniu płuc poprzez kontrolowanie rekrutacji i akumulacji leukocytów4,7. W związku z tym warunki eksperymentalne mające na celu odtworzenie zapalenia płuc z dużą wiernością powinny obejmować HLMVECs. Z drugiej strony dysfunkcję EC można zaobserwować w kilku patologiach; w związku z tym EC od pacjenta mają zasadnicze znaczenie dla zbudowania wiarygodnego modelu choroby in vitro. Na przykład wyizolowanie fragmentów EC z tętnicy płucnej (HPAECs), wypreparowanych z eksplantowanych płuc osób dotkniętych mukowiscydozą (CF), umożliwiło nam odkrycie mechanizmów dysfunkcji śródbłonka w tej chorobie8,9.

Tak więc, protokoły mające na celu optymalizację izolacji EC z różnych źródeł/narządów, również w stanach chorobowych, są niezbędne, aby dostarczyć badaczom cennych narzędzi badawczych, szczególnie gdy te narzędzia nie są dostępne na rynku. Protokoły izolacji HLMVEC i HPAEC zostały wcześniej zgłoszone10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. We wszystkich przypadkach trawienie enzymatyczne próbek płuc skutkowało mieszanymi populacjami komórek, które oczyszczono przy użyciu pożywek selektywnych ad hoc i sortowania komórek opartego na kulkach magnetycznych lub cytometrii. Dalsze optymalizacje tych protokołów muszą rozwiązać dwa główne problemy związane z izolacją EC: (1) zanieczyszczenie komórek i tkanek, które powinno zostać rozwiązane przy najwcześniejszych możliwych pasażach hodowli, aby zminimalizować starzenie replikacyjne EC20; oraz (2) niską wydajność pierwotnych izolatów EC.

To badanie opisuje nowy protokół wysokowydajnej, wysokiej czystości izolacji HLMVEC i HPAEC. Ta procedura może być łatwo stosowana i w kilku krokach daje praktycznie czyste makro- i mikronaczyniowe EC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone, a protokół był zgodny z wytycznymi komitetu etyki badań na ludziach Uniwersytetu Chieti-Pescara (#237_2018bis). Rysunek 1 ilustruje izolację komórek śródbłonka z segmentów (1-3 cm długości) miąższu płucnego lub tętnicy płucnej od zdeidentyfikowanych osób ludzkich (za pisemną zgodą) poddanych operacji klatki piersiowej z różnych powodów, takich jak odma opłucnowa lub lobektomia. W tym ostatnim przypadku chirurdzy pobrali również odcinek tętnicy płucnej. Warto zauważyć, że chirurdzy zostali dokładnie poinstruowani, aby pobrać próbki wolne od raka. Prezentowany protokół został zoptymalizowany w celu uzyskania jak największego plonu i czystości.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Rekonstytucja kolagenazy
    1. Rozpuścić kolagenazę w proszku w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem bez CaCl2 i MgCl2 (PBS−−, patrz Tabela materiałów) w stężeniu 2 mg/ml i przefiltrować roztwór za pomocą filtra porowego 0,22 μm.
    2. Przygotować 5 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić i podgrzać podwielokrotności do temperatury 37 °C.
  2. Powlekanie płyt
    1. W celu powlekania płytki należy odpipetować 1,5% roztwór żelatyny lub 50 μg/ml fibronektyny (patrz Tabela materiałów) do płytki hodowlanej (500 μl wystarcza do pokrycia powierzchni każdej studzienki płytki 6-dołkowej) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Po inkubacji usuń nadmiar żelatyny i umyj studzienki PBS-−. Zassać PBS−− i pozostawić płytkę do wyschnięcia w sterylnym kapturze.
      UWAGA: W celu rozpuszczenia żelatyny należy rozpuścić proszek w wodzie, aby uzyskać 1,5% roztwór, a następnie autoklawować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Żelatyna w temperaturze 1,5% nie jest płynna w temperaturze 4 °C; Dlatego należy go rozgrzać przed powlekaniem płyty. Alternatywnie, do powlekania płytki można użyć dowolnego dostępnego na rynku roztworu żelatyny odpowiedniego do hodowli komórkowych.

2. Przygotowanie próbki

  1. Miąższ płuc
    1. Umyj pobrane próbki, zanurzając je w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS-−−.
    2. Przenieść próbki na sterylną szalkę Petriego i ręcznie posiekać próbkę za pomocą nożyczek chirurgicznych (optymalna wielkość: >2 cm) na małe fragmenty o wielkości około 3-4 mm każdy.
  2. Segment(y) tętnicy
    1. Umyj pobrane próbki, zanurzając je w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS-−−.
    2. Przenieś go na sterylną szalkę Petriego bez siekania, ponieważ fragmentacja zwiększy powierzchnię przekroju poprzecznego odcinka tętnicy, zwiększając w ten sposób możliwość wyizolowania substancji niebędących EC.

3. Trawienie enzymatyczne

  1. Przemyć pokrojony w kostkę miąższ płuca lub odcinek/skręt tętnicy płucnej dwukrotnie za pomocą PBS−−. Ten krok usunie dużą część zalegającej krwi.
  2. Umieścić próbki w probówkach o pojemności 15 ml i inkubować z 5 ml kolagenazy typu 2 (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Podczas tej inkubacji degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej uwalnia pojedyncze komórki i agregaty komórkowe.

4. Odzyskiwanie strawionych komórek

  1. Umieść sterylne sitko ze stali/metalu (tj. sitko do herbaty o rozmiarze oczek ~1 mm) na górze probówki zbiorczej o pojemności 50 ml.
  2. Wlej całą zawartość z probówki 15 ml na sitko, delikatnie masuj strawioną tkankę szpatułką i przepłucz próbkę PBS-−− aż do napełnienia probówki zbiorczej.
    UWAGA: Ten krok wyeliminuje duże fragmenty tkanek w skali milimetrowej, zapewniając większą skuteczność kolejnych etapów filtracji.

5. Usuwanie Non-EC przez filtrację

  1. Przefiltrować odpływ zebrany w kroku 4.2 za pomocą sitka do komórek o rozmiarze oczek 70 μm i zebrać odpływ do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Następnie użyj sitka do komórek o rozmiarze oczek 40 μm i zbierz odpływ do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Oznacz tę probówkę jako "tuba 1".
    UWAGA: Te filtracje w kroku 5.1 i kroku 5.2 usuną duże agregaty komórek, które często składają się z mieszanych populacji komórek.

6. Sedymentacja klastrów komórkowych i zasiewanie komórek

  1. Odwirować próbki o masie 30 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia skupisk komórek.
  2. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety (nie nalewać) i umieścić go w świeżej probówce o pojemności 50 ml ("probówka 2").
  3. Zawiesić osad w "probówce 1" i napełnić probówkę do 50 ml PBS-−. Napełnij "probówkę 2" do 50 ml PBS−−.
    UWAGA: Od tego kroku obie rurki są traktowane w ten sam sposób.
  4. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zawiesić granulki w 2 ml pożywki wzrostowej (patrz Tabela Materiałów) i wysiać zawiesinę w dwóch oddzielnych dołkach wstępnie pokrytej płytki 6-dołkowej (krok 1.2).
    UWAGA: Od tego etapu należy karmić komórki co 2 dni pożywką wzrostową, aż osiągną zbieg (około 1 tygodnia, w zależności od wielkości próbki), aby uzyskać rozsądną liczbę komórek do sortowania.

7. Ekspansja komórek

  1. Przemyć komórki 2 ml PBS z CaCl2 i MgCl2 (PBS++, patrz Tabela Materiałów) w celu usunięcia resztek krwinek (użycie PBS++ jest ważne, aby uniknąć oderwania komórek).
  2. Usuń PBS++ i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną.
  3. Powtarzaj kroki 7.1 i 7.2, aż komórki osiągną zbieżność (około 1 tydzień, w zależności od wielkości próbki).

8. Sortowanie komórek

  1. Odłączyć komórki za pomocą 500 μl trypsyny-EDTA (0,05%, patrz tabela materiałów), odwirować i ponownie zawiesić osad za pomocą 190 μl PBS-−.
  2. Dodać 10 μl fluorescencyjnego sprzężonego przeciwciała anty-ludzkiego CD31-FITC (rozcieńczenie 1:20, patrz tabela materiałów) i inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  3. Umyć komórki za pomocą 10 ml PBS-−−, odwirować przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 300 μl PBS−−.
  4. Wyizoluj i zbierz komórki CD31 dodatnie (CD31+) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) za pomocą dyszy 100 μm i zbierz je w probówce.
    1. Zgodnie ze strategią bramkowania, najpierw zdefiniuj morfologię komórki za pomocą parametrów obszaru rozpraszania bocznego, SSC-A i FSC-A. Następnie wybierz pojedyncze komórki za pomocą wykresu kropkowego FSC-Area/FSC-Height lub SSC-Area/SSC-Height, zdefiniuj dodatnie komórki w oznaczonej próbce w porównaniu z niebarwioną próbką kontrolną i skieruj komórki fluorescencyjne do probówki zbiorczej21.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zawiesić osad w 2 ml pożywki wzrostowej do wysiewu w wstępnie pokrytych dołkach na płytce 6-dołkowej.

9. Rozszerzenie po sortowaniu

  1. Dwa dni po posortowaniu komórek zastąp kondycjonowaną pożywkę świeżą pożywką.
  2. Powtarzaj kroki 7.1 i 7.2 co 2 dni, aby rozszerzyć komórkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HLMEC isolation
Głównym problemem podczas izolacji HLMVEC jest obecność komórek zanieczyszczających, ponieważ mikroskopijnych naczyń włosowatych nie można łatwo oddzielić od tkanki zrębu. Dlatego osiągnięcie najwyższej możliwej czystości na najwcześniejszych etapach procesu izolacji ma kluczowe znaczenie dla ograniczenia pasaży hodowlanych, a tym samym starzenia się komórek. Podobnie, optymalny protokół izolacji powinien zapewnić najwyższą możliwą wydajność czystych HLMVEC. Aby osiągnąć te cele, stwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielorakie role, jakie odgrywają komórki śródbłonka naczyń krwionośnych w patofizjologii człowieka, sprawiają, że komórki te są niezastąpionym narzędziem do badań patogenetycznych i farmakologicznych in vitro . Ponieważ EC z różnych miejsc naczyniowych/narządów wykazują szczególne cechy i funkcje, dostępność zdrowych i chorych EC z narządu będącego przedmiotem zainteresowania byłaby idealna do celów badawczych. Na przykład HLMVEC są niezbędne do badań nad zapaleniem płuc; W związku z tym metodologia wysokowydajn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z włoskiego Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego i Badań (ex 60% 2021 i 2022) dla R. P. oraz przez granty z Włoskiej Fundacji Mukowiscydozy (FFC#23/2014) i z włoskiego Ministerstwa Zdrowia (L548/93) dla M. R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna-EDTA 1XGIBCO25300-054Służy do oddzielania komórek od płytek hodowlanych Przeciwciało
anty CD31, klon WM59DakoM0823Służy do barwienia CD-31 w immunocytochemii. Zastosowane rozcieńczenie: 1:50
Przeciwciało anty vWFThermo Fisher ScientificMA5-14029Stosowane do barwienia czynnikiem von Willebranda w immunocytochemii. Rozcieńczenie robocze: 1:100
Autoklawowalne nożyczki chirurgiczneDowolnaUżywana do rozdrabniania próbek
Sitka do komórek 40 i mikro; mCorning431750Używany podczas drugiej filtracji
Sitka komórkowe 70 & mikro; mCorning431751Stosowanie podczas pierwszej filtracji
Kolagenaza typu 2WorthingtonLS004177Typ 2 Kolagenaza stosowana do trawienia enzymatycznego. Stężenie robocze: 2 mg / ml
Sprzężone przeciwciało anty CD31BD Biosciences555445Służy do sortowania komórek (rozcieńczenie 1:20)
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z  CaCl2 i MgCl2Sigma-AldrichD8662Stosowany do płukania komórek przed zmianą pożywki
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez CaCl2 i MgCl2Sigma-AldrichD8537Służy do mycia próbek chirurgicznych i komórek przed trypsynizacją
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MVPromoCellC-22020Pożywka wzrostowa HLMVEC
FibronektynaSigma-AldrichF0895Fibronektyna z ludzkiego osocza stosowana do powlekania płytki. Stężenie robocze: 50 i mikro; g/ml
Żelatyna ze skóry świni, typ ASigma-AldrichG2500Stosowana do powlekania płytek
Żelatyna typu ASigma-Aldrichg-2500Żelatyna ze skóry świni stosowana do powlekania płytek. Stężenie robocze: 1,5%

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183(2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032(2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61(2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23(2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313(2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253(2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501(2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310(2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki r db onka p uckom rki r db onka mikro naczyniowegokom rki r db onka makro naczyniowegokom rki t tnicy p ucnejtrawienie kolagenazoczyszczanie kom rekfiltracja przez sito kom rkowemetoda wirowaniamarkery kom rek r db onka

Powiązane artykuły