Śledzenie progów elektrycznych w czasie rzeczywistym do translacyjnych badań nad bólem

Summary

APTrack to wtyczka oprogramowania opracowana dla platformy Open Ephys, która umożliwia wizualizację danych w czasie rzeczywistym i śledzenie potencjałów czynnościowych neuronów w pętli elektrycznej. Z powodzeniem zastosowaliśmy to w mikroneurografii dla ludzkich nocyceptorów z włókna C oraz mysich nocyceptorów z włókna C i Aδ.

Abstract

Nocyceptory to klasa pierwotnych neuronów doprowadzających, które sygnalizują potencjalnie szkodliwe bodźce. Wzrost pobudliwości nocyceptorów występuje w ostrych i przewlekłych stanach bólowych. Powoduje to nieprawidłową ciągłą aktywność lub obniżone progi aktywacji szkodliwych bodźców. Zidentyfikowanie przyczyny tej zwiększonej pobudliwości jest niezbędne do opracowania i walidacji terapii opartych na mechanizmach. Śledzenie progu elektrycznego pojedynczego neuronu może określić ilościowo pobudliwość nocyceptorów. Dlatego opracowaliśmy aplikację, która umożliwia takie pomiary i demonstruje jego zastosowanie u ludzi i gryzoni. APTrack zapewnia wizualizację danych w czasie rzeczywistym i identyfikację potencjału czynnościowego za pomocą czasowego wykresu rastrowego. Algorytmy wykrywają potencjały czynnościowe poprzez przekroczenie progu i monitorują ich opóźnienie po stymulacji elektrycznej. Wtyczka następnie moduluje amplitudę stymulacji elektrycznej za pomocą metody góra-dół, aby oszacować próg elektryczny nocyceptorów. Oprogramowanie zostało zbudowane w oparciu o system Open Ephys (V0.54) i zakodowane w języku C++ przy użyciu frameworka JUCE. Działa w systemach operacyjnych Windows, Linux i Mac. Dostępny jest kod open source (https://github.com/Microneurography/APTrack). Zapisy elektrofizjologiczne pobrano z nocyceptorów zarówno w mysim preparacie skórno-nerwowym metodą drażnionego włókna w nerwie odpiszczelowym, jak i u zdrowych ochotników za pomocą mikroneurografii w powierzchownym nerwie strzałkowym. Nocyceptory klasyfikowano ze względu na ich reakcję na bodźce termiczne i mechaniczne, a także poprzez monitorowanie zależnego od aktywności spowolnienia prędkości przewodzenia. Oprogramowanie ułatwiło przeprowadzenie eksperymentu, upraszczając identyfikację potencjału czynnościowego za pomocą czasowego wykresu rastrowego. Po raz pierwszy demonstrujemy śledzenie progów elektrycznych w zamkniętej pętli potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu podczas mikroneurografii ludzkiej in vivo oraz podczas elektrofizjologicznych zapisów włókien C i Aδ ex vivo myszy. Dowodzimy zasady, pokazując, że próg elektryczny ludzkiego nocyceptora z włókna C wrażliwego na ciepło jest zmniejszany przez ogrzewanie pola recepcyjnego. Ta wtyczka umożliwia śledzenie progów elektrycznych potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu i umożliwia ilościowe określenie zmian w pobudliwości nocyceptorów.

Introduction

Nocyceptory są głównymi neuronami doprowadzającymi w obwodowym układzie nerwowym, które są aktywowane przez zdarzenia jawnie lub potencjalnie uszkadzające tkanki i odgrywają kluczową rolę ochronną w ostrym bólu¹. Zapisy elektrofizjologiczne nocyceptorów włókien C i Aδ w modelach zwierzęcych, zdrowych ochotnikach i pacjentach wykazały uczulenie i nieprawidłową spontaniczną aktywność w różnych stanach bólowych^2,3,4,5,6,7. Zrozumienie mechanizmów, które leżą u podstaw tych zmian w pobudliwości nocyceptorów u pacjentów, może umożliwić ukierunkowane interwencje terapeutyczne⁸. Istnieje jednak niewiele narzędzi do bezpośredniej oceny pobudliwości nocyceptorów, szczególnie u pacjentów⁹, ale potencjał użyteczności takich narzędzi jest dobrze rozpoznany^10,11.

Śledzenie progu elektrycznego całego nerwu może być wykorzystane do badania pobudliwości aksonalnej u ludzi¹². Jednakże, ponieważ duże, mielinizowane, obwodowe neurony przyczyniają się nieproporcjonalnie do amplitudy potencjału czynnościowego związku czuciowego, śledzenie progu elektrycznego całego nerwu nie pozwala na ocenę funkcji włókna C^11,13. Rzeczywiście, w poprzednim badaniu, śledzenie progu elektrycznego całego nerwu w kohortach przewlekłego bólu neuropatycznego z neuropatią cukrzycową i polineuropatią wywołaną chemioterapią nie wykazało różnic w pobudliwości aksonalnej¹¹.

W poprzednim badaniu, śledzenie progów elektrycznych na poziomie pojedynczego neuronu zostało wykorzystane do zbadania pobudliwości nocyceptorów włókna C podczas zapisów drażnionych włókien w preparacie skórno-nerwowym ex vivo na szczurach¹⁴. Autorzy wykazali, że zwiększone stężenie potasu, kwaśne warunki i bradykinina zwiększają pobudliwość nocyceptorów włókna C, co znajduje odzwierciedlenie w obniżonym progu elektrycznym dla generowania potencjału czynnościowego. Co więcej, podgrzanie pola recepcyjnego nocyceptorów wrażliwych na ciepło zmniejszyło ich próg elektryczny, podczas gdy nocyceptory niewrażliwe na ciepło wykazywały wzrost swojego progu elektrycznego¹⁴. Dostarcza to ważnego dowodu na to, że śledzenie progu elektrycznego pojedynczego neuronu jest możliwe i może być użyteczne, ale obecnie nie ma dostępnych rozwiązań programowych i/lub sprzętowych, które umożliwiałyby takie badania, szczególnie w przypadku badań na ludziach.

U ludzi mikroneurografia jest jedyną dostępną metodą bezpośredniej oceny właściwości elektrofizjologicznych włókien C¹⁵. Podejście to zostało wykorzystane do wykazania dysfunkcji nocyceptorów u pacjentów z przewlekłym bólem^2,3,4,5,6,7. Mikroneurografia może wykrywać potencjały czynnościowe pojedynczych neuronów; jednak ze względu na niski stosunek sygnału do szumu, naukowcy używają techniki znakowania do scharakteryzowania aktywności włókien C¹⁶. W technice znakowania ponadprogowa stymulacja elektryczna jest stosowana do pól recepcyjnych z włókna C w skórze. Ta stymulacja elektryczna generuje potencjał czynnościowy, który występuje przy stałym opóźnieniu, które jest określane przez prędkość przewodzenia włókna C. Włókna C wykazują spowolnienie zależne od aktywności, w wyniku czego ich prędkość przewodzenia zmniejsza się, a tym samym zwiększa się ich opóźnienie przewodzenia w okresach wyładowania potencjału czynnościowego¹⁷. W warunkach podstawowych włókna C zwykle nie generują potencjałów czynnościowych przy braku szkodliwych bodźców, a zatem ich opóźnienie przewodzenia w odpowiedzi na stymulację elektryczną o niskiej częstotliwości jest stałe. Bodźce mechaniczne, termiczne lub farmakologiczne, które wywołują odpalanie, indukują spowolnienie zależne od aktywności, co zwiększa opóźnienie potencjałów czynnościowych wywołanych przez jednoczesną stymulację elektryczną o niskiej częstotliwości. Pozwala to na obiektywną identyfikację reakcji na zastosowane bodźce nieelektryczne w kontekście niskiego stosunku sygnału do szumu. W związku z tym, spowolnienie zależne od aktywności może być wykorzystane do funkcjonalnego scharakteryzowania C-fibers¹⁶. Rzeczywiście, różne klasy funkcjonalne włókien C wykazują charakterystyczne wzorce spowolnienia zależnego od aktywności w paradygmatach stymulacji elektrycznej, które obejmują zmianę częstotliwości stymulacji^18,19. Ta zmienność opóźnień potencjałów czynnościowych włókien C stanowi wyzwanie dla algorytmów zaprojektowanych do ich monitorowania.

Ciągła aktywność nocyceptora prowadzi do zwiększonej zmienności jego opóźnienia podczas stymulacji elektrycznej o niskiej częstotliwości, co jest znowu spowodowane spowolnieniem zależnym od aktywności. Ta zwiększona zmienność, czyli fluktuacja, jest wymierną miarą pobudliwości w przybliżeniu². Dalsze przyczyny zmienności opóźnienia potencjału czynnościowego obejmują przerzutnik, w którym stymulowane są naprzemienne końcowe gałęzie pojedynczego neuronu, co powoduje, że wywołany potencjał czynnościowy ma dwa (lub więcej) opóźnienia linii bazowej, które wzajemnie się wykluczają²⁰. Wreszcie, zmiany temperatury końcowych gałęzi neuronu obwodowego powodują również zmiany opóźnienia potencjału czynnościowego w sposób termodynamiczny, przy czym ocieplenie zwiększa prędkość przewodzenia, a chłodzenie spowalnia prędkość przewodzenia¹⁹. Tak więc każde oprogramowanie dążące do śledzenia progów elektrycznych w pętli zamkniętej nocyceptywnych włókien C musi uwzględniać zmiany opóźnień w elektrycznie wywołanych potencjałach czynnościowych.

Aby osiągnąć nasz cel śledzenia progów elektrycznych między gatunkami nocyceptorów światłowodowych C, opracowaliśmy APTrack, wtyczkę oprogramowania open-source dla platformy Open Ephys²¹, aby umożliwić śledzenie progów elektrycznych w czasie rzeczywistym w czasie rzeczywistym, w pętli zamkniętej, oraz śledzenie opóźnień. Dostarczamy dane potwierdzające słuszność koncepcji, które pokazują, że możliwe jest śledzenie progu elektrycznego nocyceptora włókna C podczas mikroneurografii człowieka. Ponadto pokazujemy, że narzędzie to może być wykorzystywane w elektrofizjologii ex vivo włókien drażnionych gryzoni, umożliwiając w ten sposób badania translacyjne między ludźmi a gryzoniami. Tutaj szczegółowo opiszemy, w jaki sposób naukowcy mogą wdrożyć i wykorzystać to narzędzie, aby wspomóc swoje badania nad funkcją nocyceptorów i pobudliwością.

Protocol

Eksperymenty mikroneurograficzne na ludziach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Wydziału Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu w Bristolu (numer referencyjny: 51882). Wszyscy uczestnicy badania wyrazili pisemną świadomą zgodę. Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Bristolu zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. po zatwierdzeniu przez komisję ds. dobrostanu zwierząt i oceny etycznej Uniwersytetu w Bristolu i były objęte licencją projektową.

1. Instalacja GUI Open Ephys i APTrack

1. Zapoznaj się z dokumentacją oprogramowania, aby znaleźć najnowszą wersję obsługiwanego graficznego interfejsu użytkownika (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) Open Ephys, a następnie pobierz i zainstaluj graficzny interfejs użytkownika.
2. Zainstaluj kompatybilną wersję graficznego interfejsu użytkownika z następującego adresu URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. Pobierz najnowszą wersję z GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. W przypadku komputera z systemem Windows skopiuj plik .dll do folderu wtyczek, który zwykle znajduje się w folderze C:\Program Files\Open Ephys\plugins. W przypadku komputera z systemem MacOS skopiuj plik .bundle do folderu Zawartość/Wtyczki pakietu.

2. Montaż aparatury rejestrującej i stymulującej

1. Podłącz płytkę akwizycyjną do komputera za pomocą dostarczonego przez producenta i włącz ją.
   UWAGA: W przypadku mikroneurografii u ludzi do elektrycznego odizolowania uczestnika od komputera użyto izolatora USB 3.0, a płytka akwizycyjna była zasilana przenośną baterią, w przeciwieństwie do zasilacza sieciowego używanego do badań na gryzoniach. Wszystkie połączenia USB, z wyjątkiem płytki sterującej silnikiem krokowym, zostały przepuszczone przez izolator USB podczas badań na ludziach.
2. Podłącz płytę we/wy do portu wejścia analogowego na płytce akwizycyjnej. Podłącz stację czołową nagrywającą Intan RHD do karty akwizycyjnej za pomocą interfejsu szeregowo-peryferyjnego (SPI).
   UWAGA: Zastosowano tutaj 16-kanałową dwubiegunową stopnie czołowe Intan, ale mogą być używane inne monopolarne stopnie z serii RHD2000
.
3. Podłącz PulsePal do komputera²². W przypadku montażu z analogowym stymulatorem sterowanym napięciem (np. DS4) za pomocą PulsePal, tak jak w przypadku nagrań z drażnionych włókien myszy, wykonaj kroki 2.5.1-2.5.3; w przypadku montażu ze stymulatorem opartym na enkoderze obrotowym (np. DS7) za pomocą silnika krokowego, podobnie jak w przypadku zapisów mikroneurografii u ludzi, wykonaj kroki 2.6.1-2.6.8 (Rysunek 1).
4. Zbuduj łańcuch sygnałowy w graficznym interfejsie użytkownika zgodnie z poniższym opisem.
   1. Włóż wtyczkę Rhythm FPGA do łańcucha sygnałowego, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając ją do łańcucha sygnałowego; spowoduje to połączenie GUI z płytą akwizycji. Upewnij się, że przycisk ADC został kliknięty, aby zainicjować nagrywanie kanałów ADC z karty I/O. Przycisk ADC zaświeci się na pomarańczowo, gdy jest włączony.
      UWAGA: Jeśli chcesz odtworzyć wcześniej nagrane dane eksperymentalne, na początku można użyć wtyczki File Reader zamiast Rhythm FPGA. Użycie tego w połączeniu z APTrack pozwoli na wizualizację i śledzenie opóźnień potencjałów czynnościowych w poprzednich eksperymentach.
   2. Włóż filtr pasmowoprzepustowy do łańcucha sygnałowego; domyślne ustawienia 300-6 000 Hz są odpowiednie zarówno dla nagrań wykonywanych przez ludzi, jak i myszy. Dodatkowo włóż za nim rozdzielacz.
   3. Włóż wtyczkę APTrack do łańcucha sygnałowego po jednej stronie rozgałęźnika, a LFP Viewer po drugiej stronie. LFP Viewer zapewnia tradycyjny widok śladu napięcia podobny do oscyloskopu, który jest przydatny podczas eksperymentów.
   4. Wstaw węzeł rekordu po wtyczce. W menu rozwijanym zmień format zapisywania danych z binarnego na Open Ephys. To uzupełnia prosty łańcuch sygnałowy, który działa dobrze (Rysunek 2); Można jednak dodawać dodatkowe składniki zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
      UWAGA: Jeśli węzeł rekordu zostanie umieszczony przed wtyczką w łańcuchu sygnałowym, informacje o śledzeniu potencjału czynnościowego nie zostaną zapisane.
   5. W prawym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika kliknij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć przesyłanie danych z karty akwizycji i ich wizualizację. Aby rozpocząć nagrywanie, kliknij okrągły przycisk nagrywania obok przycisku odtwarzania.
      UWAGA: Łatwo zapomnieć o kliknięciu na nagrywanie; Rejestrujemy dane od momentu, w którym zaczynamy je gromadzić, aby temu zapobiec.
5. W przypadku montażu z analogowym stymulatorem sterowanym napięciem, postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
   1. Włącz stymulator prądu stałego, którego amplituda stymulacji jest kontrolowana przez analogowe wejście napięciowe. W tym przypadku użyto DS4 (Rysunek 1).
   2. Kanał wyjściowy 1 PulsePal służy do analogowego polecenia napięcia. Podziel ten sygnał za pomocą rozgałęźnika T BNC, a następnie podłącz go do wejścia stymulatora prądu stałego i płytki I/O tak, aby zarejestrowane zostało napięcie polecenia.
   3. Kanał wyjściowy 2 PulsePal służy do znacznika zdarzenia TTL stymulacji elektrycznej. Podłącz to do karty I/O, aby znaczniki zdarzeń TTL stymulacji były rejestrowane do użycia przez wtyczkę i do analizy post hoc.
6. W przypadku montażu z analogowym stymulatorem sterowanym napięciem, postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
   1. Włącz stymulator prądu stałego, którego amplituda stymulacji jest kontrolowana za pomocą obrotowego pokrętła kodującego. W tym przypadku użyto DS7 (Rysunek 1).
   2. Podłącz płytkę sterującą silnikiem krokowym do silnika krokowego za pomocą dostarczonego przez producenta i uchwytu magnetycznego.
   3. Podłącz płytę sterującą bezpośrednio do komputera za pomocą dowolnego standardowego USB A do USB micro-B. Nie podłączaj płyty sterującej po stronie uczestnika izolatora USB, ponieważ jest on również podłączony do zasilania sieciowego 12 V.
   4. Jeśli używasz płyty sterującej po raz pierwszy, prześlij skrypt silnika krokowego z GitHub do tablicy sterującej; wystarczy to zrobić tylko raz lub jeśli zostaną wydane jakiekolwiek aktualizacje oprogramowania dla skryptu silnika krokowego.
   5. Ustaw pokrętło amplitudy stymulacji na stymulatorze prądu stałego na 0 mA. Użyj niestandardowego wspornika montażowego, aby połączyć silnik krokowy i pokrętło amplitudy stymulacji. Można je drukować w 3D, co umożliwia tanie, szybkie i konfigurowalne rozwiązania montażowe. Skonsultuj się z GitHub, aby sprawdzić, czy montaż został już zaprojektowany dla wybranego stymulatora.
   6. Użyj niestandardowego adaptera lufy, aby podłączyć lufę silnika krokowego do pokrętła regulacji amplitudy stymulacji. Adaptery te powinny być wykonane z metalu ze względu na wytrzymałość i trwałość; jednak odpowiednie byłyby również części drukowane w 3D, chociaż mogą wymagać regularnej wymiany. Skonsultuj się z GitHub, aby sprawdzić, czy adapter lufowy został już zaprojektowany dla wybranego stymulatora.
   7. Luźno przymocuj tablicę sterowniczą/aparat silnika krokowego do pokrętła sterującego stymulatora za pomocą niestandardowego uchwytu i adaptera lufy.
      UWAGA: Mocowanie i adapter lufy zostaną dokręcone później, po uruchomieniu oprogramowania i automatycznym ustawieniu silnika krokowego w pozycji zero.
   8. Podłącz PulsePal zgodnie z opisem w krokach protokołu 2.5.2-2.5.3 (bez podłączenia kanału wyjściowego 1 do stymulatora), ponieważ generowanie znaczników zdarzeń TTL jest nadal wymagane do analizy i działania wtyczki. Dodatkowo podłącz kanał wyjściowy 2 do stymulatora DS7, aby go wyzwolić.
7. Przygotuj preparat skórno-nerwowy myszy zgodnie z poniższym opisem.
   1. Zapewnij myszom C57BL/6J (Charles River Laboratories, Wielka Brytania, w tym badaniu) w wieku 2-4 miesięcy i obu płci jedzenie i wodę ad libitum.
   2. Po usunięciu przez przedawkowanie środka znieczulającego poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (≥200 mg/kg) i potwierdzeniu ustania krążenia, należy wyciąć skórę od grzbietowej strony tylnej łapy myszy i nerwu odpiszczelowego, który unerwia ten obszar, stosując metody opisane przez Zimmermann i wsp.²³.
   3. Preparat skórno-nerwowy należy utrzymywać w karbogenicznym syntetycznym płynie śródmiąższowym (Tabela 1) w temperaturze 30-32 °C w połowie specjalnie przygotowanej dwukomorowej kąpieli akrylowej (szybkość perfuzji 15 ml/min, objętość 30 ml). Przewlecz nerw przez mały otwór do komory wypełnionej olejem mineralnym i uszczelnij wazeliną. Olej zapewnia izolowane środowisko nagrywania.
   4. Oderwij dwa cienkie włókna od pnia nerwu za pomocą bardzo cienkich kleszczy i zawieś po jednym z każdej strony dwubiegunowej elektrody rejestrującej srebro / chlorek srebra.
   5. Digitalizuj i wzmacniaj sygnał neuronowy za pomocą RHD2216 16-kanałowej dwubiegunowej głowicy czołowej i przetwarzaj ją za pomocą płytki akwizycyjnej. Próbkuj sygnał z częstotliwością 30 kHz, z filtrem pasmowo-przepustowym 300-6 000 Hz i wizualizuj go za pomocą graficznego interfejsu użytkownika.
   6. Za pomocą szklanej pałeczki pogłaszcz skórę preparatu. Użyj aktywności masy o niskiej amplitudzie, aby potwierdzić, że preparat jest żywy.
8. Wykonaj ludzką mikroneurografię włókna C, jak opisano poniżej.
   1. Przeprowadź mikroneurografię z uczestnikami, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę, zgodnie z wcześniejszym opisem²⁴.
   2. Gdy uczestnik siedzi wygodnie leżąc na łóżku i wsparty poduszkami, zidentyfikuj powierzchowny nerw strzałkowy za pomocą skanera ultrasonograficznego i zaznacz obszar docelowy około 5-10 cm proksymalnie do kostki bocznej, mniej więcej na poziomie środkowej goleni.
   3. Wysterylizuj skórę wokół obszaru docelowego za pomocą 2% chusteczki nasączonej chlorheksydyną w 70% alkoholu i włóż sterylną elektrodę referencyjną podskórnie w pobliżu zamierzonego miejsca nagrywania na środkowym poziomie goleni.
   4. Wprowadzić sterylną elektrodę rejestrującą do powierzchownego nerwu strzałkowego pod kontrolą ultrasonograficzną w obszarze docelowym.
   5. Digitalizuj i wzmacniaj sygnał neuronowy za pomocą RHD2216 16-kanałowej dwubiegunowej głowicy czołowej i przetwarzaj ją za pomocą płytki akwizycyjnej. Próbkuj sygnał o częstotliwości 30 kHz, z filtrem pasmowoprzepustowym 300-6 000 Hz i wizualizuj go za pomocą GUI.
      UWAGA: Sprzęt akwizycyjny został odizolowany elektrycznie od laptopa za pomocą izolatora USB 3.0 z izolacją 5 kV RMS i zasilany za pomocą dedykowanego zasilacza bateryjnego 12 V.
   6. Potwierdź udane pozycjonowanie wewnątrznerwowe, delikatnie głaszcząc skórę, aby odsłonić mechanicznie wywołaną aktywność masy. Ponadto uczestnicy zwykle zgłaszają parestezje w grzbietowo-bocznym aspekcie stopy po udanym ułożeniu śródnerwowym.

3. Konfiguracja oprogramowania oraz identyfikacja i fenotypowanie neuronów obwodowych

1. Skonfiguruj oprogramowanie zgodnie z poniższym opisem.
   1. Otwórz GUI (Rysunek 3). Jeśli płyta sterująca silnikiem krokowym jest podłączona do komputera, zostanie wykryta i ustawiona w pozycji zero. Dokręć niestandardowe mocowanie i adapter lufy opisane w krokach 2.6.5-2.6.7, ponieważ pokrętło amplitudy stymulacji stymulatora i silnik krokowy są ustawione na zero.
      UWAGA: Jeśli silnik krokowy i pokrętło amplitudy stymulacji nie są jednocześnie "wyzerowane", może to spowodować, że silnik krokowy będzie próbował obrócić pokrętło sterujące poza swój zakres, co może spowodować uszkodzenie.
   2. Z menu opcji wybierz Kanał wyzwalania. Wybierz kanał ADC zawierający znacznik TTL stymulacji elektrycznej z kanału wyjściowego PulsePal 2.
   3. Z menu opcji wybierz Kanał danych, a następnie wybierz kanał zawierający dane elektrofizjologiczne.
   4. W panelu sterowania stymulacją zdefiniuj początkową, minimalną i maksymalną amplitudę stymulacji za pomocą suwaka. Upewnij się, że bieżąca stymulacja jest ustawiona powyżej 0, aby wygenerowane zostały znaczniki TTL.
      UWAGA: Niektóre stymulatory mają współczynnik skalowania wejścia do wyjścia, który nie wynosi 1:1; Weź to pod uwagę przy wyborze odpowiedniej amplitudy stymulacji. Na przykład w niektórych systemach stymulacji można wybrać współczynnik wyjściowy 1:10, aby uzyskać wyższą moc wyjściową ze stymulatora prądu stałego.
   5. W panelu sterowania stymulacji kliknij F, aby załadować plik zawierający instrukcje stymulacji. Protokoły stymulacji elektrycznej są przechowywane jako pliki z wartościami oddzielonymi przecinkami (CSV) składające się z żądanych częstotliwości i czasu trwania stymulacji, co pozwala użytkownikom tworzyć złożone paradygmaty stymulacji dla swoich eksperymentów. Przykładowy szablon dostępny jest tutaj: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. W panelu sterowania stymulacją kliknij >, aby rozpocząć załadowany paradygmat stymulacji. Domyślnie APTrack żąda od PulsePal generowania dodatnich impulsów prostokątnych o czasie trwania 0,5 ms o różnych amplitudach w celu kontrolowania amplitudy stymulacji stymulatora prądu stałego.
   7. Czasowy wykres rastrowy zacznie być aktualizowany wraz z reakcją na stymulację elektryczną, przy czym każda nowa odpowiedź na stymulację będzie wyświetlana jako nowa kolumna po prawej stronie.
2. Wizualizacja i identyfikacja potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu.
   1. Dla skutecznego wykrycia potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu ważne jest ustawienie odpowiednich progów obrazu. W panelu czasowego wykresu rastrowego dostosuj wartości dolnego, wykrywania i wysokiego progu obrazu.
      1. Wybierz schemat kolorów z menu opcji. W trybie WHOT (White Hot) (domyślnie) napięcia poniżej niskiego progu obrazu są kodowane w kolorze czarnym. Napięcia pomiędzy niskim obrazem a progami detekcji są zakodowane w skali szarości. Napięcia powyżej progu detekcji są kodowane na zielono, a napięcia powyżej wysokiego progu obrazu są kodowane na czerwono.
   2. Neurony obwodowe wykazują stałe reakcje opóźnienia przy niskich częstotliwościach stymulacji (<0,25 Hz), a odpowiedzi te są determinowane przez ich prędkość przewodzenia i odległość między miejscami stymulacji i rejestracji. Po ustawieniu odpowiednich progów obrazu, zdarzenia przekroczenia progu wykryte przez algorytmy zostaną zakodowane w kolorze zielonym (Rysunek 4).
   3. Systematycznie przesuwaj elektrodę stymulującą wokół obszaru skóry unerwionego przez rejestrowany nerw, pozwalając na co najmniej trzy zdarzenia stymulacji w każdym miejscu. Monitoruj czasowy wykres rastrowy pod kątem zdarzeń przekroczenia progu (oznaczonych na zielono) występujących w tym samym punkcie czasowym po każdym zdarzeniu stymulacji elektrycznej.
      UWAGA: U myszy zastosowano bodziec poszukiwawczy o natężeniu 5 mA. U ludzi amplituda przezskórnego elektrycznego bodźca poszukiwawczego została dostosowana do oceny bólu werbalnego tak, że nigdy nie przekroczyła 7/10.
   4. Sprawdź, czy nie ma trzech zdarzeń przekroczenia progu (zielone paski), które pojawiają się w rzędzie przy tym samym opóźnieniu i w tej samej pozycji stymulacji; wskazuje to na identyfikację potencjału czynnościowego neuronu obwodowego.
   5. Zoptymalizuj pozycję elektrody stymulującej, identyfikując najbardziej wrażliwy elektrycznie punkt pola recepcyjnego docelowego neuronu, a następnie zamocuj elektrodę na miejscu. W tym momencie w ludzkiej mikroneuronografii przełącz się na używanie śródskórnych igieł do elektroakupunktury (średnica 0,2 mm) do bipolarnej stymulacji elektrycznej, u myszy stosuje się niestandardową przezskórną sondę stymulacyjną, aby pozycja stymulacji była stała.
3. Wykonaj klasyfikację i fenotypowanie sensoryczne neuronów obwodowych.
   1. Oszacuj próg elektryczny docelowego potencjału czynnościowego, dostosowując amplitudę symulacji ręcznie lub w razie potrzeby za pomocą APTrack (opisano w krokach 4.1-4.2).
   2. Stymuluj pole recepcyjne przy 2-krotności szacowanego progu elektrycznego z częstotliwością 0,25 Hz w całym protokole fenotypowania sensorycznego.
   3. Oblicz prędkość przewodzenia neuronu, dzieląc odległość przewodzenia przez opóźnienie przewodzenia. Włókna C można zidentyfikować na podstawie prędkości przewodzenia ≤2 m/s.
   4. Mechanicznie stymuluj pole recepcyjne za pomocą filamentów von Freya, aby określić mechaniczny próg aktywacji. Mechanosensację można zidentyfikować na podstawie wywołanych potencjałów czynnościowych widocznych na śladzie napięcia i wzrostu opóźnienia neuronu, jeśli jest to włókno C, przy wystarczającej sile.
   5. Podgrzej pole recepcyjne neuronu, ponownie obserwując potencjały czynnościowe widoczne na śladzie napięcia i wzrost opóźnienia neuronu, jeśli jest to włókno C, po wystarczającym zastosowaniu ciepła. Neurony niewrażliwe na ciepło będą wykazywać zmniejszenie opóźnienia ze względu na termodynamiczny wpływ na propagację aksonów.
      UWAGA: W mikroneurografii człowieka należy użyć TSC-II do szybkiej i dokładnej kontroli termicznej. W preparacie dla myszy dodaj podgrzany lub schłodzony syntetyczny płyn śródmiąższowy do aluminiowej komory izolacyjnej umieszczonej nad polem recepcyjnym, aby umożliwić dostęp do zakończeń neuronów, jednocześnie ograniczając szybkie rozpraszanie ciepła do otaczającego płynu. Zapisz temperaturę za pomocą termopary.
   6. Schłodzić pole recepcyjne, ponownie obserwując potencjały czynnościowe widoczne na śladzie napięcia i wyraźny wzrost opóźnienia neuronu, jeśli jest to włókno C, po wystarczającej aplikacji na zimno. Wszystkie neurony będą wykazywać wzrost opóźnienia ze względu na termodynamiczny wpływ na propagację aksonów, dlatego należy zachować ostrożność przy oznaczaniu neuronów jako wrażliwych na zimno na podstawie samego wzrostu opóźnienia.

4. Śledzenie opóźnień i progów elektrycznych

1. Wykonaj śledzenie opóźnień zgodnie z poniższym opisem.
   1. Po zidentyfikowaniu potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu na czasowym wykresie rastrowym przesuń szary suwak liniowy po prawej stronie czasowego wykresu rastrowego, aby dostosować położenie pola wyszukiwania.
   2. Poniżej czasowego wykresu rastrowego dostosuj suwak obrotowy szerokości pola wyszukiwania do odpowiedniej szerokości. Zmniejsz szerokość pola wyszukiwania, aby zmniejszyć ryzyko przejściowych skoków hałasu, spontanicznie wyzwalających potencjałów czynnościowych lub innych pobliskich potencjałów czynnościowych o stałym opóźnieniu błędnie zidentyfikowanych jako interesujący potencjał czynnościowy.
   3. Aby rozpocząć śledzenie docelowego potencjału działania, kliknij przycisk + poniżej tabeli śledzenia wielu jednostek. Do tabeli zostanie dodany nowy wiersz zawierający szczegółowe informacje na temat docelowego potencjału czynnościowego, w tym lokalizację opóźnienia, procent wystrzeliwania ponad 2-10 bodźców (dostosowany w menu opcji) oraz wykrytą amplitudę szczytu.
   4. Po dodaniu potencjału czynnościowego do wielojednostkowej tabeli śledzenia, algorytm śledzenia opóźnień (Rysunek 5) będzie automatycznie wykonywany na niej przy każdej kolejnej stymulacji elektrycznej.
   5. Jeśli na czasowym wykresie rastrowym widocznych jest wiele dyskretnych potencjałów czynnościowych, dodaj je do tabeli śledzenia wielu jednostek, jak opisano powyżej. Teoretyczna maksymalna liczba potencjałów czynnościowych, które można dodać do tabeli w celu jednoczesnego śledzenia opóźnień, to maksymalna 32-bitowa wartość całkowita.
   6. Zaznacz pole Track Spike w tabeli śledzenia wielu jednostek, aby przesunąć pole wyszukiwania do odpowiedniej pozycji dla tego konkretnego potencjału czynnościowego, zgodnie z algorytmem śledzenia opóźnienia. Umożliwi to monitorowanie śledzenia opóźnień w czasie rzeczywistym i zapewni, że śledzenie podąża za potencjałem działania zgodnie z oczekiwaniami. Śledzenie opóźnień innych skoków będzie kontynuowane w tle w normalny sposób.
   7. Usuń śledzone potencjały czynnościowe z wielojednostkowej tabeli śledzenia za pomocą przycisku usuwania na końcu każdego rzędu.
2. Wykonaj śledzenie progu elektrycznego zgodnie z poniższym opisem.
   1. Dostosuj szybkość przyrostu i spadku w panelu sterowania stymulacją w zakresie od 0,1 V do 0,5 V. Utrzymuj te wartości na równym poziomie i nie dostosowuj ich podczas eksperymentu, chyba że jest to częścią paradygmatu eksperymentalnego.
   2. Upewnij się, że częstotliwość stymulacji jest ustawiona na odpowiednią częstotliwość, zwykle 0,25-0,5 Hz, chyba że modulacja częstotliwości stymulacji jest częścią paradygmatu eksperymentalnego. Zwiększenie szybkości wypalania nocyceptorów może zmienić próg elektryczny nocyceptora.
   3. Po pomyślnym śledzeniu potencjału czynnościowego zaznacz pole Track Threshold w tabeli śledzenia wielu jednostek, co zainicjuje algorytm śledzenia progu elektrycznego (Rysunek 6).
      UWAGA: Śledzenie progu elektrycznego jest uruchamiane tylko na docelowym potencjale czynnościowym; Rzeczywiście, szybkości wystrzeliwania innych potencjałów czynnościowych w tabeli śledzenia wielu jednostek będą odpowiednio aktualizowane wraz ze zmianami amplitudy stymulacji.
   4. Dostosuj amplitudę stymulacji ręcznie do oszacowania progu elektrycznego, co skróci czas oczekiwania na określenie progu elektrycznego. Czas potrzebny do ustalenia wiarygodnego progu elektrycznego zależy od częstotliwości stymulacji, szybkości przyrostu i spadku oraz różnicy w amplitudzie stymulacji od początkowej stymulacji do progu elektrycznego neuronu.
   5. Oprogramowanie wykorzystuje metodę góra-dół do oszacowania progu elektrycznego neuronów. W tabeli śledzenia wielu jednostek szybkość wypalania jest określana na podstawie 2-10 poprzednich stymulacji (wybranych w menu opcji). Wybierz liczbę zdarzeń stymulacji, które mają być brane pod uwagę; Wyższa liczba zwiększy wiarygodność oszacowania progu, ale jego osiągnięcie zajmie więcej czasu.
   6. Podczas mikroneurografii u ludzi ważne jest monitorowanie bolesności bodźców elektrycznych, aby zapobiec nadmiernemu dyskomfortowi uczestników; pewien dyskomfort jest nieunikniony podczas badania nocyceptorów, szczególnie cichych/śpiących włókien C. Regularnie pytaj o oceny bólu, gdy amplituda stymulacji wzrasta podczas śledzenia progu elektrycznego i pozostań w pobliżu stymulatora prądu stałego, aby odłączyć go na żądanie uczestnika.
      UWAGA: Alternatywnie stymulację elektryczną można odłączyć za pomocą interfejsu użytkownika, klikając przycisk [ ] w panelu sterowania stymulacji.
   7. Szybkość wypalania wynosząca 50% wskazuje, że określono przybliżony próg elektryczny.
   8. Podczas śledzenia progu elektrycznego zastosuj eksperymentalną manipulację do pola recepcyjnego, taką jak manipulacje temperaturą lub lekami. Wpływ tych manipulacji na próg elektryczny nocyceptora będzie śledzony.
      UWAGA: Daj wystarczająco dużo czasu na zidentyfikowanie nowego progu nocyceptora po eksperymentalnej manipulacji.

Results

Reprezentatywny przykład oprogramowania działającego w celu kontrolowania eksperymentu jest pokazany w Rysunek 7. Iteracyjnie dostosowuje amplitudę stymulacji za pomocą metody góra-dół, aby skutecznie znaleźć próg elektryczny pojedynczych nocyceptorów. Po raz pierwszy pokazujemy wykonalność śledzenia progu elektrycznego pojedynczego neuronu w czasie rzeczywistym u ludzi podczas mikroneurografii (Rysunek 7A). Dodatkowo pokazujemy śledzenie progów elektrycznych w myszym włóknie Aδ (Rysunek 7B). Identyfikacja potencjałów czynnościowych poprzez przekroczenie progu, jak to jest tutaj stosowane, jest wystarczająca do śledzenia progów elektrycznych w czasie. Zalecamy użytkownikom podjęcie kroków w celu zminimalizowania szumów elektrycznych podczas nagrywania, takich jak użycie klatki Faradaya i filtrów pasmowoprzepustowych w celu poprawy stosunku sygnału do szumu.

Aby zademonstrować, że śledzenie progu elektrycznego może być używane jako miara zmian w pobudliwości nocyceptorów u ludzi, przeprowadzono śledzenie progu elektrycznego podczas paradygmatu ogrzewania krokowego (Rysunek 8). Zwiększenie temperatury końców nocyceptora zmniejszyło prąd stymulacji elektrycznej wymagany do wywołania potencjału czynnościowego, odzwierciedlając wzrost pobudliwości nocyceptorów (Rysunek 8C). Było to prawdopodobnie spowodowane generowaniem potencjałów receptorowych przez wrażliwe na ciepło kanały jonowe wyrażane w nocyceptorze włókna C¹⁴. Przy najwyższym kroku temperatury, 44 °C, wywołano termicznie wywołane potencjały czynnościowe (Rysunek 8A, numer bodźca 86-96). Powoduje to wzrost progu elektrycznego, ponieważ nocyceptor może znajdować się w stanie ogniotrwałym po wyładowaniu o wysokiej częstotliwości. Zgodnie z oczekiwaniami, opóźnienie śledzonego potencjału czynnościowego zmniejszało się wraz ze wzrostem temperatury. Uważa się, że dzieje się tak z powodu wpływu termodynamicznego na maszynerię przewodzącą, która zwiększa prędkość przewodzenia włókna C. To włókno C może również wykazywać przerzutnik (Rysunek 8B, numer bodźca 47-54), co może skutkować błędnym zwiększeniem amplitudy następującej stymulacji elektrycznej, jeśli potencjał czynnościowy wykracza poza okno wyszukiwania algorytmu.

Rysunek 1: Schemat konfiguracji sprzętu i połączeń kablowych wymaganych do śledzenia progów elektrycznych nocyceptora za pomocą APTrack u gryzoni i ludzi. Zwróć uwagę na dwie różne metody kontroli amplitudy stymulacji: silnik krokowy do ręcznie regulowanych stymulatorów w naszym ludzkim zestawie oraz PulsePal do stymulatorów sterowanych napięciem wejściowym w naszym zestawie dla gryzoni. (1) Komputer PC (Windows, Mac lub Linux) z uruchomioną wtyczką dla platformy Open Ephys. (2) Silnik krokowy, który obsługuje pokrętło amplitudy stymulacji w DS7. (3) Stymulator prądu stałego dopuszczony do stosowania u ludzi; tutaj użyliśmy DS7. (4) Optoizolator USB 3.0, który izoluje ludzkiego uczestnika od komputera (opcjonalnie, wymagany tylko do badań na ludziach). (5) Generator impulsów PulsePal V2, który generuje znaczniki czasu TTL (kanał wyjściowy 2) i kroki napięcia odpowiadające żądanej amplitudzie stymulacji (kanał wyjściowy 1). (6) Stymulator prądu stałego do stosowania u zwierząt; tutaj użyliśmy DS4. (7) Zasilacz prądu stałego dla systemu (zasilacz sieciowy prądu stałego używany do konfiguracji gryzoni i akumulatorowy zasilacz prądu stałego używany do konfiguracji z człowiekiem). (8) Rada ds. przejęć. (9) Płytka I/O do podłączenia koncentrycznych BNC przenoszących sygnały, które mają być nagrywane, takie jak wyjścia termopary i znaczniki TTL. (10) Preparat skórno-nerwowy myszy poddawany zapisom elektrofizjologicznym nocyceptora. (11) Uczestnik ludzki poddawany zapisowi mikroneurograficznemu z włókien C w powierzchownym nerwie strzałkowym. (12) Intan RHD2216 główną sceną dla pozyskiwania i digitalizacji nagrań. (13) Płytka adaptera elektrody Intan, do której podłączone są elektrody nagrywające i która umożliwia przekazanie sygnału do RHD2216 sceny czołowej. (14) System stymulacji termicznej, który może wyprowadzać temperaturę za pośrednictwem koncentrycznego połączenia BNC. (15) Zasilany bateryjnie pedał przyciskowy/nożny 3,3 V, który służy do oznaczania zdarzeń stymulacji mechanicznej i aplikacji leków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Łańcuch sygnałowy szablonu. Czerwona strzałka wskazuje przycisk włączający wejście ADC z karty we/wy. Żółta strzałka wskazuje menu rozwijane, w którym można wybrać format pliku Open Ephys. Zielona strzałka wskazuje przyciski Odtwórz i Nagraj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika. Graficzny interfejs użytkownika składa się z czterech głównych komponentów. (1) Panel Czasowy wykres rastrowy (zielony) do wizualizacji danych i ustawień związanych ze sterowaniem wykresem. Stała odpowiedź opóźnienia pokazująca stopniowe spowolnienie zależne od aktywności jest wskazywana przez zieloną strzałkę. (2) Panel sterowania stymulacją (żółty) do ustawiania parametrów amplitudy stymulacji i wczytywania skryptów paradygmatu stymulacji. (3) Tabela śledzenia wielu jednostek (niebieska) do dodawania potencjałów czynnościowych do śledzenia i aktywacji opóźnienia i śledzenia progów elektrycznych. (4) Menu opcji do wyboru stylów kolorów i kanału wejściowego dla wyzwalaczy danych i TTL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ułatwienie identyfikacji potencjałów czynnościowych o stałym opóźnieniu poprzez wizualizację danych w czasie rzeczywistym na czasowym wykresie rastrowym za pomocą APTrack. Jest to przykład o wysokim stosunku sygnału do szumu. Dane przedstawione na czasowym wykresie rastrowym pochodzą z zapisu ludzkiego włókna C z powierzchownego nerwu strzałkowego podczas mikroneurografii. Voltage Trace to podobna do oscyloskopu wtyczka LFP Viewer w Open Ephys. APTrack User Interface to graficzny interfejs użytkownika wtyczki. Śledzony potencjał czynnościowy jest wskazywany zielonymi strzałkami, a okrągły suwak na granicy czasowego wykresu rastrowego służy do kontrolowania pozycji pola wyszukiwania, w którym algorytmy będą szukać zdarzeń przekroczenia progu. Artefakt stymulacji elektrycznej jest oznaczony na niebiesko na ścieżce napięcia. Amplituda stymulacji analogowego polecenia napięcia jest oznaczona kolorem czerwonym; Należy pamiętać, że może to nie być to samo, co amplituda prądu stymulacji w zależności od współczynnika skalującego ustawionego na stymulatorze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Graficzna reprezentacja algorytmu śledzenia opóźnień. Mówiąc prościej, jeśli potencjał czynnościowy zostanie wykryty przez przekroczenie progu, pole wyszukiwania dostosuje swoje położenie tak, aby wyśrodkować się w momencie napięcia szczytowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Graficzna reprezentacja algorytmu śledzenia progów elektrycznych. Mówiąc prościej, jeśli potencjał czynnościowy zostanie wykryty przez przekroczenie progu, amplituda stymulacji zostanie zmniejszona o szybkość zmniejszania. Jeśli nie zostanie wykryty potencjał czynnościowy, amplituda stymulacji zostanie zwiększona o szybkość przyrostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Automatyczne śledzenie progów elektrycznych potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu przy częstotliwości stymulacji 0,25 Hz. (A) Sekwencyjne ślady ludzkiego włókna C powierzchownego nerwu strzałkowego podczas eksperymentu mikroneurograficznego. (B) Sekwencyjne ślady mysiego włókna Aδ nerwu odpiszczelowego podczas preparacji skórno-nerwowej drażniły elektrofizjologię włókien. Ślady były pokolorowane na czerwono, gdy zidentyfikowano potencjał czynnościowy, co skutkowało spadkiem amplitudy bodźca. Algorytm oprogramowania skutecznie znajduje amplitudę bodźca wymaganą do 50% prawdopodobieństwa odpalenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Śledzenie progu elektrycznego przy częstotliwości stymulacji 0,25 Hz podczas stymulacji termicznej ludzkiego nocyceptora z włókna C. Oś y koduje liczbę stymulacji od początku paradygmatu. (A) Ślad napięcia przez 4 000 ms po stymulacji elektrycznej, ze zdarzeniami przekroczenia progu zaznaczonymi na czerwono. (B) Ślad napięcia od A powiększony wokół śledzonego potencjału czynnościowego. Ślady były pokolorowane na czerwono, gdy wykryto śledzony potencjał czynnościowy. Pionowa niebieska linia to opóźnienie linii bazowej śledzonej jednostki. (C) Prąd stymulacji sterowany przez APTrack. Pionowa niebieska linia to podstawowy próg elektryczny. (D) Pole recepcyjne temperatury sondy termostymulującej TCS-II. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

związek	koncentracja
Zawartość NaCl	107,8 mln
NaHCO3	26,2 mln
Kcl	3,5 mM
NaH2PO4	1,67 mln
CaCl2	1,53 mM
MgSO4	0,69 mM
Glukonian sodu	9,64 mln
sacharoza	7,6 mln
glukoza	5,55 mln

Tabela 1: Zawartość syntetycznego płynu śródmiąższowego do preparatu skórno-nerwowego myszy²³.

Discussion

APTrack to wtyczka programowa do użytku z platformą Open Ephys. Wybraliśmy tę platformę, ponieważ jest open-source, elastyczna i tania we wdrożeniu. Nie wliczając w to kosztu stymulatora prądu stałego, cały sprzęt wymagany do rozpoczęcia korzystania z wtyczki można było kupić za około 5,000 USD w momencie pisania tego tekstu. Mamy nadzieję, że umożliwi to naukowcom łatwiejsze wdrożenie APTrack w badaniach elektrofizjologii nerwów obwodowych. Co więcej, badacze mogą dowolnie modyfikować oprogramowanie, aby dopasować je do swoich potrzeb eksperymentalnych. Co ważne, narzędzie to po raz pierwszy umożliwiło śledzenie progów elektrycznych pojedynczych nocyceptorów włókien C u ludzi.

Im wyższy stosunek sygnału do szumu, tym lepiej algorytmy mogą identyfikować potencjały czynnościowe. Stosunek sygnału do szumu podczas mikroneurografii był wystarczający w większości naszych nagrań, ale użytkownicy muszą być wyczuleni na ryzyko degradacji sygnału w czasie. Jest to szczególnie ważne w przypadku dłuższych protokołów eksperymentalnych, ponieważ jeśli amplituda śledzonego potencjału czynnościowego spadnie poniżej progu wykrywania, amplituda stymulacji zostanie omyłkowo zwiększona; Można to złagodzić, monitorując wtyczkę przez eksperymentatorów, a następnie dostosowując ustawienia, jeśli jest to wymagane. Stosunek sygnału do szumu jest poprawiony dzięki filtrowaniu pasmowoprzepustowym, ale większe stany nieustalone mogą być nadal błędnie identyfikowane jako potencjały czynnościowe, jeśli pojawią się w oknie czasowym pola wyszukiwania. Ryzyko błędnej identyfikacji szumu przejściowego jako potencjału czynnościowego można zmniejszyć, zawężając okno czasowe, w którym wtyczka wyszukuje potencjały czynnościowe, oraz optymalizując ustawienia progowe. Jednak nadal istnieją sytuacje, które można napotkać, które utrudniają działanie wtyczki. Spontaniczna aktywność może powodować trudności, jeśli potencjały czynnościowe o większej amplitudzie mieszczą się w oknie pola wyszukiwania algorytmu, ponieważ zostaną błędnie zidentyfikowane jako docelowy potencjał czynnościowy. Dodatkowo, spontaniczna aktywność w neuronie będącym przedmiotem zainteresowania może oznaczać, że stymulacja elektryczna spada w okresie refrakcji, powodując niepowodzenie w generowaniu potencjału czynnościowego. Trudności w korzystaniu z oprogramowania mogą również wystąpić, gdy pierwotne neurony aferentne wykazują przerzutnik, w którym stymulowane są naprzemienne końcowe gałęzie pojedynczego neuronu, powodując w ten sposób, że wywołany potencjał czynnościowy ma dwie (lub więcej) opóźnienia linii podstawowej, które wzajemnie się wykluczają²⁰. Podczas nagrań z neuronów wykazujących przerzutnik z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, z powodzeniem przeprowadziliśmy śledzenie opóźnień i progów elektrycznych, zwiększając szerokość pola wyszukiwania, aby zawrzeć wszystkie potencjalne prędkości przewodzenia, które wykazywał neuron. Jednak próg elektryczny może się różnić w zależności od końcowej gałęzi neuronu, który jest pobudzany, co prawdopodobnie jest częściowo spowodowane różnicami w odległości od miejsca stymulacji elektrycznej do alternatywnych końców nocyceptorów. Możliwe są dodatkowe prace nad procesem identyfikacji potencjału czynnościowego, obejmujące na przykład dopasowywanie szablonów, które można zintegrować z tym oprogramowaniem. Wtyczki GUI do przerywania pasma lub adaptacyjnej filtracji szumów mogą być również używane przed APTrack w łańcuchu sygnałowym, jeśli zostaną opracowane.

Uważamy, że próg elektryczny określany jest jako prąd wymagany do wywołania potencjału czynnościowego w 50% przypadków, przy zdefiniowanej przez użytkownika liczbie bodźców elektrycznych, zwykle 2-10. Morfologia stymulacji elektrycznej wynosi 0,5 ms i dodatnich impulsów fali prostokątnej. To nie to samo, co określenie reozasady, powszechnie stosowanej miary pobudliwości neuronalnej. Wtyczka może być dostosowana do określenia reobazy. Jednak dążyliśmy do prostszego pomiaru, ponieważ dynamiczne zmiany pobudliwości, takie jak te, które hipotetycznie występują podczas ogrzewania, byłyby trudniejsze do ilościowego określenia w przypadku zmian reozasady niż nasze oszacowanie progu elektrycznego.

To oprogramowanie może być używane zarówno w eksperymentach na ludziach, jak i gryzoniach. Jest to możliwe dzięki elastycznemu wsparciu dla systemów elektrostymulacji. Oprogramowanie będzie współpracować z każdym stymulatorem, który akceptuje analogowe napięcie sterujące lub może być ręcznie połączony z silnikiem krokowym. Do mikroneurografii używaliśmy go ze stymulatorem prądu stałego z oznaczeniem CE, który został zaprojektowany do użytku w badaniach na ludziach i miał stymulację kontrolowaną za pomocą tarczy. Stymulatory, które akceptują analogowe polecenia napięciowe, mogą być głośne, ponieważ nie rozłączają obwodu między bodźcami, co oznacza, że każdy buczenie lub szum 50/60 Hz na wejściu analogowym zostanie przesłany do nagrania. Stymulator, który wymaga dodatkowego sygnału wyzwalającego TLL do podłączenia obwodu, pozwalającego na wygenerowanie bodźca o prądzie analogicznym do analogowego wejścia napięciowego, jest idealny do użytku z wtyczką. Zapobiega to przenoszeniu szumu na nagranie między bodźcami.

Oprogramowanie wykorzystuje prostą metodę góra-dół do oszacowania progu elektrycznego. Jest to wykorzystywane w testach psychofizycznych od wielu dziesięcioleci²⁵. Zgodnie z metodą góra-dół, algorytm śledzenia progu elektrycznego do modulacji amplitudy stymulacji uwzględnia tylko amplitudę i reakcję poprzedniej stymulacji przy obliczaniu amplitudy następnej stymulacji. Oznacza to, że amplituda stymulacji będzie oscylować wokół rzeczywistego progu elektrycznego, wytwarzając w ten sposób 50% szybkość wypalania, przy założeniu, że próg jest stabilny. Minimalny rozmiar przyrostu lub spadku wynosi 0,01 V; jest to równoważne 0,01 mA, przy założeniu, że stymulator ma stosunek sygnału wejściowego do wyjściowego 1 V:1 mA i wystarczającą rozdzielczość, aby osiągnąć tak małe zmiany krokowe. Wtyczka będzie aktualizować na żywo oszacowanie progu elektrycznego docelowego potencjału czynnościowego za każdym razem, gdy osiągnie 50% szybkości wystrzeliwania w stosunku do zdefiniowanej przez użytkownika liczby poprzednich bodźców (2-10). Post hoc zalecamy użycie średniej kroczącej amplitudy stymulacji z ostatnich 2-10 bodźców w celu oszacowania progu elektrycznego i należy zauważyć, że oszacowanie to będzie dokładne tylko wtedy, gdy szybkość wyzwalania jest stosunkowo stabilna na poziomie 50%. Zarówno w przypadku bieżących, jak i post hoc szacunków progu elektrycznego istnieje równowaga między rozdzielczością, niezawodnością i czasem do rozważenia. Użycie mniejszych kroków inkrementacji i dekrementacji zwiększy dokładność oszacowania progu elektrycznego, ale wydłuży czas potrzebny na znalezienie nowego progu elektrycznego początkowo i po perturbacji. Obliczenie progu elektrycznego na większej liczbie poprzednich bodźców zapewni lepszą wiarygodność, ale wydłuży czas potrzebny do osiągnięcia dokładnego oszacowania.

APTrack został zaprojektowany do stosowania w zapisach nerwów obwodowych, w szczególności do śledzenia progów elektrycznych włókien C podczas eksperymentalnych i patologicznych zaburzeń w okresach, w których opóźnienie potencjału czynnościowego może się różnić w zależności od podstawowej aktywności neuronalnej. Metoda ta umożliwi badanie nie tylko pobudliwości aksonalnej, ale także potencjałów generatora nocyceptorów u zdrowych ochotników i pacjentów. Przewidujemy, że inne dziedziny elektrofizjologii mogą przyjąć i dostosować to narzędzie do użycia w każdym eksperymencie, który wymaga śledzenia progu elektrycznego aktywności zablokowanej przez bodziec. Na przykład, można to równie łatwo zaadaptować do stymulacji optogenetycznej za pomocą impulsów świetlnych sterowanych z APTrack. Wtyczka jest open-source i dostępna dla badaczy na licencji GPLv3. Jest zbudowany na platformie Open Ephys, która jest elastycznym, tanim systemem pozyskiwania danych typu open source. Wtyczka zapewnia dodatkowe punkty zaczepienia dla wtyczek podrzędnych w celu wyodrębnienia informacji o potencjale działania i zapewnienia dodatkowych interfejsów użytkownika lub paradygmatów adaptacyjnych. Wtyczka zapewnia prosty interfejs użytkownika do wizualizacji i śledzenia opóźnień potencjałów czynnościowych w czasie rzeczywistym. Może również odtwarzać poprzednie dane i wizualizować je za pomocą czasowego wykresu rastrowego. Co więcej, może również śledzić opóźnienia podczas odtwarzania poprzednich danych. Chociaż dostępne są inne pakiety oprogramowania do śledzenia opóźnień w czasie rzeczywistym, nie są one open-source i nie mogą wykonywać śledzenia progów elektrycznych^26,27. APTrack ma przewagę nad tradycyjnymi metodami identyfikacji potencjałów czynnościowych o stałym opóźnieniu na podstawie śladów napięcia, ponieważ wykorzystuje czasowy wykres rastrowy do wizualizacji danych. Co więcej, nasze doświadczenia z wykorzystaniem go w eksperymentach z niskimi stosunkami sygnału do szumu wykazały, że metoda czasowej wizualizacji wykresu rastrowego pozwala na identyfikację stałych potencjałów czynnościowych opóźnień, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte.

Śledzenie progu całego nerwu jest szeroko stosowaną metodą oceny pobudliwości aksonów¹³. Śledzenie progu elektrycznego pojedynczego neuronu we włóknach C gryzoni było wcześniej wykorzystywane do ilościowego określania pobudliwości nocyceptorów¹⁴, a jego użyteczność u ludzi jest uznawana ^10,11; Jednak do tej pory nie było to możliwe. Dostarczamy nowatorskie narzędzie typu open source do bezpośredniego pomiaru pobudliwości pojedynczego nocyceptora zarówno w badaniach elektrofizjologicznych nerwów obwodowych u gryzoni, jak i u ludzi. APTrack po raz pierwszy umożliwia w czasie rzeczywistym, open-source, elektryczne śledzenie progów potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów u ludzi. Przewidujemy, że ułatwi to badania translacyjne nocyceptorów między gryzoniami a ludźmi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zasilacz 12V DC	NA	NA	Do zasilania uStepper S-lite. Wymagane dla stymulatorów sterowanych pokrętłem.
36-pinowa płytka adaptera elektrody	Intan Technology	C3410	Zależność APTrack. Do podłączenia wejścia elektrody do sceny czołowej. 255 USD w marcu 2021 r.
APTrack Plugin	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolarna elektroda rejestrująca Ag/AgCl	Niestandardowa		elektroda nagrywająca NA do przygotowania skórno-nerwowego. Lub równoważny.
Bipolarna koncentryczna elektroda stymulująca	World Precision Instruments	SNE-100	Do stymulacji elektrycznej w preparacie skórno-nerwowym myszy. Lub równoważny.
Bipolarna przezskórna elektroda stymulująca	Custom	NA	Do przezskórnej stymulacji elektrycznej podczas poszukiwania potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu podczas mikroneurografii.
Rozdzielacz BNC T (1+)	Zależność NA	NA	APTrack. Dowolny standardowy rozdzielacz BNC T.
BNC do BNC (3+)	Zależność NA	NA	APTrack. Dowolne standardowe BNC.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
CaCl2	Merck	C5670	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
Digitimer DS4 Stymulator prądu stałego	Digitimer	DS4	Stabilizator prądu stałego do badań na zwierzętach. 1,695 GBP stan na wrzesień 2022 r.
Digitimer DS7 Stymulator prądu stałego	Digitimer	DS7A	Stabilizator prądu stałego do badań na ludziach. 3,400 GBP stan na wrzesień 2022 r.
Elektrody stymulujące Classic Plus	Harmony Medical	NA	Do śródskórnej stymulacji elektrycznej grzbietowej części stopy w stałej pozycji podczas mikroneurografii u ludzi.
Glukoza	Fisher Scientific	G/0450/60	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
HDMI	NA	NA	Zależność APTrack. Dowolny standardowy pasywny HMDI. Aby połączyć płytę we/wy OE z płytą przejęć OE.
KCl	Merck	P9541	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Preparat skórno-nerwowy, syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
Olej mineralny	Merck	330779	Izolacja elektryczna do zapisów nerwowych w preparacie skórno-nerwowym. Lub równoważny.
NaCl	Merck	S9888	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
NaHCO3	Merck	S6014	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
NaHCO3	Merck	S0751	Preparat skórno-nerwowy syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
Otwórz tablicę akwizycji Ephys	Ephys	NA	. W zestawie USB do podłączenia do komputera i gniazdka sieciowego. i euro; 2,955 EUR stan na wrzesień 2022 r.
Otwórz graficzny interfejs użytkownika Ephys	Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Otwórz płytę we/wy Ephys	Ephys	NA	. Do wejść napięciowych ADC za pośrednictwem BNC. i euro; 12,5 EUR bez złączy, & euro; 85 EUR ze złączami od września 2022 r.
Zależność PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack. Przetwornik cyfrowo-analogowy typu open source i generator pociągów. Wstępnie zmontowane 725 USD we wrześniu 2022 r. Ok. 275 USD za samodzielny montaż.
SPI RHD 6ft	Intan Technology	C3206	Zależność APTrack. Do podłączenia headstage do OE Acquisition Board. 295 USD od marca 2021 r
RHD2216 16-kanałowa dwubiegunowa scena czołowa	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. Do akwizycji i digitalizacji danych. 725 USD w marcu 2021 r. Lub odpowiednik RHD2000 głównej scenie.
Sacharoza	Fisher Scientific	S/8560/60	Preparat skórno-nerwowy, syntetyczny składnik płynu śródmiąższowego. Lub równoważny.
Stymulator termiczny TCS-II	QST. Lab	NA	Do stymulacji termicznej pól recepcyjnych nocyceptorów podczas mikroneurografii człowieka.
Para mikroelektrod wolframowych (aktywna + referencyjna)	FHC	30085	Do zapisów mikroneurograficznych. 35mm.
Skaner ultradźwiękowy iQ+	Butterfly Network	NA	Do wprowadzania elektrody pod kontrolą USG podczas mikroneurografii.
Izolacja USB 3.0 5kV RMS	Inota Technology	7055-D Do	izolowania ludzkiego uczestnika mikroneurografii od komputera. 459 EUR według stanu na wrzesień 2022 r.
USB-A do micro USB-B (2)	Zależność od		APTrack NA. Aby podłączyć komputer do PulsePal i uStepper S-lite, jeśli używasz interfejsu krokowo-stymulacyjnego.
Silnik uStepper S-lite + NEMA17	uStepper	NA	Do łączenia ze stymulatorami za pomocą pokrętła sterującego. € 50 EUR od września 2022 r.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	Do mechanicznej stymulacji pól recepcyjnych podczas fenotypowania sensorycznego nocyceptorów.